Recherche fondamentale

402 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une dermatite atopique leur est provoquée par micropores au laser dans la peau puis application d'un allergène, une partie étant ensuite exposée à l'allergène par voie respiratoire pour déclencher une réaction de type asthme, et 104 recevant en plus de la toxine diphtérique pour détruire une sous-population de lymphocytes. Le porteur indique attendre une inflammation cutanée et pulmonaire légère et prévoit l'euthanasie selon des points limites. Il décrit la complexité de la réponse immunitaire comme rendant l'expérimentation in vivo nécessaire.

Objectifs

Les allergies (ou maladies atopiques), incluant la dermatite atopique (eczéma), l’asthme, la rhinite allergique et les allergies alimentaires sont des maladies inflammatoires complexes avec des caractéristiques communes, impliquant différents organes du corps. La dermatite atopique précède souvent le développement d’autres allergies, et sa sévérité aggrave le cours de l’allergie respiratoire. Cette évolution de la dermatite atopique vers d’autres maladies atopiques, et en particulier l’asthme, est appelée « marche atopique ». Une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires impliqués dans la mise en place de la dermatite atopique est cruciale dans le but de développer de nouveaux traitements ou de nouvelles stratégies de prévention. Les lymphocytes T sont des cellules clés du système immunitaire permettant de se défendre contre les pathogènes. Cependant ces lymphocytes peuvent entraîner différentes maladies s’ils sont dérégulés, comme par exemple les allergies. Plus spécifiquement, deux sous-populations de lymphocytes T sont dérégulées dans la dermatite atopique et la marche atopique. Ces deux populations restent cependant mal définies à ce jour. C’est pourquoi nous nous intéressons au rôle et aux mécanismes impliqués dans la génération de ces populations de cellules immunitaires au cours de la dermatite atopique et de la marche atopique. Pour ce faire, nous utilisons un modèle mimant les caractéristiques de la dermatite atopique chez la souris. Dans ce modèle, nous utilisons une technologie permettant de générer des micropores dans la peau à l’aide d’un laser (technique également utilisée chez l’Homme dans la sphère médicale) puis nous appliquons un allergène sur la peau des souris. Cette étape engendre une dermatite atopique menant une sensibilisation de la souris à l’allergène. Pour étudier la marche atopique, nous appliquons ce même protocole pour induire la dermatite atopique, puis nous allons réexposer les souris à l’allergène au niveau des poumons, ce qui entrainera une réponse allergique similaire à un phénomène asthmatique. Ceci permettra d'étudier l'asthme.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre la pathogenèse de la dermatite atopique et de la marche atopique. Plus précisément, ceci nous permettra de déterminer les signaux induisant les différentes populations de lymphocytes dérégulés dans ces maladies, ainsi que le rôle de ces cellules. Elucider le fonctionnement de ces cellules pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans la dermatite atopique et la marche atopique. De plus, comprendre les signaux et cellules impliqués dans la génération des lymphocytes régulateurs pourrait permettre de trouver un traitement pour booster leur production et leur fonctionnement, ceux-ci ayant normalement pour rôle de contrôler les réponses immunitaires et donc par exemple les réponses allergiques.

Procédures

Pour étudier la dermatite atopique, 252 animaux seront anesthésiés au jour 0 pour la sensibilisation à un allergène au niveau de l'oreille (durée de la procédure : 20 minutes). Cette procédure est effectuée deux fois par semaine pendant deux semaines (durée totale de la procédure : 4x20 minutes = 1h20). Parmi ces 252 animaux, 74 seront également injectés avec de la toxine diphtérique (durée de la procédure : 10 secondes) pour éliminer une sous population de lymphocytes dans le but de déterminer leur rôle dans la dermatite atopique. Le nombre et les dates d'injections seront déterminé dans une expérience pilote. Tous les animaux seront euthanasiés au jour 13 pour collecter les différents organes pour analyses. Pour étudier la marche atopique, 150 animaux seront anesthésiés au jour 0 pour la sensibilisation à un allergène au niveau de l'oreille (durée de la procédure : 20 minutes). Cette procédure est effectuée deux fois par semaine pendant deux semaines (durée totale de la procédure : 4x20 minutes = 1h20). Ces animaux seront ensuite exposés à l'allergène au niveau des voies respiratoires (durée de la procédure : 30 minutes). Cette procédure est effectuée tous les jours du jour 9 au jour 12 (durée totale de la procédure : 4x30 minutes = 2 heures). De plus, les fluides bronchoalvéolaires seront collectés (procédure sans réveil) au jour 13 pour étudier l'inflammation des poumons. Parmi ces 150 animaux, 30 seront également injectés avec de la toxine diphtérique (durée de la procédure : 10 secondes) pour éliminer une sous population de lymphocytes dans le but de déterminer leur rôle dans la marche atopique. Le nombre et les dates d'injections seront déterminé dans une expérience pilote.

Impact sur les animaux

La sensibilisation à l'allergène au niveau de l'oreille des animaux conduira à une légère inflammation de type dermatite atopique sur l'oreille, se traduisant par une rougeur. Par le passé, nous n'avons pas observé d'autres effets avec ce traitement. De plus, nous avons déjà fait des injections de toxine diphtérique sur d'autres modèles, et n'avons observé aucun changement de comportement de la part des animaux traités, cependant une rougeur pourrait survenir au point d'injection. Les animaux traités par instillations intranasales d'allergène développeront une légère inflammation des poumons. Tous les animaux seront surveillés et tout effet indésirable sera traité selon les points limites énoncés dans le but de limiter la souffrance des animaux.

Devenir

Après la procédure "Modèle de dermatite atopique" et "Modèle de dermatite atopique + injection de toxine diphtérique" , les 178 et 74 animaux (respectivement) seront euthanasiés selon la procédure autorisée pour étudier les ganglions lymphatiques et la peau. Le dernier jour de la procédure "Modèle de marche atopique" et "Modèle de marche atopique + injection de toxine diphtérique", les 120 et 30 animaux (respectivement) seront euthanasiés pour analyser les voies respiratoires.

Remplacement

L'étude de la réponse immunitaire, et en particulier au cours de la dermatite atopique et la marche atopique, met en jeu différents organes et réseaux impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse immunitaire et le rôle de chaque cellule impliquée.

Réduction

Ce protocole sera appliqué à un maximum de 402 souris, permettant de caractériser le rôle des lymphocytes Treg et Tfh dans les allergies, et en particulier au cours de la dermatite atopique et la marche atopique. Selon les expériences, les groupes comporterons 8 souris (modèle de dermatite atopique) ou 15 souris (modèle de marche atopique), ce qui permettra d'avoir des résultats statistiquement interprétables pour les différents paramètres étudiés, à l'aide d'un test de Student (t-test). Dans la partie 4 du projet, dans un but de réduction, l'oreille droite et l'oreille gauche des souris seront traitées différement et seront comparées entre elles. Trois études pilotes seront effectuées lors de ce projet, avec un nombre réduit d'animaux, dans le but de déterminer 1) l'allergène le plus approprié, 2) quand commencer les injections de DT en fonction de l'apparition des lymphocytes Tfh, 3) quand faire les injections de DT et leur nombre.

Raffinement

Les animaux seront gardés en groupe dans leur cage pour préserver les interactions sociales. La sensibilisation est réalisée sous anesthésie gazeuse pour limiter la souffrance / stress des animaux. Après ces traitements, les animaux seront placés sur une plaque chauffante et surveillés jusqu'à leur réveil. Tout au long du protocole, les animaux seront surveillés de manière visuelle avec un suivi de l'aspect général des animaux (et en particulier des oreilles), de leur posture et de leur comportement. Une grille d'évaluation de la douleur sera utilisée. Si celle-ci est importante, ils seront retirés de l'étude et pourront bénéficier de soins. Si le cas est plus grave, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est le modèle choisi pour étudier la dermatite atopique et la marche atopique car le système immunitaire des souris est proche de celui de l'Homme avec une immunité innée mais également une immunité adaptative, ce qui permet l'étude de la réponse immunitaire spécifique d'un allergène et de la réponse mémoire. De plus, la peau des souris présente des similitudes (épiderme, derme, présence de cellules immunitaires) avec la peau humaine, rendant ce modèle pertinent pour l'étude de la sensibilisation cutanée. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines de vie afin d'étudier le système immunitaire à l'âge adulte.

75 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Maintenus sous anesthésie gazeuse jusqu'à deux heures et demie, ils reçoivent un candidat-médicament par cathéter dans la veine caudale et subissent jusqu'à dix micro-prélèvements de sang sur 24 heures avant d'être tués pour récolter les échantillons. Le porteur décrit ces micro-prélèvements comme indolores mais reconnaît un stress possible, et signale un risque d'hypothermie ou d'arythmie en cas de défaillance du matériel. Il affirme qu'aucun modèle alternatif ne reproduit l'ensemble des phénomènes d'absorption et d'élimination et juge l'approche animale "indispensable".

Objectifs

Le développement de nouveaux médicaments requiert d'étudier le devenir de la substance active dans l’organisme afin de déterminer sa distribution, son métabolisme et son élimination. Ces propriétés influencent la posologie du médicament : dose et fréquence d'administration. L’objectif de ce projet est de mesurer la concentration sanguine de candidats-médicaments en fonction du temps afin de déterminer le volume de distribution, la concentration maximale observée, le temps de demi-vie, la clairance et la valeur d’exposition des candidats-médicaments chez le rat.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de sélectionner les candidats présentant une concentration élevée et durable dans le sang, alliée à un métabolisme lent et une faible élimination. Ces caractéristiques sont indispensables pour garantir la distribution du candidat-médicament à sa cible et une bonne efficacité. Ce projet s'inscrit pleinement dans les étapes indispensables au développement des candidats-médicaments. Cela permettra de réduire drastiquement le nombre d'études nécessaires pour ne mesurer ensuite que l’activité des candidats-médicaments les plus prometteurs et épargnera la vie de centaine d'animaux, tout en augmentant les probabilités d'obtenir un médicament efficace pour le traitement des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à une anesthésie gazeuse durant plusieurs dizaines de minutes (maximum de 2h30), l'insertion d'un cathéter avec aiguille dans la veine caudale (sous anesthésie, l’aiguille est ensuite éliminée) et des micro-prélèvements de sang répétés à l'extrémité de la queue (maximum 10 prélèvements). La procédure durera un maximum de 24h puis les animaux seront mis à mort afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses.

Impact sur les animaux

Les animaux seront maintenus sous anesthésie gazeuse durant la perfusion intraveineuse des candidats-médicaments dans la veine caudale et les premiers prélèvements de sang (maximum de 2h30). En cas de défaillance du matériel, une hypothermie ou une arythmie pourrait survenir si elles ne sont pas détectées à temps. Les derniers micro-prélèvements de sang sont réalisés dans la veine caudale, à l’extrémité de la queue, sur les animaux vigiles et non contraints. Ces micro-prélèvements, d’une durée de 1 à 2min, sont indolores mais peuvent être stressant pour quelques animaux qui peuvent manifester leur impatience ou inconfort. Un maximum de 10 micro-prélèvements de sang seront réalisés sur une durée maximum de 24h. D’autre part, une toxicité imprévue d’un candidat-médicament pourrait être mise en évidence et entrainer l’arrêt immédiat de la procédure.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses.

Remplacement

Les candidats médicaments auront été sélectionnés préalablement lors des tests in vitro pour leur activité et leur innocuité sur les modèles cellulaires, ainsi que pour leur caractéristiques pharmacochimiques (solubilité, stabilité plasmatique et microsomale…). Cependant, tous les essais réalisés ne peuvent prédire avec exactitude l'activité d'un médicament car aucun modèle alternatif (bio-informatique, moléculaire et/ou cellulaire) n’est suffisamment intégré et complexe pour reproduire l’ensemble des phénomènes biologiques impliqués dans l’absorption, distribution, la dégradation et l’élimination des médicaments. Ces phénomènes biologiques sont liés à la circulation sanguine, aux barrières biologiques et aux voies d'élimination (dégradation par le foie, élimination biliaire et rénale...) et régulent l’activité des médicaments. Pour ces raisons, une approche chez l’animal reste indispensable pour sélectionner les candidats-médicaments les plus prometteurs avant de poursuivre leur développement. La mesure de la concentration sanguine en fonction du temps sera réalisée chez le rat, car c’est l’espèce la plus utilisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments.

Réduction

La procédure développée et validée permet la réalisation de micro-prélèvements de sang répétés chez un même animal. Cela permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisés pour la détermination de la pharmacocinétique. Elle est effectuée par un technicien rompu à ces manipulations, ce qui garantit une excellente reproductibilité et de limiter encore le nombre d’animaux engager dans les études. Nous avons montré que la procédure expérimentale parfaitement maîtrisée permet une mesure efficace de la pharmacocinétique d’un candidat-médicament à l’aide de trois animaux pour un candidat médicament.

Raffinement

La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance de l’animal. Le rat étant un animal social, les rats seront maintenues par groupes sociaux dans des cages enrichies de tubes en carton et de bâtonnets à ronger. Une période d'aclimatation et d'habituation d'une semaine sera respéctée. Les rats seront anesthésiés le temps de la perfusion pour éviter tous risque de blessure et assurer une perfusion efficace et parfaitement repoductible. Le rat sera placée sur un tapis chauffant afin de prévenir une hypothermie durant l’anesthésie. Les micro-prélèvements de sang sont indolores et réalisés sur les animaux vigiles et non contraints a même de signifier librement tout manquement à leur bien-être. Les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration des candidats-médicaments pour visualiser tous signes de toxicité imprévue qui seraient immédiatement suivi de l’arrêt de la procédure.

Choix des espèces

Les rats permettent l’étude des cibles thérapeutiques et des candidats-médicaments et sont suffisamment gros pour qu'une perfusion soit réalisée avec des volumes et des débits comparables à ceux utilisés chez les patients en clinique (0,25 à 2ml/kg/h). Les rats auront minimum 6 semaines, stade adulte, pour débuter les protocoles, car les systèmes immunitaires, nerveux et circulatoires sont matures.

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, une ligature imprégnée de la bactérie Porphyromonas gingivalis est posée autour d'une dent et renouvelée tous les trois jours pendant 28 jours, pour provoquer une parodontite, suivie d'injections d'une molécule anti-inflammatoire. Toutes sont ensuite tuées par ponction du sang dans le cœur pour prélever les tissus. Le porteur affirme n'observer aucune modification de l'état de santé des souris et présente cette espèce comme la plus utilisée pour l'étude de cette maladie.

Objectifs

La parodontite est une maladie inflammatoire chronique très fréquente (47% de la population adulte américaine). Elle entraine une destruction des tissus de soutien des dents, générant des édentements précoces et une difficulté à la réhabilitation orale. Elle est déclenchée par un déséquilibre du microbiote (plaque dentaire) avec une infection par la bactérie Porphyromonas gingivalis. Les parodontites sont une source chronique de passage de bactéries dans le sang et d'une inflammation généralisée de faible intensité, favorisant des maladies inflammatoires à distance (ex : maladies cardiovasculaires). Il n'existe pas de cibles thérapeutiques de l'inflammation pour le traitement des parodontites, ni de biomarqueurs pour évaluer précocement et mieux suivre des malades, notamment ceux atteints d'autres maladies inflammatoires chroniques. Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants dans les lésions parodontales et semblent clés dans le développement des parodontites. Récemment, il apparait qu’il existe des sous types de neutrophiles aux fonctions pro-inflammatoires ou pro-résolutives de l'inflammation. Certaines drogues sont des inhibiteurs d'un facteur de la survie et l’activation du neutrophile, et permettent d’inhiber spécifiquement les neutrophiles pro-inflammatoires. Notre objectif est de déterminer si l’inhibition des neutrophiles pro-inflammatoires par administration d’une telle drogue permet de diminuer l’inflammation et la résorption osseuse dans un modèle de parodontite expérimentale chez la souris. La parodontite sera induite pendant 4 semaines, selon un protocole validé dans la littérature et maitrisé par notre équipe. Nous caractériserons la destruction du parodonte chez des souris injectées par cette drogue en comparaison de souris injectées avec l’adjuvant de la drogue et de souris contrôle (injectées avec un tampon neutre).

Bénéfices attendus

Notre projet est le premier à tester les conséquences d’une inhibition ciblée des neutrophiles pro inflammatoires par la drogue dans la pathogénie de la parodontite. Il pourrait ouvrir sur des pistes thérapeutiques régulant l’inflammation de la parodontite pour laquelle plus de 30% des situations échappent au traitement conventionnel (traitement qui repose actuellement exclusivement sur le contrôle de l’infection). De plus, une modification par lune drogue ciblant des neutrophiles circulants primés (activés) par l’inflammation parodontale et qui peuvent influer sur des processus pathogéniques à distance, tels que l’athérosclérose, sera recherchée et serait très prometteuse en prévention des comorbidités de la parodontite. Enfin, la parodontite est un modèle parfait de maladies inflammatoires choniques au cours de laquelle la régulation des neutrophiles est primordiale. Elle partage des mécanismes pathogéniques communs avec, par exemple, les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin ou la polyarthrite rhumatoïde : les résultats de ces travaux permetteraient donc d’ouvrir des perspectives dans l’étude de la pathogénie et de stratégies thérapeutiques d’autres maladies inflammatoires chroniques.

Procédures

Avant chaque expérimentation, les souris sont anesthésiées par une anesthésie générale par voie intra-péritonéale (IP) de Kétamine 100mg/kg-Xylazine 10mg/kg en solution injectable dans du sérum physiologique. L'intervention chirurgicale sera effectuée selon une procédure qui dure environ 10 min/souris. La procédure consiste en la pose répétée d’une suture de soie chirurgicale 6-0 imprégnée d’une solution de 109 CFU/mL de P gingivalis. Après chaque pose de ligature, les souris sont placées dans un environnement chauffé (tapis) et surveillées jusqu’à leur réveil. Cette procédure est répétée tous les 3 jours pendant 28 jours pour induire une inflammation chronique locale et une destruction du parodonte. Entre chaque renouvellement, les souris seront maintenues dans des cages dans un environnement enrichi avec nourriture et eau ad libidum. Au bout de 14 jours ; une destruction parodontale peut etre observée du coté ligature +/- P gingivalis pour tous les animaux. A 14 jours, les groupes recevront des injections de la solution diluante ou de la drogue pendant les 14 jours suivants, en parallèle de la poursuite du modèle de parodontite expérimental. Les groupes contrôles recevront un volume équivalent d’une solution neutre.

Impact sur les animaux

Notre expérience ne nous montre aucune modification observable de l’état de santé des souris suite à la réalisation des anesthésies par isoflurane et examen radiologique de précision micro-Computed Tomography (micro-CT), comme suite aux anesthésies générales et pose de ligature : aucune de perte de poids, de modifications comportementales, ni de modifications de l’apparence physique pour les animaux contrôles comme pour les animaux injectés avec la solution diuante n’ont été observées. Une prise de poids en accord avec les conditions d’élevage est observée démontrant que les souris se nourrissent correctement. La dose de drogue administrée est évaluée en accord avec la littérature scientifique). Une vigilance accrue sera mise en place pour les groupes d’animaux traités avec cette drogue.

Devenir

A l'issue de la procédure,tous les animaux sont mis à mort par exsanguination cardiaque sous anesthésie et analgésie profonde, permettant le prélèvement des tissus nécessaires à nos travaux.

Remplacement

Nous développons une recherche sur modèle expérimental chez le petit animal, car c'est le seul moyen à l'heure actuelle d’étudier les différents aspects de notre projet, c’est-à-dire analyser l’inflammation du tissu parodontal complexe. Il n’existe pas d’autres méthodes alternatives (in vitro, in silico) pour l’étude des parodontites, et la souris est l’espèce la plus couramment utilisée pour l’étude de cette maladie.

Réduction

Une publication sur la comparaison des modèles de parodontite expérimentale avec ligature +/- P gingivalis chez la souris montre une différence significative sur la perte osseuse et l'inflammation parodontale avec 5 souris/groupes (test statistique d’analyse de variance Turkey suivi d’un test t de Student). Le suivi longitudinal par micro- CT sur souris vivante de la perte osseuse induite nous permet aussi de rationaliser le nombre de souris. Une souris supplémentaire par groupe est prévue en cas de mort prématurée au cours de l’expérimentation. Le nombre d’animaux estimé et les tests statistiques sont également basés sur notre expérience pour ce type d’étude. Ce nombre minimum nous permettra d’être certains de répondre aux questions scientifiques de ce projet et de mettre en évidence des différences significatives entre les groupes.

Raffinement

La procédure ne conduit pas à des altérations évidentes des souris. Le suivi quotidien des animaux et la mise en place de points limites permettront d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur, d’abord par des antalgiques et par une mise à mort anticipée selon les méthodes réglementaires, si nécessaire. Les animaux seront hébergés en groupe en milieu enrichi pour minimiser leur stress.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus couramment utilisée pour l’étude de la parodontite et tout particulièrement pour l’approche moléculaire et histologique. De nombreux outils d’analyses, qu'ils soient commerciaux ou dans notre laboratoire, sont développés et adaptés à ce modèle. 3 mois – âge adulte avec croissance des maxillaires achevée

1 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer colorectal, sous la peau ou par injection dans la rate pour induire des métastases, puis des injections de microbulles et des ultrasons deux fois par semaine jusqu'à l'atteinte des points limites. Le porteur cite parmi les atteintes la douleur de la chirurgie du ventre et la dégradation de l'état général liée à la croissance de la tumeur. Il affirme qu'à cette étape le modèle animal ne peut être remplacé par un modèle in vitro ou in silico.

Objectifs

Evaluer différents types de microbulles pour la délivrance d’un protocole de chimiothérapie, l’irinotécan (libre et encapsulé) par action combinée de microbulles et d’ultrasons (appelé également sonoporation).

Bénéfices attendus

Optimiser le modèle murin de métastases hépatiques de cancer colorectal Optimiser la procédure d’imagerie CT des métastases hépatiques de cancer colorectal Améliorer l’efficacité thérapeutique de l’irinotécan libre et encapsulé pour le traitement du cancer colorectal

Procédures

Procédure 1 Evaluation de microbulles de gaz pour la délivrance d'une chimiothérapie par sonoporation dans un modèle murin de cancer colorectal sous-cutané chez la souris 1- identification par puce – insertion sous cutanée du trocart –anesthésie gazeuse– 480 animaux- pour chaque animal 1 seule fois 2- injection sous cutanée de cellules tumorales – anesthésie gazeuse - 480 animaux- pour chaque animal 1 seule fois 3- i.v. microbulles gaz et/ou chimiothérapeutiques et/ou ultrasons (

Impact sur les animaux

- Le stress lié à la manipulation des animaux - L’hypothermie induite par l’anesthésie générale - La douleur induite par la chirurgie abdominale - La dégradation de l’état général des animaux induite par la croissance tumorale

Devenir

Procédure 1 : A la fin de l'étude, une euthanasie par dislocation cervicale de l'animal après anesthésie gazeuse (Vetflurane 5%) sera réalisée par un des responsables de l’étude. Procédure 2 : A la fin de l'étude, une euthanasie par dislocation cervicale de l'animal après anesthésie gazeuse (Vetflurane 5%) sera réalisée par un des responsables de l’étude.

Remplacement

Dans une première approche expérimentale, nous avons réalisé des expériences sur des cellules cellulaires dont les résultats sont particulièrement encourageants et nécessitent d'être validés avec un modèle préclinique. Par conséquent, à cette étape du projet, le modèle animal ne peut être substitué par un autre modèle d'étude in-vitro ou in silico.

Réduction

Grâce à un plan d’expérience, les groupes contrôles et expérimentaux seront constitués de 20 souris (10 mâles et 10 femelles). Nous réaliserons une étude statistique pour déterminer si ces différentes thérapies permettent une diminution significative de la croissance, du métabolisme et de la perfusion tumorale (Puissance de test: 80%, Seuil de risque: 0.05).

Raffinement

Les nuisances ou effets indésirables des procédures 1 et 2 seront évalués par le personnel de zootechnie et par les responsables de l’étude. Les animaux seront observés une fois par jour afin d’évaluer leur stress/leur douleur après les différentes procédures réalisées sous anesthésie gazeuse (Vetflurane). - Le stress lié à la manipulation des animaux : Les souris seront hébergées en présence d'un objet d'enrichissement (morceaux de carton et/ou tube plastique) en groupe. Le stress est minimisé par l'implication d'un personnel qualifié à l'expérimentation animale. Les souris sont facilement stressées, la contention nécessaire à l’induction de l’anesthésie rajoute une source de stress supplémentaire. Les animaux, après la phase d’acclimatation, seront habitués à être sortis de leur cage. - L’hypothermie induite par l’anesthésie générale : L’animal est réchauffé par une couverture chauffante. - La douleur induite par la chirurgie abdominale : La douleur sera prise en charge par une analgésie adaptée (Buprénorphine 0.05 mg/kg et lidocaïne) en pré- et post-opératoire. - La dégradation de l’état général des animaux induite par la croissance tumorale : Le poids sera mesuré tous les deux jours et les animaux seront observés tous les jours selon les critères ci-dessous : (1) Détérioration générale de l'état sanitaire, altération sévère des comportements physiologiques (prostration, refus de se nourrir et de boire, locomotion réduite, dos vouté et yeux enfoncés). (2) Cachexie associée à une perte de poids de 17% du poids total de l'animal. (3) Symptomologie évocatrice : Saignements, urines ictériques, dyspnées ou sibilances… La manifestation d'un seul de ces signes cliniques conduira à une euthanasie par dislocation cervical après anesthésie au vetflurane (5%) par une des personnes en charge de l'étude. Une analgésie ne pourra pas être administrée aux animaux pendant la croissance tumorale car cette première influence cette dernière.

Choix des espèces

Dans la littérature et pour la lignée cellulaire CCR choisie pour notre étude, l'implantation se fait généralement dans des souris nudes. Dans la littérature et pour les lignées cellulaires CCR choisies pour notre étude, l'implantation se fait généralement dans des souris nudes de 6 semaines environ pour un poids de 20 g.

1 386 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par voie nasale par la bactérie de la coqueluche, hébergés avec des animaux sains pour étudier la transmission, puis tués pour prélever nez et poumons. Le porteur indique une surveillance quotidienne du poids et du comportement, une perte de plus de 20 % du poids pouvant déclencher la mise à mort. Il présente le hamster comme un modèle permettant, contrairement à la souris, d'étudier la transmission par aérosol, et revendique le recours à l'animal pour valider son vaccin vivant.

Objectifs

Ce projet a pour but d'étudier une phase critique de la coqueluche qui est la phase de transmission et la potentialité de notre vaccin vivant à protéger contre l’infection bactérienne par aérosolisation naturelle.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but d’étudier et comprendre la phase de transmission de Bordetella pertussis dans un modele Hamster et de potentialiser notre vaccin vivant pour définir la protection médiée contre une infection par transmission naturelle par infection nasale.

Procédures

1) administration intranasal de Bordetella chez le hamster (5 min par animaux). Les animaux seront euthanasiés 0, 3, 7, 14,21, 28 et 56 jours post administration pour prelevement post mortel de sang, du nez et des poumons 2)exposition des animaux sains à l'infection par co-hebergement avec les animaux infectés. Le temps de co-hebergements est de 0, 7, 14, 28 et 56 jours, ensuite les animaux sains et infectés initialement seront euthanasiés pour prelevement post mortel de sang, du nez et des poumons 3) les hamsters seront vaccinés par instilation intranasal de Bordetella pertussis (5 min) ou injection sous cutanée de vaccin commercial (5 min). Un mois plus tard, le groupe ayant recu le vaccin commercial sera boosté par la même dose. 28 jours plus tard, les hamsters immunisés ou naifs seront infectés par une souche virulente de Bordetella (5min). 3h et 7j après ce challenge, les hamsters seront euthanasiés pour prelevement post mortel de sang, du nez et des poumons. 4) les hamsters seront vaccinés par instilation intranasal de Bordetella pertussis (5 min) ou injection sous cutanée de vaccin commercial (5 min). Un mois plus tard, le groupe ayant recu le vaccin commercial sera boosté par la même dose. 28 jours plus tard, les hamsters immunisés ou naifs seront mis en contact avec des hamsters préaleblement infectés par une souche virulente de Bordetella (5min). 3 heures, 14 jours, 28 jours et 56 jours après la mise en contact les hamsters seront euthanasiés pour prelevement post mortel de sang, du nez et des poumons.

Impact sur les animaux

Nous avons déjà démontré que l’infection nasale par BPZE1 dans un modèle hamster ne provoque aucun symptôme bien que les bactéries puissent coloniser le nez pendant 56 jours. En revanche bien que la littérature montre une résistance naturelle des hamsters à Bordetella bronchiseptica, nous ne connaissons pas la virulence des souches cliniques de Bordetella pertussis ni des souches de Bordetella parapertussis dans le modèle hamster.

Devenir

Les hamsters seront mis à mort à la fin de chaque expérience pour la récupération des nez et poumons ou à l'atteinte des points limites

Remplacement

Il nous tient à coeur d'appliquer au mieux la règle des 3R. Les modèles in vitro ou in silico ne suffisent pas pour comprendre les phénomènes de colonisation et d’induction de l’immunité induits par l’infection. En outre, dans l’optique de positionner le vaccin BPZE1P comme protecteur contre une infection naturelle, son efficacité doit être validée par une expérimentation animale in vivo. D'autre part l'etude de la phase de transmission necessite de mettre en contact (cocconing) les animaux infectés avec des animaux sains pour tenter de mimer une infection naturelle, cette etape ne peut etre reproduite in vitro.

Réduction

Il nous tient à coeur d'appliquer au mieux la règle des 3R. le nombre d’animaux est basé sur un calcul de puissance statistique en fonction de la variabilité attendue concernant la significativité des différences observées entre les groupes expérimentaux. Si la variabilité inter-individus et inter-expérimentation est faible le nombre d’animaux par groupe sera revu à la baisse.

Raffinement

Il nous tient à coeur d'appliquer au mieux la règle des 3R. nous serons extrêmement vigilants sur le respect de la notion de points limites. Chaque jour, les critères de souffrance seront évalués (changement comportemental, prostration, etc.) à l’aide d’une grille de cotation. Dans le cas où le score atteint le seuil limite fixé, l'animal sera mis à mort. Les résultats de la procedure 2 nous permettra d'affiner les points de prelevement d'organe pour la procedure 5 ce qui limitera le nombre d'animaux utilisés. Le bien-être animal sera vérifié quotidiennement au travers de : - Contrôle du poids de l’animal (si une perte de poids de plus de 20% était observée, nous procéderions à l’euthanasie des animaux concernés) - Comportement général de l'animal (prostration, isolement dans la cage ou au contraire hyperactivité) - Aspect physique, en particulier si le poil est hérissé ou si la respiration est rapide ou saccadée (puisque Bordetella pertussis responsable de la coqueluche est une maladie respiratoire).

Choix des espèces

Le modele animal utilisé pour étudier Bordetella pertussis, l’agent responsable de la coqueluche chez l'humain, est depuis plus de 30 ans le modèle murin. En effet cette bactérie colonise transitoirement le nez et le poumon de la souris. Cependant, la pathologie humaine de la coqueluche met en évidence une infection des voies aériennes supérieures (nez, trachée, bronche) mais très rarement l’entièreté du poumon. Le mode d’infection utilisé pour le modèle murin semble être trop intrusif pour mimer complètement l’infection naturelle humaine. D’autre part, malgré de nombreux essais, le modèle murin ne permet pas d’étudier la phase de transmission car les souris ne toussent pas et n’aérosolisent pas la bactérie. En revanche, le modèle hamster a été mis en évidence comme permettant l’aérosolisation de particule virale du SARS-COV2 et permet l’infection d’animaux naïfs présents dans la même cage avec une séparation physique. l'age de 3 semaines et le sexe sont liés au fait que des hamsters males de 3 semaines ont deja ete utilisés dans un autre protocol APAFIS#27475-2020100514546435 v3 et nous voulons puvoir comparer les resultats experimentaux avec ces deux projets l'age de 3 semaines est aussi liée au fait que les animaux qui seront vaccinés a deux reprises par le vaccin acellulaire auront alors 11 semaines lors du challenge avec les souches de Bordetella