Recherche fondamentale

5 vaches laitières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis éventuellement réintégrées au troupeau non expérimental. Hébergées en stabulation entravée pendant quinze semaines, elles subissent des prélèvements sanguins et des prélèvements répétés de jus de rumen par une canule, avec collectes totales d'urine et de fèces sur cinq jours par période. Le porteur indique que certains régimes peuvent réduire l'ingestion et la production laitière. Il affirme qu'aucune autre approche ne peut remplacer la vache pour étudier les flux d'azote, notamment au sein du rumen.

Objectifs

Dans l’objectif d’atteindre la multi-performance, les élevages laitiers doivent mieux valoriser les ressources alimentaires, notamment celles non consommables par l’homme, comme les fourrages, distribués frais ou conservés. Les conséquences de ces associations de fourrages conservés et pâturés (ou distribués en affouragement vert) sur les performances animales, la possibilité de réduire les intrants, l’efficience d’utilisation de l’azote et la composition des effluents doivent être approfondies. Cet essai aura pour but de suivre les variations de flux d’azote à l’échelle de la vache laitière lorsque celle-ci est nourrie avec des rations associant herbe fraiche et ensilage de maïs selon des proportions variables. Il sera réalisé à l'auge afin de pouvoir mesurer précisément les flux d'azote (ingéré et excrété) à l'échelle individuelle et de la journée. Cinq traitements expérimentaux seront comparés : un traitement à base d’une ration mélangée d’ensilage de maïs et de tourteau de soja en proportion 85/15, 3 traitements permettant l'ajout progressif d’herbe verte à cette même ration mélangée maïs-soja, à hauteur de 25, 50 et 75% d’herbe verte, et 1 traitement à base d’herbe verte seule.

Bénéfices attendus

L’influence des traitements sur la composition des effluents (urine seule, fèces seuls, lisiers reconstitués) sera évaluée afin d’estimer les pertes d’azote vers l’environnement, potentiel source de pollution, et le potentiel d’émission de NH3. Le suivi en cinétique des paramètres fermentaires dans le rumen (ammoniac, acides gras volatiles, pH), et de la caractérisation de l'activité fermentaire du rumen (dégradation d'un aliment témoin permettront de caractériser les conséquences de ces stratégies d'alimentation sur la dynamique des fermentations, la digestibilité de l'azote et la valeur protéique réelle des rations étudiées.

Procédures

Cet essai concerne des animaux vigiles qui seront hébergés en stabulation entravée, durant 15 semaines (3 semaines de mesures de référence, puis 4 périodes de 3 semaines). Les vaches seront nourries à volonté et traitent 2 fois par jour. Des échantillons de lait seront prélevés à la traite (10 traites par semaine). Lors des mesures de bilan ingestion-excrétion d’azote, des prélèvements sanguins seront réalisés à la veine caudale, à raison de 4 par périodes (soit 16 au total), chaque prélèvement de sang durant 5 minutes maximum (nettoyage de la peau et prélèvement de sang). Des collectes totales d’urine et de fèces seront aussi réalisés pendant 5 jours consécutifs par période, en continu. Des mesures de l’activité fermentaire du rumen seront aussi réalisées, avec les prélèvements en cinétique de jus de rumen par la canule à raison de 10 prélèvements par période, de 5 minutes maximum chacun répartis sur 1 journée (soit 40 prélèvements au total), ainsi que des mesures de dégradabilité in sacco avec incubation de coques de soja dans le rumen sur une période de 24h, 1 fois par période (soit 4 fois au total, 5 minutes de pose et de retrait des sachets dans le rumen).

Impact sur les animaux

Il est possible que certains des régimes étudiés entrainent une baisse des quantités d'aliments ingérées et donc une baisse de production laitière. Quantifier les effets de ces régimes sur l’ingestion et la production des animaux est un des objectifs de l’essai. Toutefois ces cinq traitements sont des rations pratiquées en élevage qui ne devraient pas entrainer de conséquences néfastes sur la santé des animaux.

Devenir

Suite à l’estimation de l’état général des animaux en fin d’essai, la décision pourra être prise par le responsable de l'installation de réintégrer ces vaches dans le troupeau non expérimental. Si une alerte au niveau de l’état général d’un animal le justifiait, la cellule bien-être (SBEA) et le vétérinaire seraient consultés.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les animaux par une autre approche pour cet essai car le but est d’étudier les flux d'azote à l'échelle de la vache, incluant des mécanismes de recyclage/mobilisation notamment au sein du rumen et par la salive.

Réduction

Le schéma expérimental en carré latin ainsi que l'analyse statistique des données permettront de répondre aux objectifs scientifiques tout en limitant le nombre de vaches à 5 dans ce projet. L’utilisation d’un carré latin permet que chaque animal soit son propre témoin, pour ainsi réduire le plus possible le nombre de vaches tout en gardant une puissance statistique suffisante pour montrer les effets des traitements expérimentaux. L'utilisation d'analyses de variance permettra de tester l'influence du facteur "proportions d’herbe verte" sur les variables de production (ingestion, production laitière...) et de flux d'azote (azote ingéré, azote excrété dans le lait, l'urine, les fèces) en corrigeant des effets "vache" et "période".

Raffinement

Les animaux seront élevés et suivis conformément aux règles d’élevage et de bonnes pratiques en place dans l’élevage. Un suivi régulier du comportement des animaux sera mis en place pour détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance ou de douleur. Les animaliers chargés du suivi ont tous une solide formation en élevage laitier et sont sensibilisés à la douleur animale. Le suivi régulier par le vétérinaire sanitaire assure également la bonne santé des animaux. Des points limites adaptés ont été définis afin d’éviter au maximum toute forme de souffrance des animaux. En cas de problèmes détectés, les animaux seront isolés et soignés selon les prescriptions du vétérinaire. Les régimes testés, classiques, n'induiront a priori aucune douleur ou souffrance.

Choix des espèces

Les vaches laitières utilisées seront de race Prim’Holstein. Pour diffuser les résultats, la race Prim’Holstein, qui est la race la plus répandue dans le monde en bovin lait, est la race appropriée.

200 truites sauvages vont être capturées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis relâchées après intervention. Le porteur décrit une capture par pêche électrique suivie de l'insertion chirurgicale d'une marque dans la cavité abdominale sous anesthésie, une seule fois par animal. Il indique que tous les poissons sont remis à l'eau après contrôle sanitaire et récupération complète de l'anesthésie. L'objectif affiché est de suivre les déplacements de truites porteuses de larves de moule perlière entre un bief et un cours d'eau.

Objectifs

Le tronçon de cours d’eau et son bief, objet de l’étude, abrite la plus importante population de moules perlières du bassin versant. Les différentes études conduites sur le site montrent que la population de moules perlières est vieillissante, pas ou très peu renouvelée, et pourrait disparaitre à moyen terme (une vingtaine d’années). Les observations régulières de glochidies (stade larvaire enkysté des larves de moules) sur les branchies de truite confirment cependant la reproduction des moules sur le bief mais celle-ci ne présume pas de l'accomplissement du cycle biologique de l'espèce au-delà de ce stade, notamment de la réussite du développement benthique des jeunes moules. En effet, les très rares observations de juvéniles pourraient indiquer la très faible survie de ces individus, pour des raisons qui restent encore à préciser (colmatage des substrats…). Le cours d’eau à proximité du bief pourrait présenter des habitats de meilleur qualité pour les moules que ceux du bief, du fait notamment du moindre colmatage des fonds. Les études piscicoles ont montré par ailleurs une densité de truites relativement faible dans le bief si on la compare à celle du cours d’eau principal. Sur ces constats, la question se pose de l’interaction de la population de moule du bief entre les deux milieux : que deviennent les glochidies produites par les moules du bief une fois fixées sur les truites ; parviennent-elles, au moins pour une partie, à rejoindre le cours d’eau et disséminer ainsi l’espèce depuis le bief ? Répondre à ces interrogations et caractériser le rôle éventuel du bief comme « réservoir biologique », pour la population de moule perlière, nécessite de comprendre le déplacement des truites porteuses des glochidies entre les deux milieux aquatiques.

Bénéfices attendus

Comprendre et mesurer les déplacements des truites entre le bief et le cours d'eau qui l’alimente et caractériser le rôle du bief comme « réservoir biologique » pour la population de moule perlière, c’est-à-dire comme milieu (« hot spot » de biodiversité) à partir duquel l’espèce pourrait se disséminer dans la rivière et participer ainsi à accroitre sa population.

Procédures

Capture de poissons sauvages par pêche électrique puis insertion chirurgicale, sous anesthésie générale, de marques semi actives, de type Pit-Tag, dans la cavité péritonéale (temps d'intervention 10 minutes maximum). Une seule opération de ce type est effectuée par animal.

Impact sur les animaux

Insertion de marques PIT-tags dans la cavité péritonéale des truites, suite à anesthésie générale et incision (temps d'intervention 10 minutes maximum). Une seule opération de ce type est effectuée par animal, le déplacement de ce dernier, ou son bien-être n'est pas modifié par la présence de la marque. Toutes les précautions sont prises lors de l'intervention chirurgicale pour limiter le risque d'infection. En ce qui concerne les opérations d’échantillonnage par pêche électrique, ces dernières sont mises en œuvre par du personnel formé, elles sont encadrées et réglementées par arrêté préfectoral. Toutes les dispositions sont prises pour assurer la sécurité des personnes (port des EPI, utilisation du matériel certifié) et limiter au maximum le risque de blessures ou de dommages vertébraux sur les poissons (réglage des appareils en fonction de la conductivité et de la température de l’eau). Le ratio taille (poids) de la marque / taille (poids) de l'individu sera évidemment respecté en utilisant des transpondeurs de type « Pit-tag » de tailles 12, 13 et 23 mm adaptées à la taille et au poids des poissons marqués (le poids du Pit-tag ne devant pas dépasser 2% du poids de l’individu). Dans notre cas la taille minimum des poissons marqués sera de 100 mm et la taille maximale de 250 mm. Les poids respectifs des individus iront de 30 g à 350 g.

Devenir

Le but de cette étude étant de connaitre les déplacements des truites porteuses de glochidies de moule dans le temps, tous les animaux capturés temporairement pour les besoins de marquage seront relâchés immédiatement après l’intervention.

Remplacement

La capture et le marquage in situ d’un certain nombre d’individus de truite sont rendus nécessaires pour les besoins de l'étude. S’agissant d’une expérimentation en milieu naturel sur des espèces sauvages (truite et moule perlière), il n’est pas envisageable de réaliser cette étude in vitro ou en conditions contrôlées avec des poissons d’élevage qui ne reproduiraient pas le comportement des poissons sauvages.

Réduction

La taille de l'échantillon doit être suffisante pour dégager des résultats fiables et statistiquement interprétables. Le test statistique paramétrique dit U de Mann-Whitney sera utilisé afin de vérifier l’hypothèse de sélectivité de franchissement des obstacles en fonction de la taille des individus, ainsi que des tests non paramétriques (AFC ou ACP)). Les opérations de marquages prévoient un objectif d’une centaine de truites par an pendant 2 ans, soit 200 truites sur la durée totale de l’étude. Cette taille de l’échantillon (tailles des populations de truite estimées à environ 300 individus dans le bief et plusieurs milliers dans le cours d'eau à proximité du bief) sera suffisante pour répondre nos interrogations quant au déplacement de l’espèce porteuse de glochidies de moule entre le bief et le cours d’eau.

Raffinement

Toutes les manipulations se feront sous anesthésie par du personnel qualifié sur le site d’étude. L'ensemble des poissons ne sera remis à l'eau qu’après contrôle de l’état sanitaire (absence de lésions) et récupération totale de l’anesthésie. Les points limites (comportement du poisson lors de l’anesthésie, pigmentation anormale liée au choc électrique) sont suffisamment prédictifs et précoces pour limiter la souffrance de l’animal et exclure des individus avant intervention chirurgicale le cas échéant. Suite aux recommandations du vétérinaire-référent, l’anesthésie sera réalisée par balnéation dans une solution de benzocaïne Benzoak®avec une posologie de 25mg/L. Compte tenu du caractère nouveau de l’emploi de cette molécule dans nos procédures, si nous constatons sur les 10 premiers poissons que la mise en place de ce nouveau protocole d’anesthésie est difficilement maitrisable, nous reviendrons à un protocole initial, utilisé jusqu’alors et maitrisé, via la balnéation dans une solution d’iso eugénol Aqui-S à 8mg/L sur le reste de notre procédure.

Choix des espèces

La truite commune, (Salmo trutta fario) est l'espèce cible de l'étude à travers son rôle de poisson hôte pour la moule perlière (Margaritifera margaritifera). Ce sont bien les truites qui seront capturées et marquées pour être suivies dans leurs déplacement entre les milieux aquatiques (bief et cours d’eau). Les moules ne feront pas l’objet de manipulation et seront simplement comptées à leur stade larvaire fixé sur les branchies de la truite. Nos suivis antérieurs sur le site d’étude ont montré que les stades juvéniles immatures de truite étaient en majorité parasités par les larves de moule (54% de truitelles d’un an et 38% de truites sub-adultes), ces cohortes étant numériquement dominantes dans le milieu aquatique au moment de la reproduction estivale des moules. Ce sont donc ces stades de développement des truites qui seront majoritairement marqués.

Les souris reçoivent sous la peau une greffe de cellules tumorales, puis une ou deux séances d'irradiation à faible dose sur la tumeur et quatre injections dans l'abdomen, sur neuf jours, d'une immunothérapie anti-PD-L1 ou d'anticorps témoins. 800 souris immunocompétentes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tumeurs. Le projet cherche le meilleur schéma d'irradiation à associer à l'immunothérapie, une association qui "pourrait à terme bénéficier aux patients réfractaires à l'immunothérapie" selon le porteur. Parmi les effets indésirables, il ne cite que ceux des injections et de l'irradiation, sans un mot sur la croissance des tumeurs, et annonce un "volume tumoral limite" sans en donner la valeur.

Objectifs

Il y a deux objetifs. 1) Evaluer l'efficacité anti-tumorale de la radiothérapie délivrée à faible dose en combinaison avec une immunothérapie en utilisant un modèle préclinique de lignée tumorale murine greffée chez des souris immunocompétentes. 2) Etudier les mécanismes par lesquels la radiothérapie à faible-dose est capable d'induire une réponse immunitaire anti-tumorale potentialisée par l'immunothérapie et ainsi expliquer l'effet synergique du traitement associant radiothérapie à faible dose et immunothérapie.

Bénéfices attendus

Malgré une amélioration sans précédent du pronostic de nombreux cancers grace à l'immunothérapie, de trop nombreux patients présentent une réponse insuffisante à ces nouvelles thérapies. L'optimisation et la compréhension des traitements combinés associant une radiothérapie à faible dose et une immunothérapie pourrait à terme bénéficier aux patients réfractaires à l'immunothérapie et présentant un cancer à un stade avancé inaccessible à une radiothérapie standard qui serait trop toxique pour les organes et tissus sains adjacents. Dans ce cadre, la mise au point du meilleur schéma de radiothérapie faible dose à utiliser en combinaison à l'immunothérapie, ainsi que la compréhension des mécanismes à l'origine de l'efficacité d'une telle association doivent être recherchés sur modèle animal préclinique avant une transposition au patient.

Procédures

Irradiation sur la tumeur uniquement : 1 à 2 séances d'environ 1 minute chacune. Injections sous-cutanées de cellules tumorales: 1 seule injection, 1 minute. Injections intra-péritonéales d'immunothérapie ou d'IgG contrôle : 1 injection d'une minute tous les 3 jours pendant un total de 9 jours, soit 4 injections au total.

Impact sur les animaux

Ils sont liées aux injections en intrapéritonéales ou sous-cutanées sous anesthésie locale et aux séances d'irradiations localisées. Les séances d'irradiation seront effectuées sur la tumeur uniquement grace à des caches adaptés, le risque de dommages aux tissus et organes sains adjacents est donc très limité. Aucun effet indésirables de ces irradiations localisées n'est donc à prévoir.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir procéder à des analyses de laboratoire sur les tumeurs prélevées.

Remplacement

Le cancer est aujourd’hui la 1ère cause de décès chez l’homme et la 2ème chez la femme en France. Malgré la révolution thérapeutique que constitue l’immunothérapie, seul un nombre limité de patients présente une réponse tumorale significative aux inhibiteurs de checkpoints immunitaires utilisés seuls. Un nombre croissant de données suggère que de faibles doses de radiothérapie délivrées sur la tumeur pourraient augmenter la réponse anti-tumorale induite par l’immunothérapie, le tout avec un excellent profil de tolérance. La compréhension des mécanismes soutenant cette stratégie d’association est source d’espoirs pour de nombreux patients atteints de cancers métastatiques présentant une réponse insuffisante à l’immunothérapie et un pronostic réservé. Le recours à un modèle animal est nécessaire car les interactions entre radiothérapie, immunothérapie, tumeur et système immunitaire de l'hôte font appel à des processus cellulaires et moléculaires complexes impossibles à reproduire de façon fiable sur des modèles alternatifs. De plus, l’étude de l’efficacité de l’association entre radiothérapie à faible dose et immunothérapie sur une tumeur constituée ne peut se vérifier que sur un modèle in-vivo.

Réduction

Nous allons tester plusieurs schémas d’irradiation à faible dose délivrés en 1 ou 2 séances, associés ou non à une immunothérapie anti PD-L1. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux nécessaire, nous avons réalisé une analyse statistique à priori à l’aide du logiciel GPower, version 3.1. Afin de calculer le nombre d’animaux nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives, nous avons choisi le test ANOVA avec les paramètres suivants : effect size f = 0.25 ; puissance = 0.9 ; risque d’erreur α = 0.05. En considérant un total de 32 lots, nous avons besoin de 25 souris par lot, soit 800 souris au total. 1) Efficacité de la radiothérapie faible-dose délivrée en 1 fraction associée à l’immunothérapie anti PD-L1 : 16 lots, 25 souris/lot soit 400 souris. Dans le détail : 1 lot non-irradié avec IgG contrôle (groupe contrôle), 1 lot non-irradié avec immunothérapie anti PD-L1 (groupe anti PD-L1 seul), 7 lots avec IgG contrôle + des doses croissantes d’irradiation délivrées en une séance (monofractionnée), 7 lots avec anti PD-L1 + des doses croissantes d’irradiation délivrées en une séance (monofractionnée). 2) Efficacité de la radiothérapie faible-dose délivrée en 2 fractions associée à l’immunothérapie anti PD-L1 : 16 lots, 25 souris/lot soit 400 souris au total. Dans le détail : 1 lot non-irradié avec IgG contrôle (groupe contrôle), 1 lot non-irradié avec immunothérapie anti PD-L1 (groupe anti PD-L1 seul), 7 lots avec IgG contrôle + des doses croissantes d’irradiation délivrées en 2 séances (bifractionnée), 7 lots avec anti PD-L1 + des doses croissantes d’irradiation délivrées en 2 séances (bifractionnée). Dans le but d’utiliser le moins d’animaux possible, une analyse statistique a été effectuée a priori. Celle-ci a estimé le nombre de souris nécessaire à 800.

Raffinement

Des stratégies d’expérimentation et d’observation visant à réduire au minimum la souffrance des animaux seront mises en oeuvre. Dans ce cadre, les administrations d’immunothérapies s’effectueront sous anesthésie locale pour réduire le risque de stress et de douleur. Par ailleurs, les souris seront hébergées en groupe, avec nourriture et eau ad libitum, ainsi qu’un environnement enrichi en coton et nids en carton pour respecter leur bien-être. Une surveillance du poids et du volume tumoral sera effectuée régulièrement. Le respect des points limites et d’un volume tumoral limite seront strictement observés.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie, utilisée dans la quasi-totalité des études dans ce domaine. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues, ce qui facilite le transfert en clinique des résultats acquis lors des expérimentations précliniques dans cette espèce. Les animaux seront utilisés entre l’âge de 8 et 10 semaines bien après sevrage, âge à partir duquel les souris peuvent supporter les rayonnements ionisants.

Pour étudier comment une séparation précoce d'avec la mère, présentée comme un reflet de la prématurité humaine, modifie la perception de la douleur, 160 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever leurs tissus nerveux. La moitié des ratons est retirée de la cage maternelle trois heures par jour, du deuxième au douzième jour de vie, sous une lampe chauffante. Le porteur parle d'"épisodes de stress non douloureux", tout en décrivant chez les rats séparés une anxiété chronique et, d'après des travaux antérieurs, des "hypersensibilités douloureuses". Chaque mère est tuée après le sevrage, sans retour à l'élevage, parce que selon le porteur la séparation "altère le fonctionnement de son système nerveux" et accroît son anxiété.

Objectifs

Pendant très longtemps, la douleur du nouveau-né a été ignorée et négligée lors de sa prise en charge. Ce n’est qu’au début des années 90 que ce problème a commencé à être pris en compte en clinique humaine et de nombreux progrès restent à faire. Les nouveaux nés ressentent non seulement la douleur mais sont extrêmement sensibles aux stimulations aversives. Ceci est d’autant plus vrai pour les enfants nés prématurés (nés avant la 35ème semaine de grossesse) dont la prévalence mondiale était de 9.6 % en 2005. La prématurité conduit ces enfants à développer parfois des troubles moteurs et comportementaux et une hypersensibilité douloureuse pouvant perdurer à l’âge adulte. La séparation maternelle néonatale (SMN, 3h/jour du 2ème au 12ème jour post-natal) est un stress postnatal qui a été décrit comme un modèle reflétant la prématurité humaine. De nombreux travaux ont montré que les animaux exposés à ce stress postnatal présentaient des hypersensibilités douloureuses des troubles des comportements sociaux, une modification de la perception douloureuse au niveau de la moelle épinière ainsi que des déficits cognitifs. Dans ce contexte, nous cherchons à affiner notre compréhension de l’impact de la séparation maternelle néonatale sur le codage de l’information nociceptive par les structures nerveuses spinales et supraspinales. L’objectif est de caractériser les modifications fonctionnelles au niveau neuronal qui rend compte des symptômes observés.

Bénéfices attendus

L’ensemble de ces travaux nous permettra de mieux comprendre les phénomènes de sensibilisation nociceptive ainsi que des déficits cognitifs qui semblent se mettre en place durablement suite à des épisodes de stress non douloureux durant la période néonatale en utilisant le modèle de séparation maternelle néonatale. Nous répondrons à la question d'une origine d'un dysfonctionnement de communication nerveuse expliquant les symptômes qui façonne l’expérience douloureuse et augmente le risque de développer une neuropathologie chronique selon les études épidémiologiques sur le sujet.

Procédures

La moitié des animaux sera soumis au protocole de séparation maternelle néonatale : séparation des ratons de la cage de leur mère 3h/j du 2ème au 12ème jour post-natal.

Impact sur les animaux

La séparation maternelle neonatale chez le rat est un modèle classique de stress psycho-social et a donc des conséquences sur le comportement des animaux (expression de symptomes d'anxiété chronique et troubles de l'adaptation au stress). Les ratons sont placés sous une lampe rouge chauffante avant d’éviter tout risque d’hypothermie. Le protocole de SMN est également connu pour augmenter les comportements maternels après retours de ratons dans la cage de la mère. Après sevrage, la mère ne réintègrera pas le processus de reproduction mais sera euthanasiée puisque la séparation maternelle altère le fonctionnement de son système nerveux, ce qui induit au niveau comportemental une anxiété accrue.

Devenir

Les enregistrements electrphysiologiques nécassitant le prélèvement de tissus nerveux, tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Ce projet portant sur l’étude d’un système intégré et mature, il nous a été impossible de remplacer l’utilisation d’animaux par des tests in-vitro.

Réduction

Nous prévoyons un nombre d’animaux suffisant pour d’obtenir des résultats exploitables en termes statistiques. Le nombre d’animaux prend en compte les deux sites d’enregistrement nécessaires (moelle épinière et hippocampe) ainsi que les variabilités interindividuelles nécessitant un certain nombre d’animaux pour obtenir des résultats statistiquement significatifs lors des tests paramétriques.

Raffinement

Notre étude s'interesse à l'impact de l'environement sur les nouveaux-nés. Pour pouvoir comparer nos groupes d'animaux, il nous faut un environnement enrichi tout en étant le plus homogène possible. Ceci nous permets d'étudier uniquement l'impact de la séparation maternelle. Les animaux sont ainsi hébergés en cage collectives afin de préserver les interactions sociales avec leurs congénères et ont constamment à leur disposition de la frisure pour nid, un bâton à ronger et un tunnel. Ils sont placés en conditions de températures et hygrométrie contrôlées, en cycle jour/nuit de 12h/12h avec eau et nourriture ad libitum. Durant la séparation maternelle néonatale, les ratons sont placés sous une lampe rouge chauffante afin d'éviter toute hypothermie.

Choix des espèces

Nos précédentes études étant réalisées sur le rat, nous conserverons ce modèle qui est bien caractérisé sur le plan comportemental. Le modèle de séparation a déjà été bien décrit et caractérisé chez cette espèce, permettant ainsi de confirmer la robustesse des résultats obtenus. De plus le modèle chez le rat nous permet de modéliser l’état de développement d’un fœtus lors du 3e trimestre de gestation, puisqu’à la naissance le système nerveux du rat est au même niveau de maturation que celui du fœtus au début du 3e trimestre de gestation. Les évènements de maturation ayant lieu lors du 3e trimestre de gestation chez l’homme, correspondent à ceux qui ont lieu lors des 2 à 3 premières semaines de vie post natales chez le rat. Nous utiliserons des rats agés de 30 et 50 jours postnataux, une période qui correspond à la phase de maturité du système nociceptif. Les précédentes études portant sur l’hypersensibilités nociceptives des animaux séparés maternels chez le rat jeune et adulte, le projet continuera sur cette ligne en faisant des enregistrements électrophysiologiques in vitro chez des animaux à un stade de développement équivalent

Sous anesthésie, les souris reçoivent une sonde thermique dans le ventre, puis une partie est vaccinée et portée pendant deux jours à 2 ou 3 °C au-dessus de sa température par un champ magnétique, avec une prise de sang chaque semaine sans anesthésie. D'autres se voient implanter sous la peau du flanc un objet métallique d'un centimètre de côté, que le champ chauffe trois heures dix jours plus tard. 880 souris adultes vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Il s'agit de mesurer l'effet d'une fièvre ou d'une inflammation locale sur la production d'anticorps, une piste qui "pourrait" selon le porteur servir un jour à renforcer la vaccination. Il justifie le choix de l'espèce par un système immunitaire "proche de l'homme" et par une espèce qui "régule la température comme l'homme".

Objectifs

La température corporelle des mammifères dont l'homme est régulée, mais peut augmenter, notamment dans tout le corps lors de la fièvre, et localement dans les zones inflammées. L’élévation de la température peut être induite par différents mécanismes, notamment la production de chaleur dans de la graisse. La température est capable d’influencer la réponse du système immunitaire. L’effet de la température sur la réponse humorale, qui est caractérisée par la production d'anticorps par des cellules spécialisées, les lymphocytes B (LB), reste mal connu. La capacité des LB à produire des anticorps en réponse à la vaccination ou à des microbes est un processus complexe, nécessitant la coopération avec d'autres cellules, et la formation de structures spécialisées dans les organes du système immunitaire (ganglions lymphatiques ou rate), difficile à modéliser in vitro. Notre but est donc d’étudier in vivo chez des souris l’effet d’une augmentation locale (comme dans l’inflammation locale) ou du corps entier (comme dans la fièvre) de la température sur la réponse humorale. Dans un premier temps, nous analyserons l'effet de l'élévation globale de la température corporelle sur la réponse humorale en réponse à une vaccination. Nous étudierons également si la production de chaleur dans la graisse spécialisée participe à l’élévation de la température lors de la fièvre, et si elle modifie la réponse humorale. Enfin, nous mettrons au point un modèle permettant de tester l’effet d’une augmentation locale de la température autour d’un ganglion lymphatique, mimant l’effet d’une inflammation locale, sur la réponse humorale.

Bénéfices attendus

Comprendre l’effet de la température sur la réponse humorale pourrait avoir un impact dans le domaine de la vaccination : l’élévation de température pourrait, par exemple, être utilisée pour augmenter la réponse immunitaire (cette stratégie est déjà à l’étude dans le domaine des cancers). De plus, l’identification de la production de chaleur par la graisse comme mécanisme de contrôle de la température et de la réponse humorale pourrait permettre d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour augmenter (vaccination) ou diminuer (maladies causées par une réponse immunitaire trop importante ) la réponse humorale.

Procédures

Les souris seront injectéés avec des sondes thermiques dans le ventre, sous anesthésie générale de 10 minutes maximum. Certaines souris seront vaccinées par voie sous-cutanée (durée de l'injection : 1 minute), et une élévation de température de 2 à 3°C sera induite pendant 2 jours à l'aide d'un champ magnétique. Du sang sera prélevé une fois par semaine (animaux vigiles, durée du prélèvement 1 minute), et au moment de l'euthanasie sous anesthésie (durée du prélèvement : 2 minutes). D'autres souris seront implantées avec des objets métalliques de 1cm x 1cm sous la peau du flanc par chirurgie sous anesthésie générale (durée de la chirurgie : 10 minutes), dans une position n'affectant pas la mobilité des animaux. 10 jours plus tard, une élévation locale de température de 2 à 3°C sera induite pendant 3 heures à l'aide d'un champ magnétique, puis les souris seront mises à mort.

Impact sur les animaux

L'élévation de la température et la vaccination, peuvent dans certains cas induire une douleur et une perte de poids (déshydratation) modérée et transitoire (2 jours), correspondant à la fièvre. L'implantation d'objets métalliques peut également mener à un inconfort et une douleur modérée et transitoire, correspondant à une petite chirurgie cutanée (3 jours). Les expériences se terminent par l'euthanasie des souris.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés afin de pouvoir prélever différents organes nécessaires à l'analyse de la réponse immunitaire.

Remplacement

Nous avons effectué des expériences in vitro afin d’étudier l’effet d’une élévation de la température sur les lymphocytes B. Il est cependant impossible in vitro de reproduire l’environnement complexe impliquant la coopération entre de nombreux types cellulaires qui permet aux lymphocytes B de produire des anticorps in vivo. Il est également impossible d'étudier in vitro la contribution à la fièvre et l’inflammation de la production de chaleur dans la graisse. Il est donc nécessaire d’étudier cette réponse in vivo, dans un modèle animal dont le système immunitaire et le contrôle de la température est proche de l’homme, comme la souris. Pour les implants d’objets métalliques, nous avons au préalable testé la capacité du champ magnétique à élever la température d’objets en différents métaux sans les implanter à des souris, et avons sélectionné les 3 plus ‘chauffant’ pour les tests in vivo.

Réduction

Le nombre de sours (880) a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

L'implantation des objets métalliques par chirurgie se fait sous anesthésie générale, avec analgésie. De plus, nous avons mis au point une grille permettant de quantifier la douleur des souris. Les critères sont la perte de poids, l’apparence, le comportement, l'activité de souris et des signes cliniques tels que les yeux anormaux, un écoulement nasal, ou un fèces anormal. Les animaux seront observés le lendemain puis deux fois par semaine suite à l'injection des sondes thermiques, tous les jours pendant 3 jours suite à l'implantation d'objets métalliques, et 7 jours suite à la vaccination, puis 2 fois par semaine. Des points limites ont été établis, et selon le score de douleur et sa persistance, la douleur sera traitée soit par analgésie, soit les animaux seront euthanasiés. La perte de poids pouvant être signe de déshydratation sera traitée par injection de solution de réhydratation. Afin de diminuer le stress potentiel des souris, elles sont habituées avant les expériences à être manipulées et à des changements d'environnement. Enfin, les animaux sont maintenus sans isolement, avec enrichissement (bâtons à ronger, éléments permettant la nidification, accès illimité à la nourriture et l’eau de boisson), et sont observés tous les jours.

Choix des espèces

La souris dispose d'un système immunitaire proche de l'homme, bien caractérisé. De plus, c'est un animal qui régule la température comme l'homme. Les animaux seront utilisés entre 8 et 20 semaines (âge adulte),