Recherche fondamentale

Deux séances d'imagerie par bioluminescence sous anesthésie chaque semaine, jusqu'à douze semaines, et autant de contentions pour des injections dans le péritoine : 128 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever la tumeur et d'autres organes. Certaines subissent une chirurgie pour recevoir des cellules cancéreuses dans la prostate, avec un risque d'inflammation chronique et d'incontinence urinaire, d'autres une injection sous la peau dont la tumeur peut devenir nécrotique et douloureuse. Ce projet pilote sert à mettre au point des greffes tumorales, avant de futures études sur les macrophages. Le porteur présente l'effectif comme "le minimum requis", tout en écrivant que l'étude se passe de toute analyse statistique.

Objectifs

Le cancer de la prostate (CaP) représente le premier cancer chez l'homme en France. La majorité des patients CaP évolue favorablement, mais environ 20% de ces patients développent une maladie agressive avec l’apparition de métastases. Pour ces patients, des hormonothérapies visant à bloquer la voie du récepteur des androgènes (RA) et de la chimiothérapie sont proposées, mais des résistances apparaissent amenant au décès de près de 8700 patients chaque année. La compréhension des mécanismes de résistance thérapeutique est donc l’un des grands enjeux dans le domaine du CaP. Il a été montré ces dernières années que les cellules non cancéreuses comme les macrophages associés aux cellules tumorales (TAM) participent au développement du CaP et à sa résistance aux traitements. Nous souhaitons étudier l’impact des différents traitements, dont l’hormonothérapie, sur ces TAM dans un contexte tumoral. L’objectif de ce projet est de mettre en place des modèles de croissance tumorale prostatique utilisant des cellules cancéreuses murines. Ces lignées seront injectées chez des souris ayant un système immunitaire fonctionnel. Ces cellules proviennent de la même souche de souris ce qui permet à la tumeur de se développer. Les cellules tumorales seront injectées dans deux conditions : en sous-cutanée ou en intra-prostatique. Plusieurs lignées cellulaires et plusieurs quantités de cellules seront testées pour mettre au point les modèles. Enfin la mise en place de ces modèles sera également testée dans une lignée de souris possédant des macrophages de fluorescences différentes selon leur provenance ce qui permet d’étudier l’hétérogénéité des macrophages au sein des tissus.

Bénéfices attendus

Les études récentes montrent une implication de plus en plus importante des cellules immunitaires et en particulier des macrophages dans de nombreuses pathologies, notamment le cancer et les maladies inflammatoires. La mise en place de ces modèles est un départ essentiel qui permettra d’étudier par la suite le rôle des macrophages dans un contexte de tumeur prostatique et permettra à moyen terme de mieux comprendre leur hétérogénéité et leur complexité notamment lors des différents traitements de chimiothérapie et d’hormonothérapie. A plus long terme ce projet permettra d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le cancer de la prostate afin d’éviter la résistance aux traitements.

Procédures

Les animaux au cours de ce projet seront soumis à des injections dans le péritoine et des contentions régulières (deux fois par semaines pendant 12 semaines au maximum). Certaines souris subiront une chirurgie pour une injection de cellules cancéreuses de la prostate. Elles subiront également des prises d’images de bioluminescence sous anesthésie (deux fois par semaines pendant 12 semaines au maximum).

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus seront dus à l’acte chirurgical et à la croissance des tumeurs. La croissance tumorale sous-cutanée peut engendrer un inconfort de déplacement, parfois des nécroses et des douleurs chroniques si la taille tumorale devient trop importante. La croissance tumorale intra-prostatique peut engendrer une inflammation chronique et une incontinence urinaire. Les injections sous-cutanées peuvent entrainer une légère douleur transitoire. Tous les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière afin de détecter précocement tout signe de souffrance.

Devenir

A la fin de la procédure expérimentale les animaux seront mis à mort afin de prélever la tumeur et différents organes pour étudier le système immunitaire dans ces différents organes.

Remplacement

Des modèles cellulaires permettent d’étudier les macrophages dans des systèmes simples et l’étude des tissus de patients permettent d’intégrer ces données à des moments définis. Cependant l’étude dynamique de la complexité des populations de macrophages et notamment de l’impact des systèmes hormonaux et de leur inhibition (hormonothérapie) sur ces populations nécessite l’utilisation de modèles animaux.

Réduction

Ce projet est une étude pilote qui permettra de mettre en place des modèles de croissance tumorale prostatique chez la souris présentant un système immunitaire fonctionnel. Cette étude ne nécessite pas d’analyse statistique. Le nombre d’animaux présenté est le minimum requis pour s’assurer de la mise en place du modèle. Il permettra d’obtenir des données sur la variabilité de la croissance tumorale qui serviront par la suite à calculer le nombre d’animaux nécessaire aux prochaines études. Pour la greffe intra-prostatique, l’utilisation d’une imagerie du petit animal par bioluminescence permettant de suivre de manière non invasive dans le temps la croissance tumorale et de réduire le nombre d’animaux nécessaire.

Raffinement

L’environnement d’hébergement sera enrichi par l’ajout systématique d’au moins deux éléments parmi du papier kraft, des carrées de coton, une maison en cellulose et un bout de bois à ronger accroché à la cage. Ces enrichissements permettront de diminuer fortement le stress et de favoriser les comportements naturels des souris. Un suivi quotidien des souris tout au long des procédures sera effectué et une évaluation bihebdomadaire de leur état sera effectuée à l’aide d’une grille de score. Cette grille permettra de détecter précocement tout signe de souffrance. L’injection intra-prostatique se fera sous anesthésie générale. Une analgésie pré- et post-opératoire sera administrée systématiquement afin de contrôler la douleur.

Choix des espèces

L'étude de la complexité des populations de macrophages lors de la croissance tumorale et particulièrement de l’impact des systèmes hormonaux sur ces populations sont des éléments importants pour comprendre le fonctionnement et le rôle du système immunitaire dans le cancer. Dans la littérature scientifique, la souris est l’espèce la plus largement utilisée comme modèle du cancer en général et plus particulièrement du cancer de la prostate. Elles sont un moyen unique de suivre et d'étudier les cellules immunitaire d'intérêts dans le cadre du cancer. Les souris de ce projet seront âgées de 6 à 8 semaines (matures d’un point de vue hormonal) et seront uniquement des mâles car seuls les mâles possèdent une prostate et les cellules tumorales prostatiques ont besoin des androgènes (testostérone) pour croitre.

380 souris vont être utilisées, chacune opérée du cerveau pendant une à quatre heures pour recevoir des implants, puis soumise à des séances comportementales allant jusqu'à trois heures par jour. Toutes sont tuées à l'issue pour vérifier la position des implants et analyser le tissu cérébral, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant onze jours au plus, elles subissent jusqu'à onze injections et une restriction alimentaire qui maintient leur poids à au moins 85 % de la normale, restriction que le porteur dit destinée à entretenir leur "motivation". Les tâches, décrites comme l'apprentissage d'une règle puis son changement, ne sont pas nommées. Les retombées pour la schizophrénie ou l'autisme sont renvoyées au "plus long terme".

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre comment certains réseaux neuronaux participent à la flexibilité cognitive, c’est-à-dire à la capacité d’abandonner une stratégie devenue inadaptée afin d’en adopter une nouvelle. Nous chercherons à identifier comment certaines populations neuronales contribuent au maintien de comportements stables mais également à leur mise à jour lorsque les conditions changent. Pour répondre à cette question, nous utiliserons des approches complémentaires chez la souris. Les animaux réaliseront des tâches comportementales permettant d’étudier l’apprentissage initial d’une règle comportementale puis l’adaptation nécessaire lorsque cette règle change. Pendant ces tâches, l’activité neuronale pourra être enregistrée chez des animaux éveillés et libres de leurs mouvements afin de caractériser les dynamiques d’activité associées à l’apprentissage, aux erreurs comportementales et aux changements de stratégie. Nous étudierons également comment certaines populations cellulaires influencent ces mécanismes et peuvent favoriser des comportements persévérants lorsque l’adaptation comportementale échoue. Les données obtenues permettront une meilleure compréhension des mécanismes cérébraux impliqués dans la flexibilité cognitive et pourraient contribuer à l’identification de nouvelles pistes thérapeutiques pour des troubles neurologiques et psychiatriques associés à des déficits d’adaptation comportementale.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de faire progresser les connaissances sur les mécanismes neuronaux permettent l’adaptation du comportement lorsque les règles de l’environnement changent. Les travaux fourniront des données détaillées sur les dynamiques d’activité neuronale associées à l’apprentissage, aux erreurs comportementales, aux changements de stratégie et aux comportements persévérants. Grâce à la combinaison d’approches complémentaires ce projet permettra d’étudier de manière précise le rôle de différentes populations neuronales dans le contrôle des comportements flexibles. Les données obtenues permettront également de mieux comprendre comment certaines perturbations de l’activité inhibitrice peuvent altérer les capacités d’adaptation comportementale. À plus long terme, ces travaux contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes cérébraux impliqués dans plusieurs troubles neurologiques et psychiatriques associés à des déficits cognitifs et à une rigidité comportementale, notamment la schizophrénie, l’autisme et certains troubles neurodéveloppementaux. Ces résultats pourront contribuer au développement futur de nouvelles hypothèses et approches thérapeutiques ciblant les circuits neuronaux impliqués dans ces déficits. Les données produites dans le cadre du projet pourront également contribuer au développement de nouvelles approches visant à mieux comprendre le fonctionnement des réseaux neuronaux impliqués dans la prise de décision et l’adaptation comportementale.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie du cerveau unique sous anesthésie générale. Cette chirurgie durera entre 1 et 4 heures selon les implants réalisés. Dans certains groupes d'imagerie, une seconde courte sous anesthésie générale pourra être réalisée une seule fois; cette intervention durera 30 à 60 minutes. Les animaux pourront recevoir au maximum 5 injections sur 5 jours consécutifs, selon les lignées utilisées. Pour certaines expériences, les animaux pourront recevoir une autre injection avant certaines séances expérimentales, avec un maximum d'une injection par séance et de 11 injections par animal sur l'ensemble de la période comportementale. Après récupération post-opératoire, les animaux seront progressivement habitués aux manipulations expérimentales et aux dispositifs d’enregistrement. Les séances comportementales dureront entre 30 minutes et 3 heures maximum par jour. La période comportementale, incluant l'habituation finale la restriction alimentaire contrôlée, les enregistrements et/ou les manipulations, durera au maximum 11 jours par animal. Une restriction alimentaire modérée pourra être mise en place uniquement pendant cette périodes comportementale, pour une durée maximale de 11 jours par animal. Le poids sera surveillé quotidiennement et maintenu à au moins 85 % du poids ad libitum. Les animaux seront ensuite replacés en hébergement collectif avec leurs congénères lorsque cela sera compatible avec leur état clinique et l'intégrité des implants.

Impact sur les animaux

Ce projet implique des chirurgies du cerveau réalisées sous anesthésie générale pouvant durer entre 1 et 4 heures selon la complexité des implants. Ces interventions sont susceptibles d’entraîner une douleur légère à modérée pendant quelques jours après la chirurgie, ainsi qu’une gêne transitoire liée à la cicatrisation et à la présence des implants chroniques. Les animaux subiront également des manipulations répétées, des périodes d’habituation aux dispositifs expérimentaux, des connexions aux systèmes d’enregistrement et, pour certains protocoles, un hébergement individuel temporaire. Ces procédures pourront induire un stress modéré transitoire. Les tâches comportementales nécessiteront une restriction alimentaire contrôlée destinée à maintenir la motivation des animaux. Cette restriction pourra entraîner une diminution modérée et réversible du poids corporel. Les nuisances attendues au cours du projet sont donc principalement : une douleur post-opératoire légère à modérée et transitoire, une gêne liée aux implants chroniques, un stress modéré associé aux manipulations et aux procédures comportementales, ainsi qu’une perte de poids légère et réversible liée à la restriction alimentaire.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet ne pourront pas être replacés ou adoptés à l’issue des procédures expérimentales. Une partie des animaux sera maintenue en vie de manière séquentielle entre certaines procédures compatibles du projet afin de permettre la réalisation des enregistrements comportementaux et des analyses prévues. La poursuite des expérimentations sera conditionnée à l’état de bien-être des animaux et à l’absence de signes de douleur ou de détresse incompatibles avec la poursuite des procédures. À l’issue du projet, tous les animaux seront mis à mort selon les méthodes réglementaires prévues afin de permettre la réalisation des analyses finales nécessaires aux objectifs scientifiques du projet. Ces analyses incluront notamment l’étude des tissus cérébraux, la vérification de la localisation des implants et des injections ainsi que l’évaluation de l’expression des marqueurs expérimentaux. Les animaux ne pourront pas être réutilisés dans d’autres projets en raison des chirurgies intracérébrales, des implants chroniques, des manipulations expérimentales réalisées et des prélèvements tissulaires finaux nécessaires aux analyses scientifiques.

Remplacement

Il n’existe actuellement pas d’alternative non animale permettant d’étudier de manière complète les mécanismes cérébraux impliqués dans la flexibilité cognitive et l’adaptation du comportement lorsque les règles de l’environnement changent. Les objectifs du projet nécessitent l’étude de l’activité de réseaux neuronaux intacts pendant des comportements complexes impliquant perception, apprentissage, prise de décision et modification de stratégie comportementale. Les cultures cellulaires, modèles informatiques ou autres approches in vitro ne permettent pas de reproduire l’organisation complète des circuits cérébraux, les interactions entre différents types cellulaires, ni les comportements cognitifs étudiés dans ce projet. De plus, les expériences nécessitent l’étude de l’activité neuronale chez des animaux éveillés réalisant des tâches comportementales, ce qui ne peut pas être reproduit par des méthodes alternatives. L’utilisation d’animaux vivants est donc nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Le nombre d’animaux sera limité autant que possible et plusieurs analyses complémentaires pourront être réalisées à partir d’un même animal afin de maximiser les données obtenues.

Réduction

Le nombre total d’animaux inclus dans ce projet a été estimé en tenant compte des objectifs scientifiques et des mesures de réduction mises en œuvre afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux. Plusieurs analyses complémentaires pourront être réalisées à partir d’un même animal, notamment les expériences comportementales, les enregistrements d’activité cérébrale, l’imagerie et les analyses histologiques finales, afin de maximiser les données obtenues pour chaque animal utilisé. Le nombre d’animaux sera également réduit grâce à l’utilisation de protocoles expérimentaux standardisés, à l’expérience des expérimentateurs et à l’optimisation des procédures chirurgicales et comportementales, permettant de limiter les pertes expérimentales et la variabilité des résultats. Lorsque cela sera possible, les tissus prélevés pourront également être utilisés pour plusieurs analyses complémentaires. Les animaux ne pourront généralement pas être réutilisés après certaines procédures en raison des implants chroniques, des manipulations expérimentales réalisées ou des analyses terminales nécessaires à la collecte des tissus cérébraux. La taille des groupes expérimentaux sera déterminée à partir des données de la littérature, d’expériences antérieures et d’analyses statistiques adaptées afin d’obtenir des résultats scientifiquement interprétables tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Des tests statistiques paramétriques ou non paramétriques appropriés seront utilisés selon les données obtenues.

Raffinement

Toutes les mesures visant à réduire au minimum la douleur, la souffrance, l’angoisse et les dommages durables subis par les animaux seront appliquées tout au long du projet. Les protocoles expérimentaux ont été conçus afin de limiter le stress lié aux manipulations, aux chirurgies et aux tâches comportementales. Les animaux bénéficieront d’une période d’habituation aux expérimentateurs et aux dispositifs expérimentaux afin de réduire le stress associé aux procédures. Les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie adaptée et accompagnées d’une prise en charge analgésique appropriée. Une surveillance régulière des animaux sera effectuée après les procédures expérimentales afin d’évaluer leur état général, leur poids, leur activité locomotrice et l’apparition éventuelle de signes de douleur ou de détresse. Des points limites spécifiques et précoces seront appliqués afin d’éviter toute souffrance prolongée. Les conditions d’hébergement et d’enrichissement du milieu seront adaptées aux besoins physiologiques et comportementaux des animaux. Les expérimentateurs impliqués dans le projet sont formés aux procédures expérimentales et au suivi du bien-être animal. Les protocoles expérimentaux pourront être ajustés au cours du projet afin d’intégrer toute nouvelle méthode de raffinement permettant d’améliorer le bien-être des animaux ou de réduire les nuisances expérimentales.

Choix des espèces

La souris est un modèle largement utilisé pour l’étude des fonctions cognitives et des mécanismes cérébraux impliqués dans l’apprentissage, la mémoire et la flexibilité comportementale. Les propriétés fondamentales des circuits neuronaux chez la souris sont comparables à celles observées chez d’autres mammifères, ce qui permet d’obtenir des connaissances pertinentes pour la compréhension du fonctionnement cérébral normal et pathologique. Cette espèce permet également la réalisation d’approches expérimentales complémentaires chez un même animal. Les souris présentent en outre l’avantage de pouvoir être génétiquement modifiées afin d’étudier le rôle de populations neuronales spécifiques impliquées dans les comportements étudiés. Les lignées transgéniques utilisées dans ce projet présentent des phénotypes compatibles avec les objectifs expérimentaux et ne présentent pas d’altérations majeures du comportement ou de l’état général en dehors des manipulations expérimentales réalisées dans le cadre du projet. Les souris seront incluses dans la procédure à partir d’environ 5 semaines d’âge selon les cohortes expérimentales. Les chirurgies du cerveau pourront être réalisées à partir de cet âge afin de permettre une période suffisante de récupération post-opératoire et d’expression virale avant le début des tâches comportementales ou des analyses terminales. Les tâches comportementales et les enregistrements in vivo seront réalisés après la période de récupération et d’expression virale, chez des animaux adultes ou jeunes adultes, à un stade de développement compatible avec les objectifs du projet. Ce choix permet de réaliser les implants chroniques suffisamment tôt tout en effectuant les mesures comportementales et physiologiques après maturation adaptée des circuits cérébraux étudiés.

752 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant quatre semaines, une partie d'entre elles subit des changements d'environnement, des bruits et des perturbations lumineuses, reçoit une pompe sous la peau qui élève la pression artérielle, ou se voit implanter un dispositif d'imagerie miniaturisé dans le cerveau au cours d'une chirurgie d'environ une heure. L'équipe cherche à savoir si le stress chronique rend les petits vaisseaux cérébraux plus vulnérables à l'hypertension, et soumet les souris à des tests de mémoire et de comportement qu'elle ne nomme pas. Elle qualifie ce protocole de stress de "sans douleur", tout en indiquant qu'il peut réduire la prise alimentaire, altérer le pelage et diminuer l'activité.

Objectifs

L'hypertension artérielle est la première cause modifiable d'une maladie qui touche les petits vaisseaux du cerveau et qui peut entraîner, avec le temps, des troubles de la mémoire et de la concentration. Certaines personnes développent des atteintes cérébrales sévères malgré un bon contrôle de leur tension artérielle, ce qui suggère l'existence d'autres facteurs aggravants. Le stress chronique (lié par exemple au travail, à l'isolement social ou aux difficultés financières), auquel les femmes sont particulièrement exposées, pourrait être l'un de ces facteurs : il fragiliserait les petits vaisseaux du cerveau et les rendrait plus sensibles aux effets néfastes de l'hypertension. Ce projet a quatre objectifs : identifier les zones du cerveau les plus sensibles à cette combinaison stress-hypertension ; mesurer, grâce à des techniques d'imagerie, comment la circulation sanguine et l'étanchéité des petits vaisseaux cérébraux sont modifiées dans deux régions du cerveau impliquées dans la mémoire et les émotions (le cortex préfrontal et l'hippocampe) ; repérer des signes précoces, dans le comportement des animaux, annonçant des troubles de la mémoire ; identifier les mécanismes biologiques qui rendent certains individus plus vulnérables et d'autres plus résistants.

Bénéfices attendus

L'hypertension artérielle touche plus de 1,4 milliard de personnes dans le monde et constitue le premier facteur de risque de la maladie cérébrale des petits vaisseaux et du déclin cognitif. Malgré un contrôle tensionnel adéquat, certains patients développent des lésions cérébrales sévères tandis que d'autres sont épargnés, indiquant l'existence de facteurs de vulnérabilité encore non identifiés. Ce projet apportera : à court terme, une caractérisation de l'interaction entre stress psychosocial et hypertension sur le système neurovasculaire cérébral, avec identification de régions cérébrales particulièrement sensibles et de marqueurs biologiques permettant de distinguer les cerveaux qui résistent au stress de ceux qui y sont plus vulnérables ; à moyen terme, des indicateurs précoces (imagerie, marqueurs biologiques) permettant d'estimer le risque individuel de déclin cognitif lié à l'hypertension ; à long terme, de nouvelles pistes thérapeutiques personnalisées pour la prévention du déclin cognitif, intégrant la dimension du stress psychosocial dans la prise en charge de l'hypertension artérielle. Les résultats négatifs seront valorisés par publication dans des revues à comité de lecture.

Procédures

Ce projet utilise des souris réparties en quatre expériences sur 5 ans. Dans toutes les expériences, certaines souris sont soumises pendant 4 semaines à un protocole de stress modéré (changements d'environnement, bruits, perturbations lumineuses, sans douleur) et/ou subissent une chirurgie d'environ 5 minutes sous anesthésie gazeuse pour l'installation d'une petite pompe sous la peau délivrant une substance augmentant modérément la pression artérielle. Première expérience : mesure du flux sanguin cérébral par imagerie non invasive sous anesthésie, à trois reprises sur 4 semaines (environ 25 minutes par session). Deuxième expérience : chirurgie sous anesthésie pour implanter un dispositif d'imagerie miniaturisé dans le cerveau (environ 1 heure), puis enregistrements chez l'animal éveillé à trois reprises sur 4 semaines (environ 1h10 par session pour la moitié des animaux ; environ 45 minutes par session, incluant un test de mémoire de courte durée, pour l'autre moitié). Troisième expérience : tests de mémoire et de comportement ne causant aucune douleur, réalisés à deux reprises (environ 20 à 40 minutes par session selon le test), suivis de l'analyse des vaisseaux cérébraux après euthanasie. Quatrième expérience : après euthanasie sous anesthésie profonde, les cerveaux sont prélevés pour des analyses au microscope et des analyses des gènes actifs dans les vaisseaux.

Impact sur les animaux

Le stress chronique peut entraîner une légère diminution de la prise alimentaire, une altération de l'état du pelage et une réduction de l'activité. Ces effets sont transitoires et de faible intensité. La chirurgie d'implantation de la pompe et celle du dispositif d'imagerie peuvent occasionner une douleur modérée, prévenue et traitée par des médicaments antidouleur. L'hypertension modérée est généralement sans symptôme. De rares complications graves peuvent survenir, entraînant la mise à mort immédiate de l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. La mise à mort est nécessaire pour le prélèvement du cerveau, seul organe étudié dans ce projet.

Remplacement

Le stress psychosocial chronique induit des modifications hormonales, comportementales et vasculaires systémiques non reproductibles en dehors d'un organisme vivant. L'étude de l'interaction entre stress et hypertension sur le cerveau nécessite un réseau vasculaire fonctionnel dans son environnement naturel. L'imagerie cérébrale avancée et les tests cognitifs nécessitent un animal vivant intact. Aucun modèle cellulaire ou informatique ne peut reproduire cette complexité. Des études complémentaires sur cellules en culture seront néanmoins réalisées pour valider certains mécanismes

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé pour garantir une analyse fiable avec le minimum nécessaire. Les expérimentations les plus lourdes (imagerie fonctionnelle et imagerie cellulaire) sont réalisées uniquement chez les femelles, population la plus à risque d'après les données épidémiologiques ; les résultats clés sont ensuite vérifiés chez les mâles (tests comportementaux et analyses tissulaires), ce qui évite de répéter l'ensemble du protocole d'imagerie dans les deux sexes. L'imagerie et les tests comportementaux sont longitudinaux (mêmes animaux suivis dans le temps).

Raffinement

Toutes les chirurgies sont réalisées sous anesthésie gazeuse avec médicaments antidouleur avant et après l’intervention. Les animaux sont acclimatés à la salle d’expérimentation et habitués à la manipulation avant le début des protocoles. Pour l’imagerie par miniscope, les animaux sont progressivement habitués au port du dispositif. Le stress utilise exclusivement des facteurs de faible intensité, sans douleur. Un suivi quotidien de l’état de santé est assuré, avec une surveillance accrue en période post-chirurgicale. Une grille de score et un arbre décisionnel définissent les soins conservatoires (antidouleur, nourriture enrichie, surveillance renforcée) et les critères de mise à mort en cas de souffrance.

Choix des espèces

La souris a été choisie car cette espèce permet de combiner stress chronique et hypertension dans un modèle intégré, avec des outils d’imagerie cérébrale avancés. La souche utilisée présente une sensibilité particulière aux lésions des petits vaisseaux cérébraux sous hypertension modérée, reproduisant les atteintes observées chez l’homme. Les souris seront utilisées au stade adulte (12 semaines) car le projet étudie des mécanismes pathologiques adultes et que la maturation vasculaire cérébrale est complète à ce stade.

7 806 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Réparties en sept lots, elles reçoivent une injection de cellules tumorales sous anesthésie, puis des injections quotidiennes dans l'abdomen quatre jours par semaine pendant deux à trois semaines, un lot étant d'abord irradié sept minutes trente avant de recevoir une greffe de moelle osseuse. Le porteur affirme que les traitements ne sont pas toxiques et ne provoquent pas d'effets indésirables, et écrit que le raffinement de ces protocoles ne fait pas appel à des antalgiques mais à un suivi rapproché, alors qu'il signale une nécrose possible de la tumeur en fin d'expérience, et une diarrhée avec perte de poids pendant quelques semaines après l'irradiation. Sur les 7 806 souris demandées, la rubrique consacrée à la réduction n'avance aucun calcul d'effectif, seulement le principe de couper chaque tumeur en deux échantillons et d'arrêter une étape si la précédente ne donne rien.

Objectifs

Les cellules dendritiques sont les sentinelles du système immunitaire. Elles patrouillent dans les tissus qu’elles échantillonnent à la recherche de signaux de danger (infection, tumeur), et sonnent l’alerte en activant dans les ganglions lymphatiques les lymphocytes T spécifiques de l’origine du danger. La mise en place d’une réponse des lymphocytes T est essentielle à la lutte contre les tumeurs, Une réponse immunitaire efficace et les stratégies actuelles d’immunothérapies visant à augmenter la réponse T reposent donc sur deux fonctions essentielles des cellules dendritiques : la migration et l’échantillonnage. Nous avons identifié une protéine qui est naturellement activée par les signaux de danger dans les cellules dendritiques au cours d’une réponse immunitaire, et qui augmente leur migration in vitro et in vivo. Cette protéine peut être activée chimiquement par des molécules spécifiques. Nos résultats préliminaires utilisant l’activateur « A1 » de cette protéine ont montré que A1 stimule la migration des cellules dendritiques in vitro sans affecter les fonctions d’échantillonnage, qu’A1 n’est pas toxique in vivo, et que l’utilisation de A1 permet d’augmenter la sensibilité de certaines tumeurs aux traitements par inhibiteur de points de contrôle (thérapies qui stimulent le système immunitaire afin d'éliminer la tumeur). . Ce projet a pour objectif d’évaluer le potentiel thérapeutique de l’activateur A1, sur la réponse immunitaire anti-cancéreuse, seul ou en combinaison avec des inhibiteurs de points de contrôle, et ce dans différents modèles tumoraux.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de déterminer si la molécule A1 peut être utilisée pour améliorer la réponse aux traitements d'immunothérapie dans les tumeurs solides qui ne répondent actuellement pas ou peu à ces traitements. Cela permettra aussi de mieux comprendre les mécanismes immunitaires déterminants dans la réponse ou la non-réponse à ce type de traitements, et ouvrira de nouvelles perspectives thérapeutiques.

Procédures

Dans un premier lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois – durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront ensuite traités par des injections dans l’abdomen à raison d’une injection/jour, 4 fois/semaine pendant 3 semaines au maximum. Dans un second lot, des souris vigiles seront irradiées pendant 7min30. Les souris seront anesthésiées pour recevoir une injection de cellules de moelle osseuse (1 fois – durée anesthésie inf 5 min). Des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois au– durée anesthésie inf 5 min) Puis les animaux seront traités par des injections dans l’abdomen à raison d’une injection/jour, 4 fois/semaine pendant 2 semaines. Dans un 3ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront traités par des injections dans l’abdomen à raison d’une injection/jour pendant 2 jours. Un prélèvement de sang par la sera effectué juste avant la mise à mort des souris. Dans un 4ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Des cellules fluorescentes seront injectés aux animaux anesthésiés (1 fois – durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront ensuite traités par une injection dans l’abdomen. Dans un 5ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Des cellules seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront ensuite traités par une injection dans l’abdomen. Dans un 6ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Des cellules seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois– durée anesthésie

Impact sur les animaux

Les effets indésirables observés sont ceux liés au développement de tumeurs en sous-cutanée sur le flanc des animaux. Etant donné que nos observations se font à des temps précoces de la croissance tumorale, la taille de la tumeur reste modérée et ne gêne pas les déplacements de l’animal. Une nécrose peut apparaitre sur la tumeur en fin d’expérience. L'irradiation peut provoquer une diarrhée et une perte de poids chez les souris pendant quelques semaines. Les différents traitements sont non toxiques et ne provoquent pas d'effets indésirables chez les souris. Leur administration entrainera une légère douleur de courte durée liée à la piqûre elle-même.

Devenir

Dans toues les procédures, les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Nos résultats in vitro ont démontré le potentiel du composé A1 pour stimuler la migration des cellules dendritiques, et nous ont permis de comprendre les mécanismes moléculaires associés. Pour analyser les effets sur la réponse immunitaire anti-tumorale de ce composé, rien ne peut remplacer un modèle animal où les cellules sont confrontées à leur environnement physiologique. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour le présent projet. Pour évaluer la migration dans un tissu, entre deux tissus (par exemple la tumeur et les ganglions), et les effets sur la croissance tumorale et sur la réponse immunitaire, il est à ce stade du projet indispensable de réaliser des expériences in vivo chez la souris.

Réduction

Chaque tumeur sera coupée en 2 échantillons afin de réaliser plusieurs analyses (imagerie et cytométrie) sur la même tumeur pour permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés. Notre projet est basé sur une suite d’étapes expérimentales dont les résultats conditionnent le passage à l’étape suivante. Nous ne procéderons à l'étude de la manière dont la réponse immunitaire est précisément affectée par le traitement que dans le groupe de souris traitées pour lesquelles nous observons un effet positif du traitement sur la croissance de la tumeur. Les résultats seront analysés par des approches statistiques.

Raffinement

En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de la cancérologie, les animaux sont suivis attentivement tous les deux jours (poids, aspect et comportement). En effet, conformément aux guides de la Commission Européenne et aux recommandations internationales en cancérologie expérimentale, le raffinement de ces modèles ne fait pas appel à des antalgiques mais à un suivi rapproché pour déterminer des points d’arrêt les plus précoces possibles. Une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux et de mettre en place des points-limite adaptés. L’atteinte d’un point-limite conduira à la mise en place de soins de support voire à la mise à mort de l’animal si la souffrance ne peut être soulagée. Du gel nutritif et hydratant sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire, et limiter la perte de poids et la déshydratation qui peuvent être causés lors de l’irradiation. Un apport de fluide injectable sera également assuré pour en cas de déshydratation. Les gestes nécessitant une immobilisation de l’animal seront effectués sous anesthésie générale.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les études en immunologie anti-cancéreuse, de par la proximité de son système immunitaire avec le système immunitaire humain. C’est également dans ce modèle murin que nous avons à notre disposition les modèles génétiques indispensables à ce projet (souris déficientes pour la protéine d’intérêt, cible de A1). Stade adulte entre 8 et 24 semaines Nous souhaitons travailler sur un système immunitaire adulte.