Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude du comportement migratoire de la truite lacustre
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
90 truites de lac sauvages vont être utilisées, capturées par pêche électrique puis relâchées après marquage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque poisson subit sous anesthésie l'insertion chirurgicale d'une marque dans la cavité abdominale, opération de cinq à dix minutes réalisée une seule fois. Le porteur indique que la marque ne modifie ni le déplacement ni le bien-être des poissons, relâchés ensuite pour un suivi par antennes. L'étude sert la gestion halieutique de l'espèce, la capture et la chirurgie étant décrites comme obligatoires pour observer la migration.
Objectifs
La truite de lac représente une espèce emblématique des lacs alpins. Le Plan Départemental pour la Protection des milieux aquatiques et la Gestion de la ressource piscicole identifie le statut de cette espèce comme menacé. Sa particularité réside dans le fait que son cycle biologique comprend une phase de croissance en lac et une phase de reproduction et de production de juvéniles en rivière. De par son cycle biologique particulier, la truite lacustre constitue ainsi l’indicateur ultime de la connectivité entre le lac et ses affluents et donc l’espèce indicatrice de la fonctionnalité des milieux.
Bénéfices attendus
Cette étude rentre dans le cadre d’un objectif d’amélioration : -des dispositifs de franchissement et éventuellement d’appliquer cette méthode sur d’autres sites avant et après aménagement; -des connaissances de l’espèce en vue d’adapter sa gestion dans une optique de préservation.
Procédures
Capture de poissons sauvages par pêche électrique puis insertion chirurgicale, sous anesthésie générale, de marques semi-actives dans la cavité péritonéale (temps d'intervention 5 à 10 minutes). Une seule opération de ce type est effectuée par animal.
Impact sur les animaux
En ce qui concerne l’implantation chirurgicale du poisson et le comportement post-marquage, le déplacement ou son bien-être n'est pas modifié par la présence de la marque. Toutes les précautions sont prises lors de l'intervention chirurgicale pour limiter le risque d'infection. En ce qui concerne les opérations d’échantillonnage par pêche électrique, ces dernières sont mises en œuvre par du personnel formé, elles sont encadrées et réglementées. Toutes les dispositions sont prises pour assurer la sécurité des personnes (port des EPI, utilisation du matériel certifié) et limiter au maximum le risque de blessures ou de dommages vertébraux sur les poissons (réglage des appareils en fonction de la conductivité et de la température de l’eau).
Devenir
Le but de cette étude étant de connaitre les déplacements des truites lacustres dans le temps, les individus marqués seront relâchés post intervention et ne feront pas l’objet de recapture (les individus seront localisés au moyen des antennes fixes et mobiles). Tous les animaux capturés temporairement pour les besoins de marquage seront relâchés.
Remplacement
Le projet consiste en l'étude même du comportement de déplacement des individus de l'espèce truite lacustre ; la capture et le marquage de certains individus sont donc rendus obligatoires pour les besoins de l'étude.
Réduction
La taille de l'échantillon doit être suffisante pour dégager des résultats fiables et statistiquement interprétables. Aussi, un nombre maximal de 90 individus adultes seront recherchées sur les 3 années. Cette taille plutôt "modeste" de l’échantillon suffira pour répondre à toutes nos interrogations quant au comportement reproducteur de cette espèce.
Raffinement
Toutes les manipulations se feront sous anesthésie par du personnel qualifié sur le site d’étude. L'ensemble des poissons ne sera remis à l'eau qu’après contrôle de l’état sanitaire (absence de lésions) et récupération totale de l’anesthésie. Les points limites (comportement du poisson lors de l’anesthésie, pigmentation anormale liée au choc électrique) sont suffisamment prédictifs et précoces pour limiter la souffrance de l’animal et exclure des individus avant intervention chirurgicale le cas échéant.
Choix des espèces
Le but de cette étude étant de mieux connaitre le fonctionnement du cycle biologique de cette espèce, et notamment dans sa phase de reproduction (dans les affluents), seuls les géniteurs (mâles et femelles) présents sur le cours d'eau d'intérêt, au cours des différentes campagnes annuelles, seront recherchés pour le marquage. Le ratio poids de la marque / poids de l'individu sera évidemment respecté en utilisant des transpondeurs de type Pit-Tag de 32 mm pour 0.8g (la taille est ainsi adaptée à la taille et au poids de l’individu, celui-ci ne devant pas dépasser 2% du poids de l’individu). Dans le cas de notre espèce recherchée, le poids moyen des individus reproducteurs varie de 200g à 9 000g pour les mâles et de 200g à 10 000g pour les femelles.
Impact de la perte d’expression de régulateurs clés du cycle de division de l’hépatocyte et de l’immunosurveillance dans la NAFLD et la carcinogenèse hépatique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
2 132 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de souffrance légère à modérée. Elles subissent une injection intrapéritonéale, une injection rétro-orbitale sous anesthésie et des prélèvements mensuels de sang à la queue pendant six à douze mois, pour étudier le cancer du foie et la maladie du foie gras. Le porteur reconnaît une prise de poids importante liée aux régimes imposés et une altération de l'état général due au développement tumoral attendu au foie. Il présente le modèle murin comme "indispensable", seul modèle permettant selon lui d'invalider des gènes de façon tissu-spécifique.
Objectifs
Le foie est un organe vital qui intervient dans le stockage du glucose, la fabrication de la bile et la détoxification. L'incidence du cancer du foie (CHC) est en forte augmentation depuis 20 ans et ce cancer représente la 3ème cause de mort par cancer dans le monde. Ce cancer grave dispose de très peu de traitements efficaces et l’apport de nouvelles stratégies thérapeutiques représente donc un enjeu majeur dans la prise en charge de cette maladie. Bien que des progrès aient été accomplis dans le déchiffrage des mécanismes moléculaires du CHC, la dissection des événements précoces de la carcinogenèse hépatique, notamment comprendre la transformation tumorale des hépatocytes, cellules majoritaires du foie, est centrale pour mieux comprendre le développement de ce cancer. Des études récentes ont montré que le développement du CHC était intimement lié à un contexte d’altérations au niveau génétique, métabolique et inflammatoire, qui favorise un remaniement du cycle de division de l’hépatocyte. Dans ce cadre, nos travaux visent notamment à décrypter les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le cycle de division des hépatocytes, pour assurer ainsi le maintien de l’intégrité du tissu hépatique. Ce projet nécessitera 2132 souris et sera mené pour une durée de 3 ans.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet nous permettront de définir le rôle de STING, RhoA, ATM, ATR, DNAM-1 et LECT2, dans le contrôle prolifératif des hépatocytes, mais aussi dans la compréhension des mécanismes sous-jacents assurant l'intégrité génomique dans le foie, mécanismes faisant défaut au cours de l'hépatocarcinogenèse humaine. Ces travaux devraient conduire à élaborer chez l’Homme de nouveaux outils diagnostic/pronostic et des stratégies thérapeutiques innovantes pour ce cancer grave sans traitement effectif.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, une injection intra-péritonéale sera réalisée (une fois, à 5 semaines de vie, durée 30 secondes ) sur animal vigile (756 animaux). Une injection rétro-orbitale sera réalisée (une fois, à 5 semaines de vie, durée : 1 minute) sur animal anesthésié (820 animaux). Un prélèvement au niveau de l'apex de la queue de l'animal sera réalisé pour une mesure de glycémie de manière mensuelle (6 répétitions, pendant 6 ou 12 mois suivant l’expérimentation, durée : 30 secondes - 1 minute) sur animal vigile (2132 animaux).
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet nous procéderons à une injection intrapéritonéale et un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine) pourra être ressenti par les animaux. Par ailleurs, du fait des différents régimes alimentaires auxquels seront soumis les animaux, une prise de poids importante est attendue. Enfin, du fait d’un développement tumoral attendu au niveau du foie, les animaux pourraient être sujets à une altération de leur état général.
Devenir
Pour ce projet de recherche, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglementaire) de l’ensemble des animaux (2132).
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence dans notre cas le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires induisant la séquence NAFLD/NASH/CHC.
Réduction
Nous estimons que pour ce projet, 2132 animaux seront étudiés. Les groupes expérimentaux sont constitués du minimum d’animaux nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique robuste des effets observés. La taille des groupes a été déterminée selon nos travaux préliminaires ou basée sur l’expérience de nos études antérieures. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.
Raffinement
Les animaux provenant de l’extérieur seront stabulés une semaine au sein de l’animalerie. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour-nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive (injection à l’œil) sera précédée d’une courte anesthésie générale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur une plaque chauffante. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, la mise à mort anticipée de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.
Choix des espèces
Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour déterminer les mécanismes moléculaires conduisant au CHC. Nous avons choisi la souris, car en plus de partager plus de 90% de gènes communs avec l’homme, il existe pour cette espèce des modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (5 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans la séquence NAFL/NASH. Une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l'expérimentation.
NEUROCONFLICT: Circuits neuronaux impliqués dans des situations conflictuelles chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
1 950 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de souffrance légère à modérée. Elles reçoivent des injections de cocaïne, des chocs électriques jusqu'à 0,6 mA, des chirurgies stéréotaxiques avec vecteurs viraux et l'implantation de fibres optiques, avant une perfusion intracardiaque, pour étudier les circuits neuronaux du conflit approche-évitement et de la rechute. Le porteur affirme que la cocaïne, l'évitement et la perfusion "n'engendrent ni douleur ni stress" et que le choc choisi reste inférieur aux intensités habituelles. Il conclut à la "nécessité" d'un organisme vivant intègre, qu'aucune technique in vitro ne remplacerait.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’identifier les mécanismes impliqués dans les situations conflictuelles chez la souris, lorsque l'individu hésite entre approche et évitement en condition normale ou sous l'influence de substances psychoactives telles que la cocaïne. Identifier les circuits neuronaux des comportements conflictuels est clé afin d'empêcher le phénomène de rechute. Ce projet se focalise sur des structures cérébrales critiques dans ces deux types de comportement, à savoir l'hippocampe, le noyau paraventriculaire du thalamus ainsi que de leur cible cérébrale commune : le nucleus accumbens. Bien que ces structures aient déjà été impliquées dans les comportements addictifs aux substances psychoactives, il reste à comprendre leur interaction pendant les comportements d'approche, d'évitement, et de rechute chez la souris. Afin d'atteindre l’objectif général, nous réaliserons une étude anatomo-fonctionnelle de ces structures cérébrales à plusieurs moments clés des comportements d'approche ou d'évitement. Ce projet nécessitera ainsi l'utilisation de différentes lignées de souris transgéniques permettant la manipulation et enregistrement de l’activité au sein de ces différents circuits.
Bénéfices attendus
Les expériences proposées amélioreront notre compréhension sur le phénomène de rechute, en examinant comment les informations contenues dans l’environnement peuvent déclencher des comportements inadaptés précipitant la recherche compulsive de cocaïne. Les neurones du noyau accumbens participant à ce circuit en recevant des informations de l'hippocampe et du thalamus paraventriculaire pourraient représenter une cible thérapeutique pour prévenir les rechutes chez les patients atteints d’addiction à la cocaïne, et plus largement aux drogues d’abus.
Procédures
Ce projet implique 3 procédures expérimentales décrites en item 4 Toutes les procédures (1, classe légère, 2 à 3, classe modérée) comprennent le comportement d’évitement (4h sur une journée, les animaux recevront un maximum de 1 injection de substance psychoactive et de saline), un comportement de récompense avec une substance psychoactive ou une solution saline (entre 15 min et 1h par jour, sur 4 jours, les animaux recevront un maximum de 4 injections de la substance psychoactive, et de 4 injections de saline) et la perfusion intracardiaque (7 min). Les procédures 2 et 3 comprennent la chirurgie stéréotaxique pour des injections de vecteurs viraux (45-60 min sous anesthésie générale) et peut comprendre une injection d'un composé chimique ou d'une solution saline (étude pharmacogénétique, CNO). La procédure 3 comprend également une chirurgie stéréotaxique additionnelle pour l’implantation de fibres optiques (1 ou 2 fibres, 60-90 min) pour les études d’optogénétique et de photométrie de fibre.
Impact sur les animaux
Le comportement de récompense à la cocaïne, d’évitement et la perfusion intracardiaque n’engendrent ni douleur ni stress. L'intensité du choc électrique choisie (maximum de 0.6 mA) est inférieure aux intensités de chocs classiquement utilisées dans la littérature (0,7 mA). Les approches de chirurgie stéréotaxique sont des procédures dont la douleur est prise en charge tout le long de l'expérience, via l’usage d’anesthésiques et analgésiques, avant, pendant et après la chirurgie (jusqu’à 8 jours).
Devenir
Notre étude nécessite d’une part de fixer les tissus cérébraux afin d’y réaliser des marquages immunohistochimiques. Ce but expérimental nécessitant la mise en place d’une méthode de mise à mort de perfusion intracardiaque. A l’issue de chaque procédure, les souris recevront une dose d’anesthésique et perfusées avec une solution fixatrice (4% paraformaldéhyde). Ces souris ne seront donc pas impliquées dans une autre procédure.
Remplacement
L’utilisation d'animaux vivants se justifie par la nécessité d’identifier des phénomènes physiologiques complexes au sein des circuits neuronaux impliqués dans le comportement conflictuel chez la souris, ainsi que leur interaction fonctionnelle. De nombreuses structures cérébrales entrent en jeu et communiquent entre elles. Il est donc nécessaire d’étudier un organisme vivant intègre, qui ne peut être remplacé à ce jour par des techniques in vitro. De plus, le niveau de complexité dans une telle étude est si important qu’aucun modèle informatique n’existe à l’heure actuelle pour remplacer l’animal, d’autant que de nombreux mécanismes biologiques sous-tendant les comportements conflictuels restent inconnus.
Réduction
Nous prévoyons d’utiliser un maximum de 1950 souris adultes (mâles et femelles) sur une période de 5 ans (Annexe Chronogramme). Plan d'expériences: Afin de réduire le nombre d’animaux, toutes les souris de chaque groupe serviront aux immunomarquages après la phase de comportement. Statistiques : le nombre d’animaux par groupe a été déterminé en utilisant un calcul de puissance (voir 3.4.10). Pour comparer 2 groupes, nous utiliserons un t-test de Student ou un test non-paramétrique. Pour comparer plus de 2 groupes, nous utiliserons une analyse de variance (ANOVA) à 1 ou 2 facteurs. Dans le cas des mesures répétées (évaluation des performances mnésiques), des ANOVAs à mesures répétées suivies des tests post-hoc adéquats seront utilisés. Les animaux mâles et femelles seront utilisés pour toutes les expériences. L'analyse des données se fera en tenant compte du sexe car dans de nombreux cas le niveau basal dans les tâches comportementales est différent. Ceci nous permettra de plus d'utiliser toutes les souris générées.
Raffinement
Enfin, en vue du raffinement des procédures, un soin particulier est apporté aux questions relatives au bien-être animal. Le manque d’interactions sociales pour les expériences où les souris sont stabulées individuellement est compensé par un enrichissement des cages avec des cylindres de coton permettant de stimuler l’activité naturelle, diminuer le stress et faciliter la thermorégulation. En outre, les cages, transparentes sont rapprochées les unes des autres afin que chaque animal puisse avoir un contact visuel avec ses congénères. Avant chaque procédure expérimentale, les animaux sont manipulés fréquemment afin de les habituer aux expérimentateurs et réduire ainsi leur stress. Enfin, pour les procédures impliquant une neurochirurgie, un protocole d’anesthésie et d’analgésie péri- opératoire est en place afin de garantir la bonne prise en charge de nos animaux. La santé des animaux sera surveillée tout au long de l'expérience et évaluée grâce à une grille codifiant le niveau de bien être (Annexe Points Limites). Cela nous permettra d'intervenir immédiatement et de manière appropriée si un premier signe de souffrance est détecté.
Choix des espèces
La souris représente un modèle de choix pour notre projet par la possibilité d’étudier des individus génétiquement modifiés (la souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux transgéniques, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement) et dont la physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain pour que les informations obtenues soient pertinentes sur un plan médical. Toutes les souris C57Bl6/j arriveront dans notre animalerie expérimentale à l’âge de 11 semaines. Les souris transgéniques seront élevées dans notre animalerie. Les procédures expérimentales débuteront après 1 semaine d’habituation. Il est admis qu’à 12 semaines, la croissance des os est achevée, ce qui facilite les procédures impliquant une chirurgie stéréotaxique (car les points de repère anatomiques se situent sur le crâne). Les souris ne seront plus utilisées au-delà de 10 mois.
HTAM IL1: Etude du rôle de l’inflammasome dans l’hypertension artérielle maligne chez la souris 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales quotidiennes, l'implantation chirurgicale d'une mini-pompe et des séjours en cage métabolique, avant un prélèvement sanguin terminal, pour reproduire une hypertension artérielle maligne. Le porteur reconnaît de possibles atteintes du cœur, des reins et de la rétine, ainsi que des douleurs post-opératoires. Les bénéfices, identifier les patients à risque et de nouvelles cibles, sont formulés au conditionnel.
Objectifs
L’intérêt de ce projet est de comprendre pourquoi certains patients avec hypertension artérielle vont développer une forme grave de cette hypertension, appelée hypertension artérielle maligne, avec une atteinte sévère du coeur, des reins et de la rétine et du cerveau pouvant conduire à la mort des patients. Notre équipe a identifié des mécanismes pouvant expliquer cette aggravation sévère de l'hypertension artérielle et cherche à valider ces mécanismes complexes dans un modèle d'hypertension artérielle chez la souris.
Bénéfices attendus
Si notre projet confirme nos hypothèses, cela pourrait permettre d'identifier les patients hypertendus susceptibles de développer une forme grave d'hypertension artérielle maligne. Nous pourrions également identifier des marqueurs prédictifs et/ou diagnostic de l'hypertension artérielle maligne. De plus, la démonstration qu’une altération des petts vaisseaux est en cause dans certains troubles graves du rythme cardiaque pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques.
Procédures
Injection intrapéritonéale quotidienne pendant 5 jours. Une procédure chirurgicale: implantation d'une mini-pompe osmotique sous-cutanée. Prélèvement urinaire en cage métabolique sur animal vigile. Prélèvement sanguin terminal sur animal anesthésié.
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés au traitements: inconfort lié à la préhension des animaux, douleur au point d'injection, inconfort lié aux cages métaboliques. Effets de la chirurgie: douleurs post-opératoire. Effets du modèle pathologique d'HTA: potentiellemnt atteinte des organes cibles, coeur, reins et rétines
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes et analyser les atteintes microvasculaires des organes cibles de l'hypertension artérielle.
Remplacement
Nous utilisons différentes approches pour analyser les mécanismes de l'atteinte microvasculaire liés à l'hypertension artérielle, incluant les cultures cellulaires (in vitro). En général, les expériences de remplacement ne peuvent pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours de l'HTA comme les interactions entre les vaisseaux et le système immunitaire. C'est pourquoi nous aurons aussi recours au modèle animal, en choisissant la souris comme modèle classique de mammifère, et comme modèle expérimental établi, avec de nombreux outils génétiques disponibles, un temps de génération court et des portées de grande taille.
Réduction
Réduction : le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Un calcul d'effectif a été réalisé au préalable permettant d'évaluer le nombre d'animaux requis. Nous prélevons un maximum d'organes d'intérêt par animal afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Raffinement : les animaux seront élévés en cages enrichies en coton et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Les souris hypertendus urinent beaucoup. Pour cette raison, le nombre d'animaux par cage est limité à 3 et les cages sont changés plus fréquemment et dès que nécessaire. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie péri-opératoire. Les échographies cardiaques qui sont non invasive sont réalisées sous anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
La souris est le seul modèle permettant à la fois de réaliser des expériences de physiopathologie de mammifère et d’utiliser la recombinaison homologue ou l’excision allélique dirigée afin de connaître la fonction des produits des gènes in situ et in vivo. Souris adultes agées de 10 à 20 semaines car il faut de jeunes adultes. En effet, l'age est un facteur de risque de fibrose rénale et utiliser des souris trop agées induirait une plus grande variabilité de nos résultats expérimentaux.
Caractérisation d’un modèle de souris des mouvements anormaux liés à la mutation de l’Adenylyl cyclase 5
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 044 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de souffrance légère à modérée. Elles passent les tests comportementaux du rotarod et de l'open-field pendant neuf jours, 864 d'entre elles recevant en plus trois injections intrapéritonéales quotidiennes, pour caractériser un modèle de mouvements anormaux lié à une mutation du gène ADCY5 et tester une molécule. Le porteur décrit un stress possible lié aux injections et au nouvel environnement, ainsi qu'une légère perte de poids. Il présente la souris comme "le modèle le plus utilisé" pour ces maladies du mouvement.
Objectifs
L’objectif général de ce projet est de déterminer le phénotype de ces souris et de caractériser les anomalies de fonction de l’AC5 (gain de fonction ou perte de fonction) consécutives à cette mutation, et les conséquences sur les voies de signalisation dans lesquelles l’AC5 est impliquée. Nous avons choisi de commencer par une évaluation comportementale motrice et une évaluation de l’effet de KW6002 par deux procédures comportant le test de l’open field et du rotarod, qui font l’objet de cette demande.
Bénéfices attendus
Bénéfices tant scientifiques que théreputiques. Mise en évidence des anomalies motrices similaires à celles observées chez les petients et essai d'un traitement potentiel de ces anomalies. Ces découvertes bénéficeront à la caractérisation et compréhension des anomalies moléculaires expliquant les symptômes observés chez les patients et permettront de découvir de nouveaux traitement et d'améliorer la prise en charge des patients qui souffrent d'une maladie rares et orpheline donc nécessitant un effort de recherche pour les soutenir.
Procédures
Pas de prélèvement ni de chirurgie. Tous les animaux décrits dans les procédures N°1 et N°2 (nombre maximum 1044) vont passer des tests comportementaux rotarod et openfield d’une durée totale de 9 jours. Les temps passés sur l’appareil rotarod et dans l’appareil openfield pour chaque animal sont environ 35 min et 10 min respectivement. Les animaux décrits dans la procédure N°2 (nombre maximum 864) recevront des injections intrapéritonéales tous les jours au cours des tests comportementaux d’une durée totale de 9 jours. Chaque animal reçoit 3 injections par jour dont 1 injection avant chaque test openfield et 1 injection avant le test rotarod. Chaque injection dure moins d’une minute
Impact sur les animaux
Les protocoles utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de douleur possible. Les injections intrapéritonéales ainsi que le nouvel environnement dans l’appareil openfield pourraient potentiellement introduire un stress chez certains animaux. Une légère perte du poids (jusquà 1g) pourrait arriver chez certains animaux notamment ceux qui présentent une meilleure capacité motrice durant le test du rotarod. Mais ce phénomène s’arrête quand le test est fini. Les animaux reprennent leur poids très rapidement. Une fatigue liée aux tâches d’apprentissage pourrait apparaître pendant la réalisation de la tâche, mais qui n’induirait qu’un arrêt de la participation à la tâche par l’animal sans conséquence négative pour lui, il sera replacé dans sa cage. Toutes les précautions nécessaires seront prises afin d’éviter le stress. L’animal est manipulé tous les jours pendant deux semaines avant commencer les protocoles. L’animal sera placé aussi dans l’appareil afin d’acclimater. Les expérimentateurs vérifient quotidiennement l’état d’animal notamment les signes du stress
Devenir
A la fin des procédures, il y aura une euthanasie réglementaire pour des analyses biochimiques au niveau cérébrale pour l'étude des anomalies neurobiologiques en lien avec les anomalies.
Remplacement
Notre projet propose de disséquer les bases moléculaires du rôle de la mutation d’ADCY5 dans le contrôle moteur et l’apparition de mouvements anormaux, mettant en jeu différents réseaux neuronaux. Le fonctionnement de ce réseau ne peut, à ce jour, pas être reproduit ni modélisé par des modèles in vitro ou computationnels. Le projet met en jeu des approches intégrées sur animal entier, nécessitant des souris transgéniques et ne peut se faire qu’à l’aide d’études comportementales au niveau de l’animal. Il est donc impossible de remplacer les animaux par un modèle cellulaire pour les tests comportementaux. Les études in vitro et sur les invertébrés ne permettent pas l'étude de comportements tels que les mouvements anormaux et leurs conséquences. Une fois les acteurs moléculaires déterminés, nous étudierons les mécanismes moléculaires à l’aide de modèles de cultures lorsque cela est possible pour limiter le nombre d’animaux utilisés. D’une façon générale, nous nous efforçons continuellement d’évaluer nos approches et adapter nos expériences pour des modèles in vitro ou computationnels autant que possible.
Réduction
Concernant la réduction, des expériences précédentes nous ont permis de définir le nombre minimal d'animaux permettant de générer des données statistiquement solides. Le nombre total d’animaux est de 1044 au maximum. Quand cela sera possible et afin de réduire leur nombre, les mêmes animaux sont utilisés dans les deux tests comportementaux rotarod et openfield. – Nos connaissances sur le modèle étudié, notamment sur les potentielles doses fonctionnelles de KW6002, nous permettront de limiter le nombre de doses à essayer et d’animaux nécessaires pour générer des résultats statistiquement robustes.
Raffinement
Concernant le raffinement, pour toute cette étude, les conditions d’hébergement et les protocoles expérimentaux utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de douleur et d’inconfort possible. Pendant les procédures, les animaux seront observés et manipulés quotidiennement et une pesée sera effectuée tous les 7-10 jours. Les animaux seront hébergés en groupe de 2 à 5 animaux, dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne nocturne de 12h. L’eau, la nourriture seront fournies ad libitum, un carré de coton pour nidifier est placé dans chacune des cages de manière à offrir aux animaux un enrichissement. Ils feront l’objet d’un contrôle quotidien. L’évaluation de la douleur et de la détresse est réalisée en observant l’aspect des souris et leur comportement. Les points limites seront pour l’apparence et la posture : poil ébouriffé, perte excessive de poils, blessure cutanée, automutilation, dos courbé, yeux enfoncés, couché sur le côté, hypothermie. Pour les comportements anormaux ces points limites seront : agressivité soudaine, abattement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, apathie, prostration, diminution de l’appétit et amaigrissement, changement des périodes de sommeil, réduction de la mobilité. Ces contrôles seront enregistrés et doivent permettre de repérer tout animal malade ou blessé et de prendre les mesures appropriées. Le cas échéant, des méthodes seront mises en place pour réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux (injection d’antalgiques) si trouble mineur ou passage, ou bien mise à mort règlementaire par CO2. Les mutations dans les lignées transgéniques envisagées ne sont pas dommageables pour l’état de santé de l’animal.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus utilisé pour les maladies du mouvement proche de celle de l’homme. La souris est un modèle reconnu d’étude du mouvement, notamment car elles ont des mouvements coordonnés des pattes pour des comportements moteurs élaborés et sont déjà utilisées dans des modèles de mouvements anormaux, particulièrement pertinents dans l’étude de la pathologie étudiée ici. Dans nos études, les souris transgéniques portent la même mutation que chez les patients. Les animaux utilisés seront adultes âgés au-delà de 8 semaines. Cette partie du projet s’intéresse à la cause et les traitements des mouvements anormaux liés aux mutations du gène ADCY5, exprimés dans un organisme mature, à l’âge adulte, en prenant en compte la variabilité individuelle et le sexe. Afin de ne pas interagir avec les phénomènes développementaux, nous utiliserons donc uniquement des animaux adultes
Identification et manipulation des réseaux neuronaux encodant pour la valeur, la valence et la prépondérance des émotions de peur chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 536 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié dans des procédures de souffrance modérée et l'autre moitié sévère. Chaque animal subit deux chirurgies cérébrales puis une perfusion intracardiaque et un prélèvement du cerveau, pour cartographier les circuits neuronaux de la peur au moyen d'outils comportementaux, électrophysiologiques et optogénétiques. Le porteur déclare pourtant "aucun" effet indésirable attendu, alors que 768 souris sont classées en souffrance sévère. Il conclut qu'il "n'existe pas de méthode alternative", une culture cellulaire ne contenant pas les connexions neuronales étudiées.
Objectifs
L’objectif principal de ce protocole est double. Premièrement, développer et valider un protocole de comportement chez la souris libre de ses mouvements pour distinguer les termes de valeur, de valence et de la prépondérance. Deuxièmement, l’identification et la manipulation des réseaux neuronaux qui encodent les signaux mentionnés ci- dessus. Ces objectifs seront atteints en utilisant une combinaison d’outils comportementaux, électrophysiologiques, pharmacologiques et optogénétiques.
Bénéfices attendus
Le développement d’un protocole pour dissocier simultanément la valeur, la valence et la prépondérance nous permettra d’étudier comment les réseaux neuronaux dédiés encodent ces différents signaux. Cela nous permettra de développer de nouvelles cibles thérapeutiques pour des pathologies telles que l’anxiété ou le trouble de stress post-traumatique où la prise de décision de ces signaux est souvent inadaptée.
Procédures
Opérations chirurgicales : tous les animaux sont soumis à deux procédures chirurgicales Prélèvements de tissus : touds les animaux sont soulmisd au prélèvement du cerveau après perfusion intracardiaque à la fin de l'expérimentation
Impact sur les animaux
aucun
Devenir
Euthanaise de l'ensemble des animaux à la fin de la procédure expérimentale afin de prélever le cerveau
Remplacement
L'identification et la manipulation des circuits impliqués dans l’encodage de valence, valeur et prépondérance de signaux de peur nécessitent l'utilisation d'un cerveau intact chez l'animal vigile. De plus, des méthodes telles que la culture cellulaire ou bien les coupes de cerveau ne contiennent pas les connections neuronales qui sont le sujet de nos travaux. Il n'existe donc pas de méthodes alternatives.
Réduction
le nombre d’animaux a été calculé par l’estimation de la variance observée avec ce type de données permettant d’atteindre une signification statistique. Ce nombre est de 15 souris par groupe mais par expérience 8 animaux par groupe sont suffisant et seront utilisés, soit un total de 1536 animaux pour la réalisation de ce protocole.
Raffinement
afin de réduire au minimum la souffrance des animaux, nous appliquons systématiquement un traitement antalgique avant et trois jours suivant les actes chirurgicaux qui sont réalisées sous anesthésie gazeuse. L’évaluation du poids de l’animal est effectuée de façon journalière à partir du moment où il est isolé en cage individuelle et rentre dans la phase expérimentale. Ces mesures ont lieu lors de la manipulation journalière des animaux en même temps que la vérification de l’état général de l’animal. Ces mesures sont consignées dans un cahier d’expérience prévu à cet effet. Pour identifier les dommages et contraintes subis par l’animal, nous avons définis des points limites au nombre de 5. Ces cinq aspects évalués au cours de nos expériences nous aident à déterminer un point final à l’expérimentation. Chaque critère est évalué de 0 à 3 et si un critère obtient le score maximal, ceci induit un arrêt immédiat de l’expérience. Sur la base des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et les zootechniciens seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez les souris.
Choix des espèces
La souris est un bon modèle pour les études comportementales. Son utilisation est généralisée dans le domaine des neurosciences et en particulier pour l’étude des circuits neuronaux impliqués dans le comportement de peur. De plus, nous utilisons ici des modèles transgéniques divers ce qui présente un intérêt scientifique fort. Les animaux seront utilisés entre 2 et 6 mois post natal fin de permettre une comparaison avec des résultats précédemment publiés.
Etude de la biodistribution de nouveaux nanomédicaments.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
4 401 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées de souffrance légère. Elles reçoivent des injections de nanomédicaments par voie sanguine, orale ou nasale, avec suivi par imagerie ou prélèvement d'organes, pour étudier la distribution de ces particules dans l'organisme. Le porteur précise qu'aucun traitement antidouleur n'est prévu, afin de "ne pas altérer les résultats" de l'expérimentation. Il présente le recours aux animaux comme "indispensable", affirmant qu'il n'existe pas de système alternatif.
Objectifs
Il s’agit d’un projet visant à évaluer le comportement de nouveaux nanomédicaments enzymatiques dans l’organisme (localisation et élimination). Les enzymes sont des molécules actives qui permettent la conversion de substances en d’autres afin d’éviter l’accumulation de substances toxiques ou de permettre la production de molécules essentielles. Malgré les bénéfices apportés par les médicaments enzymatiques, l’une de leur limitation est le manque de localisation spécifique dans l’organisme. Des stratégies de ciblage sont nécessaires pour optimiser leur efficacité. Nous avons développé une plateforme technologique permettant l’immobilisation et la protection d’enzymes sur des nanoparticules de silice dont la surface peut être modifiée afin d’induire une localisation précise des nanomédicaments dans l’organisme. Ces nanomédicaments ont des applications dans des pathologies diverses et donc des sites d’action variés (ex : intestin, cerveau,…). Les nanoparticules doivent donc présenter des caractéristiques leur permettant d’atteindre les organes cibles afin d’apporter les enzymes au niveau des organes malades. Du site d’action des nanomédicament découle une voie d’administration, d’où cette étude visant à comprendre le chemin parcouru par les nanomédicaments après leur administration dans un organisme. Des tests réalisés en laboratoire sur des cellules, des reconstitutions de paroi d’organes et sur des échantillons de sang ont montré que notre médicament n’est pas nocif. Cependant une caractérisation plus approfondie de notre médicament est nécessaire afin de développer un traitement sûr et efficace. Pour ce faire, l’utilisation de modèles animaux est indispensable. Dans ce cadre, les objectifs de ce projet sont : 1) D’obtenir des données sur le comportement des nanomédicaments en fonction de leurs propriétés physiques et de leur voie d’administration. 2) De définir les spécifications de surface optimale permettant d’apporter le nanomédicament dans d’un organe précis 3) De valider des techniques d’imagerie pour étudier le comportement des nanomédicaments dans l’organisme.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans le processus de développement de nouveaux médicaments. Les études précliniques (tests en laboratoire et sur animaux) sont des étapes fondamentales avant de pouvoir administrer un nouveau médicament à l’Homme. Les résultats attendus lors de ces expériences devraient nous permettre 1) de comprendre et visualiser le chemin parcouru par les nanomédicaments dans l’organisme en fonction de leurs spécifications, et 2) de sélectionner les spécifications adéquates pour atteindre les organes cibles (en fonction des domaines d’application). Ces données sont des informations majeures pour le développement spécifique de nouveaux nanomédicaments enzymatiques pour lesquels les traitements actuels ne sont pas satisfaisants. A plus large échelle, cette étude permettra de valider notre procédé de production de nouveaux médicaments. Cette validation permettra d’ouvrir de nombreuses possibilités quant au développement de futures thérapies utilisant cette stratégie.
Procédures
Ce projet sera réalisé sur le modèle de souris CD-1. En fonction des résultats des études préliminaires, les analyses seront préférentiellement réalisées par imagerie. Néanmoins, si l’imagerie ne permet pas d’obtenir des résultats conclusifs, les analyses seront réalisées sur les organes. Le nombre d’animaux concernés par chaque geste seront donc présentés sous forme d’un nombre minimum (dans le cas où l’étude pourrait être réalisée par imagerie), et d’un nombre maximum (dans le cas où l’étude nécessiterait un prélèvement d’organes). Les gestes réalisés seront les suivant : 1) Injection de nanomédicaments dans la circulation sanguine Ce geste sera réalisé sur des animaux préalablement anesthésiés (anesthésie gazeuse), une seule fois durant le temps de l’étude. Le nombre d’animaux concernés est min : 267, max : 1467. 2) Injection de nanomédicaments par voie orale Ce geste sera réalisé sur des animaux vigiles, une seule fois durant le temps de l’étude. Le nombre d’animaux concernés est min : 267, max : 1467. 3) Injection de nanomédicaments par voie nasale Ce geste sera réalisé sur des animaux vigiles, une seule fois durant le temps de l’étude. Le nombre d’animaux concernés est min : 267, max : 1467. 4) Analyse des animaux par imagerie Les analyses des souris par imagerie requièrent une anesthésie légère avant la prise d’images de manière à ce que l’animal reste immobile lors de l’acquisition des scans. Chaque souris sera analysée six fois au cours de l’étude. Dans le cas des analyses par imagerie, le nombre d’animaux nécessaire est de 801. 5) Analyses des organes des animaux L’analyse des organes des animaux nécessite que ceux-ci subissent une sédation profonde. Ce geste sera réalisé une fois par animal durant le temps de l’étude. Pour rappel, ce type d’analyse est optionnel et ne sera réalisé qu’en cas d’impossibilité de réaliser les études par imagerie. Dans ce cas le nombre d’animaux concernés est de 4401.
Impact sur les animaux
Les études de biodistribution précédemment décrites seront réalisées sur des temps cours. Après administration des nanomédicaments, les animaux seront gardés au maximum pendant 96h. De plus, des expériences préliminaires ont montré une parfaite tolérance des animaux suite à l’administration des nanomédicaments. L’ensemble de ces informations suggèrent que les substances administrées (nanomédicaments) n’induiront pas de nuisances ou d’effets indésirables sur les animaux. Les études de biodistribution requièrent une manipulation des animaux pour l’administration des nanomédicaments (voies orale, systémique ou nasale) et les analyses par imagerie. Celles-ci pourraient engendrer un léger stress chez les animaux. Tout sera mis en œuvre pour habituer les animaux à être manipulé et ainsi limiter un éventuel stress.
Devenir
Lorsque les expériences seront terminées, les animaux ne pourront pas être gardés. Dans le respect de la réglementation, la fin de vie des animaux sera effectuée par administration d’une surdose d’anesthésique.
Remplacement
Dans les processus de développement des médicaments, les études de validation d’un nouveau composé jouent un rôle fondamental. Elles font généralement appel à des expérimentations animales. C’est un pré requis obligatoire pour justifier l’investigation et la première administration chez l’Homme. Ces expériences sur les animaux ont une valeur prédictive supérieure à celles réalisées en laboratoire. Le comportement des nanomédicaments dans l’organisme est un processus complexe qui résulte de l’action concertée de plusieurs acteurs cellulaires. De fait, ceux-ci sont difficilement modélisables en laboratoire. Ainsi, même si des expériences préliminaires ont été réalisées au laboratoire les réponses obtenues ne sont qu’indicatives. Il n’existe pas à l’heure actuelle de systèmes alternatifs de remplacement.
Réduction
Nous avons planifié les expériences dans l’optique de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Dans ce but, le nombre de souris à inclure par groupe est limité 8. La significativité statistique de ces différences sera déterminée. Au-delà d’une différence significative entre les différents groupes de souris au sein d’une même expérience, ce qui est important c’est la reproductibilité de l’expérience. Donc on prévoit de reproduire une fois chaque étape. S’il n’y a pas trop d’hétérogénéité au sein des groupes lors de la première expérience on réduira le nombre de souris par groupe de 8 à 6. S’il y a contradiction entre la première et la seconde expérience on prévoit une troisième expérience avec 6 souris par groupe. D’autre part, ce projet débute par des études de faisabilité dans le but de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour le suivi des nanomédicaments dans l’organisme en utilisant l’imagerie comme alternative. Des efforts particuliers seront faits pour valider les techniques d’imagerie et ainsi limiter le nombre de souris utilisées dans ce projet.
Raffinement
Une fois les animaux réceptionnés, un délai de 7 jours sera respecté avant le début du protocole expérimental. Les souris seront hébergées au maximum par 5 dans des cages d’une superficie de 500cm2 à 20-24°C et 30- 50% d’hygrométrie, en portoirs ventilés, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le milieu sera enrichi à l’aide de litière mélangée à des copeaux (sciure de peuplier, copeaux, briques de peuplier). Les animaux seront surveillés quotidiennement tout au long des expériences. En cas de signes comportementaux, physiologiques, d’une perte de poids de 20% du poids total de l'animal ou d’une détérioration générale de l'état sanitaire de l'animal reflétant une douleur associée à l'expérimentation, celle-ci sera terminée prématurément. Il n’y a pas de traitement antidouleur prévu pour ne pas altérer les résultats de l'expérimentation en cours.
Choix des espèces
Nous avons choisi de réaliser nos études sur le modèle de souris CD-1 pour assurer la continuité avec les expériences précédemment réalisées. Les informations relatives aux doses et volumes injectés peuvent ainsi être réutiliser et évitent des étapes de mises au point supplémentaires, limitant ainsi le nombre d’animaux requis.
Rôle du cortex insulaire dans l’effet protecteur d’un traitement à la progestérone sur la rechute à la cocaïne
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
5 184 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à l'auto-administration de cocaïne, à des chirurgies cérébrales, à des prélèvements vaginaux quotidiens chez les femelles et à un stress pharmacologique à la yohimbine, pour étudier l'effet de la progestérone sur la rechute. Le porteur décrit une perte de poids et une hyperactivité après la cocaïne, ainsi que des effets de la yohimbine comparables à ceux observés chez l'humain. Les retombées thérapeutiques contre la rechute sont renvoyées au "long terme".
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont triples : - Premièrement, tester l’effet d’un traitement à la progestérone sur les tests comportementaux de rechute induite par l’exposition aux signaux associés à la cocaïne, par l’injection de la cocaïne ou par un stress - Deuxièmement, l’identification le rôle causal des neurones de l’insula exprimant les PR sur la rechute à la cocaïne - Troisièmement, déterminer comment l’activité des neurones PR de l’insula est modifiée par le traitement à la progestérone sur la rechute à la cocaïne
Bénéfices attendus
Ce projet sera une caractérisation unique de l'effet de la progestérone sur l'activité des neurones exprimant les récepteurs à la progestérone (PR) du cortex insulaire pendant la rechute de cocaïne. Nous pourrons ainsi élucider le rôle causal de cette population neuronale dans la rechute à la cocaïne, et démontrer l’effet protecteur de la progestérone dans la rechute chez les animaux mâles et femelles. A long terme, ce projet a le potentiel d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques applicables à l’humain (homme et femme) pour prévenir la rechute à la cocaïne grâce à un traitement à la progestérone.
Procédures
Chez les femelles, le cycle hormonal sera suivi par un prélèvement vaginal quotidien commençant une semaine avant le test de rechute et cela pendant 5 jours, ainsi qu’un prélèvement avant chaque test de rechute amenant à un total de 7 prélèvements par souris. Les échantillons seront collectés à l'aide de pointes de coton stériles humidifiées avec du sérum physiologique stérile. Un coton-tige par souris sera inséré dans l'orifice vaginal avec une pénétration peu profonde, tourné à 360 degrés et retiré. Un prélèvement ne dure au maximum 10 secondes par animal. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale, avec injection d’anti-inflammatoires et ajout d’anesthésiants locaux sur la zone d’incision. L’acte chirurgical sera effectué dans des conditions de propreté maximales. Des antibiotiques et analgésiques seront administrés en cas d’infection ou de douleur post-opératoire.
Impact sur les animaux
La prise de cocaïne peut engendrer une perte de poids lors dès les premières prises, mais cette perte n’excède pas 3 ou 4 jours à l’issus desquels les animaux retrouvent leur poids initial. La cocaïne peut également engendrer une hyperactivitée des animaux qui disparaît au bout d’1 heure après la fin de la prise de drogue. Les effets toxiques de la yohimbine sont similaires à ceux observés chez l'homme. L'hypertension, la tachycardie, la stimulation du système nerveux central et l'antidiurèse peuvent se produire (A. Garrard, dans Encyclopedia of Toxicology (Third Edition), 2014). Néanmoins en injection aigu à la concentration utilisée les effets indésirables restent minimes mais nous contrôlerons l’était général des animaux pendant 24 heures après l’injection.
Devenir
Tous les animaux seront sacrifiés à la fin de chaque procédure afin de procéder à des analyses sur les tissus cérébraux.
Remplacement
Le projet porte sur une analyse de la connexion des neurones et de leurs propriétés de transmission d’informations au cours du comportement. Par conséquent cette procédure doit être effectuée chez des animaux vivants. L’étude de ces phénomènes n’est donc pas possible sur des cellules isolées, car elles ne permettent pas la quantification des connections neuronales ou la mesure de l’activité en réponse à une stimulation sensorielle.
Réduction
Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux afin d’obtenir une analyse fiable (le nombre d’animaux estimé permet d’effectuer des tests statistiques) et complète de la connectivité et de l’activité de la région cérébrale d’étude. Nous utiliserons ainsi 5184 animaux sur cinq ans.
Raffinement
La majorité des animaux seront hébergés en cages collectives, afin de limiter le stress dû à l’isolement. Nous avons réduit au strict minimum les animaux hébergés individuellement pour des raisons expérimentales (endommagement du matériel implanté pouvant mettre en péril la santé de l’animal si arraché par un congénère). Les cages seront également enrichies en nids en coton. Une surveillance particulière sera adressée aux animaux en période péri-opératoire. L’acte chirurgical sera effectué dans des conditions de propreté maximales. En cas d’infection, le vétérinaire référent sera sollicité pour mettre en place un traitement antibiotique approprié.
Choix des espèces
Des souris génétiquement standards (C57Bl6/J) seront utilisées afin de caractériser leur comportement lors des procédures d’auto-administration de cocaïne, de rechute et d’enregistrement de l’activité neuronale. Des souris génétiquement modifiées (PR-IRES-Cre) seront également utilisées lorsque nous étudierons une population neuronale spécifique (exprimant les récepteurs à la progesterone) afin de cibler, lors de l’étude du role causal, uniquement ces neurones d’intérêt. De plus, il a été démontré que le comportement des animaux peut varier entre les souches génétiquement modifiées ou standards. Ainsi, nous utiliserons également des souris PR-IRES-Cre pour des études comportementales afin de comparer leur comportement avec les souris génétiquement standard. Tous les animaux utilisés seront adultes (10 semaines) afin d’étudier des populations et des circuits neuronaux matures.
Caractérisation des effets antiarythmiques de peptides dans un modèle murin du syndrome du QT long de type 3.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
184 souris vont être utilisées et toutes tuées, 160 sous anesthésie sans réveil et 24 dans des procédures de souffrance sévère. Les souris porteuses d'une mutation du canal sodique cardiaque, qui provoque des arythmies et une mortalité de 50 % dès sept semaines, sont euthanasiées à quatre semaines après un électrocardiogramme sous anesthésie, pendant lequel des peptides dérivés de venins sont testés. Le porteur reconnaît que la mutation entraîne un "phénotype dommageable" et justifie la mise à mort précoce par des raisons éthiques liées à la sévérité de la maladie. Les souris reproductrices, génétiquement modifiées, sont elles aussi tuées à quarante semaines.
Objectifs
Le syndrome du QT long (SQTL) congénital de type 3 est une maladie rare à transmission autosomique dominante due à des mutations gain-de-fonction du gène codant le canal sodique cardiaque Nav1.5. L'allongement de l'intervalle QT sur l'électrocardiogramme (ECG) est associé à un risque élevé d'arythmies cardiaques sévères pouvant conduire à des syncopes et des morts subites, le plus souvent au repos ou lors du sommeil. Ces symptômes apparaissent généralement à partir de la préadolescence, mais parfois plus tôt, ce syndrome étant suspecté d'être à l'origine d'une partie des cas de mort subite du nourrisson. Les bétabloquants, qui sont très efficaces pour prévenir les arythmies chez les patients atteints d'un SQTL de type 1 ou 2, ne montrent qu'une efficacité relative chez seulement 30-35% des patients atteints d'un SQTL de type 3. L'objectif de ce projet est de tester les effets antiarythmiques de peptides dérivés de toxines extraites de venins sur un modèle de souris porteuse de l'une des mutations identifiées chez les patients, la souris knock-in hétérozygote Scn5aWT/DelQKP1510-1512 (souris Scn5aWT/DelQKP). Ces peptides ont été sélectionnés in vitro pour leurs effets sur les deux cibles thérapeutiques potentielles identifiées lors de nos travaux antérieurs : le canal Nav1.5 lui-même, en inhibant le courant sodique persistant induit par la mutation, et le récepteur de la ryanodine de type 2, Ryr2 (canal calcique du réticulum sarcoplasmique), dont nous avons montré l'implication dans le déclenchement des arythmies in vitro sur des cardiomyocytes ventriculaires isolés de souris Scn5aWT/DelQKP.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d'identifier : 1. au moins un inhibiteur du courant sodique persistant induit par la mutation de Nav1.5, capable de normaliser la durée de l'intervalle QT sur l'ECG et de prévenir la survenue des arythmies ventriculaires, offrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques, et 2. au moins un peptide stabilisateur de Ryr2 susceptible de prévenir la survenue des arythmies malgré l'allongement de l'intervalle QT, permettant ainsi de confirmer in vivo que Ryr2 participe effectivement au déclenchement des arythmies, et offrant là aussi une solution thérapeutique possible.
Procédures
Elevage pour l'obtention de souris Scn5aWT/delQKP, à phénotype sévère. Les souris Scn5aWT/delQKP seront euthanasiées à l'âge de 4 semaines, à l'issue d'un enregistrement de leur électrocardiogramme, limitant ainsi le risque de mort subite et d'insuffisance cardiaque, dont l'incidence augmente fortement après 4 semaines. Examen électrocardiographique. L'enregistrement d'un électrocardiogramme sera réalisé sous anesthésie en conditions contrôles et pendant l'injection de doses croissantes des peptides thérapeutique à tester. Cet examen durera 35 minutes sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les souris lors de la procédure expérimentale (procédure 2) mise en œuvre lors de ce projet sont leur contention et leur anesthésie par isoflurane. En effet, cette procédure consiste en l'enregistrement d'un ECG sous anesthésie avec euthanasie de l'animal en fin d'examen (classe sans réveil). En revanche, la mutation conduit à un phénotype dommageable, puisqu'elle entraine des arythmies ventriculaires plus ou moins sévères chez les souris porteuses qui conduisent, à partir de 4 semaines à une forte mortalité : 50% de mortalité à l'âge de 7 semaines. Les souris qui ont peu ou pas d'arythmies (seulement un allongement de l'intervalle QT) survivent jusqu'à l'âge adulte mais développent une hypertrophie myocardique conduisant à terme à une insuffisance cardiaque. Pour limiter les conséquences de ce phénotype sur le bien-être des animaux, deux décisions ont été prises : (1) pour l'entretien de la lignée (procédure 1), nous n'utilisons pas de souris porteuses de la mutation (voir paragraphe 5.10.3), et (2) notre étude sera réalisée à l'âge de 4 semaines, avant la survenue des premiers décès.
Devenir
Tous les souriceaux Scn5aWT/delQKP et contrôles inclus dans l'étude seront euthanasiés à l'âge de 4 semaines à la fin de la procédure 2 pour des raisons éthiques compte-tenu de la sévérité du phénotype cardiaque au delà de cet âge. Les souriceaux surnuméraires des portées seront également euthanasiés à 4 semaines à l'exception des souriceaux Scn5aWT/Neo-delQKP et Flp qui seront conservés pour renouveler les souris utilisées pour la reproduction. Les souris reproductrices sont euthanasiées à l'âge de 40 semaines et remplacées, dans la mesure où elles sont génétiquement modifiées et ne peuvent être utilisées pour d'autres études.
Remplacement
Cette étude est focalisée sur un modèle de pathologie cardiaque qui nécessite une exploration fonctionnelle in vivo. Seule l'expérimentation animale peut permettre de déterminer si le traitement testé présente un intérêt clinique en normalisant la durée de l'intervalle QT à l'ECG et/ou en prévenant les arythmies. Les peptides qui seront testés chez la souris ont été sélectionnés pour leurs effets sur nos deux cibles thérapeutiques à l'issue d'un screening réalisé sur des lignées cellulaires, réduisant ainsi le recours au modèle animal.
Réduction
Un maximum de 20 souris (10 souris sauvages et 10 souris mutées) par peptide nous semble nécessaire pour réaliser une étude statistique fiable. Toutefois, cette étude s'étalant dans le temps dans la mesure où l'on ne peut escompter qu'un maximum de 2 souris mutées par portée, une première analyse statistique sera réalisée après inclusion de 16 animaux (8 souris sauvages et 8 souris mutées). Si les effets observés sont statistiquement significatifs, les souris supplémentaires ne seront pas incluses, réduisant ainsi le nombre de portées nécessaires. Les effets des molécules le rythme sinusal, la conduction de l'influx électrique cardiaque et la repolarisation ventriculaire seront évalués par analyse de variance à une voie pour mesures répétées, complétée par un test de Tukey pour comparaisons multiples. Les effets des molécules sur la survenue des arythmies ventriculaires sera évaluée avec un test de Fisher.
Raffinement
Les souris seront hébergées en cages ventilées enrichies de tunnels pour se camoufler, ou de papier pour fabriquer des nids. L'enregistrement de l'ECG sera réalisé sous anesthésie. Comme mentionné précédemment, la mutation conduit à un phénotype dommageable, puisqu'elle entraine des arythmies ventriculaires plus ou moins sévères chez les souris porteuses qui conduisent, à partir de 4 semaines à une forte mortalité : 50% de mortalité à l'âge de 7 semaines. Les souris qui ont peu ou pas d'arythmies (seulement un allongement de l'intervalle QT) survivent jusqu'à l'âge adulte mais développent une hypertrophie myocardique conduisant à terme à une insuffisance cardiaque. Nous avons donc choisi de ne pas conserver de souris mutées au-delà de l'âge de 4 semaines. Les souris mutées sont obtenues par croisement de souris porteuses de la cassette de recombinaison FRT-neomycin-FRT-delQKP (souris Scn5aWT/Neo-delQKP), qui n'expriment pas la mutation, avec des souris exprimant la flipase, permettant ainsi l'excision de la cassette neomycin et l'expression de la mutation chez 25% des souriceaux résultant de ces croisements. Les souris Scn5aWT/Neo-delQKP et les souris flipase n'ont pas de phénotype dommageable.
Choix des espèces
La souris est actuellement la seule espèce dans laquelle une mutation responsable de SQTL3 a été introduite. C'est un bon modèle de cette pathologie humaine, avec cependant une sévérité plus importante des arythmies par rapport aux patients. L'étude sera réalisée sur des souris de 4 semaines pour deux raisons. La première est scientifique : chez l'humain, les symptômes de la maladie étudiée apparaissent très tôt, avant l'âge adulte, ce qui est d'ailleurs observé sur le modèle de souris. La seconde raison est d'ordre éthique : au-delà de 4 semaines, la mortalité des souris mutées devient très élevée.
Monitoring permanent du volume sanguin cérébral via un dispositif doppler implantable ultrasensible chez le porc
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
12 porcs vont être utilisés dans une procédure unique menée sous anesthésie générale, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque animal subit une trépanation du crâne pour y insérer une sonde Doppler, puis la formation provoquée d'un caillot sur la carotide par application de chlorure de fer et compression manuelle, l'ensemble durant jusqu'à six heures d'anesthésie. Le projet vise à valider un dispositif de mesure continue du flux sanguin cérébral, présenté comme "unique et idéal" pour de futurs patients. Sur le remplacement, le porteur se borne à affirmer que les procédures ont un "caractère de stricte nécessité" et ne peuvent être remplacées, sans autre argument.
Objectifs
Le Doppler ultrasensible (Ultrasensitive Doppler UD) est une technique d'imagerie échographique récente qui permet une évaluation fiable et continue du flux sanguin. Son utilisation transcranienne chez l'adulte est fortement limitée par l'épaisseur du crâne. Alors le UD peut être utilisé comme outil raisonnablement invasive : une sonde placée dans un dispositif implantable lequel est inséré dans le trou de trépan destiné aux autres outils de mesure déjà utilisés en clinique (ImplantableUD, IUD). Ce dispositif implantable sera équipé d'un système de motorisation (motorizedIUD, mIUD). Ainsi différents plans d'imagerie seraient obtenus afin de mesurer le VSC, mais aussi la vitesse du flux sanguin et le calibre des artères, sur de larges zones du cerveau. Il fournirait donc une mesure continue de l'hémodynamique cérébrale et constituerait une technique unique et idéale de monitoring pour ces patients. Les soins donnés pourraient être parfaitement adaptés à l'état du cerveau ce qui en retour diminuerait le risque de décès et d'handicaps neurologiques sévères.
Bénéfices attendus
Le Doppler ultrasensible (Ultrasensitive Doppler UD) est une technique d'imagerie échographique récente qui permet une évaluation fiable et continue du flux sanguin. Son utilisation transcranienne chez l'adulte est fortement limitée par l'épaisseur du crâne. Alors le UD peut être utilisé comme outil raisonnablement invasive : une sonde placée dans un dispositif implantable lequel est inséré dans le trou de trépan destiné aux autres outils de mesure déjà utilisés en clinique (ImplantableUD, IUD). Ce dispositif implantable sera équipé d'un système de motorisation (motorizedIUD, mIUD). Ainsi différents plans d'imagerie seraient obtenus afin de mesurer le VSC, mais aussi la vitesse du flux sanguin et le calibre des artères, sur de larges zones du cerveau. Il fournirait donc une mesure continue de l'hémodynamique cérébrale et constituerait une technique unique et idéale de monitoring pour ces patients. Les soins donnés pourraient être parfaitement adaptés à l'état du cerveau ce qui en retour diminuerait le risque de décès et d'handicaps neurologiques sévères.
Procédures
Temps 1 : sédation au box, installation en salle de chirurgie, anesthésie générale et intubation avec anestésie locale et analgésie. Perfusion IV, maintient température Temps 2 : chirurgie : incision scalp 5 cm, 1 trou de trepan (diamètre 14mm), positionnement de la sonde tenue sur un bras mécanique Temps 3 : TDM de perf avec mesure concomitante du VSC par le doppler implantable Temps 4 : 10 minutes d’Hyperventilation. Gaz du sang. TDM de perf avec mesure concomitante du VSC par le doppler implantable. Temps 5 : Retour a une ventilation normale. GDS. Injection IV de Diamox. TDM de perf avec mesure concomitante du VSC par le doppler implantable. Temps 6 : incision cervicale. Application de FeCl pour formation de thrombus et faire emboliser en faisant un stress mécanique sur l'artère avec les doigts sur la carotide avec mesure concomitante du VSC par le doppler implantable. Puis TDM de perf avec mesure concomitante du VSC par le doppler implantable. Temps 7 : mise à mort avec mesure concomitante du VSC par le doppler implantable.
Impact sur les animaux
Une unique procédure sans réveil sera suivie sous anesthésie générale. L’analgésie visant à éviter la gêne occasionnée est assurée par l’injection systématique d’une analgésie adéquate au type de procédure.
Devenir
Dans un souci de raffinement, le long de l’expérience, les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux. A l'issu de la procédure chirurgicale les animaux ne pourraient récupérer leur état physiologique respectant leur bien-être, la mise à mort est donc nécessaire.
Remplacement
Afin de respecter la règle des trois R, les procédures expérimentales prévues dans le cadre de cette recherche ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum, selon les calculs d’effectifs effectués en s’appuyant sur des études précédentes, et des tests statistiques appropriés seront utilisés afin de mettre en évidence les résultats attendus. Nous estimons maximum 12 porcs nécessaires à l’étude. Sur la base de la littérature, le nombre d’animaux à utiliser a été établi à 12 animaux au total que nous utiliserons en deux campagnes de manipes. Cependant, dans un souci de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, des analyses intermédiaires seront réalisées après l’exploration des 2 premiers animaux, de façon à arrêter l’étude prématurément si les résultats significatifs sont avérés avec un effectif plus faible : il est envisagé d’arrêter les expériences avant, si possible avec 4 animaux ou 6 animaux.
Raffinement
Dans un souci de raffinement, le long de l’expérience, les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux. La procédure menée dans ce projet se réalisera sous anesthésie générale avec ventilation assistée et contrôle des paramètres physiologiques. Elle inclut une phase de préparation et chirurgie puis une phase d’imagerie. Nous estimons une durée de 6h d’anesthésie maximum pour l’intégralité de la procédure.
Choix des espèces
Le porc est un modèle couramment utilisé pour l’implantation de prothèses. Son poids et caractéristiques physiologiques sont similaires à l’homme. Les modèles de pathologies cérébrales sont développés chez les rongeurs couramment mais l’anatomie et la physiologie vasculaire du porc est plus proche de celle de l’Homme. En effet, les résultats d’une étude chez le porc apportent des informations plus probantes pour une utilisation ultérieure en clinique chez l’Homme, notamment pour les pathologies cérébrovasculaires. Pour ces raisons, nous avons choisi le porc comme modèle d’étude. Sur la base de la littérature, le nombre d’animaux à utiliser a été établi à 12 animaux au total pour les deux groupes. Cependant, dans un souci de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, des analyses intermédiaires seront réalisées après l’exploration des 2 premiers animaux, de façon à arrêter l’étude prématurément si les résultats significatifs sont avérés avec un effectif plus faible : il est envisagé d’arrêter les expériences avant, si possible avec 4 animaux par groupe.
Effet de la lumière sur le rythme circadien chez un vertébré diurne, le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
2 040 poissons zèbres, utilisés au stade larvaire, vont être tués à l'issue, dans des procédures classées de souffrance légère. Les larves transgéniques sont traitées au métronidazole pour détruire des populations de neurones photorécepteurs, puis leur activité locomotrice est filmée avant mise à mort et génotypage, afin d'étudier l'effet de la lumière sur le rythme circadien. Le porteur note que la mesure d'activité renseigne aussi sur l'anxiété des larves, une larve anxieuse restant davantage sur les bords du puits. Il justifie le choix du poisson zèbre par son caractère de vertébré diurne, jugé "plus pertinent" que les rongeurs pour cette question.
Objectifs
Notre équipe s’intéresse à comprendre quelles sont les structures controlant l’entrainement du rythme circadien par la lumière en utilisant le poisson zèbre Danio Rerio comme organisme modèle. La recherche de notre équipe focalise sur différentes structures d’intérêt en particulier la glande pinéale et l’hypothalamus et sur une famille de gènes codant pour des photopigments de la classe des mélanopsines. Ce projet consiste en la réalisation de mesures d’activité locomotrice sur larves sauvages ou dans lesquelles l’activité neuronale de photorécepteurs spécifiques a été abolie soit en éliminant ces populations neuronales, soit en invalidant leur activité synaptique. Ces larves sont âgées au maximum de 9 jours.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comprendre comment la lumière agit sur le rythme circadien chez un vertébré diurne.
Procédures
Les larves transgéniques sont traitées au métronidazole durant deux jours (jour 2 et 3), changées de milieu (eau) puis leur activité locomotrice est filmée en plaque 96 puits. Elles sont ensuite mises à mort et génotypées.
Impact sur les animaux
Le traitement au métronidazole et la mesure d'activité locomotrice n'induisent pas d'effet indésirable connu alors que ces techniques sont largement utilisées. Pour ce qui concerne les larves génétiquement modifiées (transgènes donnant de l'expression de la nitroreductase : nfsB-mCherry), un effet n'est attendu qu'une fois le metronidazole ajouté au milieu. De plus, après traitement au métronidazole, l'expression des transgènes ne devrait induire ni malformation ni létalité mais pourrait modifier le comportement des larves (activité, humeur...). De manière intéressante, la mesure d'activité locomotrice permet directement d'évaluer le niveau d'anxiété de l'animal. Une larve anxieuse passera en effet plus de temps sur les bords du puit qu'une larve normale (thigmotaxie). Le projet inclus une analyse pilote de ce paramètre après le traitement au métronidazole, ce qui nous permettra de décider d'une éventuelle réduction du nombre d'animaux utilisés s'il s'avérait qu'un des transgènes induisait une anxiété voire un changement de stratégie (voir paragraphe raffinement).
Devenir
Les larves sont génotypées après les expériences. Certains adultes transgéniques peuvent être mis à mort selon la procédure réglementaire effectuée par une personne habilitée à effectuer cette tache.
Remplacement
Notre projet utilise des larves plutôt que des adultes.Le produit du gène nfsB-mCherry nécessite l’addition du métronidazole pour être actif. Ainsi les adultes porteurs ne seront pas traités et ne subiront donc pas d’effets.
Réduction
L'équipe s'intéresse uniquement au comportement des larves. Par conséquent, les poissons adultes gardés au laboratoire sont consacrés uniquement à la reproduction et ne sont soumis à aucune expérimentation. Le nombre d'individus hébergés correspond au nombre minimal nécessaire au maintien des lignées et à la production d’oeufs nécessaires à notre expérimentation. Nous prenons soin de faire évoluer nos protocoles expérimentaux afin de réduire le nombre d’individus hébergés dans l’animalerie. Notamment, le fait d’analyser 96 larves simultanément et durant quatre jours permet de réduire le nombre de fondateurs nécessaires pour nos analyses. Les nombres de larves utilisées correspondent aux standards utilisés dans des études similaires. Nous utilisons des transgènes permettant une occurrence plus forte de larves tests que des mutations récessives (occurrence de ½ plutôt que ¼). De plus, si au cours de l’étude nous nous apercevons que nous pouvons obtenir des résultats statistiquement significatifs avec moins d’animaux, nous n’utiliserons que le nombre minimal d’animaux statistiquement nécessaire.
Raffinement
Nous avons prévu d’utiliser le gène nfsB-mCherry pour induire la mort de populations neuronales spécifiques. Si nous observons des effets génants (stress, anxiété) chez les larves modèles au cours des expériences pilotes mesurant la thigmotaxie, nous envisagerons d’utiliser le gène codant pour la toxine botulique qui empêchera l’activité synaptique des neurones cibles. Afin d’éviter que les adultes porteurs soient affectés, nous utiliserons un système de deux transgènes, l’un permettant l’expression de l’activateur transcriptionnel Gal4 et l’autre permettant l’expression de la toxine botulique sous un promoteur UAS. Ce système n'a pas été choisi en première instance car il nécessite plus d'animaux.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un vertébré diurne donc plus pertinent à étudier que les rongeurs pour les questions de rythme circadien. C'est un modèle reconnu pour l'étude du comportement animal. Les larves sont traitées à jour 2 et 3 avec le métronidazole de manière à pouvoir laisser du temps pour l'entrainement circadien. Les mesures d'activité locomotrice sont effectuées à partir du jour 6 pour trois ou quatre cycles selon les expériences. Les larves de zebrafish ont une activité locomotrice rythmique à partir du cinquième jour. L'étude à partir de jour 6 permet d'avoir un jour complet pour que les larves s'habituent à la plaque.
Signalisation du Récepteur mGlu2 dans le Cerveau de Souris. Altérations dans des Modèles Précliniques de Schizophrénie et Interférences entre Antipsychotiques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections quotidiennes de PCP pendant dix jours pour reproduire un modèle de schizophrénie, puis des injections de petites molécules et des tests comportementaux légers, avant le prélèvement du cerveau. Le porteur indique que le PCP diminue l'appétit et les interactions sociales, cette baisse d'interaction étant précisément le paramètre mesuré. Il affirme que le recours à la souris est "guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques" et que l'expérimentation humaine "ne peut atteindre ce niveau de résolution".
Objectifs
La schizophrénie touche 1% de la population. Les traitements actuels en contrôlent mal les symptômes et ont de lourds effets secondaires. Des activateurs du récepteur mGlu2 du glutamate sont actuellement en étude clinique mais les premières molécules ont échoué du fait d’une interférence avec les antipsychotiques atypiques actuels. Si les molécules mGlu2 restent de bons candidats pour un traitement de première intention, cela amène d’importantes questions. Ce projet cherche à 1) décrypter la signalisation du récepteur mGlu2 dans le cerveau avec l’espoir de trouver de nouveaux régulateurs / effecteurs, 2) caractériser l’altération de ces nouveaux régulateurs et effecteurs dans des modèles précliniques établis de la schizophrénie, 3) déterminer l’impact des antipsychotiques actuels sur ces nouveaux effecteurs et régulateurs pour comprendre l’interférence entre les deux classes d’antipsychotiques 4) déterminer l’importance des nouveaux régulateurs et effecteurs dans la capacité du récepteur mGlu2 à reverser des déficits comportementaux de modèles précliniques de schizophrénie.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait apporter une meilleure compréhension du mode d’action d’une nouvelle génération prometteuse d’antipsychotiques et de son interférence avec les antipsychotiques atypiques actuellement utilisés.
Procédures
Des animaux vigiles recevront des injections sous cutanées de PCP (1 injection par jour pendant 10 jours), des injections intrapéritonéales de petites molécules (1 injection qui met 30 min à agir) et soit seront sacrifiés pour prélévements biochimiques/immunofluorescence soit passeront des tests comportementaux de classe légère (2 jours pour l'ensemble des tests).
Impact sur les animaux
Les lignées KO 5-HT2A , KO mGlu2 et le modèle chimique PCP ont des phénotypes non dommageables. D'anciennes publications sur le modèle PCP décrivent une diminution d'appétit et une diminution d'interaction sociale. La diminution d'interaction sociale est justement l'un des paramètres que l'on cherche à mesurer dans le modèle PCP et qui est réversé par les antipsychotiques glutamatergiques. Contrairement aux publications initiales, les dernières publications sur le modèle PCP subchronique (doi.org/10.1016/j.pbb.2018.09.007) et le suivi de poids lors de notre dernier projet (1316-7251_iExplore-RAM-O1-F-003) ne montrent pas de variation de poids par rapport aux souris Véhicule. Dans nos mains le modèle PCP n'a jamais atteint les points limites que nous continuerons de surveiller. Les manipulations envisagées ne présentent pas de douleur d'un niveau supérieure à une piqure d'aiguille et nous ne devrions pas avoir besoin de recourir à des antalgiques/analgésiques. Le PCP injecté aux animaux a lui même été initialement développé comme un analgésique. Comme l'injection répétée de PCP induit une diminution de l'interaction sociale et de l'appétit nous la classons comme modérée.
Devenir
procédure 1: tous les animaux de cette procédure seront mis à mort pour le prélèvement du cerveau nécessaire aux analyses biochimiques et protéomiques. procédure 2: tous les animaux de cette procédure seront mis à mort pour le prélèvement du cerveau nécessaire aux analyses par immunofluorescence. procédure 3: tous les animaux de cette procédure seront mis à mort pour prélèvements biochimiques pour réutilisation possible dans d'autres projets.
Remplacement
Comme il est impossible de rendre compte de l’hétérogénéité et de la complexité du cerveau et de la circuiterie neuronale dans des cultures cellulaires, nous aurons recours à des modèles animaux pour étudier in vivo la réponse biochimique aux antipsychotiques. Ces analyses biochimiques impliquant le prélèvement du cerveau, elles sont impossibles directement chez l’homme. Les réponses comportementales aux antipsychotiques ne peuvent être mesurées que sur l’organisme conscient, excluant un travail sur cultures cellulaires. Le modèle souris est particulièrement adapté au projet car il est un standard dans la mesure de l’action des antipsychotiques toutes générations confondues avec des tests comportementaux bien établis pour cette espèce, ce qui limitera les mises au point et donc le nombre d’animaux utilisés. De nombreux modèles génétiques et de nombreux outils moléculaires sont disponibles pour la souris et permettront de visualiser ou de cibler spécifiquement des mécanismes cellulaires ou des protéines. L’expérimentation humaine ne peut atteindre ce niveau de résolution. Enfin, l'état actuel des connaissances ne permet pas une modélisation informatique des phénomènes cérébraux impliqués dans l’action des antipsychotiques. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques.
Réduction
Nos principales grilles de lecture sont la protéomique, l'immunofluorescence et les tests comportementaux. La protéomique permet de caractériser et quantifier en relatif des milliers de protéines en une seule expérience. L'immunofluorescence permet de réaliser une multitude de combinaisons de marqueurs à partir d'un animal. Le modèle PCP décrit dans la saisine est un modèle d’étude privilégié du fait de sa robustesse dans l’établissement du phénotype « schizophrénie » (100 % des individus) et de la réponse aux antipsychotiques. Nos méthodes statistiques concernant des données de protéomique (significance B), de biochimie et d’immunofluorescence (Anova) ont déjà été éprouvées et publiées à maintes reprises par nous et/ou des collègues du domaine.
Raffinement
Les manipulations envisagées ne présentent pas de douleur d'un niveau supérieur à une piqure d'aiguille et nous ne devrions pas avoir besoin de recourir à des antalgiques/analgésiques. Le PCP injecté aux animaux a lui même été initialement développé comme un analgésique. Avant les premières injections les souris seront habituées à la manipulation quotidiennement pendant 1 semaine pour effacer les stress de transport et de manipulation. Les lignées choisies et le modèle chimique PCP ont un phénotype non dommageable. La répétition des injections sous cutanées journalières au même point pouvant entrainer une inflammation et une gêne pour l'animal nous déplacerons chaque jour le point d'injection sous cutanée. Pour les souris prétraitées en IP journalières, les injections seront décalées chaque jour de bas en haut du ventre de l'animal coté droit pour ne pas risquer de percer la vessie ou le caecum. Les animaux pour les expériences de comportement (procédure 3) passeront l'ensemble des tests comportementaux du moins stressant au plus stressant. Les souris sont hébergées en groupes de 4 à l'intérieur desquels elles ne reçoivent pas les mêmes traitements, ce qui élimine le stress d'isolement et la propagation de la douleur sociale. Les cages présentent un enrichissement intermédiaire (petite maison, alvéole de boite à oeufs et serpentin en carton) qui stimule l'activité et limite l'agressivité. la fréquence d'observation est assurée, au minimum une fois par jour, par les animaliers de la zone d'expérimentation animale et par le chercheur (qui se rend chaque jour dans la zone d'expérimentation animale pour ce traitement et/ou pour d'autres expériences). Notre projet pour 5 ans impliquant une équipe de 3 personnes nécessitera 1120 souris issues de plusieurs lignées spécifiques déjà élevées dans nos animaleries. Les procédures décrites dans ce document ne nécessiteront aucune mise au point et sont standards dans l’étude de la réponse aux antipsychotiques.
Choix des espèces
Comme il est impossible de rendre compte de l’hétérogénéité et de la complexité du cerveau et de la circuiterie neuronale dans des cultures cellulaires, nous aurons recours à des modèles animaux pour étudier in vivo la réponse biochimique aux antipsychotiques. Ces analyses biochimiques impliquant le prélèvement du cerveau, elles sont impossibles directement chez l’Homme. Les réponses comportementales aux antipsychotiques ne peuvent être mesurées que sur l’organisme conscient, excluant un travail sur cultures cellulaires. Le modèle souris est particulièrement adapté au projet car il est un standard dans la mesure de l’action des antipsychotiques toutes générations confondues avec des tests comportementaux bien établis pour cette espèce, ce qui limitera les mises au point et donc le nombre d’animaux utilisés. De nombreux modèles génétiques et de nombreux outils moléculaires sont disponibles pour la souris et permettront de visualiser ou de cibler spécifiquement des mécanismes cellulaires ou des protéines. L’expérimentation humaine ne peut atteindre ce niveau de résolution. Enfin, l'état actuel des connaissances ne permet pas une modélisation informatique des phénomènes cérébraux impliqués dans l’action des antipsychotiques. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques.