Oncologie

1 728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyser tumeurs et cellules immunitaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Greffées de cellules tumorales sous la peau, elles reçoivent de trois à onze injections d'un composé oncolytique associé à des hydrogels de chitosan, et leurs tumeurs sont mesurées au pied à coulisse tous les deux ou trois jours. Les tumeurs peuvent provoquer des douleurs locales, les traitements une perte d'appétit et de poids, pour des retombées cliniques que le porteur renvoie au "plus long terme". Il juge "indispensable" de confirmer in vivo des données obtenues in vitro, et affirme qu'aucune alternative ne permet d'étudier l'activation immunitaire.

Objectifs

Les approches d’immunothérapie anticancéreuse ont profondément modifié la prise en charge de certains cancers. Néanmoins, seule une fraction des patients présente une réponse durable, en particulier lorsque les tumeurs sont peu infiltrées par les cellules immunitaires. Notre composé est un composé oncolytique membranolytique conçu pour induire localement la mort des cellules tumorales. Cette lyse provoque la libération simultanée d’antigènes tumoraux et de signaux de danger, susceptibles d’activer le système immunitaire. Le projet vise à optimiser cette stratégie en combinant notre composé à différents hydrogels de chitosan. Le chitosan présente un double intérêt scientifique : il augmente la rétention intratumorale du composé grâce à ses propriétés de gel visqueux et mucoadhésif, et il possède des propriétés immunostimulantes/adjuvantes susceptibles de « primer » le microenvironnement tumoral en faveur d’une immunité anticancéreuse. Il existe différentes formulations de Chitosan qui influencent la viscosité, la libération locale du composé et l’immunomodulation. Nous commencerons par déterminer les formulations les plus aptes à potentialiser l’effet antitumoral de notre composé. Puis, les procédures suivantes nous permettront de définir les paramètres les plus favorables à l’obtention d’une réponse antitumorale durable. Nous utiliserons d’abord une approche vaccinale qui pourrait permettre d’exploiter l’effet oncolytique et immunogène de de notre composé sans dépendre uniquement d’une injection intratumorale directe, ce qui serait pertinent pour les lésions non injectables ou les maladies disséminées/métastatiques. Nous vérifierons ensuite si le blocage du point de contrôle immunitaire PD-1 améliore l’effet antitumoral du composé avec son chitosan et définirons plus précisément quels types de cellules immunitaires (Cellules T et/ou cellules dendritiques) sont à l’origine de cet effet.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra d’identifier les formulations de chitosan les plus aptes à potentialiser l’activité antitumorale de notre composé. L’étude fournira des informations importantes sur l’impact des propriétés physicochimiques du Chitosan, son efficacité thérapeutique et sa capacité à induire une réponse immunitaire antitumorale. Elle permettra également de mieux comprendre les mécanismes immunologiques associés à cette combinaison. Ces connaissances contribueront à optimiser l’utilisation de notre molécule et à définir les paramètres les plus favorables à l’obtention d’une réponse antitumorale durable. À plus long terme, les résultats pourraient soutenir le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques à visée translationnelle, notamment l’optimisation d’une formulation locale de notre composé destinée au traitement de tumeurs accessibles à une injection intratumorale, avec l’objectif d’améliorer l’efficacité clinique tout en limitant les administrations répétées.

Procédures

Les animaux recevront une injection sous anesthésie générale (2min) puis trois à onze injections sous anesthésie locale (vigile,

Impact sur les animaux

Les nuisances découleront des interventions et greffes suite à une injection de cellules tumorales sous anesthésie, des injections de traitements, par contention de l’animal avec anesthésie locale, des suivis de croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse tous les deux ou trois jours. Ces différentes manipulations pouvant entraîner du stress chez l’animal. Les croissances tumorales en sous-cutanées peuvent entraîner des douleurs locales et modérées. Les traitements médicamenteux peuvent entraîner une perte d’appétit modérée et donc une perte de poids modérée chez la souris ainsi qu’un possible changement léger de température.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées pour analyse des tumeurs et des cellules immunitaires après traitement.

Remplacement

Il est indispensable de réaliser des expériences in vivo chez la souris afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude de l’activation du système immunitaire et son effet sur la croissance tumorale.

Réduction

Chaque groupe comprendra 10 souris, soit 9 animaux nécessaires définis par un logiciel de statistique spécifique et 1 animal supplémentaire pour tenir compte des exclusions possibles (tumeurs hétérogènes au moment du traitement, problème comportemental, atteinte précoce d’un point limite ou mortalité non liée au traitement). Les deux sexes seront utilisés, avec des lots non mixtes, afin de détecter d’éventuelles différences liées au sexe sans risque d’accouplement ni agressivité liée au mélange des animaux. Les expériences seront conduites de manière séquentielle : seules les meilleures formulations identifiées dans les procédures initiales seront poursuivies dans les procédures mécanistiques ultérieures, ce qui limite le nombre d’animaux exposés. Les contrôles seront mutualisés lorsque cela est possible et l’étude sera arrêtée si les premières expériences ne soutiennent pas l’hypothèse scientifique.

Raffinement

Le milieu est enrichi à l’aide de sizzlenests, tunnels, maisons. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. La mise en place d’une grille de suivi stricte des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation, des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tous changements.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par plusieurs raisons. Tout d’abord, la souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. Par ailleurs, il s’agit d’un animal très utilisé en oncologie, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. Enfin, la méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux sont utilisés au stade adulte (7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire mature.

Deux séances d'imagerie par bioluminescence sous anesthésie chaque semaine, jusqu'à douze semaines, et autant de contentions pour des injections dans le péritoine : 128 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever la tumeur et d'autres organes. Certaines subissent une chirurgie pour recevoir des cellules cancéreuses dans la prostate, avec un risque d'inflammation chronique et d'incontinence urinaire, d'autres une injection sous la peau dont la tumeur peut devenir nécrotique et douloureuse. Ce projet pilote sert à mettre au point des greffes tumorales, avant de futures études sur les macrophages. Le porteur présente l'effectif comme "le minimum requis", tout en écrivant que l'étude se passe de toute analyse statistique.

Objectifs

Le cancer de la prostate (CaP) représente le premier cancer chez l'homme en France. La majorité des patients CaP évolue favorablement, mais environ 20% de ces patients développent une maladie agressive avec l’apparition de métastases. Pour ces patients, des hormonothérapies visant à bloquer la voie du récepteur des androgènes (RA) et de la chimiothérapie sont proposées, mais des résistances apparaissent amenant au décès de près de 8700 patients chaque année. La compréhension des mécanismes de résistance thérapeutique est donc l’un des grands enjeux dans le domaine du CaP. Il a été montré ces dernières années que les cellules non cancéreuses comme les macrophages associés aux cellules tumorales (TAM) participent au développement du CaP et à sa résistance aux traitements. Nous souhaitons étudier l’impact des différents traitements, dont l’hormonothérapie, sur ces TAM dans un contexte tumoral. L’objectif de ce projet est de mettre en place des modèles de croissance tumorale prostatique utilisant des cellules cancéreuses murines. Ces lignées seront injectées chez des souris ayant un système immunitaire fonctionnel. Ces cellules proviennent de la même souche de souris ce qui permet à la tumeur de se développer. Les cellules tumorales seront injectées dans deux conditions : en sous-cutanée ou en intra-prostatique. Plusieurs lignées cellulaires et plusieurs quantités de cellules seront testées pour mettre au point les modèles. Enfin la mise en place de ces modèles sera également testée dans une lignée de souris possédant des macrophages de fluorescences différentes selon leur provenance ce qui permet d’étudier l’hétérogénéité des macrophages au sein des tissus.

Bénéfices attendus

Les études récentes montrent une implication de plus en plus importante des cellules immunitaires et en particulier des macrophages dans de nombreuses pathologies, notamment le cancer et les maladies inflammatoires. La mise en place de ces modèles est un départ essentiel qui permettra d’étudier par la suite le rôle des macrophages dans un contexte de tumeur prostatique et permettra à moyen terme de mieux comprendre leur hétérogénéité et leur complexité notamment lors des différents traitements de chimiothérapie et d’hormonothérapie. A plus long terme ce projet permettra d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le cancer de la prostate afin d’éviter la résistance aux traitements.

Procédures

Les animaux au cours de ce projet seront soumis à des injections dans le péritoine et des contentions régulières (deux fois par semaines pendant 12 semaines au maximum). Certaines souris subiront une chirurgie pour une injection de cellules cancéreuses de la prostate. Elles subiront également des prises d’images de bioluminescence sous anesthésie (deux fois par semaines pendant 12 semaines au maximum).

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus seront dus à l’acte chirurgical et à la croissance des tumeurs. La croissance tumorale sous-cutanée peut engendrer un inconfort de déplacement, parfois des nécroses et des douleurs chroniques si la taille tumorale devient trop importante. La croissance tumorale intra-prostatique peut engendrer une inflammation chronique et une incontinence urinaire. Les injections sous-cutanées peuvent entrainer une légère douleur transitoire. Tous les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière afin de détecter précocement tout signe de souffrance.

Devenir

A la fin de la procédure expérimentale les animaux seront mis à mort afin de prélever la tumeur et différents organes pour étudier le système immunitaire dans ces différents organes.

Remplacement

Des modèles cellulaires permettent d’étudier les macrophages dans des systèmes simples et l’étude des tissus de patients permettent d’intégrer ces données à des moments définis. Cependant l’étude dynamique de la complexité des populations de macrophages et notamment de l’impact des systèmes hormonaux et de leur inhibition (hormonothérapie) sur ces populations nécessite l’utilisation de modèles animaux.

Réduction

Ce projet est une étude pilote qui permettra de mettre en place des modèles de croissance tumorale prostatique chez la souris présentant un système immunitaire fonctionnel. Cette étude ne nécessite pas d’analyse statistique. Le nombre d’animaux présenté est le minimum requis pour s’assurer de la mise en place du modèle. Il permettra d’obtenir des données sur la variabilité de la croissance tumorale qui serviront par la suite à calculer le nombre d’animaux nécessaire aux prochaines études. Pour la greffe intra-prostatique, l’utilisation d’une imagerie du petit animal par bioluminescence permettant de suivre de manière non invasive dans le temps la croissance tumorale et de réduire le nombre d’animaux nécessaire.

Raffinement

L’environnement d’hébergement sera enrichi par l’ajout systématique d’au moins deux éléments parmi du papier kraft, des carrées de coton, une maison en cellulose et un bout de bois à ronger accroché à la cage. Ces enrichissements permettront de diminuer fortement le stress et de favoriser les comportements naturels des souris. Un suivi quotidien des souris tout au long des procédures sera effectué et une évaluation bihebdomadaire de leur état sera effectuée à l’aide d’une grille de score. Cette grille permettra de détecter précocement tout signe de souffrance. L’injection intra-prostatique se fera sous anesthésie générale. Une analgésie pré- et post-opératoire sera administrée systématiquement afin de contrôler la douleur.

Choix des espèces

L'étude de la complexité des populations de macrophages lors de la croissance tumorale et particulièrement de l’impact des systèmes hormonaux sur ces populations sont des éléments importants pour comprendre le fonctionnement et le rôle du système immunitaire dans le cancer. Dans la littérature scientifique, la souris est l’espèce la plus largement utilisée comme modèle du cancer en général et plus particulièrement du cancer de la prostate. Elles sont un moyen unique de suivre et d'étudier les cellules immunitaire d'intérêts dans le cadre du cancer. Les souris de ce projet seront âgées de 6 à 8 semaines (matures d’un point de vue hormonal) et seront uniquement des mâles car seuls les mâles possèdent une prostate et les cellules tumorales prostatiques ont besoin des androgènes (testostérone) pour croitre.

380 souris vont être utilisées, chacune opérée du cerveau pendant une à quatre heures pour recevoir des implants, puis soumise à des séances comportementales allant jusqu'à trois heures par jour. Toutes sont tuées à l'issue pour vérifier la position des implants et analyser le tissu cérébral, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant onze jours au plus, elles subissent jusqu'à onze injections et une restriction alimentaire qui maintient leur poids à au moins 85 % de la normale, restriction que le porteur dit destinée à entretenir leur "motivation". Les tâches, décrites comme l'apprentissage d'une règle puis son changement, ne sont pas nommées. Les retombées pour la schizophrénie ou l'autisme sont renvoyées au "plus long terme".

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre comment certains réseaux neuronaux participent à la flexibilité cognitive, c’est-à-dire à la capacité d’abandonner une stratégie devenue inadaptée afin d’en adopter une nouvelle. Nous chercherons à identifier comment certaines populations neuronales contribuent au maintien de comportements stables mais également à leur mise à jour lorsque les conditions changent. Pour répondre à cette question, nous utiliserons des approches complémentaires chez la souris. Les animaux réaliseront des tâches comportementales permettant d’étudier l’apprentissage initial d’une règle comportementale puis l’adaptation nécessaire lorsque cette règle change. Pendant ces tâches, l’activité neuronale pourra être enregistrée chez des animaux éveillés et libres de leurs mouvements afin de caractériser les dynamiques d’activité associées à l’apprentissage, aux erreurs comportementales et aux changements de stratégie. Nous étudierons également comment certaines populations cellulaires influencent ces mécanismes et peuvent favoriser des comportements persévérants lorsque l’adaptation comportementale échoue. Les données obtenues permettront une meilleure compréhension des mécanismes cérébraux impliqués dans la flexibilité cognitive et pourraient contribuer à l’identification de nouvelles pistes thérapeutiques pour des troubles neurologiques et psychiatriques associés à des déficits d’adaptation comportementale.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de faire progresser les connaissances sur les mécanismes neuronaux permettent l’adaptation du comportement lorsque les règles de l’environnement changent. Les travaux fourniront des données détaillées sur les dynamiques d’activité neuronale associées à l’apprentissage, aux erreurs comportementales, aux changements de stratégie et aux comportements persévérants. Grâce à la combinaison d’approches complémentaires ce projet permettra d’étudier de manière précise le rôle de différentes populations neuronales dans le contrôle des comportements flexibles. Les données obtenues permettront également de mieux comprendre comment certaines perturbations de l’activité inhibitrice peuvent altérer les capacités d’adaptation comportementale. À plus long terme, ces travaux contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes cérébraux impliqués dans plusieurs troubles neurologiques et psychiatriques associés à des déficits cognitifs et à une rigidité comportementale, notamment la schizophrénie, l’autisme et certains troubles neurodéveloppementaux. Ces résultats pourront contribuer au développement futur de nouvelles hypothèses et approches thérapeutiques ciblant les circuits neuronaux impliqués dans ces déficits. Les données produites dans le cadre du projet pourront également contribuer au développement de nouvelles approches visant à mieux comprendre le fonctionnement des réseaux neuronaux impliqués dans la prise de décision et l’adaptation comportementale.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie du cerveau unique sous anesthésie générale. Cette chirurgie durera entre 1 et 4 heures selon les implants réalisés. Dans certains groupes d'imagerie, une seconde courte sous anesthésie générale pourra être réalisée une seule fois; cette intervention durera 30 à 60 minutes. Les animaux pourront recevoir au maximum 5 injections sur 5 jours consécutifs, selon les lignées utilisées. Pour certaines expériences, les animaux pourront recevoir une autre injection avant certaines séances expérimentales, avec un maximum d'une injection par séance et de 11 injections par animal sur l'ensemble de la période comportementale. Après récupération post-opératoire, les animaux seront progressivement habitués aux manipulations expérimentales et aux dispositifs d’enregistrement. Les séances comportementales dureront entre 30 minutes et 3 heures maximum par jour. La période comportementale, incluant l'habituation finale la restriction alimentaire contrôlée, les enregistrements et/ou les manipulations, durera au maximum 11 jours par animal. Une restriction alimentaire modérée pourra être mise en place uniquement pendant cette périodes comportementale, pour une durée maximale de 11 jours par animal. Le poids sera surveillé quotidiennement et maintenu à au moins 85 % du poids ad libitum. Les animaux seront ensuite replacés en hébergement collectif avec leurs congénères lorsque cela sera compatible avec leur état clinique et l'intégrité des implants.

Impact sur les animaux

Ce projet implique des chirurgies du cerveau réalisées sous anesthésie générale pouvant durer entre 1 et 4 heures selon la complexité des implants. Ces interventions sont susceptibles d’entraîner une douleur légère à modérée pendant quelques jours après la chirurgie, ainsi qu’une gêne transitoire liée à la cicatrisation et à la présence des implants chroniques. Les animaux subiront également des manipulations répétées, des périodes d’habituation aux dispositifs expérimentaux, des connexions aux systèmes d’enregistrement et, pour certains protocoles, un hébergement individuel temporaire. Ces procédures pourront induire un stress modéré transitoire. Les tâches comportementales nécessiteront une restriction alimentaire contrôlée destinée à maintenir la motivation des animaux. Cette restriction pourra entraîner une diminution modérée et réversible du poids corporel. Les nuisances attendues au cours du projet sont donc principalement : une douleur post-opératoire légère à modérée et transitoire, une gêne liée aux implants chroniques, un stress modéré associé aux manipulations et aux procédures comportementales, ainsi qu’une perte de poids légère et réversible liée à la restriction alimentaire.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet ne pourront pas être replacés ou adoptés à l’issue des procédures expérimentales. Une partie des animaux sera maintenue en vie de manière séquentielle entre certaines procédures compatibles du projet afin de permettre la réalisation des enregistrements comportementaux et des analyses prévues. La poursuite des expérimentations sera conditionnée à l’état de bien-être des animaux et à l’absence de signes de douleur ou de détresse incompatibles avec la poursuite des procédures. À l’issue du projet, tous les animaux seront mis à mort selon les méthodes réglementaires prévues afin de permettre la réalisation des analyses finales nécessaires aux objectifs scientifiques du projet. Ces analyses incluront notamment l’étude des tissus cérébraux, la vérification de la localisation des implants et des injections ainsi que l’évaluation de l’expression des marqueurs expérimentaux. Les animaux ne pourront pas être réutilisés dans d’autres projets en raison des chirurgies intracérébrales, des implants chroniques, des manipulations expérimentales réalisées et des prélèvements tissulaires finaux nécessaires aux analyses scientifiques.

Remplacement

Il n’existe actuellement pas d’alternative non animale permettant d’étudier de manière complète les mécanismes cérébraux impliqués dans la flexibilité cognitive et l’adaptation du comportement lorsque les règles de l’environnement changent. Les objectifs du projet nécessitent l’étude de l’activité de réseaux neuronaux intacts pendant des comportements complexes impliquant perception, apprentissage, prise de décision et modification de stratégie comportementale. Les cultures cellulaires, modèles informatiques ou autres approches in vitro ne permettent pas de reproduire l’organisation complète des circuits cérébraux, les interactions entre différents types cellulaires, ni les comportements cognitifs étudiés dans ce projet. De plus, les expériences nécessitent l’étude de l’activité neuronale chez des animaux éveillés réalisant des tâches comportementales, ce qui ne peut pas être reproduit par des méthodes alternatives. L’utilisation d’animaux vivants est donc nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Le nombre d’animaux sera limité autant que possible et plusieurs analyses complémentaires pourront être réalisées à partir d’un même animal afin de maximiser les données obtenues.

Réduction

Le nombre total d’animaux inclus dans ce projet a été estimé en tenant compte des objectifs scientifiques et des mesures de réduction mises en œuvre afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux. Plusieurs analyses complémentaires pourront être réalisées à partir d’un même animal, notamment les expériences comportementales, les enregistrements d’activité cérébrale, l’imagerie et les analyses histologiques finales, afin de maximiser les données obtenues pour chaque animal utilisé. Le nombre d’animaux sera également réduit grâce à l’utilisation de protocoles expérimentaux standardisés, à l’expérience des expérimentateurs et à l’optimisation des procédures chirurgicales et comportementales, permettant de limiter les pertes expérimentales et la variabilité des résultats. Lorsque cela sera possible, les tissus prélevés pourront également être utilisés pour plusieurs analyses complémentaires. Les animaux ne pourront généralement pas être réutilisés après certaines procédures en raison des implants chroniques, des manipulations expérimentales réalisées ou des analyses terminales nécessaires à la collecte des tissus cérébraux. La taille des groupes expérimentaux sera déterminée à partir des données de la littérature, d’expériences antérieures et d’analyses statistiques adaptées afin d’obtenir des résultats scientifiquement interprétables tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Des tests statistiques paramétriques ou non paramétriques appropriés seront utilisés selon les données obtenues.

Raffinement

Toutes les mesures visant à réduire au minimum la douleur, la souffrance, l’angoisse et les dommages durables subis par les animaux seront appliquées tout au long du projet. Les protocoles expérimentaux ont été conçus afin de limiter le stress lié aux manipulations, aux chirurgies et aux tâches comportementales. Les animaux bénéficieront d’une période d’habituation aux expérimentateurs et aux dispositifs expérimentaux afin de réduire le stress associé aux procédures. Les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie adaptée et accompagnées d’une prise en charge analgésique appropriée. Une surveillance régulière des animaux sera effectuée après les procédures expérimentales afin d’évaluer leur état général, leur poids, leur activité locomotrice et l’apparition éventuelle de signes de douleur ou de détresse. Des points limites spécifiques et précoces seront appliqués afin d’éviter toute souffrance prolongée. Les conditions d’hébergement et d’enrichissement du milieu seront adaptées aux besoins physiologiques et comportementaux des animaux. Les expérimentateurs impliqués dans le projet sont formés aux procédures expérimentales et au suivi du bien-être animal. Les protocoles expérimentaux pourront être ajustés au cours du projet afin d’intégrer toute nouvelle méthode de raffinement permettant d’améliorer le bien-être des animaux ou de réduire les nuisances expérimentales.

Choix des espèces

La souris est un modèle largement utilisé pour l’étude des fonctions cognitives et des mécanismes cérébraux impliqués dans l’apprentissage, la mémoire et la flexibilité comportementale. Les propriétés fondamentales des circuits neuronaux chez la souris sont comparables à celles observées chez d’autres mammifères, ce qui permet d’obtenir des connaissances pertinentes pour la compréhension du fonctionnement cérébral normal et pathologique. Cette espèce permet également la réalisation d’approches expérimentales complémentaires chez un même animal. Les souris présentent en outre l’avantage de pouvoir être génétiquement modifiées afin d’étudier le rôle de populations neuronales spécifiques impliquées dans les comportements étudiés. Les lignées transgéniques utilisées dans ce projet présentent des phénotypes compatibles avec les objectifs expérimentaux et ne présentent pas d’altérations majeures du comportement ou de l’état général en dehors des manipulations expérimentales réalisées dans le cadre du projet. Les souris seront incluses dans la procédure à partir d’environ 5 semaines d’âge selon les cohortes expérimentales. Les chirurgies du cerveau pourront être réalisées à partir de cet âge afin de permettre une période suffisante de récupération post-opératoire et d’expression virale avant le début des tâches comportementales ou des analyses terminales. Les tâches comportementales et les enregistrements in vivo seront réalisés après la période de récupération et d’expression virale, chez des animaux adultes ou jeunes adultes, à un stade de développement compatible avec les objectifs du projet. Ce choix permet de réaliser les implants chroniques suffisamment tôt tout en effectuant les mesures comportementales et physiologiques après maturation adaptée des circuits cérébraux étudiés.

752 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant quatre semaines, une partie d'entre elles subit des changements d'environnement, des bruits et des perturbations lumineuses, reçoit une pompe sous la peau qui élève la pression artérielle, ou se voit implanter un dispositif d'imagerie miniaturisé dans le cerveau au cours d'une chirurgie d'environ une heure. L'équipe cherche à savoir si le stress chronique rend les petits vaisseaux cérébraux plus vulnérables à l'hypertension, et soumet les souris à des tests de mémoire et de comportement qu'elle ne nomme pas. Elle qualifie ce protocole de stress de "sans douleur", tout en indiquant qu'il peut réduire la prise alimentaire, altérer le pelage et diminuer l'activité.

Objectifs

L'hypertension artérielle est la première cause modifiable d'une maladie qui touche les petits vaisseaux du cerveau et qui peut entraîner, avec le temps, des troubles de la mémoire et de la concentration. Certaines personnes développent des atteintes cérébrales sévères malgré un bon contrôle de leur tension artérielle, ce qui suggère l'existence d'autres facteurs aggravants. Le stress chronique (lié par exemple au travail, à l'isolement social ou aux difficultés financières), auquel les femmes sont particulièrement exposées, pourrait être l'un de ces facteurs : il fragiliserait les petits vaisseaux du cerveau et les rendrait plus sensibles aux effets néfastes de l'hypertension. Ce projet a quatre objectifs : identifier les zones du cerveau les plus sensibles à cette combinaison stress-hypertension ; mesurer, grâce à des techniques d'imagerie, comment la circulation sanguine et l'étanchéité des petits vaisseaux cérébraux sont modifiées dans deux régions du cerveau impliquées dans la mémoire et les émotions (le cortex préfrontal et l'hippocampe) ; repérer des signes précoces, dans le comportement des animaux, annonçant des troubles de la mémoire ; identifier les mécanismes biologiques qui rendent certains individus plus vulnérables et d'autres plus résistants.

Bénéfices attendus

L'hypertension artérielle touche plus de 1,4 milliard de personnes dans le monde et constitue le premier facteur de risque de la maladie cérébrale des petits vaisseaux et du déclin cognitif. Malgré un contrôle tensionnel adéquat, certains patients développent des lésions cérébrales sévères tandis que d'autres sont épargnés, indiquant l'existence de facteurs de vulnérabilité encore non identifiés. Ce projet apportera : à court terme, une caractérisation de l'interaction entre stress psychosocial et hypertension sur le système neurovasculaire cérébral, avec identification de régions cérébrales particulièrement sensibles et de marqueurs biologiques permettant de distinguer les cerveaux qui résistent au stress de ceux qui y sont plus vulnérables ; à moyen terme, des indicateurs précoces (imagerie, marqueurs biologiques) permettant d'estimer le risque individuel de déclin cognitif lié à l'hypertension ; à long terme, de nouvelles pistes thérapeutiques personnalisées pour la prévention du déclin cognitif, intégrant la dimension du stress psychosocial dans la prise en charge de l'hypertension artérielle. Les résultats négatifs seront valorisés par publication dans des revues à comité de lecture.

Procédures

Ce projet utilise des souris réparties en quatre expériences sur 5 ans. Dans toutes les expériences, certaines souris sont soumises pendant 4 semaines à un protocole de stress modéré (changements d'environnement, bruits, perturbations lumineuses, sans douleur) et/ou subissent une chirurgie d'environ 5 minutes sous anesthésie gazeuse pour l'installation d'une petite pompe sous la peau délivrant une substance augmentant modérément la pression artérielle. Première expérience : mesure du flux sanguin cérébral par imagerie non invasive sous anesthésie, à trois reprises sur 4 semaines (environ 25 minutes par session). Deuxième expérience : chirurgie sous anesthésie pour implanter un dispositif d'imagerie miniaturisé dans le cerveau (environ 1 heure), puis enregistrements chez l'animal éveillé à trois reprises sur 4 semaines (environ 1h10 par session pour la moitié des animaux ; environ 45 minutes par session, incluant un test de mémoire de courte durée, pour l'autre moitié). Troisième expérience : tests de mémoire et de comportement ne causant aucune douleur, réalisés à deux reprises (environ 20 à 40 minutes par session selon le test), suivis de l'analyse des vaisseaux cérébraux après euthanasie. Quatrième expérience : après euthanasie sous anesthésie profonde, les cerveaux sont prélevés pour des analyses au microscope et des analyses des gènes actifs dans les vaisseaux.

Impact sur les animaux

Le stress chronique peut entraîner une légère diminution de la prise alimentaire, une altération de l'état du pelage et une réduction de l'activité. Ces effets sont transitoires et de faible intensité. La chirurgie d'implantation de la pompe et celle du dispositif d'imagerie peuvent occasionner une douleur modérée, prévenue et traitée par des médicaments antidouleur. L'hypertension modérée est généralement sans symptôme. De rares complications graves peuvent survenir, entraînant la mise à mort immédiate de l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. La mise à mort est nécessaire pour le prélèvement du cerveau, seul organe étudié dans ce projet.

Remplacement

Le stress psychosocial chronique induit des modifications hormonales, comportementales et vasculaires systémiques non reproductibles en dehors d'un organisme vivant. L'étude de l'interaction entre stress et hypertension sur le cerveau nécessite un réseau vasculaire fonctionnel dans son environnement naturel. L'imagerie cérébrale avancée et les tests cognitifs nécessitent un animal vivant intact. Aucun modèle cellulaire ou informatique ne peut reproduire cette complexité. Des études complémentaires sur cellules en culture seront néanmoins réalisées pour valider certains mécanismes

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé pour garantir une analyse fiable avec le minimum nécessaire. Les expérimentations les plus lourdes (imagerie fonctionnelle et imagerie cellulaire) sont réalisées uniquement chez les femelles, population la plus à risque d'après les données épidémiologiques ; les résultats clés sont ensuite vérifiés chez les mâles (tests comportementaux et analyses tissulaires), ce qui évite de répéter l'ensemble du protocole d'imagerie dans les deux sexes. L'imagerie et les tests comportementaux sont longitudinaux (mêmes animaux suivis dans le temps).

Raffinement

Toutes les chirurgies sont réalisées sous anesthésie gazeuse avec médicaments antidouleur avant et après l’intervention. Les animaux sont acclimatés à la salle d’expérimentation et habitués à la manipulation avant le début des protocoles. Pour l’imagerie par miniscope, les animaux sont progressivement habitués au port du dispositif. Le stress utilise exclusivement des facteurs de faible intensité, sans douleur. Un suivi quotidien de l’état de santé est assuré, avec une surveillance accrue en période post-chirurgicale. Une grille de score et un arbre décisionnel définissent les soins conservatoires (antidouleur, nourriture enrichie, surveillance renforcée) et les critères de mise à mort en cas de souffrance.

Choix des espèces

La souris a été choisie car cette espèce permet de combiner stress chronique et hypertension dans un modèle intégré, avec des outils d’imagerie cérébrale avancés. La souche utilisée présente une sensibilité particulière aux lésions des petits vaisseaux cérébraux sous hypertension modérée, reproduisant les atteintes observées chez l’homme. Les souris seront utilisées au stade adulte (12 semaines) car le projet étudie des mécanismes pathologiques adultes et que la maturation vasculaire cérébrale est complète à ce stade.

7 806 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Réparties en sept lots, elles reçoivent une injection de cellules tumorales sous anesthésie, puis des injections quotidiennes dans l'abdomen quatre jours par semaine pendant deux à trois semaines, un lot étant d'abord irradié sept minutes trente avant de recevoir une greffe de moelle osseuse. Le porteur affirme que les traitements ne sont pas toxiques et ne provoquent pas d'effets indésirables, et écrit que le raffinement de ces protocoles ne fait pas appel à des antalgiques mais à un suivi rapproché, alors qu'il signale une nécrose possible de la tumeur en fin d'expérience, et une diarrhée avec perte de poids pendant quelques semaines après l'irradiation. Sur les 7 806 souris demandées, la rubrique consacrée à la réduction n'avance aucun calcul d'effectif, seulement le principe de couper chaque tumeur en deux échantillons et d'arrêter une étape si la précédente ne donne rien.

Objectifs

Les cellules dendritiques sont les sentinelles du système immunitaire. Elles patrouillent dans les tissus qu’elles échantillonnent à la recherche de signaux de danger (infection, tumeur), et sonnent l’alerte en activant dans les ganglions lymphatiques les lymphocytes T spécifiques de l’origine du danger. La mise en place d’une réponse des lymphocytes T est essentielle à la lutte contre les tumeurs, Une réponse immunitaire efficace et les stratégies actuelles d’immunothérapies visant à augmenter la réponse T reposent donc sur deux fonctions essentielles des cellules dendritiques : la migration et l’échantillonnage. Nous avons identifié une protéine qui est naturellement activée par les signaux de danger dans les cellules dendritiques au cours d’une réponse immunitaire, et qui augmente leur migration in vitro et in vivo. Cette protéine peut être activée chimiquement par des molécules spécifiques. Nos résultats préliminaires utilisant l’activateur « A1 » de cette protéine ont montré que A1 stimule la migration des cellules dendritiques in vitro sans affecter les fonctions d’échantillonnage, qu’A1 n’est pas toxique in vivo, et que l’utilisation de A1 permet d’augmenter la sensibilité de certaines tumeurs aux traitements par inhibiteur de points de contrôle (thérapies qui stimulent le système immunitaire afin d'éliminer la tumeur). . Ce projet a pour objectif d’évaluer le potentiel thérapeutique de l’activateur A1, sur la réponse immunitaire anti-cancéreuse, seul ou en combinaison avec des inhibiteurs de points de contrôle, et ce dans différents modèles tumoraux.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de déterminer si la molécule A1 peut être utilisée pour améliorer la réponse aux traitements d'immunothérapie dans les tumeurs solides qui ne répondent actuellement pas ou peu à ces traitements. Cela permettra aussi de mieux comprendre les mécanismes immunitaires déterminants dans la réponse ou la non-réponse à ce type de traitements, et ouvrira de nouvelles perspectives thérapeutiques.

Procédures

Dans un premier lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois – durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront ensuite traités par des injections dans l’abdomen à raison d’une injection/jour, 4 fois/semaine pendant 3 semaines au maximum. Dans un second lot, des souris vigiles seront irradiées pendant 7min30. Les souris seront anesthésiées pour recevoir une injection de cellules de moelle osseuse (1 fois – durée anesthésie inf 5 min). Des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois au– durée anesthésie inf 5 min) Puis les animaux seront traités par des injections dans l’abdomen à raison d’une injection/jour, 4 fois/semaine pendant 2 semaines. Dans un 3ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront traités par des injections dans l’abdomen à raison d’une injection/jour pendant 2 jours. Un prélèvement de sang par la sera effectué juste avant la mise à mort des souris. Dans un 4ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Des cellules fluorescentes seront injectés aux animaux anesthésiés (1 fois – durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront ensuite traités par une injection dans l’abdomen. Dans un 5ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Des cellules seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront ensuite traités par une injection dans l’abdomen. Dans un 6ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Des cellules seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois– durée anesthésie

Impact sur les animaux

Les effets indésirables observés sont ceux liés au développement de tumeurs en sous-cutanée sur le flanc des animaux. Etant donné que nos observations se font à des temps précoces de la croissance tumorale, la taille de la tumeur reste modérée et ne gêne pas les déplacements de l’animal. Une nécrose peut apparaitre sur la tumeur en fin d’expérience. L'irradiation peut provoquer une diarrhée et une perte de poids chez les souris pendant quelques semaines. Les différents traitements sont non toxiques et ne provoquent pas d'effets indésirables chez les souris. Leur administration entrainera une légère douleur de courte durée liée à la piqûre elle-même.

Devenir

Dans toues les procédures, les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Nos résultats in vitro ont démontré le potentiel du composé A1 pour stimuler la migration des cellules dendritiques, et nous ont permis de comprendre les mécanismes moléculaires associés. Pour analyser les effets sur la réponse immunitaire anti-tumorale de ce composé, rien ne peut remplacer un modèle animal où les cellules sont confrontées à leur environnement physiologique. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour le présent projet. Pour évaluer la migration dans un tissu, entre deux tissus (par exemple la tumeur et les ganglions), et les effets sur la croissance tumorale et sur la réponse immunitaire, il est à ce stade du projet indispensable de réaliser des expériences in vivo chez la souris.

Réduction

Chaque tumeur sera coupée en 2 échantillons afin de réaliser plusieurs analyses (imagerie et cytométrie) sur la même tumeur pour permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés. Notre projet est basé sur une suite d’étapes expérimentales dont les résultats conditionnent le passage à l’étape suivante. Nous ne procéderons à l'étude de la manière dont la réponse immunitaire est précisément affectée par le traitement que dans le groupe de souris traitées pour lesquelles nous observons un effet positif du traitement sur la croissance de la tumeur. Les résultats seront analysés par des approches statistiques.

Raffinement

En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de la cancérologie, les animaux sont suivis attentivement tous les deux jours (poids, aspect et comportement). En effet, conformément aux guides de la Commission Européenne et aux recommandations internationales en cancérologie expérimentale, le raffinement de ces modèles ne fait pas appel à des antalgiques mais à un suivi rapproché pour déterminer des points d’arrêt les plus précoces possibles. Une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux et de mettre en place des points-limite adaptés. L’atteinte d’un point-limite conduira à la mise en place de soins de support voire à la mise à mort de l’animal si la souffrance ne peut être soulagée. Du gel nutritif et hydratant sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire, et limiter la perte de poids et la déshydratation qui peuvent être causés lors de l’irradiation. Un apport de fluide injectable sera également assuré pour en cas de déshydratation. Les gestes nécessitant une immobilisation de l’animal seront effectués sous anesthésie générale.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les études en immunologie anti-cancéreuse, de par la proximité de son système immunitaire avec le système immunitaire humain. C’est également dans ce modèle murin que nous avons à notre disposition les modèles génétiques indispensables à ce projet (souris déficientes pour la protéine d’intérêt, cible de A1). Stade adulte entre 8 et 24 semaines Nous souhaitons travailler sur un système immunitaire adulte.

180 médakas vont être utilisés, tous tués à l'issue, chacun passant environ cinq heures par séance dans un dispositif qui mesure sa consommation d'oxygène puis le fait nager contre un courant dont la vitesse augmente progressivement. Chaque poisson reçoit d'abord un marquage sous la peau sous anesthésie, de dix à quinze minutes, puis vit à 20, 25 ou 30 degrés pendant une semaine ou environ deux mois selon le groupe. À chaque étape, deux poissons par aquarium sont anesthésiés profondément, saignés et mis à mort sans réveil, les autres subissant le même sort à la fin du protocole, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur justifie le choix du médaka par sa tolérance de 0 à 40 degrés, sa reproduction rapide, et par la plateforme d'élevage dont l'INRAE d'Aix-en-Provence dispose déjà.

Objectifs

Le réchauffement climatique entraîne une augmentation de la température des rivières, des lacs et des autres milieux aquatiques. Cette hausse peut avoir des conséquences importantes pour les poissons d’eau douce, car leur température corporelle dépend directement de celle de l’eau. Lorsque l’eau se réchauffe, leurs besoins en énergie et en oxygène augmentent. On ne comprend cependant pas encore complètement comment les poissons parviennent à s’adapter lorsqu'ils sont exposés à des températures élevées pendant une longue période. Le projet EPO a pour objectif de mieux comprendre les mécanismes qui permettent aux poissons de s’adapter à ces changements de température. Les chercheurs étudieront notamment la manière dont leur organisme utilise l’oxygène et produit l’énergie nécessaire à leur fonctionnement, afin de déterminer pourquoi certains poissons supportent mieux la chaleur que d’autres. Pour cela, l’étude sera réalisée sur une espèce de petit poisson appelée médaka (Oryzias latipes). Les poissons seront maintenus dans des aquariums à trois températures différentes (20, 25 et 30 °C). Une partie des animaux sera étudiée après une semaine d’exposition, et une autre après environ deux mois, afin de comparer les effets à court et à long terme. Les chercheurs mesureront leur consommation d’oxygène, leurs capacités physiques ainsi que certains paramètres de leur sang et du fonctionnement de leurs cellules. Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre la capacité des poissons à s’adapter au réchauffement des eaux. Ils contribueront à mieux prévoir les effets du changement climatique sur les espèces aquatiques et pourront aider à orienter les actions de protection de ces milieux.

Bénéfices attendus

L’étude des effets du changement climatique sur les poissons d’eau douce est essentielle pour mieux comprendre et protéger les milieux aquatiques. Lorsque la température de l’eau augmente, le fonctionnement de leur organisme peut être perturbé. Cette augmentation de température entraîne également une diminution de la solubilité de l’oxygène dans l’eau, réduisant ainsi sa disponibilité pour les organismes aquatiques. Les poissons sont donc confrontés à une double contrainte physiologique : une augmentation de leurs besoins en oxygène liée à l’accélération de leur métabolisme, alors même que la quantité d’oxygène disponible dans leur environnement diminue. Toutefois, la réponse des poissons au réchauffement ne dépend pas uniquement de la disponibilité en oxygène du milieu, mais également de leur capacité à transporter, diffuser et utiliser cet oxygène au niveau des tissus.. Le projet EPO a pour objectif de mieux comprendre comment les poissons réagissent lorsque l’eau se réchauffe. Les chercheurs étudieront la manière dont leur organisme transporte et utilise l’oxygène, depuis la respiration de l’animal jusqu’au fonctionnement de ses cellules. En mesurant leur consommation d’oxygène, en analysant certaines caractéristiques de leur sang et le fonctionnement de leurs cellules, ils chercheront à déterminer si les difficultés rencontrées à haute température sont dues à un transport insuffisant de l’oxygène, à une mauvaise utilisation de celui-ci par les cellules, ou à une combinaison de ces deux phénomènes. Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre pourquoi certaines espèces supportent mieux le réchauffement que d’autres. Ils aideront à mieux prévoir les conséquences du changement climatique sur les populations de poissons et apporteront des connaissances utiles pour la protection et la gestion des écosystèmes aquatiques.

Procédures

Après leur arrivée et une période d’adaptation dans l’animalerie, les médakas seront répartis dans des aquariums maintenus à trois températures différentes : 20, 25 ou 30 °C. Chaque poisson recevra un petit marquage sous la peau, réalisé sous anesthésie, afin de pouvoir le reconnaître et suivre son évolution tout au long de l’étude. Cette intervention durera environ 10 à 15 minutes par poisson. Les poissons seront ensuite étudiés dans un dispositif permettant de mesurer leur consommation d’oxygène et leurs capacités de nage. Ils seront placés dans ce dispositif environ une à deux heures avant les mesures afin de réduire le stress lié aux manipulations. Les chercheurs mesureront d'abord leur consommation d’oxygène au repos, puis leur demanderont de nager face à un courant dont la vitesse augmentera progressivement afin d'évaluer leurs capacités physiques. Chaque séance de mesure durera environ cinq heures par poisson. Au début de l'étude, puis après une semaine et après environ deux mois d'exposition aux différentes températures, les poissons seront pesés, mesurés et soumis à ces mesures de consommation d’oxygène. À chacun de ces moments, deux poissons par aquarium seront anesthésiés profondément afin de réaliser un prélèvement de sang. Ils seront ensuite mis à mort pour permettre l'analyse de certains organes et cellules, indispensable pour comprendre comment leur organisme produit et utilise l'énergie.

Impact sur les animaux

Les principales contraintes pour les poissons sont liées aux différentes manipulations nécessaires au suivi de l’étude. Ils recevront un petit marquage individuel sous anesthésie, seront régulièrement manipulés pour être pesés et mesurés, et participeront à des tests permettant de mesurer leur consommation d’oxygène et leurs capacités de nage. Ces manipulations peuvent provoquer un stress temporaire, une respiration plus rapide pendant un court moment, ainsi qu'une fatigue passagère après les tests de nage. Le marquage peut également entraîner une légère irritation au niveau de la zone d’injection. Après chaque anesthésie, les poissons seront surveillés jusqu’à leur récupération complète avant d’être replacés dans leur aquarium. Les poissons seront maintenus à trois températures différentes (20, 25 et 30 °C). Ces températures sont adaptées à cette espèce et correspondent à des conditions qu'elle peut rencontrer dans son environnement. Les changements de température seront réalisés progressivement afin de limiter le stress. La qualité de l’eau, notamment sa température, son oxygénation et ses autres paramètres, sera contrôlée régulièrement tout au long de l’étude pour garantir de bonnes conditions de vie. Les poissons seront observés chaque jour afin de vérifier leur état de santé. Les chercheurs surveilleront notamment leur comportement, leur alimentation, leur respiration et leur façon de nager. Si un poisson présente des signes de souffrance ou un problème de santé persistant, il sera retiré de l’étude et pris en charge selon les procédures prévues. Les prélèvements de sang et de tissus seront réalisés uniquement sur des poissons profondément anesthésiés. Ils seront ensuite mis à mort sans être réveillés. L'ensemble du projet a été conçu pour limiter autant que possible le nombre de manipulations, le stress et les effets sur les animaux, tout en permettant de répondre aux objectifs scientifiques de l'étude.

Devenir

À l’issue des différentes étapes expérimentales, certains poissons seront mis à mort afin de réaliser les prélèvements sanguins et tissulaires indispensables aux objectifs scientifiques du projet. Ces prélèvements doivent être effectués immédiatement après la mise à mort afin de préserver l’intégrité fonctionnelle des tissus et des cellules utilisés pour les analyses, notamment celles portant sur la respiration mitochondriale. Les autres poissons seront maintenus dans leurs conditions expérimentales jusqu’à la fin du protocole. Ils seront ensuite également mis à mort afin de permettre la réalisation des analyses terminales prévues dans le projet. Le nombre d’animaux utilisés et mis à mort a été limité au strict minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques tout en garantissant la robustesse des analyses, conformément au principe de Réduction.

Remplacement

À ce jour, il n’existe pas de méthode permettant de remplacer l’utilisation de poissons vivants pour cette étude. Les chercheurs doivent observer le fonctionnement de l’animal dans son ensemble afin de comprendre comment il réagit lorsque la température de l’eau augmente. Les expériences réalisées sur des cellules ou les modèles informatiques ne permettent pas de reproduire fidèlement le fonctionnement d’un organisme vivant. L’utilisation de poissons est donc indispensable pour comprendre comment ils s’adaptent au réchauffement de leur environnement.

Réduction

Le nombre de poissons a été limité au minimum nécessaire pour répondre aux objectifs du projet tout en obtenant des résultats fiables. Les poissons seront répartis dans plusieurs aquariums et exposés à trois températures différentes (20, 25 et 30 °C). Les mêmes poissons seront suivis tout au long de l’étude afin de réaliser plusieurs mesures sur les mêmes individus, ce qui permet de recueillir davantage d’informations sans utiliser plus d’animaux. Seul un petit nombre de poissons sera mis à mort à chaque étape de l’étude pour réaliser les analyses qui nécessitent des prélèvements de sang et de tissus. Enfin, le marquage individuel des poissons permettra de suivre chaque animal au cours de l’étude et de limiter le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Les poissons sont maintenus dans des conditions adaptées à leurs besoins afin de préserver leur bien-être tout au long de l’étude. Ils sont élevés en groupes dans des aquariums aménagés avec des refuges et des plantes pour limiter le stress et favoriser leurs comportements naturels. Ils sont nourris quotidiennement et la qualité de l’eau est contrôlée régulièrement. Les animaux sont observés chaque jour et, en cas de problème, des mesures sont prises immédiatement. Si nécessaire, le vétérinaire est consulté et un poisson peut être isolé en aquarium de quarantaine. Toutes les manipulations sont réalisées par du personnel formé. Les procédures susceptibles d’être stressantes sont effectuées sous anesthésie afin de limiter la douleur et le stress. Les poissons sont manipulés avec précaution, dans un environnement calme, puis replacés dans leur aquarium après une période de récupération. Leur état est surveillé tout au long de l’étude et tout animal présentant des signes persistants de souffrance est retiré de l’expérimentation conformément aux points limites définis dans le projet.

Choix des espèces

Le médaka est un petit poisson particulièrement adapté à cette étude, car il peut vivre dans une large gamme de températures (de 0 à 40 °C). Il permet ainsi de mieux comprendre comment les poissons s’adaptent au réchauffement de leur environnement. Cette espèce se reproduit rapidement, est facile à élever et supporte bien les manipulations nécessaires à l’étude. L’INRAE d’Aix-en-Provence dispose déjà d’une plateforme d’élevage dédiée à cette espèce, avec des installations adaptées et du personnel expérimenté, garantissant de bonnes conditions d’hébergement et le bien-être des animaux.

Vingt-et-une injections sous-cutanées en trois semaines, une chirurgie crânienne d'environ cinq heures sous anesthésie générale, puis douze séances de test avec imagerie cérébrale de vingt à cent quarante minutes sur six semaines : 64 rats subissent ce protocole dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le produit administré appartient à la famille du cannabis, et il s'agit de voir comment une exposition répétée à l'adolescence modifie les connexions cérébrales et la mémoire à l'âge adulte. Le porteur qualifie ces administrations de procédures "bien tolérées" et prévoit une douleur post-opératoire de 24 à 48 heures. Tous les rats sont mis à mort à la fin, la chirurgie et le traitement cannabinoïde excluant selon lui qu'ils servent ensuite à autre chose, et les tests de mémoire qui occupent six semaines du protocole ne sont jamais nommés.

Objectifs

Ce projet vise à mettre en place et à valider une technique d’imagerie cérébrale chez le rat en mouvement libre, afin d’étudier comment une exposition répétée à des substances psychoactives (de la même famille que le cannabis) pendant l’adolescence modifie les connections entre différentes régions du cerveau et les capacités de mémorisation. Les animaux utilisés bénéficieront d’une intervention chirurgicale (réalisée sous anesthésie complète et avec traitement de la douleur) permettant l’accès à l’imagerie cérébrale, ainsi que d’administrations de substances apparentées aux cannabinoïdes, procédures considérées comme bien tolérées.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment une exposition aux cannabinoïdes à l’adolescence modifie durablement les circuits cérébraux liés à la mémoire. Ces connaissances pourront contribuer à identifier des marqueurs biologiques de vulnérabilité et à informer les politiques de prévention.

Procédures

Les interventions sur les animaux comprennent : • Injections sous-cutanées répétées (21 injections sur 3 semaines, environ 5 secondes chacune) • Une intervention chirurgicale sous anesthésie générale et traitement antidouleur (environ 5h), permettant l’imagerie cérébrale • 2 injections sous-cutanées post-chirurgicales (5 secondes chacune) • Sessions d’habituation (5 jours, 10 à 20 minutes par session) • 12 sessions de test comportemental avec imagerie cérébrale (20 à 140 minutes par session sur 6 semaines)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont : • Douleur post-opératoire modérée (24 à 48h), prise en charge par analgésie • Douleurs brèves lors des injections sous-cutanées (quelques secondes) • Léger stress lors des séances d’imagerie cérébrale en état d’éveil (bruit modéré, changement d’environnement) • Modifications transitoires de la locomotion et de l’état général liées au traitement

Devenir

Les animaux seront mis à mort car pas de réutilisation possible dû à la chirurgie et au traitement cannabinoïde.

Remplacement

Aucun modèle in vitro ou informatique ne permet d’étudier simultanément le comportement complexe, la dynamique cérébrale en mouvement libre et de manière longitudinale sur plusieurs semaines. Le recours à l’animal est indispensable.

Réduction

Cette étude pilote utilise le nombre minimal d’animaux nécessaire. Les sessions longitudinales répétées évitent de multiplier les animaux. Les animaux serviront pour plusieurs types d’expériences (imagerie et comportement).

Raffinement

La chirurgie est réalisée sous analgésie et anesthésie complètes, avec suivi post-opératoire. Une grille de score et une liste de points limites permettent d’assurer le bien-être animal et d’interrompre l’expérience ou de procéder à la mise à mort dès qu’un point limite est atteint. Des analgésiques sont utilisés pour prévenir la douleur. Des séances d’habituation à l’imagerie et au comportement sont réalisées. Les souris [rats] sont élevés en groupes sociaux avec enrichissement du milieu.

Choix des espèces

Le rat a été choisi car il est adapté à l’implantation chronique d’un dispositif d’imagerie cérébrale, offre un volume cérébral suffisant pour l’imagerie des structures d’intérêt, et montre une robustesse comportementale pour les tests de mémoire. L’effet du traitement cannabinoïde a déjà été documenté chez cette espèce. Le traitement est administré au stade adolescent (en raison de la sensibilité accrue du cerveau en développement) et les enregistrements sont réalisés au stade adulte (cerveau mature, ossature crânienne plus résistante).

Pour comprendre pourquoi certaines tumeurs du foie échappent au système immunitaire, 640 souris reçoivent une injection de cellules tumorales, parfois au cours d'une chirurgie de quinze à vingt minutes sous anesthésie générale. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour prélever la tumeur, les ganglions lymphatiques drainants, le foie, la rate et le sang. Entre-temps, elles reçoivent des injections de traitements expérimentaux une à deux fois par semaine pendant deux à quatre semaines, leur tumeur étant mesurée deux fois par semaine. Le porteur indique que les souris dont la perte de poids devient importante, dont le comportement s'altère ou dont la tumeur grossit trop seront mises à mort immédiatement.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre pourquoi certaines tumeurs du foie échappent au système immunitaire. Dans certains cas, les défenses de l’organisme ne reconnaissent pas ou n’attaquent pas efficacement les cellules cancéreuses. L’objectif est de comprendre les mécanismes responsables de cette perte d’efficacité du système immunitaire et d’identifier des moyens de le réactiver. À terme, ce projet vise à améliorer l’efficacité des traitements existants, notamment l’immunothérapie, et à proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les cancers du foie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre pourquoi certaines tumeurs du foie échappent au système immunitaire et le rôle des ganglions lymphatiques proches de la tumeur dans ce phénomène. Les résultats devraient : • identifier les mécanismes qui empêchent le système immunitaire d’attaquer efficacement les cellules tumorales ; • comprendre comment les tumeurs modifient leur environnement pour favoriser leur développement ; • déterminer si certaines approches thérapeutiques peuvent améliorer l’efficacité des immunothérapies en réactivant les défenses immunitaires. À terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des principaux cancers du foie.

Procédures

Les animaux recevront une injection de cellules tumorales afin de provoquer le développement d’une tumeur. Dans certains cas, cette injection pourra être réalisée lors d’une intervention chirurgicale courte sous anesthésie générale. Les animaux seront ensuite suivis régulièrement, avec des mesures de la taille de la tumeur deux fois par semaine lorsque cela est possible. Ils recevront également des injections de traitements expérimentaux, généralement 1 à 2 fois par semaine pendant 2 à 4 semaines. Des prélèvements sanguins de faible volume pourront être réalisés, au maximum une fois par semaine. Chaque injection dure quelques minutes. Les interventions chirurgicales durent environ 15 à 20 minutes et sont réalisées sous anesthésie avec prise en charge de la douleur. À la fin de l’expérience, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses sur les tissus.

Impact sur les animaux

Les animaux développeront des tumeurs au cours de l’étude, pouvant entraîner une gêne progressive et une altération de leur état général. Les principales nuisances attendues sont : - le développement de la tumeur, - le stress lié aux manipulations, - les injections répétées, - et, dans certains cas, les suites d’une intervention chirurgicale. L’état des animaux sera surveillé régulièrement. Des critères stricts d’arrêt seront appliqués afin d’éviter toute souffrance, notamment en cas de perte de poids importante, d’altération du comportement ou d’augmentation excessive de la taille tumorale. Dans ces situations, les animaux seront euthanasiés immédiatement.

Devenir

La mise à mort de l’ensemble des animaux est nécessaire afin de réaliser les prélèvements terminaux indispensables aux objectifs scientifiques du projet. Les analyses nécessitent notamment le prélèvement de la tumeur, des ganglions lymphatiques drainants et d’autres tissus et organes impliqués dans la réponse immunitaire, tels que le foie, la rate et le sang. Ces prélèvements permettent de caractériser conjointement la tumeur et la réponse immunitaire locale, ganglionnaire et systémique et ne sont pas compatibles avec le maintien en vie des animaux. Les animaux ne pourront donc pas être réutilisés à l’issue des procédures.

Remplacement

Avant d’utiliser des animaux, nous avons recours autant que possible à des méthodes alternatives, comme des études sur des cellules en laboratoire ou l’analyse de données humaines. Cependant, ces approches ne permettent pas de reproduire l’ensemble des interactions complexes entre une tumeur et le système immunitaire dans un organisme vivant. L’utilisation de modèles animaux reste donc nécessaire pour répondre aux questions posées dans ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux est limité au strict nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Les expériences sont soigneusement planifiées afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant la validité scientifique. Plusieurs analyses sont réalisées à partir d’un même animal afin de maximiser les informations obtenues. De plus, certaines expériences ne sont réalisées que lorsque cela est nécessaire, ce qui permet d’éviter l’utilisation d’animaux supplémentaires.

Raffinement

Toutes les mesures sont prises pour limiter la douleur et le stress des animaux. Ils sont hébergés dans un environnement adapté et enrichi. Leur état de santé est surveillé régulièrement tout au long de l’étude. Les interventions sont réalisées par du personnel formé, sous anesthésie lorsque cela est nécessaire, avec une prise en charge de la douleur. Des critères stricts sont définis pour arrêter l’expérience dès qu’un animal présente des signes de souffrance.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) a été retenue comme espèce modèle pour ce projet en raison de sa pertinence largement démontrée dans l’étude de l’immunologie tumorale et des cancers du foie. Les modèles murins permettent d’étudier dans un organisme immunocompétent les interactions complexes entre la tumeur, le système immunitaire et les organes lymphoïdes secondaires, notamment les ganglions lymphatiques drainants, qui ne peuvent être reproduites de manière fiable par des systèmes in vitro. Les lignées tumorales murines utilisées sont bien caractérisées et permettent de reproduire différents phénotypes immunitaires observés chez l’homme, notamment des tumeurs pauvrement infiltrées par les cellules immunitaires. Par ailleurs, la disponibilité d’outils génétiques, immunologiques et thérapeutiques adaptés chez la souris permet d’explorer de manière contrôlée les mécanismes d’immunotolérance et d’évaluer des stratégies immunothérapeutiques pertinentes pour les cancers primitifs du foie. Des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines seront utilisées. À cet âge, les animaux présentent une physiologie stable et un système immunitaire mature, ce qui est nécessaire pour étudier les réponses immunitaires anti-tumorales.