Recherche fondamentale

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent l'ablation chirurgicale des deux tiers du foie et des injections, pour étudier le contrôle de la division des hépatocytes en lien avec le cancer du foie. Le porteur indique que la laparotomie peut provoquer une gêne et une légère douleur, et prévoit une mise à mort anticipée en cas d'atteinte des points limites. Il affirme que le modèle murin est le "seul modèle préclinique" permettant d'invalider ou d'induire des gènes de façon tissu-spécifique.

Objectifs

Le foie est un organe vital qui intervient dans le stockage du glucose, la fabrication de la bile et la détoxification. L'incidence du cancer du foie (CHC) est en forte augmentation depuis 20 ans et ce cancer représente la 3ème cause de mort par cancer dans le monde. Ce cancer grave dispose de très peu de traitements efficaces et l’apport de nouvelles stratégies thérapeutiques représente donc un enjeu majeur dans la prise en charge de cette maladie. Bien que des progrès aient été accomplis dans le déchiffrage des mécanismes moléculaires du CHC, la dissection des événements précoces de la carcinogenèse hépatique, notamment comprendre la transformation tumorale des hépatocytes, cellules majoritaires du foie, est centrale pour mieux comprendre le développement de ce cancer. Des études récentes ont montré que le développement du CHC était intimement lié à un contexte d’altérations au niveau génétique, métabolique et inflammatoire, qui favorise un remaniement du cycle de division de l’hépatocyte. Dans ce cadre, nos travaux visent notamment à décrypter les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le cycle de division des hépatocytes, pour assurer ainsi le maintien de l’intégrité du tissu hépatique. Ce projet nécessitera 280 souris et sera mené pour une durée de 2 ans.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet nous permettront de définir le rôle de RhoA, DNAM-1 et LECT2, dans le contrôle prolifératif des hépatocytes, mais aussi dans la compréhension des mécanismes sous-jacents assurant l'intégrité génomique dans le foie, mécanismes faisant défaut au cours de l'hépatocarcinogenèse humaine. Ces travaux devraient conduire à élaborer chez l’Homme de nouveaux outils diagnostic/pronostic et des stratégies thérapeutiques innovantes pour ce cancer grave sans traitement effectif.

Procédures

Dans le cadre de ce projet de recherche, une injection intra-péritonéale (une fois, à 6 semaines de vie) sera réalisée sur animal vigile (112 animaux). Par ailleurs, une hépatectomie partielle des 2/3 du foie (chirurgie) sera effectuée sur animal anesthésié (280 animaux). Enfin, une injection intra-péritonéale (une fois, à 8-10 semaines de vie) sera réalisée sur animal vigile (280 animaux).

Impact sur les animaux

Du fait de la laparotomie nécessaire à la chirurgie du foie, les animaux pourraient resssentir soit une gêne au niveau de la zone chirurgicale (présence de sutures/agrafes) ou bien une légère douleur de par l'acte chirurgical. Par ailleurs, l’injection intrapéritonéale pourrait entrainer un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine).

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglemantaire) de l’ensemble des animaux (280).

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence dans notre cas le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires conduisant au CHC.

Réduction

Les groupes expérimentaux seront constitués du minimum d’animaux nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique robuste des effets observés. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Pour cette étude, nous estimons que 280 souris seront nécessaires.

Raffinement

Les animaux provenant de l’extérieur seront stabulés une semaine au sein de l’animalerie. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive (hépatectomie partielle) sera précédée d’une anesthésie générale et d'une prise d'antalgique pré/post opératoire. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, la mise à mort anticipée de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour déterminer les mécanismes moléculaires conduisant au CHC. Nous avons choisi la souris, car en plus de partager plus de 90% de gènes communs avec l’homme, il existe pour cette espèce des modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (6 à 10 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris immunodéprimées porteuses d'une tumeur humaine, elles reçoivent une chimiothérapie par gavage pendant quatorze jours puis de l'iode-131 radioactif, pour tester une combinaison anticancéreuse. Le porteur précise que l'étude est menée comme une "prestation de services" pour le compte d'une entreprise biopharmaceutique. Il affirme qu'une étude in vitro "ne peut représenter la complexité du vivant".

Objectifs

Cette étude est menée dans le cadre de prestations de services contractualisées pour le compte d’une entreprise biopharmaceutique spécialisée dans la recherche et le développement de nouveaux outils thérapeutiques et de diagnostic. Elle s’intéresse à l’évaluation in vivo d’une approche thérapeutique multimodale combinant des agents anti-cancéreux (chimiothérapie) avec de la thérapie interne par radio-isotopes dans le traitement du cancer.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de montrer l'intéret de la combinaison de la chimiothérapie avec une radiothérapie interne à l'iode-131 dans le traitement du cancer.

Procédures

Les animaux recevront une administration par gavage de chimiothérapie pendant 14j consécutifs. Ils recevront également une administration par gavage ou par injection intraveineuse d'iode-131 (1 seule fois ou 2 fois à une semaine d'intervalle)

Impact sur les animaux

Des effets indésirables de la chimiothérapie couplée ou non à l'administration d'iode-131 ne sont à pas exclure. La surveillance quotidienne des animaux permettre de réagir rapidement dès l'appartition de signes cliniques avec une prise en charge médicamenteuse ou une mise à mort de l'animal en cas d'atteinte des points limites définis.

Devenir

A l'issue du projet, tous les animaux seront mis à mort par surdosage d'anesthésie gazeuse puis dislocation cervicale en vue d'analyses ex vivo.

Remplacement

La validation de nouvelles thérapeutiques requiert la détermination de paramètres pharmacocinétiques des molécules candidates sur des modèles animaux adaptés. En effet, la physiologie globale de l’individu entre en jeu et une étude ex vivo ou in vitro ne peut représenter la complexité du vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience du laboratoire sur l'analyse desparamètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux nécessaire est réduit au maximum en sélectionnant uniquement les expérimentations essentielles. Le nombre d'animaux a été calculé afin de garantir une valeur statistique à l'étude menée.

Raffinement

Un enrichissement des cages d’hébergement sera assuré par l'ajout de briquettes de bois. Pour legavage des animaux, ceux-ci seront habitués à la contention par l'expérimentateur avant le début des procédures. Par ailleurs, les animaux seront suivis de façon quotidienne à l’aide de feuille de score de façon à détecter tout signe d’inconfort et de permettre une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis.

Choix des espèces

La validation de nouvelles cibles thérapeutiques requiert la détermination de paramètres pharmacocinétiques des molécules candidates sur des modèles animaux adaptés. En effet, la physiologie globale de l’individu entre en jeu et une étude ex vivo ou in vitro ne peut représenter la complexité du vivant. L'implantation d'une tumeur humaine chez l'animal est possible uniquement chez des individus immunodéprimés. Ainsi la souris immunodéprimée est préférée pour cette étude. Les souris utilisées sont des immunodéficientes adultes de 4-6 semaines d’environ 25 grammes qui sont adaptées à la croissance des tumeurs.

318 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un état de mal épileptique est induit par injection de kaïnate et un implant crânien est posé pour l'enregistrement EEG, pour étudier le lien entre crises épileptiques et neurodégénérescence. Le porteur indique que les décharges peuvent provoquer un arrêt cardiaque ou conduire l'animal à se blesser dans 10 % des cas, et prévoit la mise à mort des souris perdant plus de 15 % de leur poids. Il affirme qu'il n'existe "pas de modèle alternatif" pour observer les crises et le déclin cognitif.

Objectifs

L'association entre crise épileptique et neurodégénérescence a été observée en clinique. Malgré ça, à l’heure actuelle, aucune étude n’a intégré des modèles précliniques pour examiner systématiquement comment des crises épileptiques peuvent accélérer des processus de neurdégénérescences et en cours de vieillissement. Dans ce projet, nous allons tester les hypothèses suivantes : i) les crises épileptiques suffisent à déclencher les voies amyloïdes et l’hyper phosphorylation de tau dans le cerveau ; ii) ces effets sont plus sévères au cours du vieillissement. Cette exploration est importante, au vu de l’incidence croissante des épilepsies et des comorbidités neurologiques chez la personne âgée.

Bénéfices attendus

Pouvoir mettre en évidence une corrélation pathophysiologique entre une crise épileptique qui arriverait pendant le vieillissement et le développement de la maladie d'Alzheimer.

Procédures

- Entre 2 et 5 injections intra-péritonéales sur une durée de 2 heures - Une procédure chirurgicale d'une durée de 40 minutes.

Impact sur les animaux

L'induction d'un status epilepticus sur la souris engendre des décharges neuronales fortes. Celles-ci peuvent provoquer un arrêt cardiaque ou entrainer l'animal à se blesser dans la cage (morsure de la langues). Ces effets sont observés dans 10 % des cas. L'injection, si nécessaire, de diazépam entraine une somnolence de l'individu avec absence d'hydratation (comblée par une IP de solution saline stérile) et d'alimentation pendant plusieurs heures. La pose d'un implant crânien pour suivi électroencéphalographique peut entrainer un inconfort temporaire, signe de grattage plus intense au niveau de celui-ci.

Devenir

A la suite de la procédure 1, les animaux seront mise à mort par CO2 car leur utilisation est terminée. Les animaux de la procédure 2 seront mise a mort comme décrit dans la procédure pour prélèvement d'organes.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle alternatif pour observer les crises épileptiques et le déclin cognitif (maladie d'alzheimer) dans leur globalité.

Réduction

Cette étude permettra de faire des analyses en longitudinales sur les animaux d'un an puisque le comportement sera effectué sur les méme animaux que le prélèvement d'organes. De plus, Nous avons prévu de créer une banque d'échantillons à partir des prélèvements qui seront effectués (organes et sang). Elle nous servira à la suite du projet ou encore pour des études préliminaires pour des nouveaux.

Raffinement

Le raffinement passe par le maintien de l'enrichissement dans les cages notamment en cas d'isolement des souris pour les besoins de l'expérience. La socialisation sera de nouveau rendue possible quand les contraintes expérimentales le permettront. Tous les animaux seront surveillés lors de la procédure 1 et un SE supérieur à 2 H entrainera l'injection IP de diazépam à 0.5mg/kg pour stopper les crises et éviter ainsi une surmortalité. Pour la procédure 2 avec chirurgie, une grille de score (ci-joint) sera établie et permettra par exemple de : -procéder à une désinfection en cas de palie ou de suture problématique sous isoflurane, -surveiller le poids de l'animal avec une mise à mort si perte > 15% et apport de nourriture appétente si perte entre 10 et 15%. Pour les enregistrement EEG, une habituation à la contention sera effectuée chaque jour pour minimiser les stress lors des enregistrements.

Choix des espèces

L'espèce souris a été choisi en fonction des modèles nécessaires à l'étude. Un modèle isomorphe est nécessaires. La mise en place d'un modèle épileptique artificiellement induit . La souris répond aux besoins scientifiques et aux règles des 3R. Le fond génétique C57Bl/6 est utilisé dans le modèle car il a pu montrer la meilleure réponse physiopathologique. Le modèle d'épilepsie utilisé ici, induit par injection de kainate est un modèle connu et robuste. Il permet l'étude de la physiopathologie de l'épilepsie. Les animaux utilisés sont des adultes mâles agés de 2 mois, 6 mois et 9 mois. Les souris seront gardées au long court pour les points de prélèvement à 6 mois, 9 mois et 1 an. Nous allons induire une crise épileptique a des stades différents de la vie pour évaluer les conséquences de celle-ci en fonction de l'âge.

108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de tamoxifène pendant quatre jours puis six séances d'électrostimulation du mollet sous anesthésie générale, pour étudier le rôle d'une protéine du métabolisme énergétique dans les cellules souches musculaires. Le porteur décrit un projet de recherche fondamentale et affirme que l'analyse détaillée du tissu musculaire ne peut se faire sur "animal entier vivant", ce qui justifie la mise à mort de toutes les souris. Il indique que l'électrostimulation ne peut être reproduite in vitro et conclut au caractère "indispensable" du modèle animal.

Objectifs

Le maintien de la quantité et de la qualité du tissu musculaire strié squelettique est crucial pour une bonne qualité de vie, et est facilité par la remarquable capacité de ce tissu à s’adapter soit à une augmentation de l’activité musculaire (exercice physique) soit à une diminution de l’activité musculaire (immobilisation, alitement prolongé). Les cellules souches musculaires (les cellules satellites) ont une contribution importante à cette capacité d’adaptation du tissu musculaire grâce à leur capacité de différenciation et de fusion avec les fibres musculaires, processus conduisant à une accumulation de noyaux au sein des fibres musculaires. Cette accumulation de noyaux au sein des fibres musculaires dépend des propriétés énérgétiques des cellules souches et de la fibre musculaire. Ainsi, des données obtenues sur des cultures cellulaires montrent qu’une protéine X régulant les processus énergétiques des cellules favorise l’accumulation de noyaux au sein des fibres musculaires. Il a également été démontré qu’un protocole d’exercice consistant à électrostimuler les muscles du mollet de souris saines se traduit par une augmentation du nombre de noyaux au sein des fibres musculaires. Nous avons donc pour objectif d’utiliser ce protocole d’exercice par électrostimulation afin d’étudier le rôle de la protéine X dans l’accumulation de noyaux générée par l’exercice. Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des cellules souches musculaires dans le maintien du bon fonctionnement du muscle strié squelettique et l’influence d’une protéine dont la fonction est de réguler les processus énergétiques cellulaires.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche fondamentale permet de mieux comprendre le rôle d’une protéine régulant les processus énergétiques des cellules souches dans le fonctionnement du tissu musculaire.

Procédures

Chaque animal recevra une injection par jour de tamoxifène ou d’huile en intra péritonéale pendant 4 jours. Chaque animal sera ensuite soumis à 6 séances d’exercice d’électrostimulation du mollet réparties sur une période de 7 jours (i.e., 3 séances consécutives, 1 jour de repos, 3 séances consécutives). Chaque séance d’exercice d’électrostimulation sera réalisée sous anesthésie générale et durera un maximum de 20 minutes. Afin d’évaluer la progression du cycle cellulaire des cellules souches musculaires, les animaux seront supplémentés à l’aide d’un analogue de la thymidine (0,5 mg/ml repris dans une solution glucosée à 1%) administré dans l’eau de biberon 24h avant la première séance et jusqu’à la fin de la procédure expérimentale (soit pendant 8 jours consécutifs).

Impact sur les animaux

Des nuisances et effets indésirables "modérés" sont attendus du fait d’un cumul d’actes (injections ip, électrostimulation, anesthésies). L’injection de tamoxifène dans les animaux adultes n’induit pas en soi de phénotype dommageable comme montré dans des études précédentes. Les données de la littérature ne rapportent pas d’effets indésirables de l’administration d’EdU dans l’eau de biberon. Il a été démontré que le protocole d’exercice par électrostimulation n’induit aucune altération de la fonction et de la structure musculaire ainsi qu’aucun changement de mobilité, d’activité et de comportement des animaux. Aussi, il a été démontré que les anesthésies répétées à l’isoflurane liées au protocole d’électrostimulation n’induisent pas de troubles anxieux ou de modifications du comportement, de l’activité et de la mobilité des animaux. Les animaux ne présentent aucun signe de prostration ou d’amaigrissement et sont en mesure de se mouvoir, de s’alimenter et de s’hydrater normalement dès leur réveil. Enfin, aucun animal n’a dû être mis à mort du fait de la procédure d’exercice par électrostimulation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort car le projet nécessite une analyse détaillée du tissu musculaire qui ne peut pas être réalisée sur animal entier vivant.

Remplacement

Pour ce projet, les modèles animaux sont indispensables car la procédure implique un exercice d’électrostimulation qui est impossible à reproduire in vitro. Aussi, les études de physiologie nécessitent l'utilisation de modèles animaux car seule l'analyse du tissu, voire de l'organisme entier permet d'identifier le réel impact de ces interactions moléculaires et cellulaires sur la fonction de l'organe

Réduction

Nous utilisons un dispositif expérimental totalement non-invasif qui permet de réaliser des protocoles d’électrostimulation et de mesurer la force musculaire de manière concomitante sur les mêmes animaux rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Nous proposons d’établir des banques biologiques informatisées issues des expérimentations qui pourront à terme limiter l'utilisation de nouveaux animaux. Des prélèvements multiples sont réalisés après euthanasie sur le même individu pour des tests parallèles. L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectués précédemment pour ces procédures. Les analyses statistiques précédentes de l'équipe permettent d'ajuster le nombre d'animaux requis. La taille de l’échantillon (12 animaux par condition) a été déterminée en prévoyant, à l’aide de tests statistiques adaptés, une augmentation de 15% du nombre de noyaux par fibre à l’issue du protocole d’électrostimulation chez les animaux contrôles

Raffinement

Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. Les procédures expérimentales utilisées incluent un recours systématique à l'anesthésie générale profonde lors de l’exercice d’électrostimulation. Des mesures sont prises pour améliorer les conditions d'élevage afin d'enrichir l'environnement des souris. Aussi, un suivi quotidien des animaux permet d’éviter toute souffrance inutile et de prendre les mesures adéquates dans le cas d’un éventuel phénotype dommageable

Choix des espèces

Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'homme dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin permet d’invalider la protéine X soit dans la fibre musculaire, soit dans la cellule souche afin d’évaluer les impacts fonctionnels, tissulaires et cellulaires sous-jacents. Les processus physiologiques impliqués dans l’homéostasie du muscle squelettique ont été largement décrits chez des animaux adultes. Les animaux seront utilisés entre 8 et 12 semaines d'âge.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une bactériémie à staphylocoque doré résistant à la méticilline leur est provoquée par injection dans la veine de la queue, avec prélèvements sanguins quotidiens pendant dix jours, pour étudier le rôle protecteur de la protéine cavéoline-1. Le porteur indique que l'aggravation de l'infection conduit à prostration, cyanose et perte de poids, la mise à mort étant alors anticipée. Il reconnaît qu'une étude sur cellules a déjà établi le rôle de la cavéoline-1, mais affirme que la confirmation "doit" passer par un modèle in vivo.

Objectifs

La famille des exotoxines EDIN (A, B et C) de S. aureus compromet la perméabilité vasculaire par induction de tunnels transcellulaires. Des résultats non publiés montrent que cavéoline-1, une protéine fortement exprimée dans les cellules endothéliales, limite la formation et l’élargissement de ces tunnels transencellulaires. La perte d’expression de la cavéoline-1 entraine i) un doublement du nombre des tunnels transcellulaires provoqués par l’EDIN et ii) l’élargissement de ces tunnels. Des études antérieures sur modèle souris ont montré que l’EDIN est responsable d’une plus grande capacité des bactéries à induire une augmentation de la perméabilité vasculaire, associée à une plus forte dissémination de S. aureus dans les tissus par voie hématogène. Basé sur des résultats obtenus in vitro, l’objectif de notre étude est de démontrer que la perte d’expression de la cavéoline-1 chez l’animal est responsable d’une hyper-susceptibilité des animaux à la bactériémie induite par la souche LUG1799 du clone ST80-SARM-IV PVL+ et que ceci est directement lié à l’activité de la toxine EDIN-B. La souche LUG1799 est représentative des souches de S. aureus résistantes à la méticilline, problème majeur en Europe et en France. Nous nous baserons sur des études précédentes pour limiter le nombre d’animaux engagés dans cette étude et par une approche d’analyse statistique pour définir le nombre d’animaux par groupe.

Bénéfices attendus

Des travaux antérieurs ont permis de montrer un lien causal entre la formation des tunnels transendothéliaux induits par l’exotoxine EDIN de S. aureus et la survenue de dysfonctions vasculaires : œdème et hémorragie. De plus un exemple de formation transitoire de tunnels transcellulaires en physiologie est décrit lors de la transmigration des leucocytes à travers l’endothélium. Bien qu'elle ait été longtemps controversée, la première preuve de transcytose de leucocytes au travers des cellules endothéliales a été démontrée in vivo et/ou in vitro pour les monocytes, les neutrophiles, les lymphocytes, grâce à l’imagerie confocale à haute résolution. L'intégrité de la barrière endothéliale est maintenue lors de la diapédèse des leucocytes au travers des cellules endothéliales grâce à la formation d'un anneau d’actine-myosine qui est étroitement ajusté à la taille des leucocytes. Cet anneau stabilise le pore pendant le passage des leucocytes empêchant la fuite de plasma et la formation associée d'œdème. La formation de tunnels transcellulaires de taille régulée est aussi essentielle pour permettre l'écoulement de l'humeur aqueuse. Le dysfonctionnement de ces tunnels transcellulaires affecte la résistance à l'écoulement avec augmentation de la pression intraoculaire, provoquant le glaucome. Les protéines responsables de la régulation de ces tunnels transcellulaires sont largement inconnues. Nous avons identifié le rôle inhibiteur de la cavéoline-1 sur la formation et l’élargissement des tunnels transcellulaires induits par l’EDIN. Cette étude permettra de démontrer le rôle protecteur de la cavéoline-1 lors de la bactériémie induite par une souche clinique de S. aureus ST80-SARM-IV edinB+ et ouvrira à une meilleure compréhension de la régulation des tunnels transcelluaires dans les processus physiologiques et pathophysiologiques.

Procédures

Cette procédure consiste en l’administration de S. aureus par injection intravasculaire dans la veine de la queue avec suivi de la bactériémie par prélèvement sanguin quotidien de 20 microlitres (3 minutes par intervention) durant 10 jours. Cette procédure est néanmoins modérée car conduit à une mise à mort anticipée des animaux lors de l’apparition d’un phénotype caractéristique d’aggravation de la bactériémie.

Impact sur les animaux

Des expériences antérieures ont montré que des souris transgéniques invalidées pour le gène de la cavéoline-1 du même fond génétique que celle que nous élevons (C57BL/6, 12-14 semaines) une fois infectées par voie intravasculaire (veine de la queue) par 103 CFU de Salmonella typhimurium souche SB300 meurent en 7 jours (temps ½) alors que les souris sauvages meurent en 13 jours. Cet effet de susceptibilité à l’infection est à mettre en parallèle avec une translocation accrue des bactéries vers le foie avec formation de larges granulomes et translocation dans la rate, une forte augmentation de marqueurs de la réponse immunitaire (IFN-gamma, IL-6, TNF-alpha) dans le sang et la production de taux élevés de NO dans le sérum. Cette réponse péjorative de marqueurs immunitaires est récapitulée par l’injection de LPS de S. typhimurium. Les souris lors de l’infection meurent plus rapidement du fait d’une réaction immunitaire élevée et translocation de Salmonella plus forte dans les organes essentiels. Aucune étude à ce jour n’a permis de définir si des souris invalidées dans le gène de la cavéoline-1 sont plus susceptibles à des bactériémies induites par des bactéries à Gram-positif, S. aureus étant la plus fréquemment isolée dans la bactériémie à Gram-positif chez l’homme que l’infection soit d’origine nosocomiale ou communautaire. Un ensemble de résultats obtenus in vitro sur cellules primaires endothéliales humaines concordent pour indiquer que la perte d’expression de la cavéoline-1 entraine une augmentation du nombre et du diamètre des tunnels transendothéliaux provoqués par les exotoxines EDIN (A, B et C). Nous chercherons à prouver chez l’animal invalidé pour la cavéoline-1 que lors de la bactériémie à S. aureus produisant l’EDIN-B les animaux montrent des signes d’hyper-susceptibilité à l’infection du fait d’induction de fuites vasculaires. Nous suivrons l’évolution de la bactériémie provoquant un phénotype caractéristique de bactériémie aggravée conduisant à la prostration, immobilité, apathie, des animaux avec hérissement des poils, le tremblement, la cyanose, et perte de poids significative de plus de 20%. Ce suivi des animaux permettra une mise à mort anticipée des souris présentant un phénotype de bactériémie aggravée.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure.

Remplacement

Une étude de biologie cellulaire conduite sur cellules endothéliale en remplacement d’expériences sur l’animal nous permet d’affirmer que la cavéoline-1 est un gène de susceptibilité à la formation de tunnels transendothéliaux qu’induit l’EDIN. La formation de ces tunnels transendothéliaux corrèle avec l’apparition de fuites vasculaires. Cette approche de remplacement de type biologie cellulaire nous a permis de limiter le nombre de gènes de susceptibilité à l’EDIN à étudier pour ne sélectionner que la cavéoline-1. Le rôle protecteur de la cavéoline-1 dans l’infection bactériémique par une souche de S. aureus produisant l’exotoxine EDIN-B doit être confirmée par une approche in vivo.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux engagés dans cette étude nous procèderons en étapes successives avec une seule procédure de « suivi d’aggravation de la bactériémie » et nous définirons le nombre d’animaux par groupe grâce à un calcul statistique de puissance. Pour l'étape 1 (établissement de la CFU50) les effectifs ont été calculés sur la base d'expériences précédentes sur d'autres modèles animaux. Pour les étapes 2, 3 et 4 les effectifs ont été calculés sur la base d'une analyse de puissance. Pour approximation, une analyse de puissance d'un test de comparaison de proportions a été réalisée, pour un risque 5%, une puissance de 80%, donnant des effectifs de 30 animaux par groupe. Ceci correspond à une différence entre les groupes variant de 0.13 à 0.35, suffisante pour répondre à la question biologique.

Raffinement

Une surveillance quotidienne des animaux selon la grille d’évaluation de la douleur du stress et inconfort du SBEA, nous permettra de détecter au plus tôt les points limites de souffrance de l’animal. Les points limites seront : des changements de comportement, tels que l'isolement dans le groupe, ainsi que prostration, immobilité, apathie, hérissement des poils, le tremblement, la cyanose, et une perte de poids significative (plus de 20%) seront mis à mort. Dans ces conditions, la mise à mort sera anticipée par dilacération cervicale pour abréger les souffrances de l’animal (technique validée 1A). Des cotons imbibés d’eau et de la nourriture « Dietgel » seront placés dans la cage dans le cas ou certaines souris auraient du mal à se déplacer.

Choix des espèces

Etude comparative de souris transgéniques invalidées dans le gène codant la cavéoline-1 de fond génétique C57BL/6 (B6.Cg-Cav1tm1Mls/J, Jackson via Charles River) versus souris sauvage « littermate ». Les souris C57BL/6 sont sensibles à l’infection intraveineuse par S. aureus (geste technique validé 18A). Nous savons d’expériences précédentes (n° dap160118) que l’injection de doses comprises entre 5x 106 et 5x 108 CFU suivant les souches de S. aureus conduit à un état de prostration, immobilité, apathie avec hérissement des poils, le tremblement, la cyanose, et une perte de poids significative de plus de 20% conduisant à une mise à mort anticipée de 50 % des animaux sur 10 jours. La valeur de CFU50 des souris C57BL/6 à l bactériémie LUG1799 sera déterminée dans l’étape n°1. La souris est l'espèce de choix pour l'étude de l'infection par S. aureus : espèce naturellement colonisée par S. aureus comme l'homme, pathogenèse infectieuse proche de celle de l'homme, espèce permissive à l'infection par S. aureus, littérature abondante. Notre étude portant sur l’infection de type bactériémie sera conduite sur des animaux de 8-16 semaines selon un protocole publié portant sur un modèle de souris invalidées dans le gène codant la cavéoline-1.