Recherche fondamentale

465 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des instillations intranasales d'un produit bactérien sous anesthésie, un transfert de cellules lymphoïdes et des injections d'une neurotoxine pour dénerver le poumon, avant prélèvement pulmonaire, pour étudier la formation de structures lymphoïdes tertiaires. Le porteur indique que les instillations peuvent provoquer une gêne respiratoire et fixe la mise à mort à une perte de poids de 20 pour cent. Il affirme qu'aucune approche in vitro ne permet de provoquer ces structures.

Objectifs

Le projet vise à élucider les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la formation des structures lymphoïdes tertiaires en conditions inflammatoires. La présence de ces structures a en effet été corrélée à un bon pronostic dans de nombreux types de tumeurs solides, et notamment dans les cancers du poumon non à petites cellules. Nous souhaitons étudier le rôle de cellules lymphoïdes innées dans la néogenèse de ces structures. L'étude des voies de signalisation à l'origine de l'induction de ces structures dans les poumons pourrait permettre à l'avenir leur manipulation à des fins thérapeutiques, avec l'identification de molécules candidates jouant un rôle dans leur néogenèse. L'expérimentation sera réalisée en utilisant un modèle inflammatoire visant à induire ces structures pulmonaires. Les objectifs principaux de ce projet sont : 1 – d'étudier la population de cellules lymphoïdes innées au cours de l'inflammation induite par un produit bactérien, par l'analyse cinétique des différents compartiments cellulaires des poumons de ces souris ; 2 - d'étudier la néogenèse des structures lymphoïdes tertiaires et la présence des cellules lymphoïdes innées pulmonaires au cours de l'inflammation, en présence ou absence de fibres nerveuses ; 3 - de transférer des cellules lymphoïdes innées pulmonaires chez des souris naïves ou ayant reçu un traitement avec une faible dose du produit bactérien, afin d'étudier la capacité des cellules transférées à induire ces structures en conditions non ou faiblement inflammatoires.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d'élucider les mécanismes sous-jacents à la formation des structures lymphoïdes tertiaires, et plus particulièrement d'évaluer le rôle des cellules ILC3 dans ces processus. Pour cela, l'utilisation de souris rapportrices RORgt-EGFP dans lesquelles nos cellules d'intérêt expriment l'EGFP, représente un outil pour étudier cette population mais aussi pour les purifier en vue de réaliser des tests fonctionnels. Ce projet vise donc à mieux comprendre le processus de formation des TLS, et étudier la cible thérapeutique que pourraient représenter des ILC3 pulmonaires dans différentes maladies. Induire des TLS chez les patients cancéreux ouvrirait la voie à de nouvelles possibilités thérapeutiques tous stades de la tumeur confondus, et pourrait ainsi contribuer à allonger la survie de ces patients, même lorsqu'ils sont inopérables.

Procédures

- Instillations intranasales : 5 instillations par voie intranasale (lent dépôt de 14 µL/narine de chaque souris maintenue verticalement ; durée totale environ 2-3 minutes/souris en fonction du rythme respiratoire) de NaCl 0,9% ou de LPS à des animaux préalablement anesthésiés. - Transfert adoptif d'ILC3 pulmonaires par voie intraveineuse : injection dans la veine de la queue de 100 µL de suspension cellulaire (1000 cellules en PBS 1X stérile) sur souris vigile, sous lampe chauffante et placée brièvement dans un dispositif de contention lors de l'injection (durée totale environ 1 minute, chauffage préalable environ 5-10 min). Cette intervention n'est réalisée qu'une fois par animal. - Injections de 6-OHDA par voie intrapéritonéale : Sur animal vigile, injection de 200 µL de NaCl 0,9% ou de 6-OHDA resuspendue en NaCl (100mg/kg puis une deuxième injection à 250 mg/kg 48h plus tard). Durée totale < 30 secondes. - Prélèvements : Tous les prélèvements (poumons, plasma) sont réalisés sur animaux euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les animaux ne subiront aucune manipulation plus douloureuse qu'une injection ponctuelle par voie intra-péritonéale ou intraveineuse (cellules), ou une instillation intranasale (LPS) sous anesthésie générale. Les injections pourront provoquer l'apparition d'un stress chez les animaux, mais toutes sont rapides (pas plus de quelques secondes) et les animaux sont maintenus immobiles le temps de l'injection (voie i.p. ou i.v.) afin de limiter au maximum l'éventuelle douleur provoquée. Dans le cas des instillations intranasales, une gêne respiratoire pourra dans certains cas être observée au moment des instillations dans la narine.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les poumons des animaux seront prélevés dans le but d'analyser les TLS pulmonaires ainsi que les ILC3. Les animaux devront donc être euthanasiés suite à l'inflammation induite par le LPS afin de prélever leurs poumons pour procéder aux analyses ex vivo décrites dans les procédures (suivi de la densité de TLS et de la population d'ILC3, purification d'ILC3 fonctionnelles pour leur utilisation in vitro et in vivo). Du sang sera également prélevé post mortem sur les animaux afin de procéder à des dosages plasmatiques de catécholamines, afin de s'assurer notamment de la dénervation du système nerveux sympathique.

Remplacement

Il n'existe pas actuellement d'approches alternatives in vitro pour provoquer la formation des structures lymphoïdes tertiaires dans les situations inflammatoires et permettant d’évaluer le rôle des différentes sous-populations cellulaires pulmonaires dans l’induction de ces structures.

Réduction

Nous utiliserons au maximum un total de 465 souris sur trois années dans les approches expérimentales envisagées. Ce nombre a été calculé au plus juste, afin de permettre des analyses statistiques fiables pour chaque expérience. Ces expériences ne répèteront pas d’expériences publiées antérieurement.

Raffinement

Transport depuis le lieu du fournisseur agréé et période d’acclimatation d’au moins une semaine, conditions d’hébergement des souris soigneusement contrôlées : les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés en groupe (5 par cage au maximum). Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté). Locaux d’expérimentation agréés. Les instillations intranasales pouvant engendrer une gêne et un stress intenses seront réalisées sur les animaux sous anesthésie générale (par injection par voie i.p. d'un mélange xylazine-kétamine) afin de limiter ces perturbations. Les animaux seront maintenus immobiles pour les injections afin de limiter la douleur et le stress pouvant éventuellement être provoqués par leur mouvement. Expériences arrêtées dès les premiers symptômes comportementaux et physiologiques d’une santé altérée apparaissant chez les souris : l'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent responsables du bien-être des animaux. Les points limites tout au long des procédures sont déterminés comme suit. 1. Tout dérèglement physiologique aboutissant à une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire 2. Modification du comportement caractéristique d'une douleur intense, d'une détresse ou d'une souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et/ou terne, prostration, dos voûté, difficultés respiratoires) 3. Anomalies pouvant entrainer une douleur intense, une détresse ou une souffrance : perte de poids supérieure ou égale à 20% du poids initial de l'animal (pesées entre 1 et 3 fois par semaines selon les procédures : J0-J4-J6-J10-J15 et J20 pour la procédure 1 ; J0-J2-J4-puis 1x/semaine jusqu'à J30-J32-J34-J37 et J40 pour la procédure 2 ; J0-J4-J7-J10 et J14 pour la procédure 3), plaies et ulcères, tumeurs, fractures... Les éventuels risques anesthésiques seront également pris en compte, avec une surveillance de la détresse respiratoire des animaux lors des instillations intranasales (avec arrêt et/ou modulation du rythme des instillations si observation de difficultés respiratoires), et surveillance des animaux après les instillations et avant leur réveil.

Choix des espèces

La souris est l’animal permettant d’explorer le plus facilement la formation des TLS ainsi que les interactions entre cellules du système immunitaire et fibres nerveuses grâce à l’accessibilité d’un grand nombre de réactifs (ex. anticorps, cellules de lignée cellulaire tumorale transfectées avec l’ADNc codant la luciférase). Par ailleurs, les cellules immunitaires ont été exhaustivement caractérisées chez la souris : les marqueurs des cellules d’intérêt de cette étude sont connus et de nombreux anticorps spécifiques sont disponibles. Enfin, différents protocoles développés chez la souris sont décrits de façon détaillée dans la littérature et sont donc applicables sans nécessité de mises au point longues et consommatrices d’animaux. Les animaux seront reçus à l'âge de 12 semaines, puis mis en stabulation pendant une semaine minimum avant de débuter l'expérimentation (8 semaines pour la procédure 2). Cet âge a été choisi car à ce stade de développement, les souris sont sevrées, ont atteint une taille adulte et disposent d'un système immunitaire et nerveux mature. Les expériences durent entre 10 à 40 jours soit un âge maximum de 17,5 semaines (ou avant si les souris présentent des signes de souffrance, une perte de poids>20% de leur poids initial ou détresse respiratoire) à la fin de l'expérience.

45 rats nude vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une greffe de cellules tumorales cérébrales humaines lors d'une chirurgie d'une heure, puis des injections intraveineuses de nanoparticules et des séances d'imagerie par scanner et IRM, pour optimiser la dose visualisant un glioblastome. Le porteur estime la douleur légère au motif que le cerveau n'est pas innervé, la gêne provenant de l'incision du crâne. Il affirme que la distribution des nanoparticules in vivo est "indispensable" et qu'aucune méthode alternative n'est possible.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales appelée glioblastomes sont les cancers du cerveau les plus fréquents et sont généralement agressifs. En clinique, actuellement le protocole de traitement de ces tumeurs cérébrales commence par une ablation chirurgicale, suivie de séances de radiothérapie et de chimiothérapie. En effet, dans la plupart des cas, l’ablation chirurgicale ne permet que de retirer partiellement la masse tumorale. Les cellules cancéreuses restantes après chirurgie sont ensuite traitées par radiothérapie et chimiothérapie. Ce projet se place dans le contexte clinique de traitement des tumeurs cérébrales, et plus particulièrement sur l’amélioration de l’efficacité du traitement par radiothérapie guidée par l'image grâce à l’utilisation de nanoparticules. Une nanoparticule radiosensibilisante (en cours de développement clinique) a été développée pour permettre une imagerie bimodale par résonance magnétique (IRM) et tomodensitométrie (TDM). L’objectif principal de ce projet consiste à optimiser la dose de nanoparticule à injecter chez le rat pour visualiser la tumeur en IRM et en TDM. Nous avons préalablement évalué in vitro (sur cellules tumorales humaines) l’intérêt s de ces nanoparticules pour les 2 modalités d’imagerie, la toxicité des nanoparticules ainsi que l’efficacité thérapeutique en association avec la radiothérapie et avons ainsi pu démontrer leur pouvoir « radiosensibilisant » et leur intérêt pour de l’imagerie bimodalité. Nous souhaitons confirmer ces résultats très prometteurs sur un modèle de tumeur cérébrales chez le rat et optimiser les conditions d’imagerie.

Bénéfices attendus

Les nanoparticules que nous avons développées présentent de multiples intérêts. (1) elles permettront de décupler les effets toxiques du traitement de radiothérapie au sein de la tumeur (2) elles permettront un meilleur suivi par imagerie de la progression/régression tumorale au cours du traitement des patients L’objectif du projet étant ainsi d'optimiser les modalités de traitement des tumeurs cérébrales.

Procédures

Chirurgie 1h sous anesthésie gazeuse. 1 fois Imagerie par bioluminescence : injection intra-péritonéale sur animal vigil (quelques secondes) puis15 min d'imagerie sous anesthésie gazeuse. 1 fois Injection de nanoparticule par voie intraveineuse dans la veine de la queue ( quelques secondes) : 2 fois à 3 jours d'intervalle. Imagerie par tomodensitométrie sous anesthésie gazeuse : 30 min; 2 fois Imagerie IRM sous anesthésie gazeuse : 20 min; 2fois

Impact sur les animaux

Chirurgie opératoire classée modérée car la procédure est parfaitement maitrisée au sein de notre laboratoire . Malgré une opération invasive due à l’incision de la peau du crâne et à l’injection de cellules intracérébrale, la douleur engendrée par l’acte chirurgical est estimée modérée, car dès le lendemain le rat se laisse manipuler aisément, ne montre aucun signe de peur (cris, prostration, agressivité) lors du nettoyage de la plaie. Le cerveau n’étant pas innervé, la douleur principale engendrée par l’opération provient de l’incision de la peau du crâne que nous estimons légère. Utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux. Imageries non invasives réalisées sous anesthésie volatile.

Devenir

Animaux mis a mort à la fin de la procédure ou si un point limite est atteint. Les animaux seront mis à mort et le cerveau ainsi que les organes seront prélevés pour analyse macroscopique et histologique.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes. De plus la distribution des nanoparticules in vivo est indispensable pour évaluer leur intérêt en imagerie. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous pourrons suivre dans le temps sur chaque animal la croissance tumorale ainsi que la prise de contraste par les nanoparticules. Nous obtiendrons ces données sans avoir besoin de mettre à mort les animaux à différents temps. Cette procédure offre donc l’opportunité d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux car la prise d’image peut être réitérée au cours du temps

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux après l'implantation de la tumeur (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) . L'atteinte d'un point limite décrit dans le descriptif de la procédure conduira à la mise à mort de l'animal. Une attention toute particulière sera également portée lors du transport des animaux depuis le site d’hébergement et de chirurgie vers les sites d’imagerie, notamment par le maintien d'une température optimale (par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages). Ce transport se fera toujours sous conditions éveillées : l’anesthésie gazeuse étant rapidement réversible. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de sopalins et de bâtonnets en bois à ronger. Une prise en charge analgésique sera réalisée en pré-opératoire et post-opératoire par injection sous-cutanée de Meloxicam avec possibilité de réitération les 2 jours suivants la chirurgie.

Choix des espèces

Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les rats constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. En outre, le choix de cette espèce se justifie par les limitations de résolution offertes par l’imagerie. Les rats nude (dépourvus d’une partie du sytème immunitaire) sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines car il n'y a ainsi pas de rejet du greffon tumoral implanté. Nous privilégions des rats mâles, sexe utilisé jusqu’à présent dans nos études antérieurs afin de pouvoir confronter nos résultats. Des rats âgés de 8 semaines sont utilisés, à un stade où leur conformation crâniale correspond à celle de l’atlas sur lequel nous nous basons pour injecter les cellules tumorales dans un endroit précis du cerveau.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intraveineuses de vecteurs viraux et d'un Nanoprimer dans la veine caudale, puis des prélèvements sanguins hebdomadaires pendant un à trois mois, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. L'objectif est d'évaluer un produit censé réduire les doses de vecteurs de thérapie génique et leur toxicité pour le foie. Le porteur affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas la complexité des interactions in vivo.

Objectifs

La thérapie génique consiste à introduire un gène « médicament » dans des cellules pour traiter une maladie. Pour véhiculer ce gène, les vecteurs viraux, et en particulier les virus adéno-associés (AAVr) constituent des outils de choix comme en atteste la commercialisation de trois produits de thérapie génique utilisant les vecteurs AAV (Luxturna®, Glybera® et Zolgensma®). Une seule injection d’AAVr permet une expression à long terme du gène thérapeutique. Cependant, l’administration de l’AAV par voie intraveineuse (IV) peut induire une élimination rapide du gène « médicament » par le foie. Pour compenser cette élimination, de fortes doses de vecteurs sont nécessaires afin de toucher les tissus cibles comme les muscles squelettiques, le cœur, les poumons etc…). Par ailleurs, il a été rapporté que chez les patients que ces fortes doses de vecteur peuvent induire des effets indésirables liés à une toxicité dans le foie. Cette toxicité a entraîné dans certains cas la suspension des essais cliniques. Dans cette étude, nous proposons de tester un Nanoprimer® (Curadigm) en combinaison avec notre vecteur AAV pour d’une part diminuer son élimination par le foie et favoriser l’atteinte de tissus-cibles tels que les muscles squelettiques et d’autre part, prévenir l’hépatotoxicité liée à la forte concentration du vecteur après son injection. L’objectif scientifique de ce projet est de développer une stratégie pour diminuer les doses de vecteur de thérapie génique injecté et prévenir une éventuelle hépatotoxicité.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de développer une stratégie pour diminuer les doses de vecteur de thérapie génique injecté et prévenir une éventuelle hépatotoxicité et permettre ainsi d’améliorer les traitements de thérapie génique à l’aide d’AAVr.

Procédures

Les souris seront injectées en IV dans la veine caudale avec dans un premier temps 100 µl de PBS ou d’AAV. Selon les groupes d’animaux, 150µl de Nanoprimer seront injectés 10 minutes après l’injection d’AAV puis à J+2 et J+5. Pour ces injections, les souris seront placées dans un tunnel de contention. Pour limiter le désagrément de la piqûre, un anesthésique local de type crème EMLA sera appliqué juste avant la procédure. Un prélèvement sanguin sera réalisé la semaine avant les injections puis toutes les semaines jusqu’à l’euthanasie pour les animaux suivis pendant 1 mois. Pour les souris suivies pendant 3 mois, les prélèvements seront espacés tous les 15 jours au bout du premier mois et ce jusqu’à la fin du protocole. Le prélèvement n’excédera pas la quantité recommandée par animal par semaine soit 7.5% du volume sanguin total. Les animaux seront anesthésiés dans une cage à induction, puis transférés sur une planche chauffante équipée d’un masque anesthésique. Le sang sera prélevé au niveau de la veine jugulaire par du personnel compétent pratiquant ce geste en routine. Conformément à la réglementation, la mise à mort des animaux sera réalisée sur des souris isolées visuellement et phoniquement du reste des animaux. Les animaux en attente, resteront dans leur cage et salle d’hébergement. Afin de réaliser des études post mortem, les animaux subiront une anesthésie gazeuse préalable suivie d’une décapitation qui sera systématiquement réalisée par du personnel compétent pratiquant cette technique en routine.

Impact sur les animaux

Les vecteurs AAV et le Nanoprimer ont tous déjà été administrés chez la souris à des doses supérieures ou égales à ce qui est envisagé dans ce projet, sans observation de signe clinique notable. L’injection en intra veineuse dans la veine caudale engendre une légère douleur due à la piqure. Pour limiter le désagrément, un anesthésique local de type crème EMLA sera appliqué juste avant la procédure. Pour le prélèvement sanguin, la souris sera sous anesthésie gazeuse et ne pourra donc pas ressentir de douleur. Une légère douleur au point de prélèvement due à la piqure peut être ressenti après le réveil. Pour l’euthanasie, les souris seront sous anesthésie gazeuse que ce soit pour la dislocation des cervicales ou la décapitation

Devenir

Mise à mort pour prélèvement d'organes pour des études post mortem.

Remplacement

Les modèles in vitro ne peuvent s'approcher de la complexité des interactions entre le vecteur et l’environnement biologique in vivo et rendent donc difficile la reproductibilité de ces résultats in vivo. L’utilisation de la souris est donc justifiée pour évaluer ces différents paramètres.

Réduction

Dans le contexte de cette étude pilote, le nombre d’animaux est réduit au strict minimum pour avoir suffisamment de données pour une suite ou non de ce projet. En première intention, 110 souris réparties sur 11 groupes seront utilisées pour tester le Nanoprimer et l’AAV8 avec deux doses différentes. Selon les résultats obtenus, des analyses supplémentaires pourraient être étendues à d’autres sérotypes d’AAV cliniquement pertinents comme l’AAV9. Dans ce cas, 4 groupes représentant un total de 40 souris supplémentaires seraient injectés.

Raffinement

Le bien-être animal et le raffinement des procédures passera par de bonnes conditions d’hébergements, un suivi quotidien des animaux, l’instauration de points limites pertinents et précoces ainsi que la mise en place de mesures adaptées (anesthésie, analgésie etc.).

Choix des espèces

Dans la majorité des études de thérapie génique, une espèce mammifère est requise pour avoir une pertinence clinique. L'utilisation de la souris est justifiée à la fois par la possibilité de constituer des groupes suffisamment larges pour effectuer des analyses statistiques. Par ailleurs, l’utilisation de souris est justifiée par la disponibilité de nombreux modèles murins transgéniques mimant des pathologies pouvant être traitées par thérapie génique. La preuve de concept de l’utilisation du nanoprimer co-injecté avec le vecteur de thérapie génique pourra être étendu à différents modèles de maladies. Notre étude sera réalisée sur de jeunes adultes d’environ 8 à 12 semaines.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des applications cutanées répétées de la bactérie Staphylococcus aureus, d'imiquimod, de calcipotriol et de l'allergène DNFB, ainsi que des injections de toxine diphtérique, pour induire psoriasis, dermatite atopique et eczéma de contact, avec un risque de nécrose cutanée. L'objectif est d'étudier la réponse immunitaire mémoire de la peau. Le porteur affirme que cette réponse tissulaire ne peut être remplacée par des modèles in vitro.

Objectifs

Staphylococcus aureus (S. aureus) est une bactérie colonisant la peau des patients atteints de dermatite atopique (DA) et de psoriasis (Pso). Des données cliniques montrent que S. aureus aggrave la DA, mais il n’y a pas d’évidence pour le Pso. La compréhension des mécanismes par lesquels la bactérie aggrave une inflammation cutanée plutôt qu’une autre permet de définir de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblées sur ces mécanismes. Des résultats préliminaires obtenus dans un modèle murin montrent qu'une souche de S. aureus isolée de patients atteints de DA, est capable d’induire une inflammation cutanée de type DA, ainsi qu’une infiltration de lymphocytes T. D’autres résultats montrent que la réponse mémoire à S. aureus diffère dans des modèles sans inflammation cutanée préalable, des modèles de Pso ou de DA. Mais le rôle des lymphocytes T induits par S. aureus dans ces modèles est actuellement inconnu. Un modèle d'eczéma allergique de contact (EAC), fort pourvoyeur de lymphocytes T, sera également inclus. L’objectif principal du projet est de caractériser la réponse mémoire à S. aureus dans les différentes conditions d’inflammation cutanée (DA, Pso ou EAC) afin de trouver de nouveaux mécanismes par lesquels S. aureus est capable d’aggraver la DA. Les objectifs des procédures sont : (i) caractériser l’infiltration de lymphocytes T induite par S. aureus dans des modèles de Pso, de DA et d’EAC ; (ii) caractériser le rôle de l’infiltration de lymphocytes T dans la réponse d’hypersensibilité à S. aureus et son rôle protecteur lors d’une réexposition à la bactérie.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objet l’étude des mécanismes impliqués dans la dermatite atopique (DA), une maladie complexe touchant jusqu’à 20% des enfants dans les pays occidentaux. Les bénéfices attendus sont multiples. 1. Comprendre l’interaction entre colonisation cutanée à S. aureus et réponse immunitaire cutanée ; 2. Corréler la qualité de la barrière cutanée (normale, inflammée type 2, 17 ou 1) et la réponse mémoire cutanée à S. aureus ; 3. Comprendre les mécanismes par lesquels S. aureus aggrave la DA. Ces analyses mécanistiques s’intrègrent dans la réflexion actuellement menée sur les thérapeutiques à développer pour traiter et/ou prévenir la DA chez l’homme. La compréhension des mécanismes par lesquels S. aureus pourrait aggraver une inflammation cutanée, selon la qualité de la barrière cutanée, devrait ouvrir des opportunités thérapeutiques ciblant 1. S. aureus et ses toxines, 2. le microbiote cutané commensal et 3. la réponse immunitaire cutanée à S. aureus. Ainsi ces données alimenteront la réflexion sur l’utilisation des inhibiteurs de toxines de S. aureus, la restauration de la barrière cutanée par l’utilisation d’émollients éventuellement associés à l’application de bactéries commensales ou de pré/probiotiques et l’utilisation de traitements ciblés sur les lymphocytes T résidents mémoires.

Procédures

Application de Staphylococcus aureus à J0, J2, J6 et J8 pour induire une réponse primaire (4 applications) et éventuellement une application à J60 (1 application). Durée 5 secondes par face. Application quotidienne de 10 µl d’imiquimod de J0 à J3 et J6 à J8 (7 applications). Durée 5 secondes par face. Application de 12.5 µl de calcipotriol par face d’oreille, à J0, J2, J6 et J8 (4 applications). Durée 5 secondes par face. Application de 5 µl/face d’oreille de DNFB 0.13% à J0, J2, J6 et J8 (4 applications). Durée 5 secondes par face. Injection intrapéritonéale d'un mélange dilué de kétamine et xylazine à J0, J2, J6 et J8 pour induire une réponse primaire (4 injections) et éventuellement une injection à J60 (1 injection). Durée de l'injection 5 secondes. Injection de toxine diphtérique diluée à J56 et J59, et J66 (3 injections). Durée de l'injection 5 secondes. Mesure de l'épaisseur quotidienne des oreilles. Durée de la mesure 3 secondes par oreille. Sédation par isoflurane 3,5% pendant 30 secondes. Pesée dans une boîte adaptée, durée 5 secondes par souris.

Impact sur les animaux

Les procédures mises en place ne devraient pas donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l'état général des animaux, toutefois les animaux sont surveillés 5 jours par semaine et tout animal qui présenterait des signes physiologiques anormaux (souris prostrées ou encore apparition de nécrose cutanée) suite à l’application cutanée des composés, serait mis à mort.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort et certains organes sont utilisés pour analyse de la reponse immunitaire

Remplacement

L’utilisation de modèles in vivo, animaux, ne peut être remplacée par d’autres modèles. Il s’agit d’une caractéristique de la biologie cutanée : nous analysons la réponse immunitaire tissulaire, et non systémique. Ainsi les modèles in vitro, s’ils tendent à être optimisés, ne permettent pas d’analyser la réponse mémoire tissulaire. Par ailleurs, les modèles humains ne sont pas développés pour cette thématique, limités par le nombre de prélèvements réalisables. Il n’existe pas d’autre modèle expérimental de DA, de Pso ou d'EAC avec colonisation cutanée par S. aureus. Les modèles de peau reconstruite, de plus en plus utilisés en biologie de la peau, ne permettent pas l’inclusion et la stabilité de cellules immunitaires de type lymphocytes T ; l’analyse en phase mémoire est actuellement impossible. Par ailleurs, l’étude des lymphocytes T résidents mémoires se fait nécessairement au sein d’un complexe immun cutané qui n’est aujourd’hui pas modélisé dans ces peaux reconstruites. Au niveau humain, isoler les mécanismes immunitaires induits par S. aureus chez des patients atteints de DA (ou d’autres pathologies cutanées) est évidemment impossible. Les méthodes d’exposition aux bactéries (type patch-tests) ne sont pas développées et sont limitées par le nombre de biopsies réalisables chez l’Homme.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes.

Raffinement

Des mesures seront mises en œuvre pour optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée dans l'animalerie, une période d'acclimation d'une semaine sera respectée avant le debut de la procédeure expérimentale, et les souris seront maintenues entre 4 et 5 souris par cage, afin de les maintenir au maximum en groupe social. Dans le cadre de ce projet, les animaux seront anesthésiés pour chaque geste entraînant ou pouvant entraîner un stress ou une douleur pour l’animal. Des points limites bien définis et suffisamment précoces et prédictifs pour prévenir tout stress et toute douleur de l’animal ont été mis en place. L’observation des animaux sera effectuée 5jours/7 et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Les soins et les procédures seront réalisées par du personnel qualifié. Le poids des animaux sera egalement suivi tout au long de l'experience, et si des animaux perdaient du poids (+ de 5% de leur poids), des croquettes humides seraient mises dans le fond de la cage.

Choix des espèces

L’espèce souris est un modèle très utilisé en pathologie immunologique telle que l’allergie et autres inflammation cutanée en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de cytokines inflammatoires ou encore l’induction de des différentes populations de lymphocytes mémoires. De plus, l’utilisation de ce modèle, couramment employé dans ce domaine, nous permettra de discuter nos résultats par rapport aux données existantes de la littérature. Les souris entrent dans les procédures à 8-10 semaines, âge auquel les souris présentent un système immunitaire suffisamment mature pour effectuer une sensibilisation efficace.

186 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des rats porteurs d'une dégénérescence rétinienne reçoivent une greffe de cellules par chirurgie oculaire, sous immunosuppresseur, puis des tests comportementaux d'acuité visuelle par optométrie et boîte clair-obscur, avant d'être tués au CO2 pour prélever les yeux. Le projet teste une thérapie cellulaire dérivée de cellules souches humaines. Le porteur affirme qu'aucune méthode substitutive ne permet de mesurer l'acuité visuelle.

Objectifs

L’objectif principal du projet est de transplanter différentes populations cellulaires dérivées de cellules souches pluripotentes induites humaines (hCSPi) obtenues à partir de sujets sains (sans pathologie oculaire) chez le rat RCS (Royal College of Surgeons). Nous pourrons ainsi évaluer l’impact de la transplantation de ces différentes populations sur la survie des photorécepteurs de l’hôte et l’amélioration de l’acuité visuelle. Le rat RCS est un modèle de dégénérescence rétinienne dû à une mutation spontanée responsable de la mort des photorécepteurs (cellules photosensibles de la rétine). Cette mutation va donc induire une cécité qui débute vers 18 jours post-natal et qui sera totale au 3 mois de vie de l'animal. En résumé, dans ce projet nous souhaitons étudier (1) la survie et l'intégration (2) l'effet thérapeutique de la transplantation de différentes populations cellulaires dans un modèle de dégénérescence rétinienne par des anaylses comportementales et histochimiques réalisées à différentes temps post-transplantations : 3, 7 et 13 semaines.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet de thérapie cellulaire est de restaurer l'acuité visuelle ou ralentir la dégénérescence grâce à la transplantation de différentes populations de cellules rétiniennes chez le rat RCS. Des précédentes études ont démontré l'inocuité et la survie du transplant lors de transplantation de cellules de l'épithélium pigmentaire chez ce modèle. Aussi, une amélioration de l'acuité visuelle suite à une transplantation de ce type cellulaire a été décrite chez ce modèle animal. Cependant, de nombreuses hypothèses suggèrent que la transplantation d'un seul type cellulaire dans l'espace sous-rétinien n'est pas optimale dans le but d'une restauration visuelle. Ainsi, nous proposons de réaliser une transplantation multicellulaire avec l'obtention in vitro de mini-rétine. L'hypothése de notre étude est que (1) les différents transplants (unicellulaire et multicellulaire) vont survivre et s'intégrer (2) l'amélioration visuelle engendrée par la thérapie cellulaire sera supérieure dans le cas d'une transplantation multicellulaire en comparaison avec une transplantation unicellulaire. Il est à noter que la transplantation de mini-rétine dérivées d’hCSPi n’a jamais été réalisée dans ce modèle, rendant ce projet innovant. Chez l'Homme, la thérapie cellulaire et l’utilisation des cellules souches est une approche thérapeutique prometteuse dans le cadre de nombreuses maladies dégénératives telles que les dystrophies rétiniennes. À l’heure actuelle, la majorité des essais cliniques ont mis en évidence la faisabilité et l’innocuité de l’utilisation des cellules souches. Malgré des résultats encourageants, ces approches doivent être améliorées afin d’optimiser la récupération de l’acuité visuelle.

Procédures

Aucun prélèvement sur animaux vigiles ne sera réalisé. En revanche, les animaux seront soumis à 1 procédure expérimentale dont la gravité est estimée modérée. Les animaux (2 lots de 3 animaux pour l'étude pilote, 4 lots de 30 animaux dans l'étude principale) recevront une transplantation de différentes populations rétiniennes sous traitement anesthésique, antalgique et anti-inflammatoire. La durée de la chirurgie est estimée à 30 minutes. Afin de limiter le risque de rejet du greffon, les animaux seront sous traitement immunosuppresseur. Afin de mesurer le bénéfice de cette thérapie cellulaire, l'acuité visuelle de l'ensemble des animaux de l'étude principale sera testée grâce à 2 tests comportementaux réalisés à 3, 7 et 13 semaines post-tranplantation. Le premier test est un test d’optométrie, qui durera 1 minute / œil. Le deuxième test (light dark-box) permet de tester l’acuité visuelle globale des rongeurs grâce à leur instinct photophobique. Il sera réalisé pendant 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuissances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont : hémorragie oculaire non maitrisable lors de la greffe, opacité de la cornée persistante, stress et photophobie des animaux lors des tests comportementaux lié au changement d’environnement (durée courte de 1 à 5 min).

Devenir

L’objectif du projet est d’évaluer l’effet de la transplantation de populations rétiniennes sur l’acuité visuelle. A l’issue des tests comportementaux permettant de mesurer l'acuité visuelle, les animaux seront euthanasiés par inhalation de CO2 afin de récupérer les yeux pour des analyses anatomiques et histochimiques ultérieures : à 3 semaines post-transplantation pour tous les sous-lots 1, à 7 semaines post-transplantation pour tous les sous-lots 2, à 13 semaines post-transplantation pour tous les sous-lots 3.

Remplacement

L’objectif de ce projet est de valider l’utilisation de cellules rétiniennes dérivées de cellules souches pluripotentes induites dans le cadre d’une thérapie cellulaire. Cela nécessite au préalable une approche dans un modèle animal avant de pouvoir être transposer à l'Homme à des fins thérapeutiques. Il ne peut pas être envisager l’utilisation d’une méthode substitutive puisque que nous devons ici mesurer l’acuité visuelle.

Réduction

Pour l'étude pilote, 2 lots de 3 animaux recevront une transplantation afin de valider la procédure chirugicale. Afin de diminuer le nombre d’animaux, les tests comportementaux et les analyses post-mortem seront réalisés sur l’ensemble des animaux. Les tests comportementaux seront réalisés de façon longitudinale afin que chaque animal soit son propre contrôle (mesures répétées à plusieurs temps). Le nombre d’animaux utilisé a été statistiquement défini selon la loi de Cochran. La réduction du nombre d’animaux nécessaires à l’expérimentation a été calculé en s’assurant d’avoir un nombre suffisant d’animaux pour garantir la qualité statistique des données et ainsi empêcher la reproduction de ces expérimentations. Ainsi, nous nous sommes basés sur un niveau de confiance déduit de 95% (z) avec une marge d’erreur de 5% (d). La proportion estimative de la population ayant la caractéristique étant inconnue, elle a été définie à 0,5 (p). Ainsi, suivant ce calcul (nombre d’animaux =(z)2/4d2 quand p=0.5), 180 animaux seront utilisés pour l'étude principale : 10 animaux multiplié par 3 cinétiques temporelles et 6 conditions expérimentales soit n = 10 x 3 x 6 = 180 animaux.

Raffinement

Les méthodes expérimentales utilisées dans cette étude sont validées, reproductibles et classiquement retrouvées en laboratoire. Conformément à la règle des 3R, différents dispositifs seront mis en place afin de réduire au maximum la souffrance, la douleur et l’angoisse des animaux. Ainsi, une grille de scoring du bien-être des animaux sera remplie tous les jours afin de détecter le plus précocement possible le point limite et de diminuer ou éviter toute souffrance animale. Ainsi, cela engendrera la mise en place d'un traitement antalgique. En cas d'atteinte d'un point limite terminal, la souffrance sera arrêtée immédiatement par la mise à mort de l'animal. De plus, les animaux seront observés tous les jours afin de mettre en évidence des signes de détresse (stéréotypie, hyper toilettage, oreilles positionnées en arrières et moins rosées). De plus, suite à la transplantation, l’absence d’hémorragie oculaire ou/et d’opacité de la cornée seront vérifiées quotidiennement pendant 7 jours puis de façon hebdomadaire. Pour un raffinement maximum, les rongeurs seront maintenus dans un environnement de statut sanitaire contrôlé et dans des conditions de température et d’hygrométrie réglementaires. Ils seront hébergés par groupe de deux, dans des conditions d’élevage standardisées (litière propre, au calme, cycle lumière/obscurité 12 heures) avec accès à un bâton de bois, leur permettant d’assouvir leur besoin naturel de rongeur. Par ailleurs, de la veille de la transplantation jusqu'à la mise à mort, les animaux seront immunodéficients par traitement à la cyclosporine A : ainsi ils seront hébergés en portoir ventilé permettant le maintien d'un statut sanitaire en adéquation avec l'immunité réduite. De plus, les tests comportementaux utilisés dans ce projet, ne nécessiteront pas d’intervention directe de l’expérimentateur. Une étude pilote sera réalisée sur deux lots de 3 animaux (lot 1 : rats RCS transplantés avec une population multicellulaire, lot 2 : rats RCS transplantés avec une population unicellulaire) afin de vérifier que le transplant est présent au niveau de l'hôte 3 semaines post transplantation et confirmer ainsi la procédure chirurgicale.

Choix des espèces

Le rats RCS est un modèle largement décrit dans de nombreuses études précliniques des pathologies rétiniennes. En effet, ce modèle de dégénérescence rétinienne précoce est l'un des 2 modèles les plus utilisés en ophtalmologie dans le monde (plus de 900 publications à ce jour), notamment pour tester de nouvelles approches thérapeutiques pour restaurer la fonction visuelle. Cette espèce animale présente une mutation spontanée responsable d’une incapacité pour les cellules rétiniennes à phagocyter les segments externes du photorécepteur entraînant l'accumulation de débris du segment externe et, par la suite, la dégénérescence des photorécepteurs. La cécité débute vers le 18ème jour post-natal et est totale environ 3 mois après la naissance. Par ces caractéristiques, l’utilisation d’une telle espèce animale est pertinente et justifiée pour tester la capacité des transplantations sous rétiniennes sur la restauration visuelle. Des rats Long Evans seront utilisés comme animaux contrôle (dont l’acuité visuelle n’est pas affectée). Les LE sont des rats pigmentés (comme les rats RCS) possédant une bonne acuité visuelle. Chez le rat RCS, le nombre de photorécepteurs commence à diminuer à 18 jours post-natal, de façon continue et progressive jusqu’à l’âge de 3 mois (cécité totale). Dans cette étude, nous souhaitons réaliser des transplantations à 22 jours post-natal, période précoce de la dégénérescence, qui est représentatif de la fenêtre temporelle qui serait utilisée dans le cas d’une transplantation chez l’Homme (phase précoce et diagnostique de la maladie).