Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Impact de la croissance sur l’élimination de différents polluants industriels et agricoles chez le jeune mouton contaminé
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
5 jeunes moutons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent des polluants industriels et agricoles par cathéter, puis subissent une dizaine de prélèvements de sang étalés sur cent jours et le port de couches pour recueillir leurs fèces. Le porteur affirme que la dose reste sous le seuil de toxicité et ne retient que le stress de la contention et des prélèvements. Il présente l'étude in vivo comme un préalable à des modèles informatiques censés à terme remplacer une partie de l'expérimentation.
Objectifs
Certains territoires métropolitains ou Antillais sont durablement contaminés par des polluants persistants. Sur ces territoires, la production de denrées alimentaire comme l’élevage, pose un risque sanitaire pour la population. Afin de proposer des stratégies d'élevage (conditions et temps d'attente) permettant une diminution de la concentration de polluants dans la viande, c'est à dire une décontamination des animaux permettant la production de denrées saines en zone contaminée, de nouveaux modèles informatiques sont aujourd’hui développés pour prédire les temps de décontamination nécessaires. Ces modèles sont des modèles toxicocinétiques à compartiments basés sur la physiologie (modèle PBPK). Ces modèles permettront également à moyen terme de remplacer une partie de l’expérimentation animale par une prédiction in silico (par informatique). En attendant, le paramétrage de ces modèles nécessite l’obtention de données telle que la capacité de l’animal à éliminer la molécule ou encore la distribution de la molécule dans l’organisme. La présente demande vise à obtenir ces données de paramétrage chez l’agneau pour différents polluants et à les comparer aux données de la littérature obtenues chez le mouton adulte afin de mieux comprendre l’effet âge dans le comportement des molécules au sein de l’organisme et ainsi affiner le modèle.
Bénéfices attendus
Ces résultats permettront l'acquisition de connaissances sur l'élimination de polluants chez l'ovin en croissance, ce qui permettra d'obtenir des paramètres nécessaires pour développer un modèle toxicocinétique à compartiments basé sur la physiologie (PBPK), simulant le transfert de ces polluants chez cet animal. Ce modèle prédira le temps minimal de décontamination des animaux d'élevage dans l’objectif de garantir la production de denrées animales saines dans des territoires contaminés.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 types d'interventions : 1- La pose de cathéter et l'injection des polluants sur animaux vigiles. 2- Le prélèvements de sang sur animaux vigiles les jours 1, 3, 7, 15, 29, 44, 57, 71, 84 et 100. 3- La pose de couches en tissu et la récolte de fèces toutes les 4 heures durant 24 h le premier jour puis durant douze heures les jours 3, 7, 15, 29, 44, 57, 71, 84 et 100.
Impact sur les animaux
Les quatre nuisances et stress identifiés sont : Le stress lié 1°) à la manipulation et la contention lors des différents prélèvements et 2°) à la douleur (celle d’une piqûre par une aiguille) suite à la pose de cathéter sur animal vigile ou ponction par aiguilles pour les prélèvements sanguins. 3°) Le stress lié à la perte de volume sanguin lors des prélèvements. 4°) Le stress lié à l’utilisation de couches en tissu positionnées entre le bassin et les jarrets pour le prélèvement des fèces. En revanche, la dose de contaminant employée est calculée pour être largement en deçà des seuils de toxicité. Elle n'entrainera donc pas d'effet toxique.
Devenir
Les animaux sont mis à mort. Cela permettra de prélever différents tissus afin de les analyser et d'obtenir des données sur les concentrations des différentes molécules étudiées et d'avoir ainsi des données sur la distribution de ces molécules au sein de le l'organisme du jeune ovin en croissance.
Remplacement
La contamination (et décontamination) des ovins par les polluants est un champ d’étude qui est encore peu renseigné aujourd’hui et dont l’approche est rendue complexe en raison des spécificités de la physiologie des ruminants et des pratiques d’élevage mises en œuvre. Ces interactions « ruminants-polluants » doivent être abordées in vivo dans la mesure où (i) nous ne connaissons pas les paramètres toxicocinétiques des molécules indiquées chez l'ovin en croissance (ii) nous ne disposons pas de modèle in vitro ou ex-vivo ou in silico validé chez l'ovin en croissance et (iii) il n’existe pas à ce jour de modèle mathématique adéquat permettant de simuler le devenir des contaminants dans l’organisme chez ce type d'animal. Cependant, les résultats de ce projet permettront de collecter des données pour la création d’un modèle de transfert de chlordécone chez les ruminants en croissance, ce qui permettra à termes de remplacer l’utilisation d’animaux dans ce type d’étude.
Réduction
Nous réduirons le nombre d'animaux en expérimentation sur la base de (i) la répétabilité des mesures analytiques dans le domaine de l'analyse des polluants, (ii) l'expérience antérieure de l'équipe de recherche en terme d'écart type résiduels prévisibles pour les petits ruminants, et (iii) la prédictibilité du modèle basé sur la physiologie (modèle PBPK) précédemment développé chez l'ovin adulte. Cinq animaux (répétition) peuvent donc être considérés comme un nombre minimum mais néanmoins suffisant.
Raffinement
Nous limiterons les interventions sur les animaux à des prises de sang (au début par cathéter puis par aiguilles+vacutainer) de volumes limité et des poses ponctuelles de couches pour la récupération de fèces sur des périodes de 24h. Les animaux, ayant un comportement social, seront hébergés en groupe de 2 ou 3 par boxes, dans une même pièce. Ils pourront donc se voir, se sentir et s'entendre. Des filets de foin seront positionnés dans les boxes pour favoriser la recherche de nourriture et enrichir le milieu. . Les animaux seront habitués à la présence quotidienne des expérimentateurs pour développer une relation sociale routinière avec l’homme, et entrainés progressivement au port des couches.
Choix des espèces
Ce projet concerne uniquement l’espèce ovine (jeune ovin en croissance), pour laquelle aucune information n’est disponible en termes de devenir de la chlordécone et autres polluants dans l’organisme en croissance. Cependant cette espèce, très présente aux Antilles est largement consommée par la population locale d'où l'intérêt de l'étudier. Nous pouvons également noter qu'un modèle basé sur la physiologie (modèle PBPK) a déjà été développé chez l'ovin adulte, il est donc intéressant et opportun de l'étendre à l'ovin en croissance. De plus l'ovin, espèce compatible avec les structures d'hébergement prévus, pourra plus généralement servir d'espèce modèle pour recueillir les données toxicocinétiques concernant les molécules étudiées chez le jeune ruminant en croissance. Dans le cadre de cette expérimentation, afin de s’assurer du bien-être des animaux, les ovins seront en effet hébergés dans des conditions respectant les recommandations indiquées dans la directive 2010/63/UE. Le projet met en œuvre des animaux en croissance, fraichement sevrés. Ils auront tous le même âge et leur poids sera compris entre 25 kg +/- 2kg.
Creation d’un modèle murin des affections neurosensorielles et étude d’une thérapie
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvements histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses d'une mutation reproduisant une neuropathie humaine, elles développent des déficits auditifs et visuels, et subissent des mesures de l'audition et de la vision sous anesthésie générale avec pose d'électrodes sous-cutanées et cornéennes, puis un traitement par gavage. Le porteur indique que la privation sensorielle perturbe leurs interactions avec l'environnement et génère du stress. Il teste une molécule censée restaurer la régulation du fer, présentée comme préalable à un essai clinique chez les patients.
Objectifs
Le projet a pour objectif d’étudier l’efficacité d’un traitement médicamenteux dans la récupération ou la stabilisation des fonctions auditives et optiques dans un modèle animal présentant ces atteintes neurosensorielles causées par des mutations du gène étudié. Il s’agit d’un gène découvert chez l’Homme dans un contexte de neuropathie auditive et optique débutant à l’adolescence et s’aggravant rapidement pour entrainer une cécité quasi-complète ainsi qu’un déficit auditif profond. La protéine qui est codée par ce gène présente un rôle important dans la synthèse de protéines régulant le fer intracellulaire (protéines à centre fer-soufre). Les études cellulaires ont montré que les mutations du gène entrainent une surcharge de fer dans la cellule. Les défauts de synthèse des acteurs de la régulation du fer, dont les protéines fer-soufre, sont à l’origine de cela. Il a été démontré dans ces cellules que la molécule A permet de restaurer la régulation du fer lorsque ces acteurs manquent. Or, nous ne savons pas si cela peut se traduire par la restauration des fonctions auditives et/ou optiques chez les patients. L’étude du modèle murin permettra donc, d’une part de comprendre les mécanismes physiopathologiques sous-jacents à la mutation du gène, en étudiant d'une part, les modifications des structures de l'oreille interne et de la rétine, et d'autre part, l’efficacité de la molécule A dans la récupération des fonctions sensorielles.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de comprendre les mécanismes in situ des atteintes neurosensorielles (auditive et oculaire) chez les patients portant une mutation. Nous serons capables d’étudier l’évolution de ces atteintes neurosensorielles chez la souris qui présente un développement plus rapide que l’Homme, cela nous permettra d’avoir une idée du pronostic. Nous analyserons la morphologie des cellules ciliées et du nerf auditif, ainsi que les éléments permettant la neurotransmission au niveau de la synapse. De même, une étude parallèle des cellules de la rétine, ainsi que du nerf optique, sera effectuée de la même manière. Ces éléments permettront de comprendre les mécanismes physiopathologiques de ces atteintes. Le traitement des souris par la molécule A permettra d’avoir des éléments de réponses pour juger de son efficacité dans la préservation ou la récupération des fonctions auditives et optiques.L’efficacité chez la souris permettra de mettre en place un protocole de traitement des patients durant un essai clinique.
Procédures
Nous étudierons cette lignée à différentes étapes de son développement en mesurant les fonctions auditive et oculaire. La fonction auditive sera évaluée par la mesure des potentiels évoqués auditifs ainsi que des otoémissions acoustiques provoquées via le recueil des produits de distorsions. Ces mesures dureront environ 30 à 45mn. La fonction oculaire sera étudiée par l’électrorétinogramme (environ 15mn) Les enregistrements des fonctions oculaires et auditives seront réalisés après anesthésie générale (injection intrapéritonéale d’un mélange kétamine 100mg/Kg, et xylazine 10mg/Kg) Le traitement sera administré sous forme liquide par gavage oral une fois par jour chez des souris vigiles qui seront surveillées dans les minutes qui suivent afin de s'assurer de l'absence de fausse route.
Impact sur les animaux
Les souris étudiées seront atteintes de déficit auditifs et visuels, ces atteintes entraineront une perturbation leurs interactions avec l’environnement du fait de la privation sensorielle, ainsi que des modifications de leurs comportements liées au stress que cela va entrainer. Les explorations fonctionnelles auditives et optiques nécessiteront une anesthésie générale des souris par ketamine et xylazine afin de limiter au maximum la douleur liée à la mise en place d’électrode sous-cutanée permettant de recueillir les potentiels évoqués auditifs durant les stimulations auditives. Durant cette même anesthésie générale, l’implantation d’une électrode de recueil cornéenne associée à des stimulations lumineuses permettront de réaliser l’electrorétinogramme.
Devenir
Toutes les souris utilisées pour cette étude seront mises à mort à la fin de chaque procédure afin d'obtenir les prélèvements histologiques pour analyser post mortem
Remplacement
L'utilisation de cellules en culture (fibroblastes) permettra d’effectuer les premières analyses fonctionnelles pour caractériser l'impact des mutations et pour évaluer l'efficacité de la molécule A in vitro dans les fibroblastes de patients. Dans un deuxième temps, dans le cadre de développement thérapeutique, il sera indispensable d’utiliser un modèle animal afin de tester l'efficacité de la molécule in vivo, avant que son utilisation ne soit envisagée chez l’homme.
Réduction
Afin de Réduire le nombre d'animaux utilisés, la procédure d'enregistrement de l'électrorétinogramme et des potentiels évoqués auditifs et les Otoemissions acoustiques par produits de distorsions seront standardisée sur les deux yeux et sur les deux oreilles respectivement. De plus, les mêmes animaux seront utilisés pour réaliser les études fonctionnelles (électrorétinogramme,des potentiels évoqués auditifs et les Otoemissions acoustiques par produits de distorsions) et les analyses histologiques.Les explorations fonctionnelles serons réalisées à chaque stade de développements chez 10 souris dans chaque groupe (mutantes et témoins) avant la mise à mort de celles-ci. Le nombre de 10 animaux par condition par groupe sera suffisant pour obtenir des résultats statistiquement exploitables.
Raffinement
Les enregistrements de la fonction visuelle par électrorétinogramme ainsi que la fonctionne auditive par potentiels évoqués auditifs et les Otoemissions acoustiques par produits de distorsions seront réalisés sous anesthésie générale pour éviter toute souffrance et éviter que les animaux bougent. Les procédures mises en place pour réaliser le projet sont peu traumatiques, de courte durée, elles peuvent néanmoins engendrer du stress. Les animaux seront surveillés quotidiennement, des antalgiques seront administrés en cas de douleur et des points-limites seront établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.
Choix des espèces
Le globe oculaire et l'oreille de la souris présentent des structures similaires à celles de l’humain et représentent donc des modèles adaptés pour les études physiopathologiques. De plus, les neuropathies optiques et auditives sont des pathologies pour lesquelles il est difficile de récupérer du matériel biologique adapté chez l’humain (énucléation ou pétrectomie inenvisageables), et donc de réaliser une étude scientifique fondamentale précise du tissu d'intérêt. Enfin, pour tester l’efficacité d'une molécule in vivo dans le cadre d'un développement thérapeutique, il est indispensable d’utiliser un modèle animal. Le modèle murin présente également l'avantage d'une reproduction relativement rapide compte tenu de la durée d’ovulation et de gestation de la souris. Pour toutes ces raisons, nous avons considéré le modèle murin comme étant le plus adapté pour l’étude de ces affections neurosensorielles.
Étude des fonctions de modifications du squelette cellulaire et leur implication dans les pathologies
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
5 209 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse de leurs organes, dans des procédures relevant de la gravité sévère ou menées sous anesthésie sans réveil. Une partie ne subit qu'un suivi de son état clinique, d'autres une ouverture du thorax sous anesthésie profonde sans reprise de conscience, pour étudier la régulation du squelette des cellules. Le porteur signale qu'une souche présente une ataxie et que l'état des nouvelles lignées créées reste inconnu à l'avance. Il justifie l'usage de la souris par l'étude de ces mécanismes au niveau de l'"organisme entier".
Objectifs
Ce projet a pour but d’analyser les rôles et les fonctions de différents aspects de la régulation du squelette cellulaire (cytosquelette): d’un côté ses composantes propres, de l’autre les éléments qui interagissent avec lui, au niveau de l’organisme entier, la souris. Le cytosquelette étant impliqué dans de nombreuses fonctions cellulaires, sa régulation est susceptible d’avoir des effets sur de nombreux processus cellulaires, qui, perturbées, pourrait avoir des répercussions sur la bonne survie de l’organisme entier. Ainsi, comprendre la régulation du cytosquelette et pouvoir l’influencer, permettra d’élucider son impact sur le maintien de la survie cellulaire et, comment sa dérégulation participe au développement de maladies. A terme, ce projet permettra de développer les moyens de dépistage et de nouvelles thérapies ciblant les maladies reliées à la dérégulation du cytosquelette. Le cytosquelette est présent dans toutes les cellules, ou il exerce des rôles très divers : il donne aux cellules leur forme, participe au mouvement des cellules et au transport intracellulaire, rend possible la division cellulaire et le déplacement de spermatozoïdes lors de la fécondation. Le cytosquelette interagit avec de nombreuses protéines qui contrôlent ses fonctions. Une des hypothèses suggère que le choix des éléments utilisés pour construire le squelette cellulaire et les modification de ces éléments constituent un code, qui définit ses propriétés et influence les interactions avec les autres protéines spécifiant ainsi ses fonctions. Le présent projet est une continuation d’un projet précèdent, qui a permis de démontrer le rôle essentiel de la régulation du cytosquelette dans la survie des neurones et dans la fertilité. Nous proposons maintenant d’étendre notre analyse à d’autres modèles murins de ce code de cytosquelette.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre les rôles des mécanismes de régulation du cytosquelette. Étant donné que le cytosquelette a des fonctions essentielles dans toutes les cellules, cela suggère que sa régulation pourrait être impliquée dans le développement normal de l’organisme. Inversement, les défauts de cette régulation pourraient être à l’origine de maladies telles que les neurodégénérescence, cancer ou infertilité. Cette étude vise à éclaircir le mode d’action de ces mécanismes de régulation du cytosquelette et de développer les moyens de dépistage et les traitements des pathologies liées à sa dérégulation.
Procédures
Les animaux sont soumis à une analyse phénotypique (analyse de l’état clinique des animaux) pendant leur vie mais ne subiront aucune intervention. A différents âges, les animaux seront anesthésiés et ensuite mis à mort pour fixation de leurs organes.
Impact sur les animaux
Une des souches murines utilisée dans ce projet a été décrite comme ataxique, c'est à dire qui présente des problèmes de coordination de mouvements. Pour les nouveaux modèles qui seront générés dans le cadre de cette étude, la condition des animaux n’est pas connue à l’avance. Les nuisances subies par les animaux seront celles liées à une thoracotomie sous anesthésie générale profonde. Les nuisances s'arrêteront en fin de chirurgie (procédure sans réveil).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyses de leurs organes
Remplacement
Après les premières étapes d'analyse des enzymes, impliquant la culture cellulaire (expression d’enzymes dans les lignées cellulaires et observation de leurs activités), le projet a pour but maintenant de comprendre la fonction de ces enzymes et leur mécanisme d’action au niveau de l'organisme vivant intégré et autonome, la souris.
Réduction
Les animaux générés lors de ce projet seront utilisés à la fois pour l’analyse phénotypique et pour l'analyse de leurs organes, permettant de réduire le nombre total d’animaux. Le nombre d’animaux nécessaires à la bonne exécution de ce projet sera suffisant pour obtenir les résultats statistiquement significatifs. Les croisements seront optimisés pour produire les animaux d'intérêt. Les animaux contrôles proviendront des mêmes portées que les animaux d’intérêt.
Raffinement
Les animaux seront surveillés deux fois par semaine minimum. Tout signe de mal-être, tel que la perte de poids, blessure, mauvaises relations sociales sera détecté et l‘animal sera soigné et soit isolé, soit mis à mort. Les soins peuvent inclure l’application d’une crème désinfectante (blessure) ou d’un complément nutritif (perte de poids). Une grille de score est mise en place pour le suivi clinique des animaux.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en biologie du développement, de cancer et de la neurodégénérescence. Les modèles génétiquement modifiés des éléments de cytosquelette, protéines interagissant avec le cytosquelette et les enzymes impliquées dans la régulation du cytosquelette permettent de définir leurs rôles dans ces différentes maladies. Du fait de la parenté biologique avec l’Homme, les modèles murins sont d’excellents modèles de différentes pathologies. Les analyses seront effectuées à 6 différents âges : nouveau-né, 1 mois (animal jeune), 4 mois (animal adulte), 12 mois (animal âgé) et 18 et 24 mois (animaux très âgés). En effet, les niveaux de modifications changent au cours du développement de l’organisme. De plus, certains mutants devront être analysés très âgés, vu que l’on veut observer la dégénérescence liée à l’âge chez ces animaux. Les analyses de certaines lignées (à phénotype non-dommageable uniquement) nécessiteront la génération d’embryons au stade embryonnaire E14.5 ou E17.5 (soit 14,5 jours-post fécondation ou 17,5 jours post-fécondation) E14.5 ou E17.5. En effet à partir d’embryons de ces âges (en jour post-fécondation) il est possible de cultiver les cellules primaires nécessaires pour l’étude de mécanismes cellulaires impliqués.
Étude de la circulation des cellules ILC2s au cours de l’inflammation de type 2.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système respiratoire
176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont jointes chirurgicalement deux par deux par parabiose, opération d'environ 45 minutes créant une circulation sanguine commune, puis reçoivent des injections et des prélèvements de sang au sinus rétro-orbital sous anesthésie. Le porteur décrit un protocole "parfaitement maîtrisé" et une "absence de signes quantifiables de souffrance". Il étudie la circulation de cellules immunitaires liées à l'asthme et renvoie les applications thérapeutiques au long terme.
Objectifs
Le système immunitaire permet de se défendre contre les agressions des pathogènes, mais sa dérégulation est aussi impliquée dans le développement diverses maladies telles que l’asthme. Le système immunitaire est partagé en deux grandes parties : la partie innée, préexistante, et reconnaissant des caractéristiques partagées entre différents pathogènes, et la partie adaptative, qui comme son nom l’indique s’adapte en fonction du pathogène rencontré, par des jeux de sélection et de prolifération de cellules extrêmement spécifiques du pathogène en question. Les cellules innées de groupe 2 (ILC2s) sont des lymphocytes innés résidents des tissus (poumons/intestin). Elles participent à la défense contre les parasitique, à la réparation tissulaire mais aussi aux processus physiopathologiques comme l’asthme. Les ILC2 se développent dans la moelle osseuse puis se maintiennent à long terme dans les tissus, avec la capacité de proliférer et répondre in situ en cas d’inflammation. Des résultats récents indiquent cependant qu’il existe des sous-populations ILC2s circulantes stimulées par l’inflammation et impliquées dans le maintien de l’intégrité d’un tissu, selon un axe intestin-poumon et/ou axe moelle osseuse-poumon. La fonction de ces ILC2s est encore peu connue (inflammation/régénération). Seules des expériences de parabioses peuvent permettre dans un même tissu de différencier les cellules ILC2s circulantes du sous-groupe des cellules résidentes. Les objectifs du projet sont donc 1- de déterminer les situations inflammatoires qui aboutissent à une circulation d’ILC2 2- comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans cette circulation 3- déterminer le stade de développement auquel les ILC2s circulent (progéniteur ou cellule mature) 4- déterminer l’importance physiologique de ce recrutement sur la situation inflammatoire et la régénération tissulaire. Cliniquement, il est important de comprendre ces processus car dans les cas d’allergies et asthme, la présence d’ILC2 en circulation corrèle avec une évolution défavorable ; déterminer leur rôle et mode de migration nous permettra d’envisager de bloquer leur migration chez les patients à risque.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet scientifique permettra de comprendre ce qui régit la circulation des ILC2 en détaillant les mécanismes moléculaires mis en jeu par cette population pour se propager dans les tissus en inflammation. Le mode de circulation de populations cellulaires initialement considérées comme résidentes est encore peu compris mais des données préliminaires indiquent que leur rôle serait crucial pour obtenir une réponse adaptée du tissu. A long terme, ces données moléculaires de la circulation de sous-populations d’ILC2s pourrait représenter une source importante de moyen d’actions supplémentaires pour lutter contre les crises d’asthme ou d’allergies non résolues par les corticoïdes. Ces cas sont nombreux et en constante augmentation au vu du nombre croissant d’allergies dans le monde. Il est clairement établi que ces ILC2 seraient « trop » inflammatoires dans le cas d’inflammation chronique de type 2 et donc qu’un moyen d’empêcher la mise en place d’un recrutement constant de cellules supplémentaires dans les voies aériennes des patients pourraient représenter une chance thérapeutique de deuxième intention.
Procédures
• Chirurgie de parabiose : 1 chirurgie par animal, environ 45 minutes d’anesthésie générale • Prélèvements de sang au sinus rétroorbital sous anesthésie, 1 fois 5 minutes. Si le chimérisme n’est pas effectif, les animaux pourront être prélévés de la même manière à 4 semaines et à 6 semaines • Des injections de molécules non toxiques seront réalisées dans l'abdomen des animaux anesthésiés à raison de 3 à 7 fois sur une semaine. Des administrations de molécules non toxiques seront réalisées en intranasale sur des animaux anesthésiés à raison de 2 à 3 fois. Pour ces interventions les anesthésies sont de l’ordre de 5 minutes.
Impact sur les animaux
Le protocole de parabiose est parfaitement maîtrisé dans notre laboratoire tant au niveau réalisation qu'au niveau de la gestion de l'analgésie pré et postopératoire avec une absence de signes quantifiables de souffrance animale, sans réduction de la mobilité. Injections de cytokines et d’anticorps antagonistes. Toutes les injections sont réalisées par voie intrapéritonéale ou intranasale après anesthésie des animaux en utilisant l’isoflurane, le dépôt dans la première narine est réalisé en sortant la souris une minute de la chambre à induction suivi d’un retour et du dépôt dans la seconde narine de façon identique. Ces injections n’induisent pas de douleur perceptible chez les animaux traités (pas de perte de poids, pas de changement de comportement alimentaire, pas de perturbation du comportement social ou nerveux (mobilité, interactions, agressivité ou prostration).
Devenir
les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Aucune data préliminaire in vitro ne peut être réalisée pour motiver cette étude de circulation. La présence d’une fréquence de cellules ILC2s non négligeable dans le sang de patients asthmatiques contrairement aux contrôles sains est une motivation importante pour décider de comprendre ce qui génère des cellules circulantes à partir de populations résidentes et le mécanisme de circulation mis en place. La circulation des populations immunes à travers les différents organes est très contrôlée. Les cellules passent par une circulation sanguine et lymphatique qui sont des environnements complexes et impossible à mimer sur des tests in vitro. Afin de pouvoir conclure sur des fonctions différentielles de nos cellules circulantes versus celles résidentes et de comprendre les mécanismes moléculaires en jeu, les expériences in vivo sont absolument essentielles et aucun système in vitro n’existe pour obtenir des résultats préalables.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires, l'étude des mécanismes moléculaires (anticorps bloquants) ne sera réalisée que si le taux circulation des ILC2s est significativement différent entre les conditions testées. De plus, les données de la littérature et celles déjà générées au laboratoire nous permettent de limiter le nombre d’hypothèses à tester. Enfin, le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Seulement dans les conditions adéquates où l'augmentation du taux circulant des ILC2s est validé, une étude du blocage des molécules de circulation se fera par l’injection des anticorps bloquants. Nous vérifierons ainsi en étudiant le tissu cible si les populations ILC2s bloquées avaient plutôt un effet inflammatoire ou réparateur. Appliquer les bloquants uniquement dans le cas d’une circulation statistiquement signifiante permet de réduire les effectifs requis et visera à réduire le nombre de souris nécessaires pour maintenir une interprétation biologique robuste.
Raffinement
Les animaux seront manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences afin de les habituer et de limiter leurs stress. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement lors de la première semaine post-chirurgie, puis deux à trois fois par semaine afin d’assurer leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress. Une grille de score a été établie afin d’évaluer régulièrement la souffrance des souris, et des points limites ont été définis. Une fiche d’observation tout au long des procédures permettra de vérifier leur état (pelage, poids, respiration, mobilité…) et des scores seront tenus afin de vérifier que le traitement n’induit pas de modifications des habitudes et du bien-être animal. En cas de changement des scores, des points limites sont établis (perte de poids rapide, modification aspect pelage/alopécie, déshydratation, changement de consistance/couleur des selles) et le suivi rapproché des animaux permettra de définir s’il est nécessaire de - diminuer la dose et/ou d’administrer des antalgiques selon la gravité des changements de comportement. Ces conditions s’appliquent à toutes les procédures.
Choix des espèces
Une circulation d’ILC2s chez l’homme est corrélée à la sévérité des allergies/crises d’asthme. La souris est un modèle de choix par la forte similitude des systèmes immunitaires humains/murins. Elles sont les plus facilement manipulables (chirurgie ici et génétiquement modifiées) pour comprendre la circulation (système sanguin/lymphatique et production des cellules immunes). Nous avons besoin de travailler avec différents types de souris depuis longtemps utilisées dans les laboratoires et qui ne présentent pas de signe de souffrance. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (6 à 10 semaines après la naissance, afin d’avoir un système immunitaire mature). Nous n’attendons pas d’effet lié à l’âge des souris. Cependant, des animaux plus âgés ont aussi une peau plus épaisse. Nous éviterons donc de les utiliser.
Effets cardiovasculaires précoces des toxines urémiques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système urogénital
190 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie subit deux chirurgies à sept jours d'intervalle pour provoquer une insuffisance rénale, avant l'administration de toxines urémiques et un suivi par échographie et IRM sous anesthésie jusqu'à une mise à mort échelonnée. Le porteur indique une douleur après les chirurgies, une perte de poids et des troubles du comportement dans les semaines suivantes. Il affirme que l'analyse des atteintes cardiovasculaires ne peut se faire in silico et juge le modèle souris "indispensable".
Objectifs
L'objectif de ce travail est d'étudier les effets vasculaire et cardiaque spécifiques de deux toxines urémiques: l’Indoxyl sulfate (IS) et le Para-cresyl sulfate (PCS).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de démontrer que les dysfonctions cardiaque et vasculaire observées au cours de l'insuffisance rénale aiguë (IRA) sont en partie secondaires à l'accumulation des toxines urémiques IS et PCS. Ce projet nous permettra d'en montrer le lien direct indépendamment de l'IRA en elle-même en utilisant des groupes de souris sans insuffisance rénale avec exposition par voie orale à l'IS ou au PCS. Les résultats de ce projet pourraient nous permettre également d'envisager des études thérapeutiques visant les toxines urémiques directement ou leurs mécanismes d'action.
Procédures
Les animaux du groupe IR (insuffisants rénaux ou groupe témoin positif) seront soumis à une procédure chirurgicale destinée à réduire le fonctionnement rénal. Les souris subiront 2 chirurgies à 7 jours d'intervalle afin de créer une insuffisance rénale. Les autres groupes (groupes sham ou groupe sans insuffisance rénale) seront soumis à des opérations blanches. Les animaux seront ensuite traités selon les groupes par KCl, IS ou PCS et suivis par imageries non invasives (échographies et IRM réalisées sous anesthésie), jusqu'à l'euthanasie qui surviendra dans chaque groupe à 3 temps (J7, J15 et J45). La procédure d'échographie durera 30 minutes et l'IRM 1 heure. Les prélèvements sanguin et tissulaires seront réalisés à l'euthanasie.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux seront ceux directement liés aux chirurgies et aux imageries de suivi. Les risques liés aux chirurgies et aux imageries de suivi concerneront tous les groupes de l'étude cardiovasculaire. Ils seront représentés essentiellement par la douleur aux décours des actes de chirurgies puis dans les semaines suivantes par un retentissement sur le bien-être (perte de poids, troubles comportementaux etc.).
Devenir
L'étude sera divisée en deux parties (étude préliminaire puis étude cardiovasculaire). Au terme des deux procédure (étude préliminaire et étude cardiovasculaire), les souris seront euthanasiées. Pour l'étude préliminaire, elles seront euthanasiées à J7 et J15 pour évaluer une cinétique de concentration d'IS et de PCS afin de définir la dose adéquate à administrer aux souris dans l'étude cardiovasculaire. Pour l'étude cardiovasculaire, les souris seront euthanasiées à 3 temps différents (10 souris à chaque temps par groupe) J7, J15 et J45 afin de réaliser une cinétique d'étude des atteintes structurelles cardiovasculaires (par mesure de marqueurs vasculaires et cardiaques dans le plasma et au niveau tissulaire).
Remplacement
L’analyse précise des conséquences cardiovasculaires de l’IR sur le plan tissulaire et fonctionnel ne peut être réalisée par des études in silico et l’utilisation de modèles animaux reste à l’heure actuelle indispensable. Notre choix s’est porté sur un modèle de souris car c’est le modèle le plus utilisé, le plus accessible et reconnu par l’ensemble de la communauté scientifique.
Réduction
En vue de réduire au maximum le nombre d’animaux, une étude préliminaire sera effectuée avec un effectif d’animaux réduit (7 groupes de 10 souris par groupe soit 70 souris) pour établir la dose adéquate d’IS et de PCS à administrer aux souris dans la suite de l’étude. L'étude cardiovasculaire sera réalisée sur un total de 120 souris avec 4 groupes de 30 souris par groupe. Dans l'étude cardiovasculaire de nombreux paramètres tissulaires et fonctionnels seront réalisés sur les mêmes animaux. Afin de pouvoir mettre en évidence une différence significative entre les groupes en tenant compte de la variabilité des mesures et de la mortalité, 10 animaux par groupe et par temps seront nécessaires pour les analyses tissulaires et biochimiques.
Raffinement
Dans le cadre d’un raffinement, on placera des nids végétaux, litières adaptées à la nidification et un fond sonore musical afin de favoriser le bien-être des animaux qui seront hébergés à plusieurs par cage. Des points limites seront établis et adaptés aux procédures mises en place et toutes les précautions d’usage seront mises en œuvre en terme d’anesthésie et d'analgésie afin de limiter la douleur des animaux au décours des chirurgies et lors des d’imageries. Afin de réduire la douleur lors des chirurgies (blanches ou IR), celles-ci seront effectuées sous anesthésie. Les chirurgies seront réalisées après avoir vérifié que le niveau d’anesthésie et d'analgésie est adéquat en appliquant une pression sur une des pattes de l’animal. De l’anesthésique sera réadministré en cas de réaction de l’animal. La douleur postopératoire sera systématiquement évaluée et traitée par une injection sous-cutanée d'analgésique. Tous les animaux seront suivis en postopératoire immédiat quotidiennement et jusqu’à la fin du protocole selon un score permettant de caractériser l’état de bien-être des animaux. Ainsi, la plus grande attention sera portée afin d'éviter la survenue de douleur et de stress chez les animaux tout au long du protocole.
Choix des espèces
Notre modèle murin d’IR a été validé par plusieurs publications aussi bien par notre équipe que par d’autres. Il s'agit d'un modèle d'IR stable (le niveau d'urée restant relativement stable avec le temps) qui peut devenir chronique si on laisse l'IR persister pendant plus d'un mois (chez l'homme c'est 3 mois). Avant un mois d'évolution chez la souris, l'IR est encore considérée comme aigue, permettant l’étude des stades précoces. Le modèle murin d’IR par électrocautérisation/néphrectomie est très largement utilisé depuis plusieurs années dans la communauté scientifique et accepté par les Comités d’Ethique en Matière d’Expérimentale Animale. De plus, l’étude présentée ici vise à apporter des données physiopathologiques complémentaires à ce modèle. Conformément aux publications précédentes de notre laboratoire employant le modèle d’IR, nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines. Les souris arriveront à l’animalerie âgées de 6 semaines et nécessiteront 2 semaines d’acclimatation.
Optimisation des modèles de maladies neurodégénératives chez la souris par implantation intracérébrale d’organoïdes cérébraux
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la plupart tuées à l'issue et 60 reproductrices réutilisées pour d'autres projets ou le maintien de la lignée. Un organoïde cérébral de 1 à 2 mm leur est greffé dans le cerveau sous anesthésie, parfois suivi d'une injection d'une molécule candidate. Le porteur indique des effets possibles pendant environ une semaine, stress, douleur, œdème, hémorragie ou comportement anormal, ainsi qu'un risque de prolifération des cellules injectées. Les retombées thérapeutiques sont renvoyées au long terme, et il affirme qu'un tissu complet reste accessible uniquement via l'animal.
Objectifs
Les recherches dans le champ du vieillissement du cerveau humain et des maladies neurodégénératives sont largement menées chez des souris génétiquement modifiées qui surexpriment des protéines pathologiques associées à ces maladies. De ce fait, il est difficile d’étudier ces pathologies au plus proche du contexte physiologique ainsi que les mécanismes qui mènent à leur propagation. Le projet s’intéresse à mettre au point un nouveau modèle murin permettant l’étude du vieillissement et des maladies associées. Les souris recevront une greffe d’organoïdes cérébraux dans le cerveau. Ces organoïdes, aussi appelés « minibrain », sont des structures en trois dimensions de cellules cérébrales obtenues in-vitro. La greffe de ces organoïdes chez la souris permettra d’évaluer de multiples mécanismes, comme la vascularisation ou la mise en place des projections axonales, mais aussi leur colonisation par les cellules gliales et l’interconnexion neuronale entre elles et les tissus cérébraux de l’hôte. En conditions pathologiques, suite à la greffe d’organoïdes provenant de cellules génétiquement modifiés, les conditions d’initiation de la pathologie étudiée seront plus proches de celles retrouvées chez les patients. Il sera alors possible d’étudier l’évolution, la prolifération et la colonisation de la pathologie au sein d’un organisme modèle et d’évaluer la transmission des signaux nerveux entre la greffe et le tissu hôte des souris. Enfin, une dernière partie s’intéressera à valider et repositionner notre modèle avec les traitements déjà utilisés chez les modèles transgéniques et qui permettent d’endiguer la propagation et/ou avoir des effets bénéfiques sur les déficits observés.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra dans un premier temps d’étoffer les connaissances scientifiques sur plusieurs aspects, tout d’abord techniques, sur l’implantation d’un organoïde chez la souris mais aussi fondamentales, sur les mécanismes prolifératifs des maladies neurodégénératives ainsi que la mise en place des processus neuronaux et gliaux. Un nouveau modèle murin sera alors accessible à la communauté scientifique pour étudier toutes sortes de mécanismes cérébraux. Ce projet vise aussi à repositionner notre modèle par rapport au modèles transgéniques en évaluant les effets de différentes stratégies thérapeutiques déjà éprouvées chez les animaux transgéniques. Ce nouveau modèle pourrait permettre à plus long terme la mise en place de traitements, préventifs ou palliatifs, pour lutter contre les maladies neurodégénératives.
Procédures
En fonction de la procédure les animaux recevront au maximum une intervention chirurgicale pour réaliser la greffe de l’organoïde dans le cerveau des rongeurs. Cet acte chirurgical sera effectué sous anesthésie et analgésie, qui durera environ une trentaine de minutes. Une injection permettant l’administration d’une molécule candidate pour un traitement sera réalisée elle aussi sous anesthésie (30 minutes), un mois après. D’autres animaux pourront recevoir, toujours sous anesthésie (30 minutes), une injection contenant les cellules des organoïdes dissociées suivi d’une autre injection un mois plus tard contenant une molécule candidate pour un traitement.
Impact sur les animaux
Les animaux participant à cette étude pourraient présenter des effets indésirables suite à la greffe dans la cavité cérébrale d’un organoïde dont la taille est comprise entre 1 et 2mm de diamètre. Dans la semaine qui suit cette procédure, les animaux pourraient être affectés de différentes manières par des effets indésirables : un stress et/ou une douleur accrus, un œdème ou une hémorragie ou encore un comportement anormal. La durée probable de ces effets indésirables est estimée à une semaine. Un autre effet indésirable possible est la prolifération des cellules injectées dans les temps plus tardifs.
Devenir
A l’exception des animaux reproducteurs qui n’auront reçu aucune chirurgie ni injection (élevage et production des animaux pour les autres procédures), les animaux entrant dans les procédures seront euthanasiés. Il sera ainsi possible de rechercher et scorer les mécanismes permettant à l’organoïde et au tissu cérébral de l’hôte de cohabiter, ainsi que les effets pathologiques liés à la présence d’un organoïde porteur d’une mutation retrouvée dans les maladies neurodégénératives. Les animaux reproducteurs seront réutilisés, toujours en tant qu’animaux reproducteurs pour d’autres projets ou le maintien de la lignée dans l’animalerie.
Remplacement
De nombreuses caractérisations du développement et de la prolifération des maladies neurodégénératives ont déjà été faites au niveau cellulaire et sur des modèles animaux transgéniques. Nous souhaitons mettre en place dans ce projet un nouveau modèle animal, le plus complet possible, qui permettrait de suivre le développement de ces pathologies. Pour suivre et évaluer la dissémination des marqueurs physiopathologiques, nous avons besoin d’un tissu complet disposant de tous les types cellulaires interagissant ensemble. Tous ces paramètres sont accessibles uniquement via un modèle animal.
Réduction
Dans la littérature spécialisée, les essais « pilotes » se font sur des groupes de 5 à 15 souris immunodéficientes. Chaque expérience peut être répétée au moins 2 fois, si besoin, pour obtenir des données statistiquement exploitables. Pour établir un nouveau modèle biologique et acquérir une expertise technique pour effectuer le geste chirurgical pour effectuer la greffe, nous envisageons d’utiliser des groupes de 5 animaux lorsqu’il s’agit de mettre au point les conditions optimales pour réaliser la greffe et des groupes de 10 animaux pour les études des pathologies ou des traitements. Ce nombre d’animaux par groupes nous permettra de considérer l’étude comme statistiquement significatives. Pour une expérience donnée, si les résultats statistiques se montrent significatifs après une répétition, la seconde et dernière répétition ne sera pas effectuée.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes de 5, dans un environnement approprié à leur statut immunodéficitaire (litière et nourriture stérilisées, eau sur filtre antibactérien d’exclusion 0,22 µm, cages avec couvercle filtrant dans un local isolé) à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 12h. L’eau et la nourriture seront fournies autant que nécessaire. Les animaux seront examinés quotidiennement par les zootechniciens, sous la supervision du vétérinaire clinicien, également en charge du bien-être animal. L’hébergement animal est en accord avec l’annexe III de la directive 2010/63/EU. Un environnement enrichi sera fourni aux animaux, selon nos procédures standards (tubes de carton, boules de coton…). De plus, une première expérience sera destinée à apporter un raffinement technique sur l’implantation d’organoïdes cérébraux chez la souris en passant d’une opération chirurgicale à une injection intracérébrale. Des mesures spécifiques sont prises pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être animal dans les procédures expérimentales : surveillance accrue, soins post-opératoires, mesures de gestion de la douleur, …). Mise en place egalement de points limites adaptés et d’un arbre décisionnel en fonction des observations faites pour l’application des points limites .
Choix des espèces
Le modèle murin (souris) est le modèle de référence dans le domaine des maladies neurodégénératives. Il s’agit du modèle le plus utilisé et le plus étudié dans la communauté scientifique et une bibliographie riche et abondante y est associée. Pour réaliser notre projet, nous nous appuierons sur les différentes données déjà publiées, comme l’évolution des pathologies pour les animaux génétiquement modifiés, afin de comparer ces données aux résultats que nous obtiendrons avec notre nouveau modèle. Ces données nous permettent de faire reposer ce projet sur des bases bibliographiques solides qui ne sont pas à répéter, ce qui va aussi dans la logique d’une réduction du nombre d’animaux utilisés. De plus, le laboratoire dispose des compétences techniques pour effectuer les greffes d’organoïdes chez la souris ce qui permettra une diminution du nombre d’animaux utilisés. Age/poids des souris : 6 à 8 semaines et de 20 à 25g. Il s’agit d’après la littérature scientifique du stade optimal pour réaliser les greffes d’organoïdes chez les souris immunodéprimées.
Modélisation de la maladie de Stargardt chez un rongeur diurne
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
48 Psammomys obesus, rongeurs diurnes, vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvement des rétines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Leur gène est inactivé par CRISPR-Cas9 dans un œil pour reproduire une dégénérescence maculaire, puis leur vision est suivie par imagerie sous anesthésie gazeuse. Le porteur indique que la perte de photorécepteurs ne touche qu'un œil et n'attend aucun autre effet indésirable. Il justifie ce rongeur, dont la rétine compte 40 % de cônes, par l'échec des modèles souris à reproduire cette maladie.
Objectifs
Ce projet a pour but de créer et caractériser un nouveau modèle animal de la maladie de Stargardt, dégénérescence maculaire héréditaire la plus fréquente, touchant des personnes jeunes et provoquant un handicap visuel lourd dû à la perte de la rétine centrale, appelée macula. Le gène impliqué a été identifié, mais son inactivation chez la souris n'entraine aucune des lésions rencontrées chez les patients. Le rongeur diurne Psammomys obesus présente des caractéristiques uniques pour modéliser cette maladie, ayant une structure rétinienne ressemblant à celle de la macula humaine. La technologie « CRISPR-Cas9 » sera utilisée pour bloquer l'expression du gène à l'origine de la maladie dans les yeux des Psammomys. Un suivi ophtalmologique longitudinal sera ensuite effectué, avec des techniques d'imagerie non invasives (tomographie par cohérence optique, fond d'œil, angiographie). Il sera suivi d’analyses cellulaires et moléculaires post-mortem. Nous espérons ainsi obtenir le premier modèle fidèle de la maladie de Stargardt, et ainsi ouvrir la voie à des approches thérapeutiques.
Bénéfices attendus
La suppression du gène Abca4 dans l’œil de Psammomys obesus, dont la rétine est riche en cônes comme la macula humaine, devrait permettre l’obtention d’un modèle animal de la maladie de Stargardt récapitulant les atteintes affectant les patients, et donc de déterminer les mécanismes conduisant à la perte des cônes dans cette maladie et ainsi d'ouvrir des perspectives thérapeutiques pour les patients.
Procédures
Une anesthésie gazeuse sera utilisée afin d’obtenir l’immobilité des animaux au moment des examens ophtalmologiques (imagerie OCT et fond d’œil). La durée d'anesthésie sera de 10-15 minutes pour chacun des points du suivi longitudinal. Ce suivi comprendra au moins 3 points (1, 2 et 4 semaines après injection) avec la possibilité de un à deux points supplémentaires (2 et 3 mois après injection), selon l'évolution des symptômes.
Impact sur les animaux
L’inactivation du gène à l’origine de la maladie humaine devrait entrainer une perte localisée des photorécepteurs de la rétine. Cette perte ne concernera qu’un seul des deux yeux de l’animal. Aucun effet indésirable n’est attendu à l’issue des procédures expérimentales, basées sur de l’imagerie sans contact et pratiquée au cours d’une anesthésie de courte durée.
Devenir
A la fin de chaque étape de cette procédure, les animaux retournent dans leur établissement d'origine. Ils y seront euthanasiés après la dernière étape pour prélèvements des rétines afin d'effectuer des analyses moléculaires et cellulaires complémentaires.
Remplacement
Nous cherchons à modéliser une maladie complexe - maladie de Stargardt, forme de dégénérescence maculaire précoce. Pour ce faire, il est nécessaire de pouvoir disposer d'une rétine dont la structure est proche de celle de l'homme (le modèle souris a montré ses limites pour cette maladie, le rat ne semble pas mieux adapté avec seulement 1% de cônes, contre 3% chez la souris et 40% chez Psammomys obesus), avec des interactions maintenues avec l'épithélium pigmentaire sur une durée d'un mois ou plus. Aucun modèle in vitro disponible à l’heure actuelle ne permet de reproduire ces conditions.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, l’approche Crispr-Cas9 a été validée par analyse génomique puis sur des cellules. Chaque animal sera son propre contrôle. Avec la précision de l’imagerie OCT, 12 animaux par condition (traitement, sexe) ceci permettra de valider les résultats avec une puissance statistique satisfaisante (>90%) même en cas d’un amincissement rétinienne de l’ordre de 10%, en nous basant sur la variabilité inter-animal observée chez le rat. Au cours de la maladie de Stargardt, une réaction inflammatoire est observée. Afin de vérifier si une inhibition précoce de cette inflammation permettrait de limiter les atteintes rétiniennes, la moitié des animaux sera placée sous traitement anti-inflammatoire dès l’inactivation du gène. Ceci fait donc un total de 48 animaux (24 mâles, 24 femelles).
Raffinement
OCT et fond d’œil sont des méthodes d’imagerie non invasives. Elles sont réalisées sous anesthésie chez les animaux uniquement afin d’obtenir leur immobilité sur le temps d’observation. Chez l’homme, elles sont réalisées avec des équipements comparables sans anesthésie ou analgésie. Une anesthésie gazeuse est préférée à une anesthésie par injection intra-péritonéale, car la durée d’anesthésie peut être maintenue au minimum nécessaire, avec un réveil rapide. Les deux examens seront effectués de manière bilatérale sur la même anesthésie. Comme le réflexe de clignement est absent sous anesthésie, la cornée sera maintenue hydratée grâce à du gel ophtalmique pendant toute la durée de perte de connaissance. Les animaux seront placés sur un coussin chauffant afin de maintenir leur température corporelle. Les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil complet.
Choix des espèces
Les études sur modèles murins n’ont pas permis de reproduire les symptômes de la maladie de Stargardt. La souris, rongeur nocturne avec seulement 3% de photorécepteurs cônes (3% des photorécepteurs). Nous utiliserons ici un modèle rongeur diurne, Psammomys obesus, dont la rétine est enrichie en cônes (40% des photorécepteurs), ce qui rapproche sa structure de la macula humaine. Le gène à l’origine de la maladie de Stargardt sera inactivé à partir du 15ème jour postnatal, car c’est à ce stade (équivalent à 7-12 ans) que la maladie se déclare chez l’homme. Les examens ophtalmologiques commenceront une semaine après. Ils seront répétés une puis deux semaines plus tard, puis si nécessaire de mois en mois jusqu’à stabilisation des atteintes rétiniennes.
Etude du potentiel thérapeutique du blocage des protéines X et Y dans le lymphome T chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par dislocation cervicale, dans des procédures classées en gravité modérée. Elles reçoivent une injection intraveineuse de cellules de lymphome T sous anesthésie, puis trois à cinq injections intra-péritonéales de molécules ou de placebo, pour tester le blocage de deux protéines de surface. Le porteur décrit un modèle "sans phénotype dommageable" et une "angoisse légère et de courte durée", formulation en retrait de la gravité modérée déclarée. Il présente cette portée comme "translationnelle" et le recours à la souris comme la seule voie de validation faute de systèmes in vitro fiables.
Objectifs
Les lymphomes T constituent une famille de cancers hématologiques. Les patients atteints de lymphomes T sont traités par poly-chimiothérapies ; toutefois ces traitements sont peu efficaces et il n’existe que très peu d’alternatives thérapeutiques. L’utilisation des immunothérapies, qui ont révolutionné la prise en charges de nombreux types de cancers, est à ce jour quasi-inexistante dans les lymphomes T du fait de l’absence de cibles thérapeutiques bien établies. Nos travaux réalisés chez l’homme in vitro, suggèrent que deux molécules de surface exprimées par les cellules tumorales, nommées X et Y pourraient constituer des cibles intéressantes. Pour valider leur potentiel thérapeutique, nous souhaitons désormais évaluer l’effet de leur blocage dans deux modèles de lymphomes T chez la souris.
Bénéfices attendus
Ces travaux ont avant tout une portée translationnelle, puisqu’ils pourraient permettre d’établir X et /ou Y comme des cibles potentielles d’immunothérapie chez les patients atteints de lymphomes T.
Procédures
-1 injection de cellules (lymphome T) par voie intraveineuse, sous anesthésie isofluorane (30 secondes/souris) -3 à 5 injections par voie intra-péritonéale, de molécules thérapeutiques (ou de leur placebo) dans un volume total de 100µL. (3 à 5x30 secondes/souris)
Impact sur les animaux
Nos modèles murins ne présentent pas de phénotype dommageable. L’injection de cellules de lymphomes T n’induit pas d’effets secondaires détectables dans la fenêtre de temps de l’étude. Chez la souris, l’injection des thérapies que nous souhaitons tester n’induit pas d’effets secondaires délétères détectables. Les souris reçoivent au total 3 à 5 injections de médicament ou de placebo par voie intra-péritonéale. Les animaux subissent donc un ensemble d’étapes de classe de gravité légère, susceptible d’entraîner une angoisse légère et de courte durée.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure par dislocation cervicale ; les rates, ganglions lymphatiques et foies seront prélevées pour pesée et analyse du phénotype immunitaire .
Remplacement
Nous avons tout d’abord effectué un certain nombre d'expériences in vitro. Cependant, la validation de nos résultats nécessitera une série d'expériences dans un contexte physiologique pertinent, c’est-à-dire chez l’animal. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, les interactions entre les différentes cellules immunitaires et leur microenvironnement, ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.
Réduction
Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature. Nous avons ainsi calculé une taille d'échantillon de 5 souris par groupe. Un replicat expérimental sera réalisé si la première exépérience est concluante, afin de renforcer la signification statsitique des données, et de pallier à un problème technique éventuel (ce réplicat ne sera pas fait si les résutlats de la première expérience sont négatifs).
Raffinement
Certaines procédures peuvent induire une douleur légère (injections intraveineuses et intra-péritonéales). Les protocoles d’injection que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs, et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage.
Choix des espèces
Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de lignées de lymphomes T et de réactifs bloquant nos cibles thérapeutiques d’intérêt, qui a notre connaissance n'ont pas été devéloppés dans d'autres modèles pré-cliniques. De plus notre laboratoire a développé une expertise unique dans l'analyse du système immunitaire chez la souris, et a tous les réactifs nécessaires à disposition. Pour atteindre la maturité du système immunitaire, les souris seront âgées de 7 à 12 semaines.
Évaluation d’un traitement anticancéreux par hyperthermie localisée
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
4 032 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur du foie leur est greffée sous la peau ou induite par injection intraveineuse, puis chauffée à 43-45 °C par des nanoparticules activées au laser ou par champ magnétique, sous suivi d'imagerie. Le porteur qualifie les effets secondaires de "très limités" et renvoie l'amélioration de la prise en charge des patients au conditionnel. Il présente le recours à un "organisme entier" comme un "passage obligé" avant tout transfert vers l'humain.
Objectifs
Les cancers hépatobiliaires, en particulier le cholangiocarcinome (CCA) sont difficiles à traiter. Le développement de la nanomédecine permet d’envisager des traitements anticancéreux mieux ciblés, plus efficaces et avec de moindres effets secondaires par rapport aux traitements conventionnels. L’utilisation de nanoparticules activables à distance par un rayonnement lumineux dans le proche infrarouge permet de contrôler l’action thérapeutique à la fois dans le temps et dans l’espace. Le projet propose l’évaluation d’une thérapie anticancéreuse localisée par échauffement de nanoparticules sous rayonnement électromagnétique non ionisant, (lumière dans le proche infrarouge ou champ magnétique alternatif) en association ou non avec une immunothérapie ou une thérapie ciblée anti-EGFR. Cette évaluation sera réalisée sur un modèle murin après injection sous cutanée de cellules murines de cancer de CCA. L’échauffement de la tumeur sera modulé par la puissance du laser/champ magnétique et réduit aux zones d’accumulation des nanoparticules. On visera une hyperthermie modérée (43°C à 45°C pendant 30 min, répétée 2 ou 3 fois à 24h d’intervalle au moins) de manière à moduler thermiquement le microenvironnement tumoral et le rendre plus permissif aux chimiothérapies. L’évolution de la masse tumorale sera suivie par échographie, modalité qui est intégrée au module d’Imagerie Photoacoustique. L’imagerie permettra un suivi longitudinal de la biodistribution/dégradation/élimination de nanoparticules utilisées, en complément des caractérisations ex vivo. L’objectif final est d’identifier les nanomatériaux de meilleur potentiel thérapeutique associé une biodistribution favorable, biodégradable et sans effet indésirable à long terme.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but de développer des stratégies thérapeutiques loco-régionales pour traiter le cholangiocarcinomes qui présentent une toxicité moindre en comparaison aux traitements anticancéreux systémiques. Ce projet pourrait donc permettre d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients en combinant une thérapie loco-régionale et systémique en administrant des doses plus faibles de drogues, réduisant les effets systémiques toxiques secondaires.
Procédures
Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de cancers du foie et à leurs traitements. Les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie où point limites. Pour cela, une première partie des animaux seront soumis dans un premier temps à une greffe de cellules tumorales ectopiques, sous la peau (injection sous-cutanée sur animal vigile ou anesthésié). Une seconde partie des animaux subiront une injection hydrodynamique (injection intraveineuse animal vigile) de vecteurs plasmidiques afin d’induire une tumeur dans le foie (moins d’une minute). Les animaux seront ensuite impliqués dans différents traitements seul ou en combinaison : traitement par nanohyperthermie sous anesthésie, injection intraveineuse ou intrapéritonéale (1 à 40 minutes maximum selon les traitements). Les animaux seront suivis de manière longitudinale par imagerie non invasive effectuée sous anesthésie générale pour suivre la croissance tumorale (20 minutes maximum). Enfin, les animaux seront euthanasiés en vue des différents prélèvements nécessaires aux analyses.
Impact sur les animaux
La principale contrainte concerne le développement tumoral intrinsèquement lié à la question scientifique du présent projet qui vise à trouver des traitements innovants du cholangiocarcinomes. Les traitements mis en œuvre devraient quant à eux réduire les effets liés au développement tumoral avec de possibles effets secondaires mais qui restent très limités (inflammation locale et toxicité hépatique et/ou biliaire).
Devenir
L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet (n=4032) seront euthanasiés à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures.
Remplacement
Un système vivant est nécessaire pour tester des nouvelles stratégies antitumorales in vivo. C’est un passage obligé demandé par les industries pharmaceutiques ou les compagnies de valorisation (pour dépôt de brevet) avant un éventuel transfert à l’Homme. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu dans la croissance tumorale. L’effet antitumoral et la dégradabilité de nanoparticules utilisées in vivo seront au préalable testés et optimisés in vitro sur des modèles cellulaires 2D ou 3D ou encore dans des milieux mimant l’environnement biologique (remplacer).
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Au total ce projet impliquera 4032 souris immunocompétentes ou immunodéficiences en fonction des questions scientifiques. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. L’utilisation de cette technique d’imagerie non invasive combinée à la mutualisation de tissus pour les caractérisations ex vivo permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude (réduire).
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Ainsi, l’hébergement, les soins et l’ensemble des procédures expérimentales sur les animaux seront effectués dans le respect du bien-être animal avec la définition de points limites au-delà desquels l’expérience sera interrompue (raffiner).
Choix des espèces
Justification de l’espèce : La souris est le modèle classique des expériences et études en cancérologie ; sa taille et son poids autorisent en outre d’utiliser de faibles quantités de composés cytotoxiques. La disponibilité de souches consanguines exprimant de façon stable des phénotypes immuno-supprimés permet de réaliser des xénogreffes de tumeurs humaines sans avoir recours à une suppression immunitaire iatrogénique. La disponibilité de souris non immunodéprimées permet également de réaliser des greffes syngéniques avec des cellules tumorales de la même espèce permettant ainsi d’étudier le système immunitaire et de tester des drogues anti-tumorales basées sur l’utilisation d’anticorps. Description du ou des modèle(s) : La souris Nude est le standard pour les études précliniques relatives à l'évaluation in vivo des effets anti-tumoraux sur des cellules humaines. Nous utiliserons la souche Athymic Nude-Foxnu. Nous utiliserons également les souris C57BL/6J pour les greffes syngéniques (pour greffer sous la peau des cellules cancéreuses murines) et pour induire une tumeur dans le foie par injection hydrodynamique de vecteurs plasmidiques dans la veine de la queue. Justification du stade : Les animaux sont utilisés au stade adulte (5-8 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection de cellules cancéreuses, une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l’expérimentation.
Production d’anticorps polyclonaux murins
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par prélèvement cardiaque sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent cinq injections sous-cutanées d'antigènes pour leur faire produire des anticorps dirigés contre des protéines de microsporidies, parasites de l'abeille et de l'humain. Le porteur signale de rares lésions aux points d'injection et un pelage terne, et présente les anticorps comme des outils "indispensables" et leur usage comme une "nécessité". Il affirme ne recourir aux souris que faute d'anticorps disponibles dans le commerce.
Objectifs
Le projet s'inscrit dans l'étude des interactions hôtes-parasites. Nous étudions les microsporidies, parasites intracellulaires obligatoires apparentés aux champignons, au travers notamment de la mise en place du dialogue moléculaire entre les parasites et leurs hôtes. Plusieurs modèles microsporidiens sont étudiés: 1- l'espèce Nosema ceranae, parasite de l'abeille. 2- l'espèce Anncaliia algerae parasite de l'homme et de l'anophèle. 3- les espèces du genre Encephalitozoon, parasites des mammifères. Dans le cadre de ces études sur les relations hôtes-parasites, nous nous intéressons particulièrement aux mécanismes d'invasion. Pour cela, nous avons besoin de caractériser les protéines microsporidiennes impliquées dans ces mécanismes et les protéines de l'hôte qui sont ciblées par le parasite. Les anticorps sont des outils indispensables pour localiser ces protéines à l'échelle cellulaire, et/ou les co-purifier avec leurs partenaires d'interaction. Nous ciblons plus spécifiquement les protéines parasitaires constituant l'appareil invasif des microsporidies, ainsi que les protéines de surface de la spore (stade de résistance et de dissémination). Ces protéines sont susceptibles d'interragir avec des protéines de la membrane plasmique des cellules hôtes. L'identification des protéines cibles de l'hôte pourra permettre une meilleur compréhension des mécanismes d'invasion, et ainsi permettre d'envisager un bloquage du processus d'invasion. Pour ces analyses, l'utilisation des anticorps est une nécéssité. Ce sont des sondes de choix en raison de leur spécificité et de leur affinité.
Bénéfices attendus
Les résultats du projet devraient permettre une meilleure compréhension des mécanismes d'invasion très originaux utilisés par les microsporidies pour infecter leur hôte. Ceci peut permettre d'élaborer ensuite des solutions prophylaxiques et/ou thérapeutiques pour bloquer ou limiter l'infection des hôtes par le parasite. Une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait en effet permettre d'élaborer de nouvelles approches thérapeutiques afin de lutter contre les microsporidioses, plus particulièrement chez l'abeille, pour laquelle aucune molécule efficace n'est actuellement autorisée.
Procédures
Manipulation des animaux lors de la mise en boîte à induction pour la réalisation de l'anesthésie gazeuse. Injection sous cutanée sur animaux endormis. Ces 2 interventions prennent en moyenne 10 minutes, par animaux. Les animaux seront soumis à 5 injections sur la durée du projet. Anesthésie gazeuse, puis prélèvement cardiaque sur animaux endormis, avant euthanasie de ces derniers. Ces interventions prennent en moyenne 10 minutes par animaux.
Impact sur les animaux
Des lésions aux sites d'injections peuvent apparaître dans de très rare cas sur les animaux. Certains animaux peuvent avoir une modification de leur activité, et de leur aspect physique (pelage terne ou hirsute).
Devenir
A l'issue de l'expérimentation, tous les animaux seront euthanasiés
Remplacement
Pour pouvoir réaliser des expériences d'immunolocalisation et/ou immunoprécipitation, nous avons besoin de sondes ayant une forte spécificité et une bonne affinité envers nos protéines cibles. Les anticorps permettent de répondre à ces exigences. Nous réalisons cette production en ayant recours à des animaux uniquement si il n'existe pas d'anticorps spécifiques à nos protéines d'interêts disponibles dans le commerce. Nous ciblons en général des protéines spécifiques des agents pathogènes étudiés pour lesquelles aucun anticorps n'est disponible.
Réduction
Afin de limiter le nombre d'animaux, il est prévu d'immuniser un seul animal par antigène étudié. Si les sérums des animaux immunisés ne sont pas spécifiques de l'antigène étudié, une purification des immunoglobulines sera réalisée. Une deuxième série d'immunisation contre le même antigène sera envisagée si les anticorps ne détectent pas l'antigène même après purification. Si des anticorps produits chez un deuxième animal venaient également à ne pas répondre à l'antigène, l'étude portant sur cet antigène sera définitivement abandonnée.
Raffinement
Afin de limiter les stress des animaux, ceux ci seront acclimatés deux semaines dans l'animalerie avant le début des expérimentations. Les animaux seront hébergés par groupe de 4 par cage avec un enrichissement de leur environnement. La technique d'immunisation par injection sous cutanée sera réalisée sous anesthésie gazeuse légère en boîte à induction au moyen d'air médical et d'isoflurane afin de limiter le stress de l'animal. Une surveillance des animaux, aspect externe, comportement, sera réalisée quotidiennement. Les animaux présentant une modification de comportement ou d'aspect physique seront euthanasiés afin d'éviter toute souffrance. Pour cela, des points limites ont été définis selon plusieurs critères : 1- activité, diminution marquée de la motricité spontanée, des activités de toilettage, ou motrice après stimulation. 2- aspect physique modifié, poil hirsute, pelage terne, prostration, vocalisation. 3- apparition de lésions importantes aux sites d'injections.
Choix des espèces
Deux raisons principales nous ont amené à choisir la souris pour cette production d'anticorps. 1- les anticorps polyclonaux que nous envisageons de produire seront utilisés à des fins de recherche exclusivement pour des expériences d'immunolocalisation ou d'immunoprécipitation nécessitant de faibles volumes de sera. 2- les antigènes proviennent d'espèces éloignées phylogénétiquement de la souris ( parasites eucaryotes unicellulaires) Nous utiliserons des animaux âgés de 6 à 8 semaines. 2 semaines d'acclimatation à l'animalerie sont prévues avant de manipuler les animaux. Cela nous permet de travailler sur des souris jeunes adultes ( 8 à 10 semaines) qui ont une réponse immune suffisamment développée et pas encore (trop) affectées par des challenges immuns. De plus, la robustesse de la réponse immune diminue avec l'âge après le début de l'âge adulte.
Impaired organ repair after sepsis: role of tissue resident macrophages and recruited monocytes (ORISMO)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
570 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une ligature-ponction du caecum destinée à provoquer une infection généralisée, une ablation partielle de rein et une injection de tamoxifène, pour étudier la réparation du rein après un sepsis. Le porteur indique une perte de poids de 10 à 15 % et une baisse d'activité de plusieurs jours, et annonce un traitement de la douleur au site opératoire. Les objectifs cliniques, de nouvelles thérapeutiques pour les patients survivant à une infection grave, sont formulés au conditionnel, tandis qu'il affirme que seul le modèle animal approche la complexité du sepsis humain.
Objectifs
Evaluer le rôle des cellules immunitaires dans la réparation rénale après une infection grave
Bénéfices attendus
La plupart des avancées récentes dans le traitement des infections graves se sont focalisées sur le traitement de la source infectieuse plus que le contrôle de la réponse immunitaire. A l'heure actuelle, on observe un surrisque de maladies cardiovasculaires, d'insuffisance rénale et de cancer chez les patients qui survivent à une infection grave (pneumonie, infection urinaire, infection abdominale). Mieux comprendre le role du systeme immunitaire dans le développement des complications à long terme qui succèdent à l'infection pourrait permettre de dégager de nouvelles thérapeutiques et un meilleur suivi de ces patients.
Procédures
les animaux seront soumis à 3 procédures: - injection intra-péritonéale de tamoxifen (durée 2minutes) - Procédure chirurgicale de ligature ponction caecale (durée 10minutes)- procédure chirurgicale de nephrectomie, clampage du pédicule vasculaire rénal (durée 35minutes)
Impact sur les animaux
Les procédures chirurgicales peuvent s'accompagnées de douleur au niveau du site opératoire, celle-ci sera systématiquement recherchée et un traitement antalgique sera administré à tous les specimen, possiblement réitéré à plusieurs reprise en cas de persistence de signes d'inconfort. La perte de poids est une complication attendue de l'infection, celle-ci n'excède pas 10-15% du poids corporelle, et regresse en quelque jours après la guérison. La diminution de l'activité est également attendue et habituelle (composante du comportement maladie) et n'excède pas 5-7 jours au dela des différentes procédures
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort.
Remplacement
Le sepsis est une maladie complexe et multi-systémique qui associe une intense activation immunitaire, une défaillance circulatoire, des altérations endothéliales à divers degrés. A ce jour, seule l'utilisation de modèles animaux permet d'approcher la complexité du sepsis chez l'homme. Le modèle de ligature ponction caecale que nous utiliserons est largement étudié et le plus utilisé dans la littérature.
Réduction
Les groupes expérimentaux ont été conçus de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Ainsi, les animaux seront leurs propres contrôles pour un suivi au cours du temps (analyse rein droit puis rein gauche), ceci afin de réduire leur nombre. Le nombre d'animaux par groupe à été déterminé par calcul de puissance necessaire à mettre en évidence une différence significative entre les groupes avec le minimum de specimens.
Raffinement
Pour limiter au maximum les nuisances sur le bien être des animaux lors des procédures expérimentales les mesures suivantes seront prises: surveillance acccrue toute les 12h dans les 48h suivants la procédure. Administration systématique d'antalgique chez tous les specimen après chirurgie et réadministration à H24, h36, h48 chez les animaux montrant des signes de mal-être voire mise à mort dans les cas extrèmes (au moyen d'un scoring clinique, qui liste les points limites à partir desquels les antalgiques ou de mise à mort sont prises). Surveillance accrue 2 fois/jours pendant les 3 premiers jours après chirurgie.
Choix des espèces
Le modèle murin présente de nombreux avantages pour notre projet de recherches. Outre sa petite taille et son hébergement aisé, le modèle de sepsis comporte de nombreuses similitudes par rapport à un sepsis polymicrobien abdominal chez l’Homme. L'utilisation du modèle murin pour l'étude de la réponse immunologique au sepsis est le modèle le plus couramment utilisé. Souris mâles jeunes adultes de 4-8 semaines environ Le stade de développement des animaux correspond à de jeunes adultes afin de mimer au mieux les conditions de pathologies chez l'Homme
Imagerie chez la souris des effets de la dopamine dans la maladie de Parkinson
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une toxine leur est injectée dans le cerveau pour détruire les neurones à dopamine et reproduire une lésion de type Parkinson, opération d'environ une heure suivie pour une partie d'une seconde chirurgie d'injection virale. Le porteur indique une perte de poids et des difficultés motrices après la lésion, évaluées par un test du cylindre, et précise que la lésion d'un seul hémisphère laisse l'autre compenser. Les retombées thérapeutiques annoncées restent au conditionnel, et il juge "incontournable" d'utiliser des neurones issus d'animaux modèles.
Objectifs
La dopamine est un neuromodulateur qui joue un rôle essentiel dans le contrôle des fonctions motrices. La dopamine est libérée dans le striatum, où réside une population spécifique de neurones cibles, les neurones épineux striataux. Ces neurones répondent à cette dopamine par le biais de « signaux intracellulaires », qui changent le fonctionnement neuronal. Au cours de la maladie de Parkinson, la libération de dopamine dans le striatum se réduit progressivement. Les neurones épineux s’y adaptent en augmentant leur sensibilité à la dopamine. C’est ce mécanisme d’adaptation à la perte de dopamine que nous souhaitons étudier, pour mieux comprendre comment le corriger dans la situation pathologique. Les biosenseurs optiques permettent de mesurer à l’aide de microscopie optique les effets de la dopamine sur les neurones vivants. Cette approche méthodologique innovante nous permet de décrire avec précision le décours temporel et l’amplitude de cette réponse à la dopamine, et mesurer l’effet de molécules pharmacologiques selon un protocole précisément établi. Cette approche nous permet de comparer les neurones provenant d’animaux modèles de la maladie de Parkinson avec ceux provenant d’animaux sains. Ce type de donnée est essentiel pour développer ensuite des modèles numériques pour la recherche «in silico».
Bénéfices attendus
La maladie de Parkinson résulte de la disparition progressive des neurones qui produisent la dopamine dans le cerveau. Le cerveau s’adapte à cette perte progressive en augmentant la sensibilité à la dopamine des neurones cibles. Mais lorsque la perte atteint environ 90%, cette compensation n’est plus suffisante et le patient montre les signes invalidants de la maladie. Grâce à notre expérimentation, et en comparant la situation parkinsonienne avec des adultes normaux, nous pourrons analyser en détail comment les neurones augmentent leur sensibilité à la dopamine. Ce travail pourrait mettre sur la voie d’une nouvelle stratégie thérapeutique pour prolonger le plus possible le fonctionnement du système dopaminergique lorsque la maladie est diagnostiquée chez le patient. La maladie de Parkinson est caractérisée par un décours temporel lent, avec la perte inéluctable des neurones dopaminergiques. Toute méthode thérapeutique qui pourrait prolonger de quelques mois ou années le fonctionnement du striatum avant de devoir recourir à la dopathérapie serait très bénéfique pour les patients. Par ailleurs, notre étude révèlera certains mécanismes d’adaptations des neurones à un contexte pathologique, et cette connaissance sera importante dans le contexte scientifique de la compréhension de l’adaptation. Les mécanismes que nous analyserons seront mis en relation avec d’autres connaissances scientifiques liées à l’adaptation neuronale dans le striatum, comme par exemple l’addiction, la schizophrénie, la maladie de Huntington… Enfin, en mesurant avec une grande précision temporelle la réponse cellulaire à la dopamine chez l’animal sain et modèle de la maladie, nos données serviront à construire les modèles numériques qui permettront d’étudier la pathologie in silico. A l’aide de ces modèles numériques, la simulation permettra d’évaluer l’impact qu’aurait telle ou telle intervention thérapeutique sur le fonctionnement du striatum.
Procédures
La chirurgie vise à détruire sélectivement les neurones qui libèrent la dopamine dans une région précise du cerveau. Cette opération est effectuée par l’injection dans cette région du cerveau d’une toxine sélective de ces neurones. Avant cette chirurgie, chaque souris reçoit des injections d’antidouleurs, d’une molécule visant à protéger les neurones qui pourraient être marginalement affectés par la toxine, de sérum physiologique glucosé. L’opération dure environ 1h. Le lendemain, chaque souris reçoit une injection d’antidouleur. Dans les jours suivants, en cas de signe de douleur, l’animal concerné reçoit une injection d’antidouleur. Durant au moins 3 jours après la chirurgie et jusqu’à une reprise de poids, chaque souris reçoit une fois par jour une injection sous-cutanée de sérum physiologique glucosé. Afin d'évaluer la réussite de la lésion des afférences dopaminergiques, le test du cylindre est réalisé pour chaque animal trois semaines après la réalisation de la lésion. L'animal est placé dans un cylindre en verre transparent pendant 3 minutes. Un expérimentateur compte le nombre de fois où l'animal touche le mur du cylindre avec sa patte avant droite ou gauche. Pour une partie des animaux, une 2e opération consiste à injecter dans une région précise du cerveau un virus pour faire exprimer un biosenseur dans les neurones. Avant cette chirurgie, chaque souris reçoit des injections d’antidouleurs. Cette opération dure environ 1h20. A la fin de la procédure, tous les animaux sont euthanasiés pour prélèvement du cerveau.
Impact sur les animaux
L’injection de la 6-OHDA dans le striatum détruit une partie importante des afférences dopaminergiques. La perte de dopamine, caractéristique de la maladie de Parkinson, réduit la mise en route de programmes moteurs, qui induit une réduction de la mobilité de l’animal, à l’image de ce qu’on observe chez le patient. Il en résulte des difficultés motrices, et donc une perte de poids, les jours suivant la chirurgie. A l’inverse du patient parkinsonien, chez qui la perte de dopamine a lieu dans l’ensemble du cerveau, le modèle animal utilisé dans ce projet présente une lésion seulement dans un hémisphère. Ainsi, l’autre hémisphère cérébral compense au bout de quelques jours, de manière à ce que les symptômes moteurs ne soient pas invalidants pour l’animal. Les perturbations motrices sont alors minimes, et éventuellement détectables avec un test de comportemental spécifique. Les animaux contrôles récupèrent plus vite après la chirurgie. Ils ne présentent aucune altération motrice.
Devenir
L'objectif étant d'effectuer des mesures par imagerie sur des neurones ou bien des analyses biochimiques sur le cerveau, tous les animaux sont nécessairement euthanasiés à l'issue de la procédure, pour le prélèvement du cerveau.
Remplacement
Cette étude vise à étudier les mécanismes d’adaptation qui se mettent en place au cours de la maladie de Parkinson. Dans le contexte réglementaire actuel, la validation de cette hypothèse ne peut être effectuée sur des patients, et doit être précédée par une démonstration pré-clinique sur l'animal. Pour cette étude, il est alors incontournable d'utiliser des neurones provenant d'animaux modèles de la maladie. La dopamine agit sur les neurones dans le cerveau, et l’effet de la dopamine change au cours de la maladie. De nombreux autres processus d’adaptation se produisent si les neurones sont mis en culture, dans un environnement artificiel où manquent la plupart des stimuli présents dans le cerveau. C’est pourquoi, au lieu d’analyser ce phénomène sur des cultures de cellules, il est indispensable d’effectuer les mesures au plus près de la situation pathologique. C’est en cela que notre approche d’imagerie de biosenseurs est puissante, puisqu’elle permet de mesurer la réponse à la dopamine dans un contexte anatomique préservé, qui représente au mieux la pathologie. Une modélisation numérique a été réalisée précédemment au sein du laboratoire et permet de mieux comprendre le fonctionnement du striatum. Toutefois, ce modèle demeure pour le moment incomplet, en particulier pour rendre compte des changements induits par la maladie de Parkinson. Les expérimentations par une approche d’imagerie cellulaire sont alors nécessaires et permettent de compléter le modèle numérique. Par ailleurs, la maladie de Parkinson est causée par une dégénérescence des neurones dopaminergiques présents dans la substance noire et l’aire tegmentale ventrale. Ces neurones dopaminergiques projettent ensuite dans de nombreuses structurales cérébrales comme le striatum. Au sein du striatum, la dopamine libérée agit sur les récepteurs à la dopamine présents dans de nombreux types cellulaires du striatum. Chaque type de neurones du striatum (neurones épineux striatum et interneurones) s’adapte à la situation en fonction de l’évolution globale du système. Il est indispensable d’étudier ces adaptations, qui ont lieu lors du déficit en dopamine, dans un système complet, rendant l’étude sur des neurones en culture impossible.
Réduction
Ce modèle expérimental de souris est très bien connu et utilisé dans de nombreuses études sur la maladie de Parkinson. Ce modèle permet notamment d’obtenir des résultats transposables à l’être humain. Les animaux seront utilisés pour l’étude mécanistique ex vivo par l’approche d’imagerie de biosenseurs. Nous avons optimisé la méthode d’imagerie afin d’effectuer en moyenne deux enregistrements à partir d’une même souris. Les mesures effectuées à l’aide des biosenseurs sont comparées entre animaux test et contrôles, et les différences sont validées par des tests statistiques. Une étude déjà publiées permet d’estimer le nombre de répétitions de chaque mesure à 6. Ce projet utilisera 1un total de 216 souris. Les résultats issus de cette étude seront partagés avec la communauté scientifique par une ou plusieurs publications. Par ailleurs, l’ensemble des données obtenues à partir de ces expériences sera mis à disposition de la communauté scientifique sur un site d’archivage en ligne. Cela évitera de répliquer l’expérimentation dans d’autres laboratoires; ces données pourront être analysées par d’autres chercheurs pour répondre à d’autres questions scientifiques.
Raffinement
Condition d’hébergement : animalerie A2, cycle d’éclairage jour-nuit de 12h, température stable 22°C, hygrométrie 55%, nourriture et eau à volonté. L’animal est suivi quotidiennement pendant toute la procédure par un personnel compétent. Le milieu est enrichi par des frisures kraft pour la nidification tout au long de l’hébergement. La lésion des neurones dopaminergiques réalisée uniquement dans un hémisphère induit peu de perturbations motrices après récupération. Pour contrôler la douleur : injection sous-cutanée d’un anti-douleur opiacé le matin et le soir de la chirurgie. Avant le début de la chirurgie : injection sous-cutanée d’un produit protégeant les neurones non-dopaminergiques. Pour la chirurgie, l’animal est anesthésié et placé sur tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. Il reçoit une injection locale d’un anti-douleur au niveau de la peau du crâne et une injection sous cutanée de sérum physiologique glucosé pour prévenir la déshydratation. Les yeux sont protégés du dessèchement par un gel oculaire. Le lendemain de la chirurgie, l’animal reçoit systématiquement une injection d’anti-inflammatoire non stéroïdien. Pendant trois jours, il reçoit des injections sous-cutanées quotidiennes de sérum physiologique sucré. L’animal est pesé. Au-delà des 3 premiers jours, si l’animal présente des signes de douleurs, le niveau de douleur est évalué quantitativement avec l’échelle des expressions faciales de la souris et, si nécessaire, il reçoit une injection sous cutanée d’un anti-inflammatoire non stéroïdien. Au-delà d’un seuil de douleur, l’animal est euthanasié. Tant que l’animal continue à perdre du poids, l’animal reçoit une injection sous-cutanée quotidienne de sérum physiologique sucré. S'il reprend du poids, il est pesé tous les 3 jours. Si la perte de poids est supérieur à 35 % du poids initial, l’animal est euthanasié. Si besoin, l’animal est placé sur un tapis chauffant. Pendant cette période de récupération, la nourriture est enrichie.
Choix des espèces
Ce modèle animal présente de nombreuses similarités avec la maladie de Parkinson chez l'humain. Il est communément utilisé dans les laboratoires s'intéressant à cette pathologie. Uniquement des mâles de 10 à 12 semaines (au début du protocole) seront utilisés. Cet âge est communément utilisé dans les laboratoires travaillant sur cette pathologie.