Recherche fondamentale

884 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisées d'une étape à l'autre puis mises à mort pour prélever leurs organes. 52 femelles gestantes sont immobilisées dans un tube de contention sous lumière vive trente minutes, trois fois par jour pendant six jours, pour induire un stress prénatal, et leur descendance subit des tests de tolérance au glucose avec gavage et prises de sang à la queue. Le porteur décrit ce protocole comme un modèle de stress psychologique humain transposé à la souris. Sur le remplacement, il affirme que les méthodes alternatives sont peu représentatives des pathologies humaines et rend le recours à l'animal "incontournable", le stress et les désordres métaboliques étant des réactions de l'"organisme entier".

Objectifs

La prévalence mondiale du développement de maladies métaboliques est en perpétuelle augmentation à travers le monde. L’objectif de notre projet est d'étudier les mécanismes du stress sur le développement de ces pathologies dans la descendance.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l'impact d'un stress prénatal se rapprochant d'un modèle de stress psychologique chez l'humain, chez la souris. Ce projet apportera des connaissances sur la physiopathologie des désordres métaboliques altérés par le stress au niveau cellulaire et moléculaire afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Pour générer des souris F1 issues de mères stressées, 52 femelles seront placées dans un tube de contention sous une lumière vive durant 30 min, 3 fois par jour, pendant 6 jours, du 13ème jour au 18ème jour de gestation. L'ensemble des souris F1, soit 624 sera soumis à un test de tolérance oral au glucose avec gavage sur animaux vigiles et avec prélèvement de sang à la queue. Parmi ces animaux, la moitié, soit 312 animaux seront soumis à deux tests de tolérance oral au glucose avec prélèvement de sang à la queue 3 mois après. Ces expériences seront réalisées sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Ce modèle n'induit pas de douleur spontanée chez la souris. Nous attendons le premier jour de la procédure de stress une stabilisation du poids ou une perte de moins de 3.5% du poids des mères gestantes en comparaison avec les mères gestantes non stréssées. Dès le deuxième jour de la procédure de stress les mères gestantes doivent reprendre du poids. Le stress réalisé sur les mères gestantes ne comporte pas d'effet visible comportemental. Nous attendons un stress léger sur la génération F1 qui pourrait se manifester sur les différents paramètres mesurés, notamment une augmentation de la glycémie à jeun ou en réponse à l'administration de glucose.

Devenir

Les animaux ayant servi à générer la descendance F1 seront mis à mort et des prelèvements d'organes seront réalisés. Les souris F1 sous régime normal ou sous régime particulier seront euthanasiées à différents âges : adulte jeune ou adulte mature après la procédure du test de tolérance oral au glucose. Différentes expériences seront réalisées ex-vivo et des prélèvements tissulaires seront collectés pour différentes études au niveau cellulaire et moléculaire.

Remplacement

Les méthodes alternatives, permettant une évaluation du statut métabolique au cours du temps de la descendance suite à un stress gestationnel sont peu représentatives des pathologies humaines. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale afin d'étudier les mécanismes engagés entre l'effet du stress in utéro et les désordres métaboliques observés chez la descendance. De plus, le stress et les désordres métaboliques sont des réactions intégrées de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans leur intégralité.

Réduction

Le nombre de 8 animaux par groupe expérimental est le minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, principalement due à la variabilité interindividuelle des réponses étudiées. L'ensemble des procédures seront réalisé lors de 3 expériences indépendantes.

Raffinement

Le suivi expérimental repose sur des techniques non-invasives : suivi du poids, observation du bien etre animal. L’utilisation de ces techniques non-invasives permet d’observer au cours du temps un seul animal, là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux.

Choix des espèces

La souris présente des caractéristiques physiopathologiques proches de l'espèce humaine.

24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit l'ablation des deux glandes surrénales et la pose d'une mini-pompe, puis une injection d'aldostérone et une perfusion du rein sous anesthésie avant d'être tué par dislocation cervicale pour prélever les tubules rénaux. Le porteur indique que l'ablation surrénalienne peut provoquer léthargie, perte de poids et déshydratation, et que la ligature de l'aorte peut être douloureuse, avec des points limites prévus. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode ne reproduit in vitro la complexité cellulaire du rein et juge le modèle animal "indispensable".

Objectifs

L’hypertension artérielle est un facteur de risque cardiovasculaire qui affecte entre 10 et 40% de la population en fonction de l’âge. Les reins sont indispensables pour la régulation de la pression artérielle. L'acteur majeur de cette régulation est l’hormone aldostérone, qui agit au niveau d'une portion spécifique du rein appelée tubule distal. Des dysfonctionnements de la production ou de l’action de l’aldostérone sont responsables de maladies entrainant une hypertension artérielle ou une perte rénale de sel associée avec une baisse de la pression artérielle. L’objectif du projet consiste à mieux comprendre les mécanismes d’action de l'aldostérone sur le tubule distal. Nous allons prélever les tubules distaux des reins de souris traitées ou non avec de l’aldostérone afin de réaliser une « carte d’identité cellulaire » de ces cellules et ainsi comprendre les effets de l’aldostérone sur ces cellules. Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre les mécanismes de l’action de l’aldostérone sur la régulation du sodium et du potassium par les reins et sur le contrôle de la pression artérielle. Ils seront également utiles pour le développement de nouvelles options thérapeutiques pour le traitement de l’hypertension artérielle et des maladies héréditaires touchant les tubules rénaux.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet devraient permettre d'établir une cartographie moléculaire du néphron distal et de définir de nouvelles cibles cellulaires et fonctionnelles du MR impliquées dans la réponse à l'aldostérone. L’identification de nouveaux mécanismes moléculaires de régulation de la balance hydro-sodée dépendante de l’aldostérone pourrait ouvrir des perspectives nouvelles dans la compréhension de la régulation de la pression artérielle et le développement d’hypertension dans la population générale, mais aussi une meilleure compréhension des bases mécanistiques de certaines pathologies touchant le néphron distal.

Procédures

Afin d’évaluer la réponse aigüe des cellules du néphron distal à l’aldostérone, nous devons nous affranchir de la production endogène de cette hormone par les glandes surrénales. Pour cela nous allons procéder à une surrénalectomie bilatérale ; il est cependant nécessaire de compenser la perte en glucocorticoïdes produits par cette glande par un apport exogène en glucocorticoïdes. L’établissement de ce modèle se décompose en trois étapes principales : 1) La surrénalectomie bilatérale qui permet l’arrêt de la production endogène d’aldostérone et la pose de mini-pompes osmotiques ALZET délivrant de la dexaméthasone (1ug/100g de poids corporel/jour) pour prévenir la chute du débit de filtration glomérulaire et assurer la survie des souris Durée de l'intervention 30 minutes. 2) Après 7 jours, une injection unique d’aldostérone (0,002 mg/kg de poids corporel) ou l’équivalent en volume de serum physiologique 0,9% est réalisée par la veine caudale pour évaluer les mécanismes moléculaires de la réponse aigue à l’aldostérone dans les cellules individuelles du néphron distal. 3) Une heure après l’administration d’aldostérone, les souris sont anesthésiées et le rein gauche est perfusé avec une solution contenant de la libérase afin de permettre une digestion partielle du rein et permettre la microdissection des tubules d’intérêt. Le rein est ensuite aussitôt prélevé. Durée de l'intervention 45 minutes. Les animaux sont ensuite mis à mort par dislocation cervicale. Dans la même procédure, le rein droit, le cœur, l’aorte abdominale, du tissu adipeux viscéral et le cerveau seront prélevés et stockés à -80oC pour des possibles études futures sur l’action de l’aldostérone sur autres tissus cibles.

Impact sur les animaux

Les manques en aldostérone ou en corticostérone endogènes suivant la surrénalectomie bilatérale peuvent être responsables d’une léthargie importante des souris, d’une perte de poids et d’une déshydratation. Ces effets indésirables sont prévenus par la supplémentation en dexaméthasone. La ligature de l’aorte avant la perfusion du rein avec la solution de libérase peut entrainer de la douleur aux souris. La procédure ne commence que lorsque l’animal est profondément anesthésié (immobilité, rythme cardio respiratoire lent, pas de réaction à la stimulation interdigitale). Une dose d'analgésie (Metacam 5 mg/Kg, soit 10 ml/KG SC) juste avant l’intervention est également administrée, si besoin une demi-dose supplémentaire de Kétamine seule à 10mg/kg (0,02 ml/kg) sera réinjectée. Des points limites en rapport avec ces nuisances éventuelles sont prévus.

Devenir

Il s’agit d’une procédure sans réveil qui concerne tous les animaux.

Remplacement

Il n'existe pas de méthode de remplacement permettant de reproduire in vitro la complexité de la composition cellulaire du rein en vue d’une analyse de l’impact de l’action de l’aldostérone sur cellule unique. L’utilisation d’un modèle animal est donc indispensable à la réalisation de ce projet. Une approche in vitro sera ensuite développée pour étudier l’impact des gènes et voies de signalisation identifiés dans les tubules distaux de ces animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au nombre minimum nécessaire et suffisant pour permettre l’analyse statistique des données.

Raffinement

Les animaux seront surveillés quotidiennement et nous avons établi des points-limites bien défini à chaque étape des procédures entrainant la mise à mort des animaux si nécessaire. Nous réduirons au maximum la souffrance animale, notamment en utilisant de l’analgésie et de l’anesthésie adaptée dès que cela sera nécessaire.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris (Mus Musculus) comme le modèle de choix, en raison de ses similarités génétiques et physiologiques proches de l’homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Ce raisonnement s’applique tout particulièrement à l’étude de l’hyperaldostéronisme primaire, maladie complexe et impossible à analyser in vitro mais aussi aux syndromes de perte de sel. Tous les animaux utilisés seront âgés de 12 à 14 semaines au début de la procédure. Nous avons choisi d’étudier des souris adultes post pubères afin de nous affranchir de possibles différences (souris âgées) ou d’absences (souris non matures) de réponse de la fonction rénale.

364 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur crée deux plaies dorsales par chirurgie sous anesthésie, on leur pose une puce télémétrique et on les traite au plasma froid une à deux fois par jour, pour mettre au point un modèle de plaie chronique infectée par des bactéries résistantes. Le porteur reconnaît une douleur et une gêne aux déplacements au réveil, et prévoit des prélèvements de peau et de rate après la mise à mort. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe pas d'alternative non animale et qu'aucun modèle in vitro ne représenterait un cas clinique.

Objectifs

L’objectif est à la fois d’optimiser les technologies plasmatiques existantes et de développer de nouvelles technologies pour éliminer les bactéries résistantes responsables d’infections nosocomiales. Les sources de plasma sont testées dans différents contextes pour leur efficacité antimicrobienne in vitro et in vivo en utilisant un modèle murin de plaie infectée. Des études mécanistiques sur la destruction bactérienne médiée par le plasma froid sont effectuées tandis que des échantillons de plaies provenant de patients facilement disponibles sont utilisés pour fournir du matériel réaliste pour étudier l’efficacité de cette nouvelle approche. Enfin, le traitement de plaies colonisées par des bactéries résistantes aux antibiotiques fourniront les données d’une preuve de concept. Les résultats du projet ne serviront pas uniquement à rendre prometteur l’utilisation du plasma froid contre les plaies infectées, mais également d’améliorer la cicatrisation de plaies afin de lutter contre le développement de l’antibiorésistance résistantes en médecine humaine et vétérinaire.

Bénéfices attendus

Au sein du projet global, il est attendu que l’utilisation du kINPen ou du Multijet avec un nouveau mélange de gaz soi efficace pour lutter contre l’infection par des bactéries résistantes aux antibiotiques et pour améliorer la cicatrisation des plaies d'animaux présentant un déficit cicatriciel. Cela se traduira notamment par une baisse significative de la colonisation bactérienne sur la plaie, et une éventuelle accélération de la cicatrisation des plaies. Un nouveau dispositif à plasma, le multijet, sera également utilisé. Il est attendu que ce nouvel outil soit aussi efficace , sinon plus, que le premier quant à la désinfection et la cicatrisation des plaies, permettant ainsi de traiter une surface de plaie plus importante et d’augmenter l’efficacité de la réponse immunitaire. A plus long terme, cela pourrait permettre de généraliser l’utilisation de divers dispositifs à plasma à l'être humain, chez des patients souffrant de troubles de la cicatrisation (diabète, immunodépression, etc.) ; mais aussi de lutter contre l’antibiorésistance s’installant notamment sur ces plaies dans le cas d’infections nosocomiales. Cela pourrait également offrir des opportunités de traitement dans divers domaines (chirurgie, ophtalmologie, oncologie, etc.). La généralisation de l’utilisation de ce système pour entièrement décontaminer du matérial médical en milieu hospitalier pourrait être envisagée.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie sous anesthésie général, suivi d'un protocole de gestion de la douleur post-opératoire (injection en intra-péritonéale des immunostimulants (introduction aiguille) une à deux fois par jour durant 3 jours. Les animaux auront une prise de sang à veine sub-mandibullaire (introduction aiguille) une fois tous les 5 à 7 jours pendant quelques secondes. Les animaux seront équipés d'une puce télémétrique (introduction aiguille) en début d'expérimentation (1 fois) pendant quelques secondes. Les animaux seront traités par le plasma à froid 1 ou 2 fois par jour pendant quelques minutes (non invasif).

Impact sur les animaux

Suite à la création des deux plaies dorsales, une douleur et une gêne possible dans les déplacements sont attendues au reveil de l’animal sans analgésie. Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après la prise de sang pourrait être observés.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort soit les 364 souris. Des prélèvements de tissus seront effectués post-morterm pour la partie histologie (zone de biospsie et rate) popur l'analyse biologique de la reconstruction de l'épiderme cutané. La décision est prise par les responsables scientifiques et concepteurs.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternatives non animales puisque l’objectif est d’évaluer l’efficacité des plasmas à gaz sur la cicatrisation d’une plaie en vue d’une standardisation de son utilisation chez l’être humain. Ainsi, il n’est pas possible de remplacer les animaux par un modèle in vitro qui permettrait de représenter au mieux un cas clinique.

Réduction

Les volumes de sang à prélever par animal et leur fréquence étant contraints, les volumes prélevés à chaque prise de sang seront « poolés » par 2 (animaux du même groupe et de même sexe pour limiter la variabilité). Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques garantissant une puissance de test de 80% minimum en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base d’un test non paramétrique : Kruskall-Wallis pour l’étude de la réponse immunitaire d’animaux et cicatricielle.

Raffinement

Dès l'arrivée des animaux à l’animalerie, une semaine d’acclimatation sera effectuée pour limiter au maximum les perturbations liées à un nouvel environnement. Les animaux seront surveillés 2 fois par jour (télémétrie, signes cliniques tels que le poids, l’apparence et le comportement général). L’eau et la nourriture seront ad libitum. Les souris bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger). Les souris sont hébergées dans une animalerie A2 en portoirs ventilés. La pose des puces est faite sous anéthésie générale à l'isoflurane. Afin de diminuer la douleur de l'injection de la puce, un dépôt de Tronothane® 1 % (pramocaïne, gel). Pour la partie chirurgie et le suivi post-opératoire : Période préopératoire : injection pré-opératoire de buprénorphine (0,1 mg/kg, SC), au moins 20 minutes avant le début de la chirurgie Période opératoire : anesthésie gazeuse à l'isoflurane. Période postopératoire : injection post-opératoire immédiate de méloxicam (20 mg/kg, SC). Suivi Injection de buprénorphine (même dose) le soir. Injection de méloxicam (20 mg/kg SC, 1 fois/jour, à J1 et J2). Injection de buprénorphine (même dose) à la demande (2 fois/jour, à J1, J2 et J3) en fonction du résultat de l'évaluation de la douleur, si elle n'est pas contrôlée par le méloxicam. Visite animalier matin et soir.

Choix des espèces

Il n’existe pas d’alternatives non animales puisque l’objectif est d’évaluer l’efficacité des plasmas à gaz sur la cicatrisation d’une plaie en vue d’une standardisation de son utilisation chez l’être humain. Ainsi, il n’est pas possible de remplacer les animaux par un modèle in vitro qui permettrait de représenter au mieux un cas clinique. Age des souris = 6-7 semaines. Les souris doivent être de jeunes adultes pour pouvoir faire les biopsies (décrits dans les modèles publiés) et avoir un système immunitaire mature.

3 132 souris transgéniques humanisées pour des molécules HLA vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections vaccinales sous-cutanées répétées et des prélèvements de sang à la veine sous-maxillaire, avant d'être tuées pour prélever la rate et d'autres organes. Le porteur vise un vaccin peptidique dit universel censé couvrir plus de 80 % de la population mondiale, un bénéfice renvoyé au développement futur. Sur le remplacement, il affirme que la réponse immunitaire après vaccination ne peut être reconstituée hors d'un "organisme entier" et juge "indispensable" le recours aux souris transgéniques.

Objectifs

Une avancée majeure dans le traitement des cancers a été réalisée au cours de ces dernières années grâce à l’utilisation de l’immunothérapie. L’immunothérapie consiste à réactiver les cellules du système immunitaire contre les cellules cancéreuses. Bien que très efficace chez certains patients, une large proportion de personnes atteintes par le cancer ne répond pas à ces nouvelles thérapies (environ 80% des patients). De nombreuses études montrent à présent, que chez les patients traités par certaines immunothérapies, l’ajout d’une vaccination dirigée contre des cibles appelées «antigènes» présentes à la surface des cellules tumorales peut améliorer la destruction de la tumeur et induire une rémission ou une stabilisation des patients. Dans ce cas, l’efficacité de la réponse vaccinale dépend directement de la nature des antigènes sélectionnés pour cibler les tumeurs et de la capacité du système immunitaire à reconnaitre efficacement ces cibles tumorales. On appelle antigène toute substance capable de déclencher une réponse immunitaire visant à l'éliminer. Dans le cas des cancers, il s'agit le plus souvent de peptides (fragments de protéines) qui sont reconnus de manière spécifique par certains globules blancs, les lymphocytes T CD8 (étudiés dans le cadre de ce projet). Nous avons développé une méthode pour identifier des cibles tumorales très efficace pour détruire les tumeurs, consistant à activer le système immunitaire avec des antigènes bactériens très semblables à certains antigènes tumoraux. L’utilisation d’antigènes bactériens permet de réactiver une réponse immune similaire à celle pouvant exister lors d’une infection bactérienne et d’induire une réponse contre les tumeurs similaires à celle observée contre un pathogène étranger. Utilisés pour la vaccination des patients, ces antigènes bactériens semblables aux antigènes tumoraux pourraient devenir un nouvel outil pour le traitement des cancers. L’objectif de notre projet est de développer un vaccin thérapeutique efficace qui ciblerait la grande majorité de la population mondiale.

Bénéfices attendus

Les objectifs pour ce projet sont d'étendre nos connaissances scientifiques sur le mimétisme moléculaire peptidique à d'autres HLA et de développer un vaccin peptidique universel (pour tous).

Procédures

Les interventions auxquelles les souris seront soumises sont les suivantes pour la 1e procédure expérimentale (Immunisation par méthode prime-boost): • Vaccination par injection sous-cutanée : 2 injections à 14 jours d’intervalle • Prélèvement sanguins sur animaux vigiles : 3 prélèvements (le premier 4 jours avant la vaccination, puis 10 et 17 jours après la vaccination). Pour la procédure expérimentale n°2 (Cinétique de vaccination) : • Vaccination par injection sous-cutanée : 5 injections à 7 jours d’intervalle • Prélèvement sanguins sur animaux vigiles : 4 prélèvements (le premier 4 jours avant la vaccination, puis 10, 17 et 31 jours après vaccination)

Impact sur les animaux

Lors de l’immunisation des animaux et du suivi des cinétiques de vaccination, douleurs légères associées à une injection sous-cutanée et à des prélèvements de sang par voie sous-maxillaire (plaie réduite au point d’injection ou de prélèvement, œdème).

Devenir

Tous les animaux de cette procédure seront euthanasiés en fin d'expérience afin de pouvoir prélever leur rate et autres organes pour effectuer les analyses in vitro.

Remplacement

La mise en place d’une réponse immunitaire après vaccination est un phénomène complexe. Cela implique la reconnaissance des antigènes par des cellules spécifiques et la collaboration de différents types cellulaires (lymphocytes T, B et cellules présentatrices d’antigène). L’efficacité de la réponse immunitaire est favorisée par de nombreux facteurs solubles provenant du microenvironnement dans lequel l’antigène est présenté. Ces particularités (collaboration de différents types cellulaires et microenvironnement) ne peuvent pas actuellement être reconstituées en dehors d’un organisme vivant. L’étude d’une réponse immunitaire après vaccination sur organisme entier ne peut donc être remplacée et n’a pas d’équivalent expérimental n’utilisant pas d’animaux. Il est donc indispensable d’avoir recours aux modèles animaux transgéniques pour le HLA humain pour récapituler ces interactions complexes antre cellules et microenvironnement afin de démontrer la mise en place d’une réponse immunitaire après vaccination. Ce projet ne vise pas à l’évaluation directe d’une réponse anti-tumorale chez l’animal. La vaccination sera réalisée chez des animaux non porteurs de tumeur.

Réduction

En amont, 2 étapes ont permis de réduire le nombre de peptide et d’animaux qui seront utilisés : 1/ Une analyse in silico et la réalisation de tests in vitro ont permis de sélectionner un nombre restreint de peptides vaccinaux immunogènes et de forte affinité pour les HLA ciblés. 2/ L’analyse in silico via l’outil en ligne tools.iedb.org/population/ a permis de déterminer que le ciblage de 3 HLA-A (parmi les 68 possibles) et 2 HLA-B (parmi les 125 possibles) permet une couverture de 80% de la population mondiale. La réduction du nombre d’animaux a été réalisée pour permettre d’obtenir un nombre suffisant de données pour répondre à la problématique. L’utilisation d’outils statistiques du calcul de puissance de test et de taille d’échantillons (https://biostatgv.sentiweb.fr/?module=etudes/sujets#), permet de définir un nombre minimal d’animaux de 12 par groupe, en considérant un seuil de significativité à p

Raffinement

Le bien-être des animaux étant primordial, les souris sont acclimatées au moins 7 jours avant le début de la procédure expérimentale. A réception, les souris sont hébergées par 7 maximum par cage pour les femelles et 6 maximum par cage pour les mâles. Les animaux seront maintenus dans des conditions environnementales contrôlées (température, humidité, cycle jour/nuit), dans un espace suffisant, en groupe pour maintenir les interactions sociales, et avec un enrichissement environnemental permettant de répondre aux besoins physiologiques et comportementaux des souris (présence de petite maison permettant aux animaux de se cacher). Toutes les manipulations seront réalisées dans le respect de l’animal. Le temps de manipulation des animaux sera de plus réduit au maximum afin de réduire le stress des animaux et l’impact possible sur la réponse immunitaire. La procédure expérimentale (vaccination) est de classe de gravité légère et ne nécessite pas d’y associer un protocole d’anesthésie. Les prises de sang régulières seront effectuées afin de suivre l’évolution dans la circulation sanguine la reponse immunitaire, ce qui élève le niveau de la procédure à une classe modérée. Ces prélèvements de sang seront effectués à la veine sous-maxillaire, 1 fois par semaine (ou tous les 15jours), selon le chronogramme prédéfini (cf annexe). Un volume total prélevé inférieur à 10% du volume sanguin de l’animal (soit au total environ 100µL/semaine ou 200µL/15jours, pour une souris de 25g) sera effectué afin de ne pas causer de dommage aux animaux. Toujours pour le bien-être de l’animal, le prélèvement sera effectué par alternance sur les 2 côtés.

Choix des espèces

Le principe de la vaccination repose sur la présentation des antigènes par le système HLA chez l’Homme. Le système de présentation antigénique est différent d’une espèce à l’autre. Ainsi les antigènes reconnus chez la souris peuvent être très différents de ceux reconnus chez l’homme car présentés par des molécules CMH (complexe majeur d’histocompatibilité) différents. Le vaccin final développé dans le cadre de ce projet représente un mélange de plusieurs peptides restreints par le HLA. Ce vaccin sera un vaccin HLA universel qui traitera une grande majorité des patients cancéreux (prédiction >80%) car ciblant les HLA du locus A et B les plus représentés chez l’homme (HLA-A1, HLA-A3, HLA-A24, HLA-B7, HLA-B35 et HLA-A2). Ce projet nécessite donc l’utilisation de souris dites humanisées transgéniques pour les différents HLA humains et parfaitement caractérisées pour leurs réponses aux vaccins peptidiques humains (HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A24, HLA-B7 ou HLA-B35 restreint). Le modèle de souris transgéniques humanisées pour les différents HLA-A et HLA-B sont des modèles existants et relevant pour étudier l’immunogénicité de ces vaccins destinés à l’homme. Les études pourront être réalisées sur des souris adultes âgées au début de l’expérimentation de 7 jusqu’à 15 semaines, âge où le système immunitaire est mature et donc à partir duquel une réponse immunitaire peut être correctement évaluable. Pour chaque étude, des souris d’âges similaires seront utilisées (plus ou moins une semaine). En cas de variation de plus d’une semaine, les animaux seront répartis de façon équilibrée dans chacun des groupes afin d’assurer l’homogénéité des groupes.

780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur foie et leur sang, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une fibrose du foie leur est provoquée par un régime alimentaire spécifique, et 255 subissent six prélèvements sanguins répétés au sinus rétro-orbital sous anesthésie, pour tester des vecteurs censés bloquer les gènes de la maladie. Le porteur renvoie au conditionnel la mise au point de traitements contre la fibrose et la cirrhose. Il affirme qu'on ne peut reproduire l'architecture d'un "organe entier" autrement que chez l'animal.

Objectifs

La fibrose hépatique correspond à une cicatrisation du foie, en réaction à une agression, qui finit par entraîner un mauvais fonctionnement de cet organe. La cause première de fibrose hépatique est l'alcoolisme, mais les maladies chroniques du foie comme les hépatites, ou les maladies métaboliques liées à l’obésité, sont aussi à l'origine de fibroses. Une fibrose peut à son tour dégénérer en cirrhose, puis en cancer du foie - l'un des plus mortels. Il n'existe à l'heure actuelle pas de traitement contre la fibrose. Vu l’augmentation de l’obésité dans la population, les maladies du foie vont devenir un problème mondial de santé publique dans les années à venir. L’objectif de notre projet est de développer des médicaments pour traiter la fibrose hépatique métabolique. Le principe de ces médicaments est d’empêcher les gènes responsables de la maladie de s’exprimer. Nous allons élaborer des vecteurs synthétiques capables de délivrer ces médicaments spécifiquement dans le foie pour réduire au silence les gènes impliqués dans le développement de la fibrose.

Bénéfices attendus

La fibrose hépatique n’ayant à ce jour pas de traitement, nous pensons que cette étude sera un premier pas vers la mise au point de nouveaux médicaments pour soigner la fibrose et la cirrhose hépatiques, actuellement incurables.

Procédures

Un prélèvement sanguin de 100 à 150 μL par voie retro-orbitale après anesthésie totale par un mélange kétamine (100mg)/kg/xylazine (10mg/kg) sera effectué toutes les 2 semaines sur une partie des animaux prévus dans le projet. Soit 6 prélèvements répétés sur 255 animaux. La durée du prélèvement est d'environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Le régime alimentaire utilisé pour induire une fibrose hépatique aux animaux entraine une légère perte de poids des animaux pendant les 3 premières semaines pour reprendre ensuite une croissance normale. L’état des souris sera surveillé quotidiennement et leur poids mesuré toutes les semaines.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de chacune des procédures. En effet, il est indispensable de récupérer le foie et le sang des souris pour pouvoir étudier les effets des vecteurs thérapeutique sur la fibrose hépatique.

Remplacement

Les procédures expérimentales nécessaires à ce projet ont été élaborées et réfléchies afin de minimiser le nombre d’animaux tout en permettant de réaliser une étude statistique valable. Le modèle de fibrose que nous avons choisi consiste uniquement en l’apport d’une alimentation spécifique, il a l’avantage de refléter fidèlement la pathologie humaine. Avant d’être administré aux souris, les systèmes thérapeutiques développés seront préalablement testés sur des cellules en cultures. Seuls les systèmes présentant une efficacité suffisante seront testés chez la souris.

Réduction

D’après la littérature et d’après notre expérience sur le modèle CDAHFD, la variabilité des réponses à l’induction de la fibrose est très faible (sur plus de 100 souris étudiées, toutes développent une fibrose hépatique). Cependant, suivant les durées de régime, la variabilité de l’expression de certains marqueurs peut être plus ou moins marquée. Ainsi, d’après nos résultats précédents, l’étude d’une réponse aux agents thérapeutiques nécessite des lots minimum de 15 animaux pour pouvoir réaliser une étude statistique. Pour les études d’effet thérapeutique nous réaliserons dans un premier temps, l’expérience sur un lot de 10 animaux, testerons la validité statistique des résultats, et nous recommencerons l’expérience sur 5 animaux supplémentaires si nécessaire. Pour les études de biodistribution, des lots de 5 animaux sont suffisants. Ainsi, le nombre d’animaux indiqués est un nombre maximum. Le test statistique utilisé sera un test non paramétrique Mann–Whitney permettant l'analyse d'échantillons de petites tailles.

Raffinement

Ce régime entraine une légère perte de poids des animaux pendant les 3 premières semaines pour reprendre ensuite une croissance normale. L’état des souris sera surveillé quotidiennement et leur poids mesuré toutes les semaines. Le milieu sera enrichi pour le bien-être des animaux (cotons de nidifications, bâtonnets et igloos…). Des mesures visant à réduire la douleur des animaux seront prises, les injections de médicaments seront réalisées sous anesthésie générale et un suivi attentif des animaux est prévu à chaque étape des procédures. Les animaux seront régulièrement évalués à l’aide de points limites bien définis. Pour chaque animal mis à mort, nous exploiterons un maximum de données disponibles.

Choix des espèces

Les objectifs du projet sont de tester différents agents thérapeutiques pour traiter la fibrose hépatique et d’étudier l’évolution des marqueurs de cette pathologie. Le recours à des animaux est indispensable pour atteindre de tels objectifs, puisque la fibrose hépatique prend place au niveau d’un organe entier, le foie. Il n’est actuellement pas possible de reproduire l’architecture et la complexité d’un organe entier autrement que chez l’animal. De nombreux modèles de fibrose hépatiques existent et sont bien connus chez la souris. En soumettant les animaux à un régime alimentaire spécifique, bien caractérisé par l’équipe, cela permettra de récapituler, les différentes étapes du développement et les potentielles variabilités de la maladie à l’échelle de l’organisme entier. Un tel niveau d’information ne peut pas être obtenu à l’aide d’un modèle in vitro.

420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Infectées par le virus de la Vaccine par voie intranasale sous anesthésie, elles reçoivent du chloramphénicol par injections répétées et une prise de sang au sinus rétro-orbital juste avant la mise à mort, pour étudier le métabolisme des lymphocytes T CD8. Le porteur indique fixer un point limite à 20 % de perte de poids, l'antibiotique n'ayant pas encore été testé dans ce contexte infectieux. Il affirme que la complexité de la réponse immunitaire rend son étude in vitro impossible.

Objectifs

Lors d’une infection virale, les T-CD8s naïfs et spécifiques des antigènes viraux sont activés dans les ganglions drainant l’organe infecté. Suite à leur activation, les T-CD8s prolifèrent et se différencient en cellules effectrices qui migrent vers l’organe infecté et éliminent les cellules infectées. En parallèle, pendant la phase effectrice, un petit nombre de T-CD8 mémoires se développent, qui vont persister sur le long terme. Les T-CD8s mémoires sont capables de réagir de manière plus rapide et plus efficace en cas de nouvelle rencontre avec le même virus. La fonction des T-CD8s et la génération de T-CD8s mémoires fonctionnels sont largement dépendantes d’une succession de changements métaboliques et reposent sur une communication étroite entre la respiration mitochondriale et la glycolyse. En effet, alors que les T-CD8 naïfs (qui n'ont jamais été activés) acquièrent leurs besoins énergétiques de la respiration mitochondriale, leur activation mène à un remodelage métabolique en faveur de la glycolyse, leur permettant d’assurer leurs fonctions effectrices. Enfin, les T-CD8 mémoires possèdent un métabolisme respiratoire, accompagné d’une augmentation de la masse mitochondriale leur permettant de répondre rapidement lors d’une réponse secondaire. Bien que ces changements métaboliques soient à présent bien admis, les mécanismes sous-jacents qui les contrôlent restent peu, voire pas, connus. De manière intéressante, la respiration mitochondriale repose sur la traduction d’ARNs spécifiques et exclusivement exprimés dans les mitochondries, un processus nommé la traduction mitochondriale. L'émergence d’études sur ce sujet suggèrent ainsi un rôle spécifique de la traduction mitochondriale, dans l’établissement des réponses immunes innées et adaptatives. Ainsi, ce projet vise à disséquer, au niveau moléculaire, la contribution relative des traductions mitochondriale et cytosolique, dans le contrôle de la respiration mitochondriale et de la glycolyse, au cours des réponses T-CD8 anti-virales. Pour cela, des souris C57Bl/6J seront infectées par voie intranasale, avec le virus de la Vaccine. La traduction mitochondriale sera spécifiquement inhibée, grâce à l’utilisation de Chloramphenicol, injecté par voie intra-péritonéale. Différents temps après infection, l'analyse du nombre, du phénotype, et des fonctions des T-CD8s, sera effectuée ex vivo sur un prélèvement de sang et des organes lymphoïdes.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus permettront de combler le manque de connaissances mécanistiques concernant les besoins métaboliques des T-CD8, et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour moduler les fonctions cytotoxiques des T-CD8 et la génération/maintenance des cellules mémoires.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Injection Intraveineuse (sous brève anesthésie Isoflurane) – uniquement pour la procédure 2 : 1 fois par animal – durée 30 secondes - Injection intrapéritonéale (pour anesthésie Kétamine/Xylazine) : 1 fois par animal– durée 30 secondes - Infection intranasale (sous anesthésie Kétamine/Xylazine) : 1 fois par animal – durée 30 secondes par narine - Injections Intra-péritonéales (pour traitements chloramphénicol): 1 fois par jour pendant 4 à 10 jours en fonction des groupes – durée 30 secondes par injection - Prélèvements sanguins au sinus retro-orbital (sous brève anesthésie Isoflurane) : 1 fois par animal, juste avant la mise à mort – durée 30 secondes

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont une légère douleur générée par les injections intra-péritonéales et le stress généré par l’anesthésie et la procédure d’inoculation du virus par voie intranasale. L'infection par le virus de la Vaccine est une procédure utilisée en routine dans le laboratoire dont les conséquences ne génèrent pas de souffrance sur les animaux. Le chloramphenicol utilisé dans ce projet (50mg/Kg, en IP) est un antibiotique largement utilisé chez l'humain et dans des modèles animaux. Les doses utilisées sont basées sur la littérature qui ne décrit aucune nuisance ou effet indésirable sur l’état général des animaux. De plus le chloramphénicol (qui inhibe la traduction mitochondriale) devrait, selon la littérature, avoir un impact surtout dans la génération et la survie des cellules T CD8 mémoires, et seulement un impact négligeable sur la réponse effectrice (et donc sur la capacité des animaux à contrôler l'infection). Cependant, étant donné que cette drogue sera testée pour la première fois dans le cadre d'une infection virale in vivo, un point limite de 20% de perte de poids est fixé.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir prélever les organes (ganglions lymphatiques, poumons, rate etc) et effectuer ex vivo: - des analyses cellulaires pour déterminer le phenotype et la fonctionalité des lymphocytes T CD8 - des analyses moléculaires et les mecanismes impliqués dans la traduction mitochondriale, au cours de la réponse T-CD8

Remplacement

La réponse immunitaire anti-virale est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires et une organisation spatiale qui rend impossible son étude dans des tests in vitro.

Réduction

Pour chacune des procédures, nous utiliserons 15 animaux par groupe expérimental, analysés individuellement. Nous utiliserons des tests de comparaison de moyennes de Student et des tests non-paramétriques pour comparer les groupes. Le calcul de la puissance des tests statistiques et nos expériences antérieures ont montré que ces nombres d'animaux par point expérimental étaient nécessaires et suffisants pour l’interprétation de nos résultats.

Raffinement

Afin de réduire la souffrance, le stress et la douleur de l’animal, i) les infections intra-nasales seront réalisées sous anesthésie profonde et la température corporelle des animaux sera maintenue lors de l'anesthésie; ii) nous effectuerons une brève anesthésie à l'isfluorane (3% dans une chambre à oxygène) pour les prélèvements de sang en rétro-orbital; iii) les injections I.V. au sinus rétro-orbital seront réalisée sous anesthésie à Isoflurane (3% dans une chambre à oxygène); iv) nous maintiendrons les animaux en groupes sociaux au sein de chaque cagée (en moyenne 5 animaux par cagée) ; v) assurerons une surveillance adaptée à chacune des procédures ou étape au sein d'une procédure, comme décrit au sein de chaque procédure.

Choix des espèces

Le choix du modèle souris est imposé par la nécessité de pouvoir utiliser, à terme, des animaux génétiquement modifiés. Dans ce projet, des souris sauvages (fond C57Bl/6J) seront utilisés.