Recherche fondamentale

5 184 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à l'auto-administration de cocaïne, à des chirurgies cérébrales, à des prélèvements vaginaux quotidiens chez les femelles et à un stress pharmacologique à la yohimbine, pour étudier l'effet de la progestérone sur la rechute. Le porteur décrit une perte de poids et une hyperactivité après la cocaïne, ainsi que des effets de la yohimbine comparables à ceux observés chez l'humain. Les retombées thérapeutiques contre la rechute sont renvoyées au "long terme".

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont triples : - Premièrement, tester l’effet d’un traitement à la progestérone sur les tests comportementaux de rechute induite par l’exposition aux signaux associés à la cocaïne, par l’injection de la cocaïne ou par un stress - Deuxièmement, l’identification le rôle causal des neurones de l’insula exprimant les PR sur la rechute à la cocaïne - Troisièmement, déterminer comment l’activité des neurones PR de l’insula est modifiée par le traitement à la progestérone sur la rechute à la cocaïne

Bénéfices attendus

Ce projet sera une caractérisation unique de l'effet de la progestérone sur l'activité des neurones exprimant les récepteurs à la progestérone (PR) du cortex insulaire pendant la rechute de cocaïne. Nous pourrons ainsi élucider le rôle causal de cette population neuronale dans la rechute à la cocaïne, et démontrer l’effet protecteur de la progestérone dans la rechute chez les animaux mâles et femelles. A long terme, ce projet a le potentiel d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques applicables à l’humain (homme et femme) pour prévenir la rechute à la cocaïne grâce à un traitement à la progestérone.

Procédures

Chez les femelles, le cycle hormonal sera suivi par un prélèvement vaginal quotidien commençant une semaine avant le test de rechute et cela pendant 5 jours, ainsi qu’un prélèvement avant chaque test de rechute amenant à un total de 7 prélèvements par souris. Les échantillons seront collectés à l'aide de pointes de coton stériles humidifiées avec du sérum physiologique stérile. Un coton-tige par souris sera inséré dans l'orifice vaginal avec une pénétration peu profonde, tourné à 360 degrés et retiré. Un prélèvement ne dure au maximum 10 secondes par animal. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale, avec injection d’anti-inflammatoires et ajout d’anesthésiants locaux sur la zone d’incision. L’acte chirurgical sera effectué dans des conditions de propreté maximales. Des antibiotiques et analgésiques seront administrés en cas d’infection ou de douleur post-opératoire.

Impact sur les animaux

La prise de cocaïne peut engendrer une perte de poids lors dès les premières prises, mais cette perte n’excède pas 3 ou 4 jours à l’issus desquels les animaux retrouvent leur poids initial. La cocaïne peut également engendrer une hyperactivitée des animaux qui disparaît au bout d’1 heure après la fin de la prise de drogue. Les effets toxiques de la yohimbine sont similaires à ceux observés chez l'homme. L'hypertension, la tachycardie, la stimulation du système nerveux central et l'antidiurèse peuvent se produire (A. Garrard, dans Encyclopedia of Toxicology (Third Edition), 2014). Néanmoins en injection aigu à la concentration utilisée les effets indésirables restent minimes mais nous contrôlerons l’était général des animaux pendant 24 heures après l’injection.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés à la fin de chaque procédure afin de procéder à des analyses sur les tissus cérébraux.

Remplacement

Le projet porte sur une analyse de la connexion des neurones et de leurs propriétés de transmission d’informations au cours du comportement. Par conséquent cette procédure doit être effectuée chez des animaux vivants. L’étude de ces phénomènes n’est donc pas possible sur des cellules isolées, car elles ne permettent pas la quantification des connections neuronales ou la mesure de l’activité en réponse à une stimulation sensorielle.

Réduction

Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux afin d’obtenir une analyse fiable (le nombre d’animaux estimé permet d’effectuer des tests statistiques) et complète de la connectivité et de l’activité de la région cérébrale d’étude. Nous utiliserons ainsi 5184 animaux sur cinq ans.

Raffinement

La majorité des animaux seront hébergés en cages collectives, afin de limiter le stress dû à l’isolement. Nous avons réduit au strict minimum les animaux hébergés individuellement pour des raisons expérimentales (endommagement du matériel implanté pouvant mettre en péril la santé de l’animal si arraché par un congénère). Les cages seront également enrichies en nids en coton. Une surveillance particulière sera adressée aux animaux en période péri-opératoire. L’acte chirurgical sera effectué dans des conditions de propreté maximales. En cas d’infection, le vétérinaire référent sera sollicité pour mettre en place un traitement antibiotique approprié.

Choix des espèces

Des souris génétiquement standards (C57Bl6/J) seront utilisées afin de caractériser leur comportement lors des procédures d’auto-administration de cocaïne, de rechute et d’enregistrement de l’activité neuronale. Des souris génétiquement modifiées (PR-IRES-Cre) seront également utilisées lorsque nous étudierons une population neuronale spécifique (exprimant les récepteurs à la progesterone) afin de cibler, lors de l’étude du role causal, uniquement ces neurones d’intérêt. De plus, il a été démontré que le comportement des animaux peut varier entre les souches génétiquement modifiées ou standards. Ainsi, nous utiliserons également des souris PR-IRES-Cre pour des études comportementales afin de comparer leur comportement avec les souris génétiquement standard. Tous les animaux utilisés seront adultes (10 semaines) afin d’étudier des populations et des circuits neuronaux matures.

1 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections quotidiennes de PCP pendant dix jours pour reproduire un modèle de schizophrénie, puis des injections de petites molécules et des tests comportementaux légers, avant le prélèvement du cerveau. Le porteur indique que le PCP diminue l'appétit et les interactions sociales, cette baisse d'interaction étant précisément le paramètre mesuré. Il affirme que le recours à la souris est "guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques" et que l'expérimentation humaine "ne peut atteindre ce niveau de résolution".

Objectifs

La schizophrénie touche 1% de la population. Les traitements actuels en contrôlent mal les symptômes et ont de lourds effets secondaires. Des activateurs du récepteur mGlu2 du glutamate sont actuellement en étude clinique mais les premières molécules ont échoué du fait d’une interférence avec les antipsychotiques atypiques actuels. Si les molécules mGlu2 restent de bons candidats pour un traitement de première intention, cela amène d’importantes questions. Ce projet cherche à 1) décrypter la signalisation du récepteur mGlu2 dans le cerveau avec l’espoir de trouver de nouveaux régulateurs / effecteurs, 2) caractériser l’altération de ces nouveaux régulateurs et effecteurs dans des modèles précliniques établis de la schizophrénie, 3) déterminer l’impact des antipsychotiques actuels sur ces nouveaux effecteurs et régulateurs pour comprendre l’interférence entre les deux classes d’antipsychotiques 4) déterminer l’importance des nouveaux régulateurs et effecteurs dans la capacité du récepteur mGlu2 à reverser des déficits comportementaux de modèles précliniques de schizophrénie.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait apporter une meilleure compréhension du mode d’action d’une nouvelle génération prometteuse d’antipsychotiques et de son interférence avec les antipsychotiques atypiques actuellement utilisés.

Procédures

Des animaux vigiles recevront des injections sous cutanées de PCP (1 injection par jour pendant 10 jours), des injections intrapéritonéales de petites molécules (1 injection qui met 30 min à agir) et soit seront sacrifiés pour prélévements biochimiques/immunofluorescence soit passeront des tests comportementaux de classe légère (2 jours pour l'ensemble des tests).

Impact sur les animaux

Les lignées KO 5-HT2A , KO mGlu2 et le modèle chimique PCP ont des phénotypes non dommageables. D'anciennes publications sur le modèle PCP décrivent une diminution d'appétit et une diminution d'interaction sociale. La diminution d'interaction sociale est justement l'un des paramètres que l'on cherche à mesurer dans le modèle PCP et qui est réversé par les antipsychotiques glutamatergiques. Contrairement aux publications initiales, les dernières publications sur le modèle PCP subchronique (doi.org/10.1016/j.pbb.2018.09.007) et le suivi de poids lors de notre dernier projet (1316-7251_iExplore-RAM-O1-F-003) ne montrent pas de variation de poids par rapport aux souris Véhicule. Dans nos mains le modèle PCP n'a jamais atteint les points limites que nous continuerons de surveiller. Les manipulations envisagées ne présentent pas de douleur d'un niveau supérieure à une piqure d'aiguille et nous ne devrions pas avoir besoin de recourir à des antalgiques/analgésiques. Le PCP injecté aux animaux a lui même été initialement développé comme un analgésique. Comme l'injection répétée de PCP induit une diminution de l'interaction sociale et de l'appétit nous la classons comme modérée.

Devenir

procédure 1: tous les animaux de cette procédure seront mis à mort pour le prélèvement du cerveau nécessaire aux analyses biochimiques et protéomiques. procédure 2: tous les animaux de cette procédure seront mis à mort pour le prélèvement du cerveau nécessaire aux analyses par immunofluorescence. procédure 3: tous les animaux de cette procédure seront mis à mort pour prélèvements biochimiques pour réutilisation possible dans d'autres projets.

Remplacement

Comme il est impossible de rendre compte de l’hétérogénéité et de la complexité du cerveau et de la circuiterie neuronale dans des cultures cellulaires, nous aurons recours à des modèles animaux pour étudier in vivo la réponse biochimique aux antipsychotiques. Ces analyses biochimiques impliquant le prélèvement du cerveau, elles sont impossibles directement chez l’homme. Les réponses comportementales aux antipsychotiques ne peuvent être mesurées que sur l’organisme conscient, excluant un travail sur cultures cellulaires. Le modèle souris est particulièrement adapté au projet car il est un standard dans la mesure de l’action des antipsychotiques toutes générations confondues avec des tests comportementaux bien établis pour cette espèce, ce qui limitera les mises au point et donc le nombre d’animaux utilisés. De nombreux modèles génétiques et de nombreux outils moléculaires sont disponibles pour la souris et permettront de visualiser ou de cibler spécifiquement des mécanismes cellulaires ou des protéines. L’expérimentation humaine ne peut atteindre ce niveau de résolution. Enfin, l'état actuel des connaissances ne permet pas une modélisation informatique des phénomènes cérébraux impliqués dans l’action des antipsychotiques. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques.

Réduction

Nos principales grilles de lecture sont la protéomique, l'immunofluorescence et les tests comportementaux. La protéomique permet de caractériser et quantifier en relatif des milliers de protéines en une seule expérience. L'immunofluorescence permet de réaliser une multitude de combinaisons de marqueurs à partir d'un animal. Le modèle PCP décrit dans la saisine est un modèle d’étude privilégié du fait de sa robustesse dans l’établissement du phénotype « schizophrénie » (100 % des individus) et de la réponse aux antipsychotiques. Nos méthodes statistiques concernant des données de protéomique (significance B), de biochimie et d’immunofluorescence (Anova) ont déjà été éprouvées et publiées à maintes reprises par nous et/ou des collègues du domaine.

Raffinement

Les manipulations envisagées ne présentent pas de douleur d'un niveau supérieur à une piqure d'aiguille et nous ne devrions pas avoir besoin de recourir à des antalgiques/analgésiques. Le PCP injecté aux animaux a lui même été initialement développé comme un analgésique. Avant les premières injections les souris seront habituées à la manipulation quotidiennement pendant 1 semaine pour effacer les stress de transport et de manipulation. Les lignées choisies et le modèle chimique PCP ont un phénotype non dommageable. La répétition des injections sous cutanées journalières au même point pouvant entrainer une inflammation et une gêne pour l'animal nous déplacerons chaque jour le point d'injection sous cutanée. Pour les souris prétraitées en IP journalières, les injections seront décalées chaque jour de bas en haut du ventre de l'animal coté droit pour ne pas risquer de percer la vessie ou le caecum. Les animaux pour les expériences de comportement (procédure 3) passeront l'ensemble des tests comportementaux du moins stressant au plus stressant. Les souris sont hébergées en groupes de 4 à l'intérieur desquels elles ne reçoivent pas les mêmes traitements, ce qui élimine le stress d'isolement et la propagation de la douleur sociale. Les cages présentent un enrichissement intermédiaire (petite maison, alvéole de boite à oeufs et serpentin en carton) qui stimule l'activité et limite l'agressivité. la fréquence d'observation est assurée, au minimum une fois par jour, par les animaliers de la zone d'expérimentation animale et par le chercheur (qui se rend chaque jour dans la zone d'expérimentation animale pour ce traitement et/ou pour d'autres expériences). Notre projet pour 5 ans impliquant une équipe de 3 personnes nécessitera 1120 souris issues de plusieurs lignées spécifiques déjà élevées dans nos animaleries. Les procédures décrites dans ce document ne nécessiteront aucune mise au point et sont standards dans l’étude de la réponse aux antipsychotiques.

Choix des espèces

Comme il est impossible de rendre compte de l’hétérogénéité et de la complexité du cerveau et de la circuiterie neuronale dans des cultures cellulaires, nous aurons recours à des modèles animaux pour étudier in vivo la réponse biochimique aux antipsychotiques. Ces analyses biochimiques impliquant le prélèvement du cerveau, elles sont impossibles directement chez l’Homme. Les réponses comportementales aux antipsychotiques ne peuvent être mesurées que sur l’organisme conscient, excluant un travail sur cultures cellulaires. Le modèle souris est particulièrement adapté au projet car il est un standard dans la mesure de l’action des antipsychotiques toutes générations confondues avec des tests comportementaux bien établis pour cette espèce, ce qui limitera les mises au point et donc le nombre d’animaux utilisés. De nombreux modèles génétiques et de nombreux outils moléculaires sont disponibles pour la souris et permettront de visualiser ou de cibler spécifiquement des mécanismes cellulaires ou des protéines. L’expérimentation humaine ne peut atteindre ce niveau de résolution. Enfin, l'état actuel des connaissances ne permet pas une modélisation informatique des phénomènes cérébraux impliqués dans l’action des antipsychotiques. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques.

728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une exposition à l'hypoxie intermittente pendant six semaines, pour certaines une implantation d'électrodes cérébrales, des tests de mémoire, des injections et des gavages, pour comparer les lésions cérébrales de l'apnée du sommeil et de la maladie d'Alzheimer. Le porteur indique une perte de poids transitoire, ainsi qu'une douleur et un stress liés à la chirurgie et aux contentions répétées. Il affirme que la compréhension des échanges entre régions cérébrales ne peut se faire que sur "animal entier".

Objectifs

L'hypoxie intermittente, modèle expérimental du syndrome d'apnées du sommeil, induirait il des lésions cérébrales comparables à celles retrouvées dans la maladie d'Alzheimer? Les troubles du sommeil sont fréquents chez les personnes âgées. Ces dernières années, des études à la fois chez l’homme et chez les rongeurs ont mis en évidence une association entre sommeil perturbé et la maladie d’Alzheimer mais les mécanismes sous-jacents restent encore en grande partie inconnus. Le syndrome d’apnées du sommeil (SAS) est l’une des causes des troubles du sommeil et il est caractérisé par une obstruction répétée des voies aériennes supérieures, entrainant une diminution fluctuante du taux d’oxygène sanguin (hypoxémie intermittente), un sommeil fragmenté et des signes tels que la somnolence et des troubles de la concentration/attention/mémoire. Le SAS doublerait le risque de démence chez l’homme, et serait associé au dépôt cérébral des protéines amyloïdes ß (Aß) retrouvées dans la maladie d’Alzheimer. Dans les modèles animaux, l’hypoxie intermittente (IH) entraine une anomalie électrophysiologique (plasticité synaptique) au niveau de l’hippocampe du cerveau, une perte des neurones et une production d’Aß. Par ailleurs, les troubles cognitifs présentés par les patients souffrants de SAS touchent la mémoire (hippocampe) et l’attention/concentration (cortex préfrontal). Or, la maladie d’Alzheimer est caractérisée au niveau physiopathologique par une altération des connexions entre les différentes régions cérébrales, notamment entre l’hippocampe et le cortex préfrontal. En utilisant l’électrophysiologie, notre objectif est d’analyser l’effet de l’hypoxie intermittente chronique sur le cerveau à plusieurs niveaux, en comparant entre le modèle souris SAS (hypoxie intermittente) et le modèle transgénique Alzheimer: 1) sur la connexion entre l'hippocampe et le cortex préfrontal, 2) sur les lésions cérébrales potentiellement induites par l’hypoxie intermittente, 3) si l'hypoxie intermittente est associée à la sénescence cérébrale (vieillissement), étude de l'effet du traitement contre la sénescence pour un éventuel effet contrecarrant l'effet délétère de l'hypoxie intermittente sur le cerveau.

Bénéfices attendus

D’un point de vue fondamental, ces études cherchent à préciser le fonctionnement cérébral (échanges d’information entre 2 régions importantes du cerveau, touchées dans la maladie d'alzheimer mais aussi dans le SAS). Leur réalisation sur le modèle murin des apnées du sommeil par l’hypoxie intermittente a pour but de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents des déficits cognitifs induits par l’hypoxie intermittente et de comparer avec les lésions cérébrales dans le modèle de la maladie d’Alzheimer. De plus ces études apporteront une évaluation originale de l’effet additif de l’hypoxie intermittente sur la pathologie Alzheimer. A long terme, à défaut d'avoir à l'heure actuelle un traitement guérissant la maladie d'Alzheimer, le projet permettra d'avoir des résultats sur le plan biologique avant de se prononcer sur l'effet potentiel thérapeutique/préventif du traitement des apnées du sommeil pour prévenir/ralentir le développement de la maladie d'Alzheimer.

Procédures

Au total 728 souris seront analysées dont: - sur 192 souris: intervention chirurgicale sous anesthésie générale et antalgique (électrodes implantés dans le cerveau pendant 2-3h), et après un temps de récupération après la chirurgie de 2 semaines, les souris vont être exposées soit à l'hypoxie soit à la normoxie pendant 6 semaines et enregistrement de l'activité cérébrale sur l'animal vigil dans les 10 jour suivants; (par exemple chez l'Homme, des enregistrements intracérébraux sont également réalisés chez certains patients avec une épilepsie grave). - 392 souris: après exposition soit à l'hypoxie soit à la normoxie pendant 6 semaines, réalisation d'un test de mémoire puis prélèvement cérébral après euthanasie pour analyser les différentes lésions du cerveau. - et si l'hypoxie entraine une sénescence cellulaire (« vieillissement »), 144 souris : traitement d'un produit sénolytique (contre la sénescence) pendant l'exposition soit à l'hypoxie soit à la normoxie pendant 6 semaines, réalisation d'un test de mémoire puis prélèvement cérébral après euthanasie pour analyser les lésions cérébrales.

Impact sur les animaux

perte de poids transitoire en début d'hypoxie intermittente (procédure 1); douleur, stress, angoisse lors de la chirurgie (procédure 2) et de la perfusion intracardiaque (procédure 5) ; restrictions alimentaires pour le conditionnement du comportement, (procédure 2) ; la douleur des injections intrapéritonéales pour le EDu (procédure 4) ; les contentions répétées pour le gavage (procédure 6) Ces effets indésirables seront remédiés par l'anesthésie et les antlagiques avant et après l'intervention

Devenir

Sur 536 animaux, nous réaliserons l'étape finale expérimentale pour prélever leur cerveau, permettant de l'analyser et rechercher les différentes lésions cérébrales. Les 192 autres animaux, après l'enregistrement de leur activité cérébrale pendant la réalisation d'un test de mémoire, seront euthanasiés de façon réglementaire.

Remplacement

La compréhension de la logique des échanges d’informations au niveau du cerveau entre 2 régions (l’hippocampe et le cortex préfrontal) ne peut faire l’objet de recherches que sur un animal entier, non anesthésié, dans un état de vigilance et des conditions comportementales précises (enregistrement de leur activité cérébrale pendant la réalisation d'un test de mémoire,). L’analyse des lésions cérébrales pour corréler avec les données électrophysiologiques ne peut faire l’objet de recherches que sur un animal entier. Compte tenu de l'analyse à plusieurs échelles (lésions cérébrales et impact sur le test du comportement), de façon intégrative, une méthode de remplacement n'est pas envisageable.

Réduction

Le développement de méthodes de traitement des signaux très sophistiquées ainsi que l’analyse statistique multivariables des résultats ont permis de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ces études.

Raffinement

L’anesthésie générale lors de la mise en place des électrodes, la sédation rapide et profonde avec un euthanasiant (avec un analgésique) pour l’étude d’immunohistochimie/perfusion intracardiaque, l’utilisation d’analgésie adéquate pour chaque procédure, la procédure d’euthanasie dans une pièce dédiée à cet objectif, l’enrichissement du milieu (coton maison en carton, baton à ronger etc), ainsi qu’une procédure quotidienne d’observation et d’examen, sont les pratiques expérimentales destinées à réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux utilisés dans ce projet. Les animaux sont regroupés par 5 (sauf pour la procédure 2, dérogation de l'hébergement décrite dans la procédure) dans des cages contenant un lit de litière, des morceaux de coton pour la nidification ainsi qu’une maison en carton qui leur permet à la fois de s’y cacher et de faire leur dent. Les animaux provenant de l’extérieur sont placés dans ces cages et ne sont manipulés au minima une semaine après leur arrivée (respect d'une semaine d'acclimatation) , afin de faciliter au mieux l’acclimatation à leur nouvel environnement. Pour chaque procédure, seront considérés comme points limites : 1. Tout dérèglement physiologique aboutissant à une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire 2. Modification du comportement caractéristique d'une douleur intense, une détresse ou une souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et/ou terne, prostration, dos vouté) 3. Anomalies pouvant entrainer une douleur intense, une détresse ou une souffrance : perte de poids supérieure ou égale à 20% du poids initial de l'animal, plaies et ulcères, tumeurs, fractures... 4.La pesée des animaux se fera de façon hebdomadaire, et renforcée en post opératoire aiguë avec une augmentation de la fréquence des pesées /48h pendant la 1ère semaine post op »

Choix des espèces

L’immense majorité des études portant sur ce sujet est réalisée chez le rongeur, notamment chez la souris du fait de la possibilité de développer des modèles génétiquement modifiés (modèle de maladie d’Alzheimer qui sera comparé avec les résultats des souris non transgéniques dites WT, en hypoxie intermittente). En effet les souris transgéniques portant la mutation humaine de la maladie d'Alzheimer permet de reproduire des lésions cérébrales semblables à la maladie d'Alzheimer et un trouble de la mémoire. Ces lésions cérébrale se développent progressivement dans le modèle transgénique que nous allons étudier. De plus, il ets également important de travailler l'effet de l'âge/vieillissement, car un des facteurs de risque de la maladie d'Alzheimer est l'âge. Enfin, il ets important de connaitre si l'impact de l'hypoxie intermittente varie en fonction du stade de la vie, ainsi que l'effet potentiel du traitement sénolytique. C'est pourquoi nous avons besoin d'étudier sur plueurs groupes d'âge les animaux. Au début de l’expérimentation (procédure 1) les animaux seront âgés de 1.5 mois, de 10.5 mois et de 20,5 mois respectivement, pour que les expériences 1 à 6 citées dans le projet soient réalisées chez des souris mâles de 3 mois, 12 mois et 22 mois, pour comparer entre le profil électrophysiologique induit par le modèle Alzheimer et celui induit par l’hypoxie intermittente. D’après les études publiées sur ces souris transgéniques Alzheimer et les données publiées chez le modèle hypoxie intermittente, dans la très grande majorité des cas des souris C57BL6 âgés

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une lésion cérébrale est provoquée par injection de 6-OHDA pour modéliser la maladie de Parkinson, puis les souris subissent quatorze tests de douleur, dont le test de von Frey, l'immersion de la queue, la plaque chaude et le test à la formaline. Le porteur précise que la douleur liée au modèle "ne peut être soulagée car c'est l'objectif de l'étude". Il affirme que la caractérisation de la douleur nécessite une observation comportementale possible seulement sur "animal vivant et vigile".

Objectifs

La maladie de Parkinson est caractérisée par une perte progressive des neurones dopaminergiques de la substance noire compacte. Cette maladie est classiquement associée à des symptômes moteurs, cependant il est maintenant reconnu que de nombreux symptômes non moteurs, incluant la douleur, sont très communs. Les symptômes douloureux peuvent être observés chez environ 85 % des patients Parkinsoniens. Le seuil de douleur est également altéré chez les patients Parkinsoniens, présentant ou non des symptômes de douleur. Ces douleurs sont négativement associées avec la qualité de vie des patients. Ces symptômes de douleurs sont donc un souci majeur dans la prise en charge de la maladie. Les douleurs associées à la maladie de Parkinson suggèrent que les circuits cérébraux permettant de percevoir et traiter les informations douloureuses pourraient être dysfonctionnels. Cependant, la cible ou les cibles de ces dysfonctionnement douloureux ne sont pour l’heure pas encore connues dans le cadre de la maladie de Parkinson. Notre objectif est d’étudier en utilisant des approches lésionnelles et comportementales si une structure cérébrale, le striatum joue un rôle dans ces dysfonctionnements douloureux. Nous proposons donc ici une expérience préliminaire permettant caractériser les altérations des réponses nociceptives observées, chez la souris, dans un modèle classique de la maladie de parkinson : l’injection de 6- hydroxydopamine (6-OHDA) dans le striatum. Ces injections permettent à la fois de détruire les terminaisons dopaminergiques dans le striatum ainsi que les corps cellulaires des neurones dopaminergiques à l’origine de ces projections dans la substance noire compacte. Ces injections seront réalisées de façon unilatérale chez des souris mâles et femelles C57BL/6j et des groupes contrôles pseudo opéré y seront associés.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de caractériser un modèle murin (valide chez les mâles et les femelles) de la maladie de parkinson, bien caractérisé sur les symptômes moteurs mais où les altérations des seuils nociceptifs ne sont pas connues. Or des symptômes douloureux bien caractérisés pourraient être prédictifs dans l’évolution de la maladie chez l’Homme. Cela nous permettra également par la suite d'étudier les structures ou réseaux du système nerveux central à la base de ces altérations et de potentiellement révéler de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter les douleurs spécifiquement chez le patient parkinsonien. Cette avancée pourrait permettre de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques, potentiellement différentes chez le mâle et la femelle.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie stéréotaxique lésionnelle d'une durée d'1h30 environ. Les animaux développeront des douleurs suite à la modélisation de la maladie de Parkinson. Avant la chirurgie à J1 les animaux auront un test de von Frey, à J2 le test d’immersion de la queue, à J4 un deuxième test de von Frey et à J5 un deuxième test d’immersion de la queue. 15J après la chirurgie, à J1 les animaux auront un test de von Frey, à J2 un test de la plaque chaude, à J3 un tail pressure test, à J4 le test du plantar, à J5 le test de l’acétone, à J9 un test de von Frey, à J10 un test de la plaque chaude incrémentée, à J11 le test d’immersion de la queue, à J12 le rotarod et à J13 le test de la formaline.

Impact sur les animaux

La présence de douleur liée à la modélisation de la maladie de Parkinson qui ne peut être soulagée car c'est l'objectif de l'étude. Les lésions dopaminergiques peuvent entrainer une perte de poids d'environ 5% attendue. Ces animaux vont développer des œdèmes inflammatoires (test de la formaline) nécessaires à l'expérimentation qui seront suivis et mesurés quotidiennement (taille de l'œdème, présence d'un érythème, d'une plaie ouverte ou d'une nécrose). Cet œdème sera d’environ 1 cm de diamètre et diminue dans les premières 24h après l’injection pour disparaître complètement 3 jours après maximum. Les animaux subiront des tests comportementaux nociceptifs au nombre de 14 au total (4 tests avant la chirurgie pour l'obtention de valeurs de base, puis 1 test par jour pendant 5 jours et cela 2 semaines).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque à l'issue de la procédure 2.

Remplacement

Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, la caractérisation de la douleur dans la maladie de parkinson nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Un calcul statistique « power analysis » a été réalisé pour définir un nombre d’animaux nécessaire afin d’obtenir des résultats valides au plan statistique (multiple ANOVA) : ce nombre est de 10 animaux par groupe au minimum. Afin de garantir un nombre minimum de 10 animaux par groupe (nombre nécessaire donné par notre calcul statistique de power analyse qui a été réalisé sur la base de nos connaissances techniques et des études antérieures), il est nécessaire d’utiliser un nombre maximum de 20 animaux au total par groupe. En effet, la possibilité d’une mauvaise localisation de la lésion (25% d’erreur environ) et la variabilité comportementale interindividuelle, nous oblige à prévoir un nombre d’animaux 2 fois supérieur à celui attendu au final. La mise au point des sites d’injection a déjà été réalisé sur des études antérieures. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés la procédure expérimentale détaillée ci-après fera partie d’un enchainement et utilisera les mêmes animaux, ce qui en réduira grandement l’effectif.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en animalerie dont la température, l’humidité et le cycle jour/nuit sont contrôlés, nourriture et boisson sont disponibles ad libitum. Ils seront hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Nous travaillerons en cycle jour/nuit (lumière allumée de 8h à 20h). Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont systématiquement utilisées. Les signes de mal-être suivants seront recherchés : perte de poids, blessure ou plaie ouverte, dégradation de l'état du pelage, dos arqué. En cas de signes de souffrance de l’animal, des soins (désinfection, suture de plaie), une administration d’antalgique ou d’anti-inflammatoire, une séparation (blessures entre congénères) seront réalisés après concertation avec le vétérinaire, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux (SBEA) et/ou le personnel zootechnique de l’institut. Enfin, des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la SBEA de l’institut pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Le modèle lésionnel de maladie de Parkinson utilisé dans cette étude a été caractérisé et validé pharmacologiquement chez la souris. De plus, pour de futures études, de nombreuses lignées de souris transgéniques existent et sont disponibles ce qui nous permettra de répondre de façon précise la question des mécanismes physiopathologiques impliqués dans cette comorbidité maladie de Parkinson/douleur. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 6 semaines, poids supérieur à 20g).