Recherche fondamentale

4 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un cathéter jugulaire sous anesthésie, subit des prélèvements sanguins sur 24 heures puis un suivi jusqu'à trois semaines, avant d'être tué pour prélever des tissus. Le projet vise à roder une technique de pose écho-guidée, à former quatre opérateurs et à mesurer la cinétique d'un antibiotique. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire" de pratiquer la technique in vivo pour assurer les gestes.

Objectifs

Dans le cadre de la directive 2010/63/UE relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques, retranscris en droit français par le décret no 2013-118 du 1er février 2013, le raffinement des techniques utilisées en expérimentation animale est souligné. Le but de ce projet est d'améliorer la technique de pose de cathéter veineux central chez le porc grâce à un appareil d'échographie permettant ainsi d'avoir une procédure moins invasive et non-chirurgicale. L'objectif est également de former certains opérateurs à cette nouvelle technique (4 opérateurs au total dont 2 ont déja eu un entrainement in vivo au préalable par un opérateur expérimenté). La pose de cathéter permet l'accés à une voie veineuse pour les études de cinétique (avec des prélèvements sanguins répétés) faites au laboratoire sur le modèle porc, de façon indolore et minimisant le stress pour les animaux. La 2e partie de ce projet porte sur une étude cinétique de la céfazoline. Il s'agit d'un antibiotique utilisé en médecine humaine en antibioprophylaxie, c’est-à-dire en antibiothérapie préventive, pour limiter le risque d'infections du site opératoire sur certaines interventions. Le porc est un modèle biomédical de l'Homme fréquemment utilisé pour lequel il est parfois nécessaire d'avoir également recours à ce type d'antibioprophylaxie. Or, il n'y a pas ou très peu de données concernant sa pharmacocinétique chez le porc conventionnel et donc peu de données permettant de justifier les doses à utiliser. Le 2e objectif de ce projet est donc de réaliser une étude de cinétique plasmatique de la céfazoline chez ces 4 porcs, en profitant de la pose des cathéters qui aura été effectuée chez ces animaux dans un but de formation.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de la mise en place de cette nouvelle technique de cathéter central sont multiples : - réduction de la durée d'anesthésie des animaux (environ 30-45 min); - diminution du risque infectieux car il n'y a pas d'ouverture chirurgicale, le seul geste invasif étant le passage de l'aiguille et du cathéter au niveau du cou - possibilité de retirer facilement le cathéter si celui-ci n'est plus fonctionnel; - amélioration globale du bien être des animaux grâce aux points précédents. Concernant la cinétique plasmatique de la céfazoline, les données récoltées permettront par la suite de calculer les paramètres phamarcocinétiques majeurs (volume de distribution, clairance...) permettant de proposer une posologie adaptée lorsque le recours à cet antibiotique est nécessaire en expérimentation animale chez le modèle porcin.

Procédures

Pour la pose d'un cathéter central au niveau de la veine jugulaire externe, une anesthésie générale d'une durée moyenne de 30-45 min est nécessaire. Le placement du cathéter central de façon écho-guidée, permet de réduire la durée de l'anesthésie et de minimiser le risque infectieux (procédure moins invasive qu'une technique chirurgicale). Cette procédure peut être source de stress et de douleur mais une contention maitrisée suivi d’une anesthésie/analgésie adaptée permettra de réduire au maximum ces désagréments. Une fois le cathéter posé (avec une rallonge du connecteur), les prélèvements de sang seront totalement indolores et sans contention particulière, et auront lieu sur une période de 24h. Puis les porcs seront gardés au maximum 2 semaines afin d'évaluer quotidiennent la fonctionnalité des cathéters (test pour voir si le sang est toujours prélevable puis rinçage du catheter).

Impact sur les animaux

La procédure de pose de cathéter réalisée sous anesthésie générale et avec des conditions d'asepsie stricte. Une fois le cathéter posé les prélèvements de sang et l'entretien des cathéters seront totalement indolores et donc non générateurs de stress. Il n'est pas attendu d'effet indésirable sauf un éventuel risque d'infection en cas d'erreur d'asepsie et/ou de mauvais entretien des cathéters (risque très faible). La dose de céfazoline utilisée est dans l'intervalle classique de dose thérapeutique chez l'Homme et dans d'autres espèces animales, sans effet toxique attendu.

Devenir

Chaque porc sera mis à mort à l’issue des 3 semaines d’expérimentation dans des conditions éthiques, et des tissus d’intérêt (muscle, foie reins) pourront être récoltés.

Remplacement

Un entrainement et une formation avec un expérimentateur aguerri à la technique avec échographe a déja été effectué pour 2 opérateurs, et d'autre entrainements sur des maquettes/fantômes sont prévus. Cependant, il est nécessaire de pratiquer cette technique in vivo sur un faible nombre d'animaux afin d'assoir les gestes techniques et évaluer l'efficacité de cette méthode. En outre, ces porcs serviront à la réalisation d'une cinétique plasmatique de la céfazoline, procédure qui ne peut pas être remplacée par des méthodes in vitro.

Réduction

Le nombre minimal d'animaux (4 porcs) a été défini pour permettre une manipulation de l'ensemble des opérateurs (4 opérateurs, entre une et 3 veines par opérateur). Concernant la cinétique plasmatique, le nombre d'animaux est faible mais suffisant pour évaluer correctement les paramètres pharmacocinétiques majeurs, surtout après administration intra-veineuse car la variabilité inter-animale est bien moindre que par voie extra-vasculaire.

Raffinement

La pose de cathéter se fait grâce à une anesthésie et analgésies adaptées. Les porcs seront hébergés par 2 lors de la phase d'acclimatation (5-7 jours) puis seront seuls par case (sur caillebotis) après la pose du cathéter afin de limiter les risques d'arrachement. Cependant, les barrières entre cases permettent un contact visuel, olfactif et tactile (groin à groin) entre porc voisin. Des jouets seront mis à disposition : balle et/ou rouleau et/ou jouets à macher suspendus. Les cathéters seront protégés avec un bandage adéquat qui sera vérifié régulièrement et changé s'il est trop souillé. Un suivi-post anesthésie individuel des animaux sera effectué. Les injections et prises de sang seront indolores grâce à la pose des cathéters. Des sessions d’interactions positives sont régulièrement effectuées lors des prélèvements sanguins par des caresses et grattages, ce qui permet d’améliorer le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Il s'agit de l'espèce et de la gamme de poids cible et utilisée au laboratorie pour les études de cinétique plasmatiques pour diverses molécules.

136 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux nouveau-nés reçoivent une injection sous-palpébrale dans chaque œil, sous analgésie par le froid sur de la glace, avec un risque de rejet par la mère au retour au nid, avant d'être tués pour disséquer leurs yeux. L'objectif relève de la recherche fondamentale sur le rôle des macrophages dans le développement du réseau lymphatique de l'œil. Le porteur affirme qu'"aucune alternative in vitro ou in silico n'existe" et que l'approche in vivo est nécessaire.

Objectifs

Les vaisseaux lymphatiques sont complémentaires des vaisseaux sanguins. Ils jouent un rôle important dans l’évacuation des déchets ainsi que la surveillance immunitaire au sein des organes et tissus. Ils transportent les cellules immunitaires et participent à l’activation de la réponse immunitaire. Une place de plus en plus importante du réseau vasculaire lymphatique apparaît dans le cadre des atteintes et troubles oculaires. La formation de nouveaux vaisseaux lymphatiques (lymphangiogenèse) a ainsi été observée dans les pathologies inflammatoires de l’œil (syndrome de l’œil sec, allergies oculaires, etc..). L’implication de ces vaisseaux dans le drainage de l’humeur aqueuse de l’œil et la régulation de la pression intraoculaire, facteur de risque majeur associé au développement du glaucome, a été également proposée. Une contribution de macrophages (cellules immunitaires impliquées dans la défense de l’organisme contre les substances étrangères ou les agents pathogènes) dans la lymphangiogenèse associée à plusieurs situations pathologiques a été décrite chez l’homme. L’objectif de ce programme est d’analyser si les macrophages peuvent également contribuer de façon directe et/ou indirecte à la formation du réseau lymphatique au cours des étapes précoces du développement. La compréhension et caractérisation des mécanismes impliqués dans le développement et la formation des vaisseaux lymphatiques oculaires est nécessaire pour élaborer des stratégies thérapeutiques ciblant ces vaisseaux lymphatiques.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de définir si les macrophages exercent un rôle majeur au cours du développement du réseau lymphatique de l’oeil dans le modèle d’étude murin. Ils permettront d’appréhender en particulier si les macrophages peuvent constituer une source alternative de cellules endothéliales lymphatiques, cellules qui tapissent les vaisseaux lymphatiques. Comme indiqué précédemment, ces nouvelles connaissances permettront de mieux cibler la formation des vaisseaux lymphatiques lors de l’élaboration de stratégies thérapeutiques visant à interférer avec la formation de ces vaisseaux dans les pathologies oculaires.

Procédures

Injection sous-palpébrale (1 seule injection par œil de durée limitée : 5 à 10 secondes)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus concernent : -la douleur qui pourrait être ressentie lors de la piqure pour l’injection, malgrè l’analgésie par le froid qui sera pratiquée ; -le rejet potentiel par la mère après retour dans le nid ; -le stress lié à la manipulation des souriceaux ainsi qu’à la variation des températures se produisant lors de l’analgésie par le froid

Devenir

L’ensemble des animaux utilisés dans la procédure décrite sera euthanasié afin de pouvoir procéder aux analyses des conséquences du traitement sur les macrophages et les vaisseaux lymphatiques oculaires après prélèvement et dissection des yeux.

Remplacement

Aucune alternative in vitro ou in silico n’existe à ce jour. Ces études fondamentales qui concernent le développement des vaisseaux lymphatiques nécessitent une approche in vivo. L’objectif du projet étant d’analyser ce développement après l’administration d’un traitement visant à supprimer les macrophages pour analyser leur contribution, ce traitement doit être au préalable réalisé et avoir produit ses effets avant d’euthanasier les animaux pour en analyser les conséquences.

Réduction

La molécule utilisée pour détruire sélectivement les macrophages, a une action effective seulement 24h post-administration voire quelques jours post-administration selon le tissu et le mode d’administration utilisé. C’est pourquoi l’euthanasie des animaux pour caractériser le réseau lymphatique nouvellement formé sera réalisée à Jour 2, Jour 3, Jour 5 et Jour 7 après l’injection, période au cours de laquelle se développe ce réseau vasculaire. Afin de tenir compte du principe de réduction du nombre d’animaux utilisés tout en évitant de compromettre l’obtention de résultats statistiquement significatifs, il sera utilisé un test statistique pour le traitement des données limitant le nombre de répétitions des expériences. Dans ce contexte, la prise en compte des résultats obtenus antérieurement permet de définir un nombre d’échantillons nécessaires à 8 yeux par groupe d’étude. Par ailleurs, l’œil des animaux étudiés se trouvant fermé aux âges considérés, les 2 yeux de chaque animal seront utilisés, lorsque justifié par l’expérience, dans le but de limiter le nombre d’animaux utilisés. De plus, le nombre d’animaux utilisés pourra être revu à la baisse à l’issue des résultats obtenus lors de la première série de traitement au cours de l’expérience de déplétion des macrophages, en privilégiant l’un des stades de développement proposés (jour 2, jour 3, jour 5 ou jour 7) pour la suite de l’étude.

Raffinement

La douleur potentielle de la piqure sera atténuée par l’analgésie par le froid en positionnant l’animal nouveau-né sur la glace avant la piqure. L’injection est réalisée à température ambiante sous loupe binoculaire permettant de visualiser avec précision le geste effectué. La finalisation du réchauffement du nouveau-né, débutée lors de la manipulation, est obtenue en plaçant celui-ci 2 à 3 minutes sur un tapis chauffant à 37°C avant son retour le plus rapidement possible dans le nid auprès de la mère. Il sera veillé à enduire le corps du nouveau-né avec une goutte d’urine de la mère pour éviter tout risque de rejet

Choix des espèces

Les souris utilisées dans ce projet sont des souris C57BL6/J sauvages. Ce modèle murin est bien caractérisé pour la distribution et le développement du réseau vasculaire lymphatique de la surface de l’oeil. Plusieurs études ont également montré de nombreuses similitudes du modèle souris avec le modèle humain pour la caractérisation des atteintes et troubles oculaires, notamment concernant la formation des vaisseaux ainsi que pour les voies et mécanismes de régulation de la pression intraoculaire. Les animaux utilisés seront des nouveau-nés : Injection à Jour 0 (jour de la naissance) ; Euthanasie à Jour 1 ou Jour 2, Jour 3, Jour 5 et Jour 7 après la naissance, selon l’expérience considérée. Les données de la littérature ainsi que nos observations montrent que les étapes précoces du développement du réseau vasculaire lymphatique de surface de l’œil de la souris C57BL6/J se déroulent au cours des premiers jours après la naissance (entre Jour 0 et Jour 7 après la naissance).

480 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'implantation de cathéter vasculaire, des infusions intraveineuses et jusqu'à huit prélèvements sanguins sur 24 heures, parfois par ponction cardiaque terminale sous anesthésie, pour établir le profil pharmacocinétique de candidats médicaments. Le porteur agit comme prestataire de services et réalise ces études pour des clients de l'industrie pharmaceutique. Sur le remplacement, il affirme que les méthodes in vitro et la modélisation restent limitées et que l'évaluation in vivo demeure "incontournable".

Objectifs

Au cours du développement préclinique, un grand nombre d’études sont effectuées afin d’évaluer l’efficacité et l’innocuité des candidats médicaments. Les études pharmacocinétiques, qui sont menées en parallèle, permettent d’étudier le devenir du composé dans un organisme vivant. Classiquement, il s’agit de caractériser son absorption, sa distribution dans l’organisme, son métabolisme (c’est-à-dire comment l’organisme procède à sa transformation) et enfin son élimination. Les données collectées dans le cadre de ces études permettent notamment d’affiner les doses et par conséquent de contribuer à la détermination de fenêtres/marges thérapeutiques, qui matérialisent la zone de concentrations permettant d’observer une efficacité tout en limitant la survenue d’effets secondaires/toxiques. En tant que prestataire de services pour l’industrie pharmaceutique, nous proposons à nos clients de réaliser la phase expérimentale de leurs études pharmacocinétiques. Ce projet a donc pour objectif de fournir à nos clients des échantillons de sang prélevés chez le rongeur (rat ou souris) et dont l’analyse permettra de connaître les variations de concentration plasmatique des candidats médicaments au cours du temps après une administration sous forme d’infusion intraveineuse, voie d’administration rencontrée lors de protocoles expérimentaux aigues réalisés au cours de procédures chirurgicales. Ainsi, ces études pharmacocinétiques permettront de mieux définir les doses à utiliser dans d’autres projets.

Bénéfices attendus

Les échantillons de sang collectés seront traités et les plasmas ou sérums obtenus seront analysés par nos clients afin d’établir le profil pharmacocinétique de leur candidat médicament et de déterminer les doses qui permettront d’obtenir un effet optimal avec des effets secondaires maitrisés.

Procédures

Les animaux seront soumis à des administrations par voie intra-péritonéale et sous-cutanée. Des prélèvements répétés de sang seront réalisés soit sur animal vigile via la veine de la queue, soit sur animal anesthésié par ponction directe de la veine jugulaire. Certains prélèvements pourront être réalisés en terminal par ponction intracardiaque sur animal anesthésié. Ces prélèvements seront réalisés le plus souvent pendant les 24h avec un maximum de 8 prélèvements sur cette période, mais ils pourront également être étalés sur 72h. Les animaux subiront des chirurgies d’implantation de cathéters vasculaires suivies d’une infusion des composés à tester. La durée de la chirurgie est d’environ 10-15 minutes. Les durées d’infusions n’excèderont pas 2 heures (1 heure si réveil de l’animal).

Impact sur les animaux

L’administration des anesthésiques et analgésiques nécessitera que les animaux soient maintenus en contention et les injections impliqueront l’introduction d’une aiguille. Afin d’effectuer l’infusion intraveineuse des composés, un cathéter sera implanté dans une veine au cours d’une chirurgie réalisée sous anesthésie générale. Des prélèvements de sang seront réalisés, impliquant parfois des ponctions directes dans les vaisseaux à l’aide d’une aiguille ou d’une lancette. Ces prélèvements pourront nécessiter également d’anesthésier les animaux et ce de façon répétée. Dans le cadre de prélèvements multiples, jusqu’à 8 prélèvements pourront être réalisés sur 24h. Lorsque des volumes importants de sang seront nécessaires, le prélèvement pourra être réalisé en intracardiaque de façon terminale sous anesthésie générale.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure 1.

Remplacement

Si des méthodes d’extrapolation in vivo des effets observés in vitro sont de plus en plus utilisées, comme la modélisation pharmacocinétique à fondement physiologique, ces approches présentent malgré tout encore certaines limites, notamment la difficulté à paramétrer certains processus mis en jeu en particulier pour les phases d’absorption et d’excrétion. Ces approches ne constituent qu’une aide à la caractérisation des interactions pharmacocinétiques, et l’évaluation in vivo du devenir d’un composé dans un organisme vivant reste incontournable

Réduction

Toutes les mesures seront prises pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet tout en prenant en compte les besoins de nos clients (volumes de sang, nombre de points de prélèvements, de voies d’administrations et de doses à tester nécessaires). Chaque animal pourra être son propre contrôle, et le recours à des prélèvements répétés au cours du temps sur le même animal permet également de limiter le N total par étude. Aucune analyse statistique sera réalisée dans ce projet.

Raffinement

L’ensemble des expérimentations seront effectuées par un personnel compétent, formé et entraîné. L’état clinique des animaux sera suivi quotidiennement grâce à une grille de score. Des points limites précis et spécifiques sont également préalablement établis afin de s’assurer que toute douleur/souffrance éventuelle des animaux pourra être détectée et prise en charge rapidement. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie appropriée. Les prélèvements sanguins ainsi que les volumes d’administration seront réalisés selon les recommandations éthiques. Après chaque prélèvement, une injection de sérum physiologique sera réalisée (volume équivalent injecté directement dans la voie veineuse ou 3 fois le volume prélevé injecté en sous cutané) afin de compenser la perte de volémie. La chirurgie nécessaire pour l’implantation du cathéter sera réalisée en conditions aseptiques, et les animaux bénéficieront d’une surveillance accrue (minimum 2 fois par jour) en phase post-opératoire.

Choix des espèces

Le développement préclinique de nouveaux composés fait usage de nombreux modèles animaux de pathologies. Les études pharmacocinétiques permettent d’étudier le devenir du composé dans un organisme vivant (absorption, distribution métabolisme et élimination). Ainsi, en vue de réalisation d’études précliniques d’efficacité chez les rongeurs, les connaissances des données pharmacocinétiques pour un nouveau composé représentent des informations clé au regard de sa biodisponibilité selon la dose administrée, la voie d’administration utilisées, l’impact de l‘anesthésie, l’espèce d’intérêt, …. Les animaux utilisés dans le cadre de ces études sont des rats de tous âges, mâles ou femelles, soit environ 150 à 600g L’âge, la souche et le sexe des animaux dépendra du protocole à réaliser, des objectifs de l’étude et des candidats médicaments à tester.

560 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit une injection de monocrotaline pour induire une hypertension pulmonaire, puis des traitements par injections, avec deux anesthésies pour échographie cardiaque et cathétérisme, avant d'être tué pour prélever poumons et cœur. Le porteur qualifie de bénins les effets attendus car la maladie est étudiée à un stade précoce, et applique une crème anesthésiante aux points d'injection. Sur le remplacement, il indique disposer de résultats sur cellules humaines mais vouloir les valider dans trois modèles animaux d'hypertension pulmonaire.

Objectifs

L'hyperTension Artérielle Pulmonaire (HTAP) est une maladie qui affecte les petits vaisseaux du poumon qui vont s'épaissir par un processus appelé remodelage vasculaire pulmonaire. Cette altération va imposer un effort au cœur qui à terme va aboutir à une insuffisance cardiaque. Bien que les mécanismes restent encore méconnues, il est maintenant établi que les protéines osseuses morphogénétiques joue un rôle important dans ce remodelage vasculaire pulmonaire. Cependant, les connaissances autour du mode de fonctionnement de ces protéines dans les petits vaisseaux du poumon sont très limitées. C'est pourquoi nous souhaitons étudier leurs rôles dans l'HTAP et tester l’efficacité de molécules ciblant ces protéines pour lesquelles nous avons trouvé une efficacité sur des cellules de vaisseaux pulmonaires en culture.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet seront multiples et devraient permettre non seulement de mieux comprendre le rôle des protéines présentes dans les petits vaisseaux du poumon, mais aussi leur contribution au développement de l'HTAP. De plus, ce projet permettra de tester l'efficacité de certaines molécules ciblant ces protéines pour lesquelles de premiers résultats in vitro sont encourageants.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés pour effectuer une échocardiographie afin de valider le modèle avant les traitements (temps : 5 min/ rat). En fin de traitement les animaux seront à nouveaux anesthésiés afin de mesurer tous les paramètres nécessaires à l'étude (échographie et cathétérisme).

Impact sur les animaux

La procédure appliquée à ce projet nécessite d'effectuer 2 types d'injection chez le rat : 1 injection sous-cutanée et des injections intra-péritonéales pour les traitements ou du placébo. Pour limiter ces nuisances, une crème lidocaïne sera appliquée sur la zone où s'effectueront les injections. Également, deux anesthésies gazeuses (isoflurane) seront pratiquées sur l'animal : la première pour valider le modèle expérimental avant traitement par échographie transthoracique, et la deuxième pour évaluer l'efficacité du traitement par échographie transthoracique et cathétérisme. Nous veillerons donc au bon réveil de l'animal et évaluerons son bien-être et prendrons, si nécessaire, les mesures développées dans la description de la procédure. La première injection de la procédure est réalisée avec la monocrotaline, une molécule naturelle extraite de la plante Crotalaria. Cette molécule est connue pour induire une hypertension pulmonaire modérée chez le rat. Les effets seront bénins dans notre projet car nous étudierons la mise en place de la maladie en phase précoce. Nous avons également des données qui valident la non toxicité cellulaires de nos molécules pour les différents traitements du projet. D’ailleurs, une étude publiée récemment a démontré l’innocuité et l’efficacité de ce type de molécules pour lutter contre le métabolisme du glucose et des lipides dans le cadre de modèles animaux axés sur l’étude de l’obésité.

Devenir

Des prélèvements d'organes (poumons et cœur) seront réalisés afin de valider l'efficacité des traitements dans les tissus biologiques. De plus, comme décrites dans notre demande, différentes expérimentations biologiques seront réalisées au laboratoire pour démontrer les mécanismes mis en jeu.

Remplacement

Nous avons obtenu des résultats sur des échantillons pulmonaires humains et des cultures de cellules qui indiquent une altération de voies de signalisation dans les cellules endothéliales HTAP et que celle-ci peuvent être restaurées sous l'effet d'une molécule spécifique. Dans l'objectif de valider l'importance de ce défaut sur la fonction cardiaque et sur le remodelage des petites artères pulmonaires, nous souhaitons restaurer ces voies dans 3 modèles complémentaires d'HTAP reconnus internationalement et conclure sur son potentiel thérapeutique.

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d'animaux, nous avons choisi de cibler nos traitements sur les protéines de la voie ayant la plus forte dérégulation que nous comparons aux contrôles positifs et négatifs d'hypertension pulmonaire. De plus, les effectifs ont été calculés à l’avance et se basent sur nos études passées et celles récemment publiées autour de ce type de molécules. Le critère déterminant pour évaluer l'efficacité du projet est la mesure de la pression artérielle pulmonaire moyenne. Les données de ce projet seront traitées statistiquement à l'aide d'un logiciel spécifique. Par ailleurs, les échantillons provenant d'animaux témoins non malades et témoins d'HTAP pourront être réutilisés pour d'autres projets de recherche pour des analyses histologiques et moléculaires.

Raffinement

Les rats bénéficieront d'un enrichissement de milieu avec du coton, des rouleaux de carton et des bâtonnets en bois. Ces animaux ne seront jamais hébergés seuls dans des cages séparées et feront l'objet d'une période d'adaptation d'une semaine après leur arrivée avant de débuter une procédure. Pour la réalisation de la procédure, nous avons établi des points limites au moyen d'un score afin d'évaluer le bien-être animal. Les animaux seront donc suivis quotidiennement afin de veiller à ce bien-être et de prendre les mesures nécessaires développées dans la description de la procédure.

Choix des espèces

Les rats sont des modèles standards d’études de maladies cardiovasculaires. Afin que nos résultats soient comparés aux travaux de la littérature dans ce domaine, des rats âgés de 4 semaines et pesant 100 grammes chacun seront utilisés.

530 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe de cellules tumorales de mélanome sous la peau, avec prélèvements de sang et de selles, pour tester l'effet de métabolites du microbiote sur la réponse à l'immunothérapie, avant d'être tuée pour prélever ses organes. Le porteur indique que l'immunothérapie ne bénéficie qu'à une minorité de patients et présente ce traitement comme "incontournable". Sur le remplacement, il répète qu'un système immunitaire ne peut être reconstitué in vitro et juge le recours à l'animal "indispensable".

Objectifs

L’immunothérapie est désormais incontournable dans la prise en charge des cancers du mélanome, du poumon et du rein. Ce traitement est basé sur la stimulation des défenses immunitaires de l’organisme favorisant la reconnaissance et la destruction des cellules cancéreuses. Bien qu’elle soit attractive, l’immunothérapie présente une efficacité restreinte, ne bénéficiant qu’à une minorité de patients répondeurs (35 %). Il est donc urgent de trouver de nouveaux biomarqueurs impliqués dans cette non-réponse à l'immunothérapie et d'en comprendre les mécanismes de résistance associés. Ce projet permettrait d'améliorer l'efficacité de l'immunothérapie des individus non-répondeurs à et in fine à en limiter la progression du cancer. Des études récentes suggèrent que le microbiote de l'hôte, c'est à dire l'ensemble des microorganismes de notre organisme, conditionne cette réponse immunitaire lors d'une l'immunothérapie et est indispensable à l'obtention d'un prognostique favorable du patient. Certains de ces effets bénéfiques du microbiote intestinal ont été attribués aux espèces bactériennes de l'hôte. Cependant, une simple corrélation de ces bactéries a été associée à une réponse efficace, sans démontrer leur causalité et les mécanismes associés. À l'heure actuelle, la métabolomique, est science récente qui permet d'étudier les métabolites issus de l'organisme et est utilisée pour identifier les métabolites, biomarqueurs d'impact sur le métabolisme complexe du patient et sur l'immunothérapie. Dans ce projet, nous sommes intéressés au métabolome de 3 cohortes de patients atteints de mélanome, recevant une immunothérapie. L’analyse du métabolome du sérum de patients hyper-répondeurs à l’immunothérapie et avec prognostique favorable, a permis d’identifier 17 métabolites d'origine de l'hôte et du microbiote. Basés sur ces résultats, l’objectif de notre projet est i) d’évaluer et valider in vivo l’effet de ces métabolites sur la croissance tumorale dans des modèles préclinique du mélanome, et d’en identifier les mécanismes métaboliques hôtes-microbiens associés, et ii) déterminer l’effet des meilleurs métabolites immunostimulants sur l'efficacité des agents immunothérapeutique dans le mélanome.

Bénéfices attendus

Ce projet sur les métabolites immunostimulateurs associé au mélanome et leur rôle potentiel dans l'efficacité de réponse à l'immunothérapie permettra: 1) de valider et de caractériser fonctionnellement les empreintes du microbiome intestinal associées au cancer et à l'immunothérapie 2) d'évaluer une pertinence clinique pour le pronostic des patients 3) développer des outils de diagnostic qui pourraient enrichir l'arsenal oncologique pour la prévention, la prédiction et la personnalisation de la thérapie du cancer.

Procédures

Au cours de l’expérimentation, nous prévoyons 2 prélèvements fécaux/souris récoltés de manière naturelle (lors de la prise de la souris engendrant une défécation naturelle) (2 à 3 fèces/ souris), au Jour 7, et lors de la fin de la procédure destiné à l'analyse de la composition du microbiote, métabolome, durée 10 secondes. Nous prévoyons également 2 prélèvements de sang/souris : sur souris vigiles après anesthésie locale (lidocaïne) à Jour 7, durée 5 minutes, , lors de la fin de la procédure pour l'étude du métabolome de l'hôte. Injections de cellules tumorales sous anesthésie générale: durée 2 minutes (une par animal).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont liées aux injections et prises de sang, ainsi qu'à la présence de tumeurs greffées par voie sous-cutanée.

Devenir

Les souris seront euthanasiées afin de prélèver différents organes pour analyse du métabolome et du microbiote intestinal.

Remplacement

Il est maintenant indispensable de valider leur effet anti-cancéreux et sur l’immunothérapie à l’échelle de l’organisme entier, de façon à prendre en compte les interactions complexe de la réponse immunitaire antitumorale, celle de l’hôte et du microbiote intestinal, d’où la nécessité d’utiliser un modèle animal. Ce projet pourra ainsi permettre d’améliorer l’efficacité des immunothérapies des non-répondeurs par l’intermédiaire de nouveaux biomarqueurs métaboliques. L’analyse de l’impact des métabolites sur le métabolisme de l’hôte et sur son système immunitaire nécessitant l’utilisation d’un organisme complexe, le recours à l’animal est indispensable. En effet, utiliser uniquement une approche in vitro exclurait la prise en compte des possibles interactions intervenant chez l’hôte. Nous avons besoin d’un modèle mimant le plus fidèlement possible l’environnement tumoral et le système immunitaire. Comme il est actuellement impossible de reconstituer un système immunitaire in vitro/ex vivo du fait de sa complexité, il est absolument nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire a été défini à l’aide d’études précédentes publiées dans la littérature scientifique, mais aussi grâce à un test de puissance afin de solliciter un nombre minimum d’animaux, tout en gardant la possibilité d’obtenir des résultats statistiques exploitables. Le nombre de groupes proposé inclut les groupes contrôles nécessaires. L’étude est divisée en plusieurs procédures séquentielles et sera arrêtée si une des procédures invalide l’hypothèse de travail ; le nombre de souris sera ainsi diminué. Par ailleurs, une veille bibliographique constante sera faite pour éviter toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature. Les expérimentations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal. Durant l’expérimentation, l’état de santé des animaux sera surveillé quptodiennement permettant l’intervention rapide en cas de problème. La mise en place d’une grille de suivi clinique et des points limites qui seraont strictement appliqués permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques: i) La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue, ii) La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Enfin dans la littérature, la souris C57Bl6/J s’avère être la souche la plus utilisée pour l’analyse du métabolisme et l’étude de l'interaction du microbiote intestinal sur son métabolisme. Les animaux seront utilisés au stade adulte (6-9 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire et le métabolisme est mature (développement thymique achevé). Ceci permet alors d’obtenir un modèle animal qui reflète au mieux la physiologie chez l’Homme adulte, âge où sont suivi est important. De plus, les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale, une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l’expérimentation.

54 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une irradiation puis une injection intraveineuse par voie rétro-orbitale sous anesthésie et deux injections intrapéritonéales, pour étudier une protéine régulant les lymphocytes T dans l'auto-immunité intestinale. Le porteur indique qu'environ 30 % des souris modifiées développent une inflammation ano-rectale, et que les animaux sont tués par dislocation cervicale pour prélever rate, ganglions et côlon. Sur le remplacement, il affirme que les interactions entre cellules immunitaires ne peuvent être reproduites in vitro de façon fiable.

Objectifs

Les maladies auto-immunes résultent d'un dysfonctionnement du système immunitaire conduisant ce dernier à s'attaquer aux constituants normaux de l'organisme. C'est par exemple le cas dans le diabète de type 1, la sclérose en plaques ou encore la maladie de Crohn. Ces maladies sont généralement la conséquence d’une activation incontrôlée des lymphocytes T (LT). La caractérisation des protéines régulant l’activité des LT a donc un fort intérêt thérapeutique. Nous avons développé un modèle de souris dans lesquelles la protéine X est spécifiquement invalidée dans les LT ; certaines de ces souris développent spontanément une auto-immunité spécifiquement dans le colon, caractérisée par une forte activation des LT. Nous souhaitons confirmer ces données sur une cohorte plus large d’animaux, puis étudier les rôles spécifiques de X dans les différents sous-types de LT afin d’identifier le mécanisme responsable de la survenue de l’auto-immunité.

Bénéfices attendus

Ces travaux ont tout d’abord une portée fondamentale, puisqu’ils pourraient permettre l’identification d’un mécanisme moléculaire responsable du développement des maladies auto-immunes touchant l’intestin. D’autre part, nous espérons mettre en évidence les niveaux d’expression de la protéine X comme facteur de risque ainsi que comme cible thérapeutique dans ces maladies.

Procédures

Les souris seront soumises à une irradiation (30 minutes), puis recevront une injection intraveineuse par voie rétro-orbitale sous anesthésie générale (1 minute). Huit semaines plus tard les animaux vigiles recevront deux injections intra-péritonéales à 24h d’intervalle (2x 30 secondes).

Impact sur les animaux

Environ 30% des souris déficientes pour la protéine X développent une inflammation ano-rectale à partir de 9 mois après la naissance ; il s’agit d’un phénotype dommageable de gravité moyenne. Les autres souches de souris utilisées ne présentent pas de phénotype dommageable. L'irradiation suivie de reconstitution de moelle, l'injection de cellules par voie intraveineuse et l'injection intrapéritonéale ne provoquent pas d’effets secondaires dommageables détectables chez la souris. Les animaux subissent donc un ensemble d’étapes de classe de gravité modérée, susceptible d’entraîner une angoisse légère et de courte durée. Le comportement, le poids, l’éventuelle déshydratation des souris, et l’apparition éventuelle d’inflammation au site d’injection seront suivis tout au long de l’expérience.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure par dislocation cervicale ; les rates, ganglions lymphatiques et colon seront prélevées pour analyse du phénotype immunitaire par cytométrie en flux et analyses histologiques. Ceci permettra de documenter la fonction des protéines X dans la fonction des lymphocytes au cours de l’auto-immunité intestinale.

Remplacement

Nous avons tout d’abord effectué un certain nombre d'expériences in vitro. Cependant, la validation de nos résultats nécessitera une série d'expériences dans un contexte physiologique pertinent, c’est-à-dire chez l’animal. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, les interactions entre les différentes cellules immunitaires et leur microenvironnement, ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature.

Raffinement

Certains animaux transgéniques utilisés développent un phénotype dommageable (prolapsus rectal) ; d’autre part certaines procédures peuvent induire une douleur légère à modérée (irradiation, injections intraveineuses et intra-péritonéales). Les protocoles d’injection que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs, et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Le comportement, le poids, l’éventuelle déshydratation des souris, et l’apparition éventuelle d’inflammation au site d’injection seront suivis tout au long de l’expérience. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de différents modèles transgéniques nous permettant de mesurer spécifiquement le rôle de la protéine X dans les lymphocytes T et la survenue de l’auto-immunité. Ces animaux seront suivi jusqu’à un an après la naissance.