Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
CREATION DE MODELES PATHOLOGIQUES CHEZ LE RONGEUR EN VUE DE MIMER DES AFFECTONS CLINIQUES.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Rats : 4000
2500 souris et 4000 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, mis à mort ou cédés à des équipes scientifiques. Ils subissent une chirurgie unique pour créer des modèles de diabète, d'insuffisance hépatique, d'arthrose, d'infarctus du myocarde ou de vagotomie, avec des prélèvements sanguins et une récupération post-opératoire de 48 à 72 heures. Le porteur revendique la production et la mise à disposition de ces modèles pathologiques pour la recherche, en assumant le recours à des animaux "surnuméraires". Il affirme qu'il est "impossible de modéliser une maladie dans sa globalité" par des outils informatiques ou cellulaires.
Objectifs
L’objectif du projet est de permettre la production et la mise à disposition pour la communauté scientifique de modèles pathologiques sur les espèces rat et souris dans le but d’étudier les pathologies associées. Les différents modèles pathologiques sont la création par des procédures de chirurgie de modèle de diabète, d’insuffisance hépatique, d’arthrose, d’infarctus du myocarde et de vagotomie.
Bénéfices attendus
L’utilisation de modèles pathologiques permet l’amélioration des connaissances et de la compréhension de la physiopathologie des affections cliniques associées pour la médecine humaine comme vétérinaire dans différents domaines : facteurs de risques, mécanismes physiopathologiques, essais thérapeutiques, recherche fondamentale, prévention …
Procédures
Tous les animaux dans le cadre de ce projet seront soumis à une procédure chirurgicale unique de quelques minutes à une heure sous anesthésie générale ou injection unique d’un produit sur animal vigile. Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis à des prélèvements sanguins (maximum 4 prélèvements sanguins par jour). Les actes de prélèvements et d’injection ont une durée d’une dizaine de secondes à une minute. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.
Impact sur les animaux
Douleur, stress et perte de poids dus aux contentions, aux procédures chirurgicales et lors de la période de récupération post-opératoire (48-72h). Hébergement individuel possible jusqu’à une semaine.
Devenir
Mise à mort ou envoi chez les scientifiques pour tous les animaux.
Remplacement
L’apparition et l’évolution d’une maladie est un phénomène complexe, faisant intervenir beaucoup de types de cellules et d’organes au sein d’un même corps. De plus, le nombre de ces types de cellules et d’organes ainsi que leur façon de communiquer entre eux ou de réagir ne sont pas semblables selon le stade de la maladie. Cette complexité et le côté dynamique d’une maladie fait qu’il est impossible de modéliser une maladie dans sa globalité par des outils informatiques ou cellulaires par exemple et demande de faire appel à des modèles pathologiques sur des espèces animales telles que le rat et la souris.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires est défini par le scientifique. Il est possible que des animaux surnuméraires doivent être utilisés de par les contraintes du modèle. La réduction de ces animaux surnuméraires repose sur : l'expertise de l’équipe chirurgie et la maitrise des procédures, les locaux adaptés, les données historiques, l’observation de l’état clinique de l’animal en péri-opératoire afin d’adapter les traitements post-opératoires et de diminuer la mortalité éventuelle. Le nombre d’animaux surnuméraires utilisés dans chaque procédure est déterminé au cas par cas, en fonction du degré de difficulté du modèle, du taux de succès de la chirurgie, du nombre d’animaux à opérer, de la souche, du sexe et de la provenance.
Raffinement
Le contrôle de la douleur est réalisé avant la chirurgie et lors du post-opératoire ou en cas de besoin par une administration d’analgésique. L’utilisation complémentaire d’anesthésique local peut être effectuée, si nécessaire. Une injection systématique sous-cutanée de sérum physiologique de réhydratation est pratiquée pour tous les animaux au réveil. Une habituation par la manipulation des animaux peut être effectué dès la phase d’acclimatation. Une observation quotidienne de l’état clinique général des animaux est réalisée tout au long de la procédure. Des soins spécifiques sont apportés en cas de signes cliniques (traitements médicamenteux, ajout d’enrichissement, mesures de réhydratation ou de réchauffement, ajout d’aliment, de gel hydratant, de litière ou d’eau complémentés ou non pouvant être disposés directement dans la cage afin d’en améliorer l’accès). En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort. Des points limites spécifiques sont établis et raffinés au fur et à mesure des observations. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type document qualité d’enregistrement permettant une traçabilité.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce et de la souche est très généralement effectué par le scientifique. Le rat et la souris sont des animaux couramment utilisés dans ce type de projet. Ce sont des mammifères dont l’anatomie et la physiologie sont proches de l’homme, la disponibilité de données historiques chez ces espèces permet d’obtenir des informations fiables et pertinentes. Le choix de l’âge ou du poids des animaux est défini par les scientifiques en fonction de leurs études et des poids et/ou âges minimum pour lesquels les modèles pathologiques peuvent être développés soit : Dès la naissance pour les rats concernant le modèle diabétique. A partir de 25g pour les souris et 125g chez le rat pour le modèle infarctus du myocarde et ligature du canal cholédoque. Dès 125g pour le modèle d’arthrose chez le rat. Dès 175g pour le modèle de vagotomie chez le rat.
La tolérance au réchauffement dépend-elle de la taille de l’individu chez les poissons ? Une étude sur trois espèces marines
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Autres poissons : 48
96 poissons marins, daurades, loups et saupes, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque poisson est marqué d'une puce sous anesthésie puis soumis à des tests d'effort et de tolérance au réchauffement en tunnel de nage et en bassin, pour évaluer si la résistance à la chaleur diminue avec la taille. Le porteur indique que les poissons sont euthanasiés pour retirer la puce, dangereuse si l'animal est mangé. Une grande partie des individus sont prélevés dans les lagunes côtières méditerranéennes avant d'être tués en fin d'expérience.
Objectifs
L’objectif est d’évaluer les relations entre la masse d'un individu et sa tolérance au réchauffement, chez trois espèces de poissons marins côtiers, la daurade royale (Sparus aurata), le loup (Dicentrarchus labrax) et la saupe (Sarpa salpa). Une récente étude a montré, chez une espèce de poisson, que la tolérance au réchauffement diminue avec la taille des individus. Ce phénomène a été mis en évidence avec un test de tolérance qui évalue la capacité des poissons à nager contre un courant pendant qu’ils subissent des augmentations progressives de la température. L’étude a montré une forte relation négative entre masse corporelle et température à laquelle un individu a arrêté de nager. Ces résultats soulèvent une problématique : Cette influence de la taille sur la tolérance est-elle un phénomène universel chez les poissons ? Les trois espèces choisies utilisent les lagunes côtières méditerranéennes comme des nourriceries et zones d’alimentation. Les lagunes semblent être des habitats clefs pour ces espèces mais sont très sensibles aux effets des changements globaux, en particulier un accroissement en fréquence et sévérité d’évènements climatiques extrêmes tels que les canicules estivales. Les vagues de chaleur représentent un risque majeur pour les poissons, il est donc important de comprendre si, chez les espèces de poissons qui utilisent les lagunes, la résistance aux canicules diminue avec l’augmentation de la taille des individus.
Bénéfices attendus
L’hypothèse est que la tolérance au réchauffement va diminuer avec la taille des individus chez les trois espèces ciblées. Le projet montrera si une diminution de la tolérance thermique avec la taille est un principe physiologique universel chez les poissons. Les informations obtenues seront très utiles dans le développement de modèles pour prédire les impacts du réchauffement global et des canicules sur les populations de poissons. Les informations sur les individus sauvages seront utiles pour les plans de gestion des trois espèces, qui sont exploitées par la pêche.
Procédures
Chaque poisson subira quatre interventions : un marquage avec une puce sous anesthésie, un test d'effort en tunnel de nage sur 24h, un test de tolérance au réchauffement en tunnel de nage sur 12h, et un test de tolérance au réchauffement en bassin sur 12h.
Impact sur les animaux
Les nuisances et les effets indésirables devraient être limités, les procédures sont d'une sévérité modérée. Les procédures en tunnel de nage impliquent un confinement mais sont de relativement courte durée et ne sont pas douloureuses. Les réchauffements progressifs représentent des nuisances transitoires d’une sévérité modérée, qui ne menacent pas la survie des animaux. La fatigue dans le tunnel de nage est une nuisance transitoire, d’une durée de moins de 5 minutes.
Devenir
Les poissons seront euthanasiés pour récuperer la puce RFID (PIT-tag) intramusculaire, qui est recouvert de verre et donc dangereux si le poisson est mangé par un prédateur ou par un humain.
Remplacement
Il est impossible de remplacer les poissons sauvages par des autres modèles, l'intêrét du projet étant justement de regarder l'impact sur ces espèces.
Réduction
Le nombre total d'individus sauvages testés sera limité à n = 24 de chaque espèce, plus n = 24 individus domestiqués. Ce nombre limité d’individus permettra, néanmoins, d’établir des relations entre masse corporelle et seuils de tolérance thermique en utilisant des approches de régression. Ce nombre permettra aussi de calculer des moyennes de taux de consommation d’oxygène à chaque température pendant les protocoles, pour évaluer les effets de la température et le comparer entre espèces, en utilisant des modèles linéaires mixtes ou des analyses de variance.
Raffinement
Tout sera mis en oeuvre durant les procédures pour limiter la souffrance et le stress des animaux afin d'obtenir des mesures valides et fiables de la physiologie des individus qui ne soient pas influencées par un état préalable de souffrance, de stress ou d'agitation. Un protocole d'anesthésie optimisé pour ces espèces sera utilisé pendant le marquage. Les poissons sont à l’abri de toute nuisance visuelle et sonore pendant la récupération et les expériences. Les protocoles expérimentaux en tunnel de nage sont bien établis chez les poissons. La phase de capture et de placement dans les dispositifs empêche toute exposition à l’air, et est suivi par une période d'acclimatation d'une durée minimale de 4 heures. Le rechauffement en bassin est aussi une technique largement maîtrisée et utilisée par l’ensemble de la communauté scientifique. Pendant les procédures en bassin les poissons seront observés avec une camera, au moment où un poisson montre des signes de stress comportemental (réponses de fuite, léthargie, perte d’équilibre), il sera enlevé très rapidement et placé dans un deuxième bassin rempli d'eau aérée et à température d'acclimatation, à l’abri de toute nuisance visuelle et sonore.
Choix des espèces
La daurade royale, le loup et la saupe sont des espèces côtières emblématiques en Méditerranée. De nombreux aspects de la physiologie environnementale restent inconnus pour les populations sauvages de ces trois espèces. L’acquisition des connaissances sur leur tolérance thermique pourrait être un appui aux mesures de gestion de ces espèces, dans un contexte des changements globaux. L’utilisation de trois espèces, de familles taxonomiques différentes, permet de montrer si les effets de la taille (masse corporelle) sur la tolérance thermique est un phénomène universel chez les poissons. Pour le fait que l’objectif du projet est l’évaluation des effets de la masse corporelle, les individus auront des stades de développement qui varient de juvéniles immatures à des adultes reproducteurs, avec une gamme de masse entre 30 et 800g.
Interventions pharmacologiques dans l’hypertension : Potentiel thérapeutique et nouveaux mécanismes
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un régime riche en sel leur induit une hypertension, puis elles reçoivent des molécules dans l'eau de boisson, des injections intraveineuses ou intrapéritonéales et des échographies cardiaques sous anesthésie, pour tester l'effet antihypertenseur des polyamines. Le porteur indique que l'hypertension induite provoque un stress et un inconfort, et que tous les animaux sont euthanasiés pour prélever leurs organes. Sur le remplacement, il affirme que le recours aux animaux vivants est "indispensable" car l'hypertension ne peut être reproduite in vitro.
Objectifs
L’hypertension artérielle est une maladie chronique, parmi les plus fréquentes en France. Cette pathologie est caractérisée par une pression anormalement élevée du sang dans les vaisseaux sanguins. Elle constitue, lorsqu’elle n’est pas contrôlée, l’une des principales causes de complications cardiovasculaires, cérébrovasculaires ou neurodégénératives (infarctus du myocarde, AVC…). A ce jour, pour normaliser la pression artérielle, les traitements thérapeutiques impliquent des mesures hygiéno-diététiques seules ou associées à certains médicaments. Nous avons montré que l'apport alimentaire en polyamines est inversement proportionnel aux niveaux de pression artérielle chez l'homme. De plus, les animaux traités avec les polyamines (dans l'eau de boisson) sont moins sensibles à l'hypertension. Dans ce projet, nous allons poursuivre ces observations et étudier si les effets antihypertenseurs des polyamines dépendent de l'induction de l'autophagie ou d'autres mécanismes moléculaires en utilisant un modèle murin d'hypertension, induite par un régime riche en sel, cliniquement pertinent.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie thérapeutique pour traiter l’hypertension artérielle, qui est le principal facteur de risque évitable de maladies cardiovasculaires et de mortalité chez les hommes et les femmes. En effet, l'hypertension artérielle systolique est à l'origine de plus de 10 millions de décès et touche au moins 874 millions de patients dans le monde. De plus, cette pathologie représente un défi majeur pour la santé publique étant la plus coûteuse de toutes les maladies cardiovasculaires.
Procédures
Tous les animaux du projet seront soumis une seule fois à l’induction de l’hypertension via un régime riche en sel (régime suivi pour environ 20 jours). Tous les animaux recevront 2 molécules administrées dans l’eau de boisson (4 semaines). 144 animaux recevront 1 injection i.p. et 144 animaux recevront 1 injection i.v. (animaux vigiles). La durée des injections i.p. et i.v. sont de quelques secondes. 144 animaux seront soumis à un prélèvement sanguin (quelques secondes). Tous les animaux seront soumis à la mesure hebdomadaire de la pression artérielle (animal vigile) (environ 20 min). Tous les animaux seront soumis (3 fois) à l’examen d’échocardiographie sous anesthésie (30 min par examen). L'échocardiographie et la mesure de la pression artérielle sont les méthodes de diagnostic les plus utilisées en cardiologie chez l’homme. Ces pratiques de routine ne sont pas invasives.
Impact sur les animaux
L’hypertension, qui est induite, est modérée. Elle va cependant provoquer un stress et un inconfort chez la souris. Les injections intra-péritonéales et intraveineuses ne provoquent pas de symptômes majeurs et seront effectués sur l’animal vigile.
Devenir
Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, les conséquences et les effets sur l’organisme de l’hypertension artérielle vu sa complexité.
Réduction
Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 432 souris. Sur la base de notre expérience précédente, nous avons effectué un calcul de la taille de l'échantillon de 12 souris par groupe afin d'atteindre une puissance statistique. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs tests statistiques seront utilisés pour comparer les divers groupes de traitements.
Raffinement
Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie des animaux, utilisation de tapis chauffantes...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de 12 semaines car l'âge a un impact sur la production neuronale de neurotransmetteurs et du métabolisme.
Traitement debout par un Champ Electrique Pulsé à Haute Fréquence des zones habituelles des sarcoïdes équins
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Trois juments vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réintégrées au troupeau de chevaux de travaux pratiques. Elles reçoivent, sous sédation, des impulsions électriques destinées à mettre au point un traitement des sarcoïdes équins sans anesthésie générale, sans injection de cisplatine à ce stade. Le porteur indique que le nouveau protocole, à tension réduite, ne devrait pas provoquer la douleur observée avec la méthode actuelle, ce qu'il dit avoir vérifié sur les bras des concepteurs de l'appareil. Il justifie le recours au cheval par l'intérêt d'éviter l'anesthésie générale et ses risques au réveil.
Objectifs
L’électrochimiothérapie (ECT) est une technique largement utilisée pour le traitement des sarcoïdes chez les chevaux. La procédure est habituellement realisée obligatoirement sous anesthesie générale car les impulsions électriques délivrées par le générateur au travers d’electrodes au contact de la tumeur sont à très haute tension. Préalablement aux impulsions électriques, des injections intra-tumorales d’agent cytotoxique (cisplatine par exemple) sont realisées. Les impulsions électriques provoquent la perméabilisation des cellules tumorales et permettent une meilleure pénétration des agents cytotoxiques. Le projet a comme objectif l’essai des applications des champs électriques pulsés (ou impulsions électriques) sur un cheval debout, tout d'abord sans administration de cisplatine. Une fois démontré que l’électroporation ne génère pas une réaction douloureuse pour le cheval ni dangereuse pour le cheval et les opérateurs, nous voudrions passer par la suite à la réalisation de séances d’ECT debout, sans l’obligation de devoir soumettre le cheval à une anesthésie générale, comme c’est le cas actuellement. Le fait d’éviter l’anesthésie générale et surtout le réveil évite une grande partie des risques de mortalité et d’accidents associés à cette procédure.
Bénéfices attendus
Les sarcoïdes sont des tumeurs bénignes très fréquentes chez les chevaux et nous recevons beaucoup de cas en consultations pendant toute l’année. Le traitement le plus efficace, et qui surtout évite le risque de récidives (très fréquent avec ce type de tumeur), est l’électrochimiothérapie (ECT). Nous proposons ce traitement quasiment pour tous les cas de sarcoïdes. Certains propriétaires acceptent ce traitement sans problèmes, alors que d’autres refusent de traiter leur cheval principalement pour une raison financière (chaque séance coute environ 900 euros, et il faut réaliser au moins 3 séances pour avoir un bon résultat) ou pour des inquiétudes liées aux risques d'une anesthésie générale. Si les sarcoïdes ne sont pas traités, ils vont la plupart du temps augmenter en taille et être gênants pour le cheval. Dans le pire des cas, si la localisation et la taille sont incompatibles avec la vie du cheval, l’euthanasie est conseillée. Ce protocole électrique amélioré de l’ECT (train d’impulsion plus court et à 800 Volts au lieu de 1 300) aurait plusieurs impacts très positifs : 1. Le cheval pourrait être juste sédaté au lieu de subir une anesthésie générale lourde, 2. La nécrose liée au champ électrique seul serait minimisée, 3. La durée du traitement et les soins liés à l’anesthésie seraient très réduits, 4. Le coût pour les propriétaires serait divisé par 4, rendant plus accessible ce traitement et incitant les propriétaires à traiter ces tumeurs à des stades plus précoces qu’actuellement.
Procédures
1. Une séance d'électrostimulation sous sédation avec maximum 3 localisations testées par jument, 30 min par jument; 2. Administration d'AINS par voie intraveineuse, une intraveineuse à J1; 3. Administration d'AINS par voie orale, maximum 2 fois par jour pendant 3 jours puis une fois par jour pendant 3 jours; 4. Examen clinique par un vétérinaire pendant 1 semaine, 10 min/jour; 5. Hébergement en box pendant une semaine avant retour au pré.
Impact sur les animaux
Les impulsions électriques du nouveau protocole sont délivrées à une fréquence autour de 1 MHz contre 5 kHz actuellement, et sont surtout multipolaires ; c’est cette combinaison qui réduit drastiquement la stimulation des axones des cellules nerveuses par rapport aux impulsions unipolaires délivrées actuellement en médecine vétérinaire et en médecine humaine. De plus, la tension a été réduite de 1 300 V à 800 V, ce qui fait que l’intensité de la douleur associée à la réaction nerveuse et musculaire (spasmes et contractions généralisés du corps du cheval) que nous observons avec le protocole actuel, ne seront plus présentes. Le cheval ne va pas sentir de douleur mais une légère sensation très localisée (voire aucune sensation). Tous les protocoles électriques ont été testés sur les bras et jambes des trois concepteurs du générateur du projet afin de vérifier l’absence de douleur. À l’issue de ce projet, lorsque les chevaux seront traités avec injection préalable de cisplatine, un œdème de la zone traitée peut être attendu le jour du traitement, qui peut durer quelques jours après la seance. Nous l’avons aussi avec le protocole actuel et cela correspond à l’inflammation créée par le cisplatine et l’électroporation. Quelques jours après le traitement la zone traitée peut devenir exsudative et montrer une légère nécrose, due à l’action cytotoxique du cisplatine dans les cellules tumorales, résultat que nous rechercherons avec le cisplatine parce qu’il indique un bon fonctionnement. Des anti-inflammatoires sont toujours donnés au cheval avant et après la séance, pendant plusieurs jours. Le propriétaire est toujours prévenu de cet effet indésirable.
Devenir
La procédure n'impactant pas la qualité de vie des animaux, ils pourront retourner dans le cheptel des chevaux de TP de l'ENVT.
Remplacement
Des essais in-vitro, sur des cellules tumorales ainsi que des cellules saines, ont été menés au préalable afin de démontrer l’efficacité du nouveau protocole avec une mortalité accrue des cellules tumorales et une survie plus élevée des cellules saines qu’avec le protocole d’ECT actuel. Parmi les protocoles électriques les plus efficaces, a été retenu celui dont la sensation ressentie a été la plus faible sur les bras et jambes des concepteurs du générateur. Le millier d’essai in vitro a donc permis de déterminer les valeurs optimales des impulsions (champ électrique, intensité, durée, fréquence), et il n’est donc pas question de faire des tests sur les chevaux en faisant varier des paramètres, d'où une réduction du nombre d'animaux pour ce projet. Il est maintenant nécessaire d’évaluer l’absence ou la faible réaction du cheval sous sédation avec ce nouveau protocole, avant d’envisager par la suite d’évaluer son efficacité sur des tumeurs solides.
Réduction
Nous voudrions tester le nouveau protocole avec 3 juments, afin d’évaluer les différents réactions subjectives que chaque cheval peut avoir par rapport à sa perception de la douleur. Nous n’avons pas besoin d’autres animaux en plus pour pouvoir valider le projet.
Raffinement
Nous allons noter, documenter et filmer toutes les différentes phases du protocole sur chaque jument, afin de suivre au mieux l’évolution du projet. Chaque jument est sedatée par voie intraveineuse, pour réduire encore plus la sensibilité pendant l’électroporation. Des anti-inflammatoires et antidouleurs sont administrés avant la séance (Jour 0) par voie intraveineuse. Le jour après (Jour 1) nous utilisons la même dose d’anti-inflammatoires par voie intraveineuse. Le Jour 2 des anti-inflammatoires sont donnés 2 fois par jour par voie orale. En fonction de la réaction locale (œdème plus ou moins marqué), nous déciderons de la prolongation ou non du traitement anti-inflammatoire oral. Les juments seront observées pendant 1 semaine après la seance, plusieurs fois par jour. Ces juments sont hébergées en groupe au pré au sein d'un Centre Equestre. Elles pourront être séparées du groupe pour les essais mais seront alors placées dans des boxs au sein de la clinique équine, lieu dans lequel elles sont habituées à être logées lors des séances de Travaux Pratiques.
Choix des espèces
Le nouveau protocole a pour vocation d'être utilisé par la suite en médecine équine. De plus, le cheval représente l’espèce la plus indiquée dans ce cas parce que le fait de pouvoir éviter l’anesthesie générale avec cette espèce réduit considérablement les risques de fractures, d'œdème pulmonaire, d’arrêt cardiaque, qui peuvent se passer pendant le réveil. Adultes car la plupart des sarcoïdes sont présents sur des chevaux adultes et non sur des poulains ou nouveau-nés.
Comparaison des caracteristiques pharmacocinetiques d’une molecule innovante administree par les voies intraveineuse, intraperitoneale et orale chez la souris NMRI
- Recherche fondamentale
- Oncologie
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque souris reçoit une injection intraveineuse, intrapéritonéale ou un gavage d'un candidat médicament contre le glioblastome, avant d'être mise à mort pour prélever le liquide céphalorachidien, l'urine, le sang et les organes. Le porteur indique avoir utilisé au préalable des modèles cellulaires 2D et 3D pour cadrer les doses. L'objet du projet est de mesurer la façon dont la molécule se distribue et s'élimine dans l'organisme selon la voie d'administration.
Objectifs
Depuis plusieurs années, nous développons une molécule innovante pour le traitement d'une forme très agressive et incurable de cancer du cerveau, le glioblastome. Son efficacité anti tumorale a été mise en évidence dans des souris chez lesquelles nous avions greffé des cellules cancéreuses provenant de patients. La demande actuelle a pour objectif d'identifier les caractéristiques pharmacocinétiques de ce candidat médicament dans le modèle murin selon différents modes d'administration.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer la manière dont le candidat médicament se distribue dans l'organisme, la vitesse à laquelle il est éliminé ainsi que le mode d'administration le mieux adapté. Ces caractéristiques sont importantes pour optimiser le traitement contre ce type de tumeur cérébrale chez l'humain.
Procédures
Chaque souris aura à subir une injection intrapéritonéale, intraveineuse ou un gavage selon le mode d'administration du candidat médicament. Ces gestes ne durent pas plus qu'une dizaine de secondes. Au terme de l'incubation, chaque souris recevra une dose d'anesthésique par voie intrapéritonéale d'une dizaine de secondes.
Impact sur les animaux
La molécule innovante a fait l'objet d'études préalables de toxicité aïgue et chronique. A la dose utilisée, aucun effet indésirable n'a été observé. Les animaux auront toutefois à subir la nuisance des injections intrapéritonéales, intraveineuses et du gavage au cours desquelles le composé à l'étude sera administré.
Devenir
La procédure comporte le prélèvement du liquide céphalorachidien, de l'urine, du sang et des organes. Les animaux seront donc mis à mort.
Remplacement
Au cours du développement du projet, nous avons utilisé des modèles cellulaires in vitro 2D et 3D pour optimiser la concentration efficace et déterminer la gamme de toxicité du principe actif.
Réduction
Le design expérimental en pharmacocinétique est variable. Nous avons choisi de limiter le nombre d'animaux nécessaire à l'étude en adoptant comme comparateur un groupe unique de souris à t=0. Cela a permis de réduire de moitié le nombre d'individus.
Raffinement
Pendant le temps de la procédure expérimentale (48h), les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnent enrichi, sans isolement et en accord avec la réglementation en vigueur. Nous apporterons un soin particulier lors de l'acclimatation à habituer les animaux à la présence de l'expérimenteur et à être manipulés (contention). Ainsi le niveau de stress sera diminué lors de la procédure qui durera 48h.
Choix des espèces
A ce stade du développement pré-clinique du médicament, la souris est le modèle de référence le plus proche de l'humain pour obtenir les résultats nécessaires La pathologie visée affecte les adultes. Aussi nous utiliserons des souris adultes
Impact des oméga-3 alimentaires dans la relation microglie-neurone et les altérations cognitives induites par le vieillissement.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
912 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent des tests comportementaux dont un test de peur conditionnée par chocs électriques, sous différents régimes alimentaires, pour étudier l'effet des oméga-3 sur le vieillissement cognitif. Le porteur indique que les souris sont mises à mort pour prélever les structures cérébrales, et que les régimes n'affectent pas le bien-être des animaux non-humains. Sur le remplacement, il affirme que l'étude des comportements ne peut se faire que sur des animaux vivants et vigiles.
Objectifs
Le vieillissement s’accompagne d’une inflammation chronique à bas bruit, c’est-à-dire qu’elle est silencieuse, le mécanisme inflammatoire se situe alors sous le seuil de la douleur et cause des dégâts dans l’organisme sans qu’il y ait de foyer inflammatoire précis. Cette inflammation est associée à des modifications du système immunitaire cérébral, des altérations des fonctions neuronales et des déficits cognitifs de degré variable. Les fonctions cérébrales impliquent notamment la communication entre les neurones et les cellules microgliales, les principales cellules du système immunitaire cérébral. Cette communication repose entre autres sur des vésicules extracellulaires, les exosomes, complexes protéiques impliqués dans la communication neurones-cellules gliales, qui participent à la fois aux fonctions physiologiques et aux réponses neuroinflammatoires, c’est-à-dire à l’inflammation dans le cerveau. L’alimentation à laquelle nous sommes exposés tout au long de la vie est clé dans le bon fonctionnement cérébral et le vieillissement cognitif. Ainsi, certains nutriments comme les acides gras polyinsaturés n-3 (AGPI n-3) ou oméga 3, ont un rôle bénéfique sur les fonctions cognitives. Cependant, leurs mécanismes d’action pour prévenir ou atténuer le déclin cognitif restent à ce jour méconnus. Ce projet consiste à identifier les biomarqueurs cérébraux du risque de déclin cognitif accéléré et de déterminer des combinaisons de nutriments pour maintenir les fonctions cognitives avec l’âge. Dans ce contexte, le projet de recherche que nous souhaitons développer a pour objectif d’identifier des biomarqueurs mécanistiques cérébraux associés au déclin cognitif, de déterminer leur rôle fonctionnel dans le déclin cognitif et de développer des approches nutritionnelles personnalisées ciblant la neuroinflammation pour restaurer les capacités cognitives du sujet âgé afin de promouvoir le bien vieillir cérébral. Pour ce faire, nous allons allier dans cette étude nutrition, neuroinflammation, microglies et analyse des exosomes.
Bénéfices attendus
Notre étude associe une approche nutritionnelle à une approche comportementale et électrophysiologique dans le cadre de troubles cognitifs liés à l’âge, afin de mettre en avant la relation microglies-neurones via les exosomes.
Procédures
Tests comportementaux à 3 mois ou à 18 mois (3 tests par animal) – quelques minutes par test.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront des chocs électriques de faible intensité pour le test de peur conditionnée. Les autres tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes, peuvent entrainer des nuisances modérées notamment durant les tests sur le stress, mais n’induisent pas d’altération de l’état général des animaux. Les régimes équilibré, carencé ou supplémenté en Oméga 3 n’impactent en rien le bien-être de l’animal.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour récupérer les structures et/ou cellules nécessaires pour les études cellulaires et moléculaires.
Remplacement
L’étude des régimes alimentaires nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. L’objectif général du projet vise à étudier les conséquences d’une carence nutritionnelle en omega-3 sur la physiologie neuronale et microgliale chez la souris pendant le développement. Pour se faire, nous utilisons des tests in vivo, et dans ce contexte, bien que certaines études soient développées sur des modèles cellulaires pour traiter les aspects neurobiologiques, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, les animaux qui passeront les tests comportementaux serviront également pour récupérer les cellules ou structures centrales nécessaires pour les études de lipidomiques et/ou moléculaires et protéomiques, évitant donc de générer une nouvelle cohorte pour ces analyses biochimiques et moléculaires. Les femelles sont également étudiées, ce qui nous permet d'utiliser tous les animaux générés durant cette étude et de ne pas euthanasier des animaux pour rien.
Raffinement
Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur, la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupe sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire.
Choix des espèces
L’objectif général du projet vise d’identifier des biomarqueurs mécanistiques cérébraux associés au déclin cognitif, de déterminer leur rôle fonctionnel dans le déclin cognitif et de développer des approches nutritionnelles personnalisées ciblant la neuroinflammation pour restaurer les capacités cognitives du sujet âgé afin de promouvoir le bien vieillir cérébral. Pour ce faire, nous utilisons des modèles souris. Une partie de nos hypothèses ont été formulées sur la base de données obtenues in vitro. Cependant dans la cadre d’une étude faisant le lien entre la nutrition et le cerveau, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Les animaux reçoivent un régime alimentaire (équilibré, carencé ou enrichi en AGPI n-3) durant toute la durée de leur développement périnatal (gestation et allaitement) ou à l’âge adulte ou en fin de vie. Nous nous intéressons à l'effet de cet apport nutritionnel sur les aspects cognitifs à l’âge adulte (3 mois) ou en fin de vie (18 mois). La souris est un modèle pertinent et reconnu en nutrition et vieillissement, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier notamment le cerveau et son fonctionnement. Nous travaillerons avec la lignée C57bl/6.
Optimisation de la distribution intratumorale d’anticorps et fragments d’anticorps pour l’imagerie par émission de positron et la radiothérapie interne vectorisée dans des modèles d’adénocarcinome pancréatique murins
- Recherche fondamentale
- Oncologie
2874 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur pancréatique sous la peau ou dans le pancréas par chirurgie abdominale, puis un produit radioactif par voie intraveineuse et des séances d'imagerie, pour tester le diagnostic et la radiothérapie du cancer du pancréas. Le porteur indique une surveillance de la croissance tumorale et une mise à mort dès qu'un seuil de volume ou une perte de poids de 20 % est atteint. Il affirme qu'il n'existe "pas de modèles in vitro et in silico" reproduisant la complexité du milieu tumoral.
Objectifs
L'adénocarcinome ductal pancréatique (PDAC) représente 90% des cancers du pancréas. Il se classe à la 4ème place des causes de mortalité par cancer et la survie à 5 ans est aujourd’hui inférieure à 10%. Ce cancer souffre aujourd’hui de méthodes diagnostiques invasives et d’options thérapeutiques très limitées. Ce projet a pour objectif d’évaluer différents vecteurs biologiques pour la délivrance de radionucléides pour un diagnostic non-invasif et une thérapie ciblée du PDAC. Ce type d’approche a déjà été appliqué par l’équipe dans le cadre du cancer ovarien et fait l’objet de nombreux essais cliniques. Nous évaluerons le ciblage d’un récepteur exprimé à la surface des cellules de PDAC, ayant été validé sur des échantillons de PDAC humains et dont le potentiel clinique pour l’imagerie et la thérapie est établi. Nous souhaitons tester sur des modèles murins de PDAC, différents vecteurs biologiques afin d’évaluer l’impact de la taille du vecteur sur la distribution et la pénétration dans la tumeur. Cette étude permettra d’identifier le vecteur permettant d’identifier les sites tumoraux avec la meilleure définition et de détruire les cellules tumorales avec la plus grande efficacité.
Bénéfices attendus
Ce projet validera au stade préclinique l'utilisation de radiopharmaceutiques pour l'imagerie et la radiothérapie du cancer pancréatique. Le développement d’une telle approche à fort potentiel de transfert clinique pourrait favoriser le diagnostic précoce et la thérapie ciblée des 14’000 patients atteints de PDAC diagnostiqués chaque année en France. Une translation clinique est envisagée à la fin de cette étude avec le soutien d'un industriel (co-financeur du projet).
Procédures
Pour l’ensemble de ce projet, nous avons prévu un nombre de 2874 souris sur une durée de 5 ans. Des souris saines et des souris porteuses de tumeurs pancréatiques seront utilisés. Les tumeurs pancréatiques seront implantés soit sous la peau des souris par une injection sous-cutanée soit directement dans le pancréas de la souris lors d'un chirurgie abdominale sous anesthésie générale. Les animaux recevront par voie intraveineuse un radiopharmaceutique. Une partie des animaux sera alors utilisé pour valider le potentiel diagnostic de l'approche, les animaux seront anesthésiés et imagé par une technique d'imagerie non-invasive. Une deuxième partie des animaux sera utilisé pour quantifier la concentration du radiopharmaceutique dans 15 organes différents. Enfin, la dernière partie des animaux sera utilisé pour valider le potentiel thérapeutique de cette approche. Après l'injection du radiopharmaceutique, la croissance des tumeurs des animaux sera surveillée quotidiennement et plus particulièrement de manière bi-hebdomadaire par une mesure au pied à coulisse ou par une technique d'imagerie non-invasive.
Impact sur les animaux
Effets indésirables direct: - douleur associée à une injection sous-cutanée - douleur associée à une injection intrapéritonéale - douleur associée à une injection intraveineuse - douleur associée à une laparotopie et injection intrapancréatique. Effets indérisables indirect conséquence des produits injectés: - croissance tumorale - perte de poids.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés selon une méthode adapté pour l'animal (non anxiogène, indolore, perte de connaissance instantanée), pour l'expérimentateur (sans danger, sans risque de choc émotionnel), pour l'expérience (pas de modification des tissus nécessaire à l'expérimentation).
Remplacement
Ils n’existent pas de modèles in vitro et in silico reproduisant la complexité du milieu tumoral et permettant de déterminer la biodistribution d’un radiopharmaceutique.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en conservant une puissance statistique suffisante pour le traitement du résultat (analyse statistique préliminaire). L’évaluation de la pharmacologie de radiopharmaceutiques nous contraint à l’utilisation de plusieurs groupes contrôles. Néanmoins, le suivie par une technique d’imagerie non invasive, nous permet de réduire le nombre d’animaux utilisés dans les protocoles expérimentaux puisqu’il n’y a pas de sacrifices à chaque temps d’imagerie.
Raffinement
Toutes les expériences suivent les recommandations du Gircor (Guide l'évaluation éthique), la "Charte pour une éthique de l'expérimentation animale" et le "Guidelines for the welfare and use of animals in cancer research "(Workman et al ; British Journal of Cancer ; 2010) . Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les mêmes membres du personnel. Un suivi quotidien des signes de souffrance sera effectué. Dans le cas où un animal présenterait des signes de souffrance ou perte de poids excessive (>20% du poids initial), ses douleurs ou sa détresse seront soulagées ou supprimées si les signes persistent plus de 24h selon des méthodologies adaptées au maintien du bien-être animal. Quand le volume tumoral dépassera un seuil limite défini pour chaque protocole l'animal sera sacrifié.
Choix des espèces
Il n’existe pas de méthodes alternatives aux expériences envisagées qui reposent sur les paramètres pharmacocinétiques et pharmacodynamiques in vivo des radiopharmaceutiques. Seule une étude in vivo permettra d’avoir des informations sur la biodistribution en temps réel et l’efficacité thérapeutique des radiopharmaceutiques. Age 6-8 semaines, animal adulte. Les cancers pancréatiques étant dominants dans la population adulte, les animaux utilisés seront donc en age adulte.
Développement d’un biomatériau pour la prévention des fistules salivaires en chirurgie cervico-faciale_changement d’EU
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
38 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Trois subissent une irradiation cervicale et trente-cinq une laryngectomie totale avec ablation du larynx, pour tester un biomatériau censé prévenir les fistules salivaires après chirurgie du cancer. Le porteur décrit des atteintes lourdes possibles, hématome, infection, fistule, douleurs à l'alimentation et troubles du comportement liés à l'impossibilité d'émettre un son, les animaux étant gardés vivants le temps de la cicatrisation avant mise à mort pour analyse. Il affirme qu'il n'est "pas possible de se passer d'animaux" et qu'aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne convient.
Objectifs
Le présent projet vise à développer un biomatériau innovant (DM) sous la forme d'un film double couche pour la prévention des fistules salivaires. Le projet est une collaboration entre un établissement de santé spécialisé en cancérologie, 2 laboratoires de recherche académique spécialisés dans les biomatériaux, 2 partenaires industriels. Ce projet s’appuie sur des résultats préliminaires concernant le design de biomatériaux à base d’alginate. L'objectif du projet présenté ici est l’évaluation in vivo du DM avec 3 tâches : 1) mise au point d’un modèle de mini-porc irradié (n=3); 2) mise au point d’un modèle de mini-porc laryngectomisé (n=5); 3) évaluation de l’efficacité du DM sur des porcs laryngectomisés avec ou sans irradiation (n=30). Afin de répondre à ces objectifs le nombre total d’animaux utilisés sera donc de 38.
Bénéfices attendus
Développement d'un biomatériau innovant permettant de diminuer le taux de fistule salivaire après laryngectomie totale chez l'homme, qui est une complication fréquente et potentiellement fatale. Cette complication est associée à une morbidité et des dépenses de santé importantes. De nombreux bénéfices secondaires sont attendus, comme une diminution de la morbidité et de la durée d'hospitalisation moyenne après laryngectomie totale.
Procédures
Irradiation cervicale (classe modérée) chez 3 porcs : une dose de 10 grays centrée sur le cou, en une séance, sous anesthésie générale, précédée d'un scanner de centrage. Laryngectomie totale (classe sévère) chez 35 porcs : chirurgie sous anesthésie générale avec exérèse du larynx et fermeture du pharynx.
Impact sur les animaux
Irradiation cervicale : risque de mucite radique causant des douleurs à l'alimentation, dermite radique causant des lésions cutanées douloureuses, oedème laryngé causant un légèr frein respiratoire. Laryngectomie totale : risque d'hématome, infection du site opératoire (abcès), fistule salivaire (pharyngostome), douleurs à l'alimentation, troubles comportementaux dus au handicap vocal (impossibilité d'émettre un son), mauvaise tolérance de la canule, décanulation accidentelle potentiellement léthale.
Devenir
Nécessité de garder les animaux en vie le temps de la cicatrisation muqueuse et la résorption du biomatériau suite à la chirurgie. Mise à mort nécessaire pour l'analyse de la cicatrisation (présence ou non de fistule salivaire) et de la biocompatibilité/biointégration du biomatériau le cas échéant.
Remplacement
Il n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet. En effet, avant de pouvoir mettre en place les premiers essais cliniques chez l'Homme, il est nécessaire de vérifier l'efficacité du nouveau biomatériau dans une étude préalable sur modèle animal. Aucun modèle animal répondant à notre cahier des charges n'a été publié à ce jour, ce qui justifie la réalisation de notre projet. Aucune alternative in silico, in vitro ou ex vivo ne peut reproduire les conditions physiopathologiques nécessaires : processus cicatrisation en présence potentielle mais non systématique de salive, tissus irradiés etc.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé en respectant les critères pour une analyse statistique appropriée*. Dans la procédure 2 nous devrons adapter les canules de trachéotomie, l’alimentation etc. Si tout se passe bien et que nous pouvons garder les animaux en vie 1 mois nos réduirons le nombre d’animaux de la procédure 3 non irradiés et sans biomatériaux. *Le principal critère d'évaluation est le taux d'animaux sans fistule. En utilisant un plan A'Hern (alpha=10%, 1-beta=80%) et (p0=45% ; p1=70%), 20 animaux doivent être inclus dans le bras expérimental à savoir biomatériau. Les règles de décision sont : insuffisamment efficace < 12 succès/20 < suffisamment efficace. Comme le bras de contrôle n'est là que pour estimer un taux de réussite, 10 animaux seront inclus dans le bras de contrôle. Par conséquent, 30 animaux doivent être inclus dans cette étude de la procédure 3.
Raffinement
Les méthodes d’analyses utilisées, les plus avancées, permettent d’obtenir une précision dans les mesures conduisant à réduire la variabilité expérimentale et donc le nombre d’animaux utilisés. Le bien-être de l’animal, outre les considérations éthiques, est aussi un facteur de variabilité expérimentale, qui est pris en compte et réduit grâce au suivi rapproché quotidien des animaux, l’aide à l’alimentation en cas de besoin, l’enrichissement de leur environnement et le respect de l’aspect social du groupe. La responsabilisation du manipulateur et le respect de l’animal nous conduisent à prendre en charge la prévention de la souffrance, notamment par l’application stricte de points-limites préalablement définis. En cas de signes externes de souffrance (cachexie, prostration, fièvre) persistant pendant plus de 24h, les animaux seront mis à mort pour raisons humanitaires.
Choix des espèces
Animaux mâtures sexuellement pour limiter la régénération des tissus, plus intense chez chez les animaux en croissance (juvéniles). L'âge est relativement secondaire en revanche nous visons des animaux dont le poids est stabilisé entre 45 et 60 kg. Cette stabilité (relative) du poids est habituellement atteinte entre 12 et 18 mois. Des modèles porcs irradiés au niveau thoracique ou de la mâchoire ont été décrits dans la littérature, il n’existe pas de modèle décrit au niveau cervical. Pour les tests in vivo de ce projet, la validation d'un modèle de mini-porc irradié au niveau du cou est nécessaire. Un modèle de laryngectomie totale (LT) chez le porc a déjà été décrit pour la recherche sur la transplantation laryngée, mais les animaux ont été gardés en vie peu de temps et l’objectif n’était pas le contrôle des fistules salivaires. Afin de valider et de se familiariser avec la procédure, une LT avec gastrostomie sera réalisée sur 5 animaux.
Role de Foxk1 dans la lutte anti-tumorale
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales par injection intradermique et intraveineuse, puis des lymphocytes T modifiés, pour étudier le rôle de la protéine Foxk1 dans la réponse anti-tumorale. Le porteur indique que la croissance tumorale peut entraîner perte d'appétit, perte de poids et perte de sociabilité, et que les animaux dont les atteintes persistent au-delà de huit jours sont mis à mort. Il affirme qu'il n'existe "aucune alternative" à l'expérimentation animale et que le recours à la souris est "crucial".
Objectifs
Les réponses immunitaires efficaces contre les cellules malignes et les pathogènes sont le résultat de processus cellulaires complexes et hautement coordonnés. Au cours des dernières décennies, d'importants efforts de recherche ont montré que des cellules immunitaires appelées cellules T jouent un rôle central dans le développement de ces processus. Le développement de drogues qui ciblent les cellules T est apparu comme un mode d'action efficace pour renforcer l'activation des lymphocytes T contre les cellules cancéreuses. Les thérapies basées sur des modifications génétiques qui ciblent les cellules T constituent une deuxième approche fructueuse et offrent un moyen unique d'armer les lymphocytes T pour éliminer certaines tumeurs. Cependant, malgré le succès remarquable de l'immunothérapie du cancer, tous les patients ne répondent pas à ces nouveaux traitements et certains développent des signes cliniques liés à des effets secondaires nocifs. L'activation des lymphocytes T est intimement liée aux activités métaboliques qui dictent l'ampleur de la réponse immunitaire. À cet égard, le ciblage des composants moléculaires impliqués dans l'aptitude métabolique des cellules T est très prometteur pour améliorer les fonctions anticancéreuses de ces cellules. Un de ces composants moléculaires appelé Foxk1 a été identifié comme étant un acteur clé du métabolisme des cellules T et constitue en ce sens une cible intéressante pour moduler les fonctions effectrices des cellules T contre les cellules cancéreuses. Le projet vise donc à caractériser le rôle de Foxk1 dans les cellules T, et à réguler ses fonctions dans le contexte des réponses anti-tumorales.
Bénéfices attendus
Un défi important dans la recherche biomédicale actuelle et son application pharmaceutique en immuno-oncologie est d'identifier les mécanismes moléculaires qui peuvent être ciblés pour reprogrammer les cellules T, et modifier leurs fonctions et leur devenir, afin de mieux contrôler les réponses anticancéreuses. Dans ce contexte, la reprogrammation du métabolisme des cellules T apparaît comme une voie alternative et prometteuse pour moduler les réponses des cellules T. Ainsi, le projet présenté ici explore cette possibilité en se concentrant sur Foxk1 qui constitue un candidat prometteur pour contrôler le métabolisme des cellules T et qui pourrait donc faire l'objet d'une intervention pharmaceutique visant à augmenter ou à diminuer les fonctions des cellules T. Par ailleurs et au-delà du facteur de transcription Foxk1, ce projet constitue une preuve de principe pour cibler les effecteurs impliqués dans les programmes métaboliques, offrant de nouvelles opportunités thérapeutiques pour reprogrammer les cellules T dans les réponses anticancéreuses.
Procédures
Les animaux impliqués dans cette recherche seront greffées avec des cellules tumorales (par injection intradermique et injection intraveineuse). Des cellules T modifiées seront subséquemment injectées par voie intraveineuse afin de déterminer leur effet sur dans la réponse anti-tumorale. Chacune de ces 3 types de procédures se déroule sur plusieurs minutes.
Impact sur les animaux
Du fait des protocoles envisagés, plusieurs nuisances sont attendues sur les animaux. 1. les animaux seront soumis à des anesthésies avec possiblement une conséquence de déshydratation. 2. l’injection et la croissance tumorale pourra conduire à une perte d’appétit, une perte de poids et perte de sociabilité vis-à-vis des congénères.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin d'analyser les tailles de tumeurs, les infiltrats cellulaires aux seins de ces tumeurs et des ganglions drainant. De manière générale, le suivie de la réponse immunitaire et en particulier des lymphocytes T, objet de l'étude, nécessite l'euthanasie des animaux à l'issue des procédures.
Remplacement
Il n’existe à ce jour aucune alternative à l’expérimentation animale lorsqu’il s’agit de modéliser les processus complexes de développement de la réponse immunitaire dans un contexte tumoral. Afin d’étudier de nouvelles approches d’immunothérapie, l’utilisation de modèles murins est cruciale.
Réduction
Nous souhaitons étudier des populations cellulaires dont certaines sont rares mais dont la distribution suit une loi normale N ( μ = 15, σ = 3). Sur la base de nos expériences antérieures et des données de littérature traitant du suivi de la croissance tumorale, nous savons que des groupes de maximum 5 animaux (suivi immuno) et 10 animaux (croissance tumorale), analysés avec le test two-tailed student’s test with welch’s correction nous permettent d’obtenir des résultats significatifs et doivent être réalisés en duplicat pour être publiables. La validité statistique des résultats (différence significative entre les groupes) sera évaluée par les tests statistiques suivants : two-tailed student’s test with welch’s correction ANOVA et/ou Mann Whitney.
Raffinement
Toutes les procédures expérimentales du projet sont réalisées en tenant compte du bien-être animal dans le strict respect des réglementations en vigueur et en étroite collaboration avec la structure du bien-être animale de notre établissement. Les expérimentations seront optimisées dans l’optique de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subie par les souris afin d'obtenir des données qui soient le moins biaisées possible par le "mal être" de l'animal. Une anesthésie générale sera utilisée durant les procédures expérimentales (transplantation de cellules tumorales, injection intraveineuse). Nous allons implanter des cellules tumorales par injection sous cutanée puis traiter les animaux pour réduire le développement tumoral. Nous porterons une attention particulière à la taille de la tumeur et au poids de l’animal mais aussi à leur posture et leur comportement en groupe. Les animaux seront observés 1 à 2 fois par semaine post injection des cellules tumorales et un tableau listant les points limites suivants sera utilisé. Si les points limites persistent au-delà de 8 jours, l’animal sera euthanasié. Pour toute expérience nécessitant une manipulation de l’animal, ceux-ci seront anesthésiés avec les méthodes autorisées. Le suivi des points limites sera réalisé par les expérimentateurs impliqués dans le projet (Chercheur, post doc, ingénieur, étudiant en thèse).
Choix des espèces
Il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin de mimer le plus fidèlement la pathologie cancéreuse humaine et d'étudier en détail l’infiltrat immunitaire associé au développement tumoral et le comparer à l’infiltrat immunitaire présent lors du rejet tumoral. Dans le laboratoire, nous avons choisi de travailler sur la souris comme modèle animal car nous pouvons facilement les manipuler génétiquement et aussi nous pouvons reproduire au mieux la complexité biologique du système immunitaire dans le développement tumoral.
Évaluation d’une thérapie peptidique chez le rat R-DMDdel52, modèle de la dystrophie musculaire de Duchenne.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
174 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue par injection létale, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère. Porteurs d'une forme de myopathie de Duchenne, ils développent une perte de masse musculaire, une faiblesse croissante et une atteinte cardiorespiratoire, jusqu'à une mise à mort dite compassionnelle entre six et treize mois, et reçoivent jusqu'à plusieurs dizaines d'injections d'une protéine testée. Le porteur décrit un comportement de "freezing" et une surveillance rapprochée, et affirme n'attendre aucune toxicité du traitement. Il retient le rat plutôt que la souris car son modèle "mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle".
Objectifs
La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie rare causée par des mutations dans le gène de la dystrophine porté par le chromosome X. La myopathie est rapidement invalidante. Le déficit en dystrophine induit une perte progressive de force dans les muscles, menant à la perte de l'ambulation à un âge médian de 10 ans. L'atteinte des muscles de la ventilation et du muscle cardiaque entraine une insuffisance cardiorespiratoire fatale à l'âge médian de 20 ans. Il n'existe à ce jour aucune thérapie curative. Cependant, l'utilisation des glucocorticoïdes, traitement de référence largement répandu chez les enfants, permet de retarder significativement la perte d'ambulation et le décès d'environ 2 à 8 ans, avec le désavantage de provoquer un grand nombre d’effets secondaires qui dégradent la qualité de vie des patients. Depuis 5 ans, on assiste à une accélération de propositions d'autorisation de mise sur le marché (composés pharmacologiques, vecteurs de thérapie génique) et on dénombre une cinquantaine d'essais cliniques en cours (clinicaltrials.gov). Sur le plan mécanistique, l'absence de dystrophine dans les cellules cardiaques et les cellules des muscles squelettiques induit d'abord une dysfonction, puis une fragilité et enfin une rupture des membranes cellulaires lors des cycles de contraction/relâchement de ces muscles. Il s'ensuit une mort des fibres musculaires à l'origine de la perte de force musculaire et une série de mécanismes secondaires délétères tels que l'inflammation chronique, l'accumulation de matière fibreuse et une formation de vaisseaux sanguins inappropriée. Cette combinaison empêche les cellules souches musculaires de réparer durablement le muscle. Dans ce contexte, notre objectif scientifique est de proposer une alternative aux traitements existants incluant les glucocorticoïdes en apportant la preuve de principe préclinique de l'efficacité d'une thérapie innovante. En se basant sur une étude précédente réalisée chez la souris, l'hypothèse est qu'une forme non oxydable d'une protéine X serait capable de ralentir la progression de la DMD, en luttant contre l'inflammation et le stress oxydatif impliqués dans la pathologie. L’efficacité de la protéine X sera testée sur les rats DMD seule ou en association avec un traitement aux glucocorticoides.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet vise à obtenir des données robustes démontrant le bénéfice du traitement avec la protéine X sur le modèle original et pertinent du rat DMD récemment développé. La protéine X est un nouvel acteur dans la gestion de la progression de la DMD grâce à son nouveau mécanisme d'action. Cette protéine X permet de rééquilibrer la balance vers la regénération aux dépens de l’inflammation dans les muscles dystrophiques. Plus particulièrement, la protéine X devrait améliorer la contribution des cellules souches du muscle à la réparation musculaire. Ce traitement devrait donc permettre de bénéficier simultanément de différentes propriétés thérapeutiques sans les effets indésirables des corticoïdes actuellement utilisés dans le traitement de la DMD pour contrer l’inflammation. En cas de bénéfice évident chez les rats, les données précliniques robustes produites seront un argument fort pour accélérer le financement des essais cliniques chez les enfants atteints de DMD. A long terme, le bénéfice attendu est une amélioration de la qualité et de l'espérance de vie des enfants atteints de DMD. La diminution de la dégénération musculaire, aussi bien au niveau des muscles squelettiques qu’au niveau du cœur, retarderait la progression de la maladie et pourrait même prévenir la perte de l’ambulation et l'insuffisance respiratoire ou cardiaque fatale. Cette thérapie est conçue en particulier pour remplacer les glucocorticoïdes en récapitulant ou en augmentant leurs effets bénéfiques, tout en annulant leurs effets secondaires.
Procédures
Les animaux reçoivent la protéine X par une injection hebdomadaire par voie intrapéritonéale et pour certains lots une injection sous-cutanée ou les deux. Cela correspond à un nombre d'injections compris entre 9 et 18 (9 semaines de traitement, essai préclinique à court terme) et 22-48-69-138 (22 semaines, 48 semaines ou 69 semaines - essai préclinique à long terme). Les animaux seront prélevés au sinus rétro-orbital, 1 fois en procédure 2 ou 4 fois en 17 mois selon les procédures. Chaque prélèvement dure moins de 2 minutes, réalisé par une personne très expérimentée. Avant ce prélèvement, l'animal est anesthésié par voie générale et locale et reçoit en plus une analgésie. L'évaluation fonctionnelle privilégie les méthodes non invasives. La mesure de force nécessite une anesthésie injectable, réalisée 1 fois avant la mise à mort pour les animaux des deux procédures d'essai clinique à court et long terme. Il n'y a pas de chirurgie prévue.
Impact sur les animaux
Les rats DMD développent spontanément une dystrophie musculaire caractérisée par une perte significative et progressive de masse corporelle à partir de l'âge de 4 semaines. La perte de masse musculaire cause une faiblesse musculaire et une difficulté croissante à se mouvoir. Le fonctionnement du cœur et du diaphragme, principal acteur de la ventilation de repos, est également progressivement altéré, ce qui conduit à une déficience cardiorespiratoire progressive. Ces défaillances combinées conduisent à la nécessité d'une mise à mort compassionnelle entre 6 et 13 mois d'âge. On assiste par ailleurs à un comportement de "freezing" chez les animaux, caractérisé par une absence de mouvement chez les animaux qui semblent se reposer plus que leurs congénères non atteints. Ce "freezing" survient par exemple lorsqu'on prend un animal dans les mains et qu'on le remet dans sa cage. Cette évolution de la maladie et ces comportements parfois atypiques sont bien connus ce qui permet de les repérer immédiatement quand ils surviennent. Cela garantit une surveillance très rigoureuse et rapprochée des animaux. Une zootechnicienne est dédiée à cette surveillance. L'essai préclinique à court terme de ce projet inclue des animaux jeunes chez lesquels les nuisances de l'évolution spontanée de la maladie sont faibles et ne semblent pas, en milieu confiné, poser de problèmes particuliers, facilement gérables. L'essai préclinique à long terme de ce projet inclue des animaux au-delà de 6 mois. Nous porterons une attention particulière à ces animaux avec une surveillance quotidienne et une prise de poids hebdomadaire jusqu’à l’âge de 6 mois puis tous les deux-trois jours. En ce qui concerne le traitement, Il n'est attendu aucun effet indésirable majeur à la suite de l'injection de la protéine X. En effet, il est reconnu que la thérapie par peptide présente l'intérêt majeur de ne pas produire de toxicité.
Devenir
À l'issue des trois procédures, tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques permettant d'évaluer à l'échelle microscopique l'efficacité du traitement sur les muscles prélevés (muscles des membres, diaphragme, cœur). Bien que non attendue, il est également essentiel de prélever les organes sentinels d'une éventuelle toxicité (reins, foie, rate, poumons) et de les soumettre à une expertise anatomopathologique. La mise à mort sera réalisée sous anesthésie par une injection létale de pentobarbital.
Remplacement
Des études antérieures ont montré qu'une version modifiée de la protéine X favorise la régénération sans exacerber l'inflammation en induisant l'expansion des cellules souches musculaires et en mobilisant les macrophages, favorisant ainsi la guérison des tissus. De manière très intéressante, un criblage cellulaire de plus de 5 000 médicaments cliniques et composés médicamenteux a mis en évidence que plus de 50 % des composés qui inhibent les activités pro-inflammatoires de la proténe X étaient des glucocorticoïdes. Ces résultats soulignent l'importance de cibler des isoformes redox spécifiques de cette protéine aussi bien dans des conditions physiologiques que pathologiques. Sur ces bases mécanistiques très robustes, ce projet vise à trouver la réponse à une question qui ne peut être obtenue que chez l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes en interrelations constante à savoir quels sont les effets bénéfiques sur l'éventail de mécanismes pathogènes ouvert par le processus dystrophique peut-on attendre d'un traitement précoce, court ou long, sur un modèle animal de dystrophie musculaire de Duchenne.
Réduction
Les expériences déjà menées sur les rats DMD traités avec différents candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique) ont montré que traiter 5-7 rats permet d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution fatale de la maladie. Le problème majeur avec cette lignée est la sensibilité des animaux à l'anesthésie. Il faut donc prévoir un animal supplémentaire par groupe de sorte qu'en cas d'accident anesthésique (essentiellement), les données de 5-7 animaux arrivés au terme de la procédure puissent être traitées. Au bilan, chacun des groupes a pu être réduit à 6-8 animaux selon le genotype sauvage ou DMD et ce grace à des analayses à l'aide d'un t test non paramétrique de Mann-Whitney entre deux groupes ou un ANOVA entre plusieurs groupes. L'effet âge étant évalué par un test de Friedman par mesures répétées.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées et monitorées. La température des locaux est maintenue dans la fenêtre 22 ± 2 °C. Pour le bien-être des rats, ils sont stabulés dans des cages XL ayant une surface de 2080 cm2 et une hauteur de 23 cm sur une moitié de la surface, soit 5 cm de plus que la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage au début (3-4 semaines, animaux de 100g puis ce nombre est progressivement réduit jusqu'à atteindre 3 rats par cage pour les animaux de plus de 600 g (animaux sauvages au-delà de 5 mois, les rats DMD non traités n'atteignent jamais cette masse corporelle). L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft et des bâtons de bois à ronger ou des carrés de coton compacté. Nous prêterons attention aux points suivants: - perte de mobilité par atrophie des muscles des pattes, - prostration due à une anomalie cognitive ou à la douleur, - lordose excessive liée à l'atrophie des muscles dorsaux comme chez les patients, - arrêt du toilettage entrainant la dégradation du pelage, - vocalise anormale (hors contention) ou grimaces faciales, la cause de la douleur est recherchée et des antalgiques pourront être prescrits, notamment sur les animaux DMD en fin de vie, nous pourrons utiliser un anti-inflammatoire ou un opioïde après consultation du vétérinaire référent. La survenue de l'un des points ci-dessus associé à une perte de poids sur une semaine dépassant 20% du poids maximal atteint par l’animal et non compensée par la mise à disposition de nourriture humide et d’hydrogel en fond de cage (difficulté à ronger les croquettes sèches, dysphagie possible liée à la dégradation des muscles masticateurs), entrainera la mise à mort compassionnelle de l'animal concerné.
Choix des espèces
Le rat, une espèce de mammifère phylogénétiquement proche de l'homme, constitue un modèle apprécié. Les récents outils d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Le modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle emblématique de la souris myopathe, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle canin de la myopathie de Duchenne. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle sur le chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format).
Effet du 4-Cholestène-3-one, métabolite du cholestérol et d’origine algale, sur le métabolisme lipidique des tumeurs mammaires (ER-) dans un modèle murin du cancer de sein triple négatif.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
48 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur mammaire humaine leur est greffée sous la peau, puis elles reçoivent sur huit semaines quinze gavages et quinze injections de docétaxel, avec des prélèvements de sang à la face sous contention renforcée. Le porteur décrit le gavage comme "inconfortable et relativement stressant" et prévoit une mise à mort si les nuisances deviennent trop importantes. Il teste un dérivé du cholestérol d'origine algale, dont l'effet antitumoral reste selon lui "peu documenté".
Objectifs
Ce projet fait suite à des travaux préliminaires obtenus avec le 4-Cholestène-3-one, un métabolite du cholestérol produit par le microbiote intestinal et par une algue (Laurencia Papillosa). Notre équipe a montré́ que ce dérivé stéroïde provoquait une diminution de la prolifération des cellules cancéreuses du sein, associée à des effets prometteurs sur le métabolisme lipidique des cellules tumorales. Par ailleurs, le 4-Cholestène-3-one induit l'augmentation du transport cellulaire du cholestérol des cellules tumorales. Les objectifs de cette étude sont d’évaluer le potentiel anti-tumoral in vivo d’un apport nutritionnel de 4-Cholestène-3-one, associé ou non à un traitement par le docetaxel, dans un modèle de souris nude xénogreffées avec des cellules tumorales mammaires humaines. Pour cette expérimentation, nous utiliserons un total de 48 souris (souris nude = immunodéprimées, adultes femelles de 8 à 10 semaines) correspondant au total à 4 groupes de 12 souris par lot de condition expérimentale. En parallèle, nous envisageons des études biochimiques d’analyse du métabolisme lipidique (sur les tumeurs xénogreffées). Les résultats de ce projet devraient permettre de valider in vivo les effets du 4-Cholestène-3-one observés récemment in vitro et de confirmer l'intérêt potentiel de ce stérol dans le traitement pharmaco-nutritionnelle du cancer du sein.
Bénéfices attendus
Suite aux résultats de ces expérimentations le rôle potentiel du 4-cholestène-3-one, dont l'effet est actuellement peu documenté permettra d'envisager une approche pharmacologique et/ou nutritionnelle de prévention des cancers du sein. De plus, notre projet devrait aussi nous permettre de valider d'éventuels nouveaux biomarqueurs reliant la consommation du 4-cholestène-3-one au devenir des tumeurs. Enfin, en plus de son existence dans les algues, il est maintenant connu que le 4-cholèstene 3-one est un métabolite du microbiote intestinal (Chen et al., 2017), ce qui laisse entrevoir des stratégies possibles d'utilisation de probiotiques afin d'augmenter sa production.
Procédures
Injection par voie sous cutanée de 100 µL d’une suspension cellulaire. L’injection sera réalisée sous anesthésie par inhalation d’un mélange air isoflurane v/v sous un débit d’air de 1 L/min (à 4% pour l’induction et 2% pour le maintien). Les cellules seront injectées au niveau du flanc. Prélèvements sanguins de 100µL au niveau de la veine faciale à l’aide d’un capillaire. Réalisation de trois prélèvements de sang au niveau de la veine faciale (100µL/souris de 25g) pour réaliser une NFS (numération de la formulation sanguine) et la récupération du sérum pour congélation avant l’analyse biochimique. Traitement des animaux pendant 8 semaines : 2 fois par semaine : Gavage avec huile d'olive enrichie avec 0,03% de 4-C-3-One volume de gavage ≤ 250 µl pour une souris de 25g) Injection IP de Docetaxel (15mg/kg) (volume total injecté < 500µl pour une souris de 25g). En bilan, chaque animal recevra : - Une Injection par voie sous cutanée de 100 µL d’une suspension cellulaire. - Deux prélèvements sanguins - Quinze injections intrapéritonéales à raison de deux fois par semaine pendant 8 semaines - Quinze gavages à raison de deux fois par semaine pendant 8 semaines - Trois séances d'anesthésie genérale gazeuse d'une durée de cinq minutes chacune.
Impact sur les animaux
- L’injection par voie sous-cutanée d’une suspension de cellules MDA MB231 sera réalisée sous anesthésie générale. - Traitement des animaux pendant 8 semaines : 2 fois par semaine : Le gavage des souris sera réalisé par une personne formée et expérimentée (madame Chauvet, technicienne en expérimentation animale). L’émulsion d’huile d'olive enrichie avec 0,03% de 4-C-3-One sera administrée par voie orale via un gavage utilisant une sonde flexible dédiée aux souris. Un volume maximal de 0,25ml/souris de 25g sera respecté. Cette procédure bien qu’inconfortable et relativement stressante ne devrait pas engendrer de douleur chez les animaux. Les administrations répétées de Docétaxel (15mg/kg) par voie intrapéritonéales seront-elles aussi réalisées par un personnel compétent et expérimenté. Le volume maximal injecté sera inférieur à 0,3ml pas souris. La cicatrisation au point d’injection entre deux injections successives sera possible vu la cinétique d'administration. - Les 3 prélèvements sanguins seront réalisés au niveau de la veine faciale à l’aide d’un capillaire dédié. Cette technique sera réalisée sur animal vigile avec une contention renforcée (ne nécessitant pas l'anesthésie gazeuse ni l'ajout d'un anesthésique local). La quantité de sang prélevée peut être gérée par le relâchement de la contention. Une goutte de sang correspond entre 60 et 100µL et ce qui respecte les 20% de la volémie d'une souris de 25g. Cette procédure réalisée très rapidement ne devrait pas engendrer de douleur chez les animaux. - Mesure de la taille des tumeurs à l'aide d'un pied à coulisse électronique sous une courte anesthésie par inhalation d’un mélange air isoflurane v/v sous un débit d’air de 1 L/min (à 4% pour l’induction et 2% pour le maintien). Cela ne devrait donc pas générer de douleur /nuisance chez les souris. - Les nuisances attendues chez l'animal seront donc éventuellement les effets secondaires liés au traitement antitumoral testé. Une observation attentive quotidienne du comportement général des animaux, de leur mobilité ainsi que de leur réactivité permettra de détecter les animaux en souffrance du fait des injections réalisées ou du développement des masses tumorales au niveau du flanc. Un ensemble de paramètres sera mesuré pour obtenir une estimation relativement précise de l’impact de la douleur. Une mise à mort de l'animal sera réalisée si les nuisances s'avèrent trop importantes.
Devenir
A la fin de la procédure les animaux seront mis à mort car des expériences d'analyses biologiques, biochimiques et de toxicologiques seront ensuite réalisées sur les tumeurs prélevées.
Remplacement
La mise en évidence du "potentiel" antitumoral du 4-cholestène-3-one a été évalué in vitro sur lignées tumorales cellulaires issues de tumeurs mammaires (MCF-7, MDA-MB231). Pour confirmer les effets observés in vitro, un passage in vivo s'avère nécessaire afin de pouvoir étudier l'effet antitumoral du 4-cholestène-3-one. Le cancer étant une pathologie complexe, il n’existe pas à l’heure actuelle, de méthodes alternatives permettant d’éviter ou remplacer l’utilisation des animaux pour l’approche thérapeutique abordée dans ce projet.
Réduction
Pour nos expériences, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et avoir le nombre nécessaire d’animaux contrôles tout en limitant le nombre total d’animaux utilisés. Les tests de Mann Whitney/Student et Kruskal Wallis/ANOVA seront utilisés pour la comparaison statistique entre lots. Pour calculer le nombre total d’animaux et le nombre d’animaux par lot, nous avons utilisé le logiciel Gpower et la méthode basée sur l’analyse de la puissance. Nous avons considéré les paramètres suivants : Alpha : 0.05 ; Puissance : 80 ; effet de la taille de l'échantillon : 0.5 (moyen) Le nombre minimal d’animaux nécessaire est de 48 souris souris, 12 souris par lot. Ce nombre d’animaux est un nombre minimal pour la validation statistique des résultats (Kruskal- Wallis One-Way ANOVA) et il tient compte d’un taux de prise de greffe > à 90%. Par ailleurs, ce nombre de souris par lot permet d’obtenir suffisamment de matériel biologique pour les analyses biochimique et histologique ultérieures, nécessaires à la caractérisation de l’activité anti-tumorale de la molécule testée.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées dans des salles à température et hygrométrie contrôlées. Elles seront réparties à raison de 4 à 5 souris par cage avec un enrichissement physique (copeaux de litière, frisottis) permettant aux souris de satisfaire leurs besoins comportementaux (exploration de leur environnement, confection de nid…). Si des cas de bagarre apparaissent on veillera à augmenter l'enrichissement avec des abris, tunnels supplémentaires dans la cage. Les litières seront changées chaque semaine par le personnel qualifié de l’animalerie. L'expérience a été́ conçue pour éviter toute souffrance inutile aux animaux. Cependant tout animal montrant des signes de gravité sera euthanasié conformément aux critères indiqués dans les procédures : Les animaux seront mis à mort par élongation cervicale après anesthésie par inhalation d’un mélange air isoflurane v/v dans une cage à induction (à 4% sous un débit d’air de 1 L/min).
Choix des espèces
Pour ce projet, nous utiliserons des souris balbc nudes femelles. Les cellules MCF-7 et MDA MB 231 étant des lignées tumorales humaines, il est nécessaire d’utiliser de souris immunodéficientes afin de permettre la prise de greffe. Il s'agit donc de l'espèce classique pour cette première étape de l'évaluation pharmacologique antitumorale in vivo d'une molécule. Des adultes de 8 à 10 semaines seront utilisés, car la prise tumorale est relativement homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse anti-tumorale, et donc un stade tumoral différent.
Effet d’un inhibiteur de l’autophagie dans la prévention et traitement de la toxicité hépatique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intra-péritonéales répétées, jusqu'à seize semaines pour certaines, et un régime provoquant une accumulation de graisses dans le foie, pour tester un inhibiteur de l'autophagie contre la toxicité hépatique. Le porteur indique que l'induction de la toxicité peut provoquer douleurs abdominales, fatigue et diarrhée. Il juge "indispensable" le recours à l'animal vivant, la complexité de la toxicité hépatique étant selon lui impossible à reproduire in vitro.
Objectifs
L’autophagie (AP) est un processus physiologique qui régule l’homéostasie cellulaire. L’AP est aussi un mécanisme d’adaptation cellulaire en condition de stress et son absence est souvent observée dans des maladies neurodégéneratives et cancers. On connaît les effets bénéfiques de l'augmentation du flux autophagique dans différentes pathologies, notamment les maladies du foie. L’objectif de ce projet est de déterminer l’implication de ce processus dans la prévention et le traitement de la toxicité hépatique chez des modèles murins appropriés.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie thérapeutique pour palier à la toxicité hépatique, qui entraîne un déclin progressif de la fonction hépatique, la fibrose, la cirrhose et souvent un carcinome hépatocellulaire.
Procédures
Tous les animaux du projet seront soumis à des injections intra-péritonéales (i.p). Les injections i.p. ne provoquent pas de symptômes majeurs et seront effectués sur l’animal vigile par du personnel formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Selon les différentes procédures du projet : (i) les animaux seront euthanasiés 6h et/ou 24h après le traitement (3/4 injections totales); (ii) les injections hebdomadaires dureront 16 semaines ; (iii) les animaux seront soumis à un régime alimentaire (de 4 semaines) permettant l'accumulation de triglycérides et cholestérol, mais qui n'est pas un régime alimentaire obésogène. Les traitements i.p. seront journaliers jusqu’à 6 semaines. La durée de chaque injection sous-cutanée et intra-péritonéale est de quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les procédures de ce projet prévoient seulement des injections intra-péritonéales. Les injections intra-péritonéales ne provoquent pas de symptômes majeurs et seront effectués sur l’animal vigile. Des douleurs abdominales, une fatigue, une diarrhée peuvent survenir lors des procédures d’induction de la toxicité hépatique.
Devenir
Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, les conséquences et les effets sur l’organisme de la toxicité hépatique vu sa complexité.
Réduction
Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 1440 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs tests statistiques seront utilisés pour les analyses pour comparer les divers groupes de traitements.
Raffinement
Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, analgésie des animaux, utilisation de tapis et lampes chauffantes, ...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.