Oncologie

Pour savoir si un cocktail de pesticides aux doses réglementaires, associé à un régime riche en graisses et en sucres, favorise le cancer du pancréas, 230 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur sang et leurs organes. Gardées jusqu'à sept mois d'âge au plus, elles peuvent développer un diabète modéré et une fibro-stéatose du foie, et subissent trois prises de sang, deux échographies sous anesthésie et deux tests de tolérance au glucose après jeûne. Le gavage, absent de la liste des procédures, n'apparaît que parmi les effets néfastes, sans fréquence ni durée. Une grille d'évaluation fixe le seuil de souffrance "trop importante" qui déclenche la mise à mort d'une souris, sans que ses critères soient donnés.

Objectifs

Le cancer du pancréas PDAC (adénocarcinome canalaire pancréatique) est un cancer très mortel ; il est devenu la troisième cause de décès par cancer. La France fait partie des pays pour lesquels l’augmentation de l’incidence et de la mortalité par cancer du pancréas est la plus élevée, avec une augmentation constante depuis les années 1970. Comprendre les stades initiaux de ce cancer est essentiel pour prévenir l'augmentation de son incidence et de sa mortalité et pour développer des stratégies de prévention pour ce cancer létal. Les facteurs génétiques de ce cancer sont bien identifiés : environ 80 % des patients présentent une mutation sur le gène KRAS, un véritable "accélérateur" biologique qui, lorsqu'il est altéré, pousse les cellules à se multiplier de façon incontrôlée. De plus en plus d’études (épidémiologiques et/ou expérimentales) suggèrent que les facteurs environnementaux contribuent également au développement du cancer du pancréas. Parmi ceux-ci, certaines études montrent qu’un régime riche en graisses peut contribuer à ce cancer et l’obésité est l'un des facteurs décrits pour ce cancer. Certains contaminants alimentaires comme les pesticides sont considérés comme des facteurs de risques potentiels dans l’induction de cette pathologie, mais il n’y a pas à ce jour de données expérimentales pour émettre une conclusion définitive. Notre objectif principal est le suivant : La population humaine Française en général n'étant pas exposée à de fortes doses d'un seul pesticide, nous souhaitons évaluer si l'exposition chronique à un cocktail de pesticides, individuellement présents à des doses réglementaires, trouvés dans l'alimentation de la population française combinée à un régime alimentaire occidental (riche en graisse, riche en sucres) pourrait favoriser l'initiation du cancer du pancréas via des dérégulations du métabolisme. Nous testerons ces changements de régime alimentaire dans un modèle murin génétiquement modifié qui est susceptible de développer un cancer du pancréas en présence de stress.

Bénéfices attendus

La population générale étant exposée quotidiennement à des doses de pesticides ne dépassant pas les LMR (Limites Maximales de Résidus), ce projet vise à évaluer l'impact réel de ces substances sur la santé. Nous étudierons si une exposition prolongée à un mélange représentatif des pesticides retrouvés dans l'alimentation française, ou à un régime alimentaire de type occidental (riche en graisses et en sucres), peut favoriser le déclenchement du cancer du pancréas. Dans ce cadre, nous analyserons également les perturbations hormonales et métaboliques causées par ces régimes, notamment sur la régulation de la glycémie ou sur les signaux chimiques libérés par le foie et le tissu graisseux. Retombées et bénéfices attendus : Ce projet permettra de déterminer pour la première fois si des doses faibles mais répétées de pesticides jouent un rôle clé dans l'apparition du cancer du pancréas. À moyen terme, ces découvertes fourniront des preuves scientifiques solides pour guider les politiques de santé publique, établir de meilleures recommandations nutritionnelles et environnementales, et ainsi mieux prévenir et réduire le risque de développer ce cancer très agressif.

Procédures

Les souris feront l'objet de trois prises de sang, réalisées à plus d'un mois d'intervalle. Pour suivre l'état du pancréas, deux échographies de 15 minutes seront effectuées sur chaque animal, à plus d'un mois d'intervalle. Cet examen d'imagerie non invasif réalisé sous une anesthésie utilise des ultrasons pour visualiser les organes en direct et en profondeur sans douleur. Pour évaluer la fonction pancréatique, deux examens de suivi appelés tests de tolérance au glucose seront réalisés. Cet examen consiste à administrer aux souris une eau très sucrée après une période de jeûne, puis à mesurer l'évolution du taux de sucre dans le sang grâce à de courtes prises de sang régulières, afin de vérifier la capacité du corps à réguler le taux de sucre dans le sang.

Impact sur les animaux

Les animaux nourris avec le régime occidental hypercalorique vont progressivement prendre du poids associé à des perturbations métaboliques progressives telles que le développement d’un diabète d’intensité modérée et d’une fibro-stéatose (infiltration de graisse et rigidifié par du tissu cicatriciel) d'intensité légère du foie. Ces altérations s'installent de manière progressive sur plusieurs semaines et correspondent à une nuisance d'intensité modérée, sans altération brutale de l'état général des animaux. Les altérations génétiques n’entraînent pas au stade précancéreux de modifications du fonctionnement normal ni du pancréas ni des souris ; on dit que ces modifications sont asymptomatiques. La piqûre de la queue pour prélever la goutte de sang peut entraîner une douleur aigüe de faible intensité et de très courte durée (quelques secondes), sans effet persistant. Le prélèvement de sang terminal peut entraîner un stress de courte durée et d'intensité modérée lié à la contention préalable à l’anesthésie. Le gavage peut également entraîner un stress des animaux lié à la contention, d'intensité modérée et de courte durée (quelques minutes). Lorsqu'il est réalisé par du personnel expérimenté, ces gestes n'entraînent pas de douleur significative ni de complication.

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique.

Remplacement

Ce projet décrit l’utilisation de souris génétiquement modifiées dans le contexte d’une exposition alimentaire à un cocktail de pesticides. Ces souris seront utilisées pour le prélèvement d’organes. A ce jour, elles ne peuvent être substituées par un autre modèle : - Il n’existe pas d’organoïdes (assemblage de cellules cultivées en 3D qui reproduit en miniature la structure et le fonctionnement du pancréas) établis de lésions pancréatiques précancéreuses ; Les organoïdes ou des lignées de cellules de ne permettent pas d’étudier l’effet sur tous les types cellulaires du microenvironnement. - Nous étudions une exposition par la nutrition, les étapes de digestion et l’effet sur le dialogue entre les organes métaboliques sont nécessaires à la compréhension de notre problématique.

Réduction

Pratiques mises en œuvres pour réduire le nombre d’échantillons : Cette étude est basée sur une étude pilote réutilisant les échantillons de pancréas d’une expérience étudiant le foie. Elle nous a permis de valider le cocktail de pesticides utilisés, les doses, et d’exclure un bras de l’étude pour lequel les pesticides n’ont pas eu d’effet additifs avec le régime alimentaire occidental. Ceci nous évite des expériences de test de doses et a permis de réduire le nombre d’individus.

Raffinement

Les souris seront hébergées en petits groupes stables dans des cages thermo-régulées et ventilées, dans un environnement sanitaire très strict garanti sans microbes pathogènes. La température, l'humidité et le rythme jour/nuit (12 heures de chaque) sont réglés automatiquement. La nourriture et la litière sont systématiquement stérilisées. Pour leur bien-être et leur confort, les cages sont équipées de matériel d'enrichissement (maisonnettes dômes, de quoi fabriquer un nid). Une surveillance quotidienne est assurée par un personnel qualifié pour détecter tout signe d'inconfort ou de douleur. En cas de souffrance trop importante (définie par une grille d'évaluation), l'animal est immédiatement euthanasié sans douleur par du personnel agréé pour éviter tout mal-être prolongé. Enfin, le suivi de l'état du pancréas est réalisé en direct par imagerie médicale non invasive sous anesthésie gazeuse (isoflurane), permettant à la fois de suivre précisément l'évolution chez chaque individu et de limiter au maximum le stress et l'inconfort de l'animal.

Choix des espèces

Le modèle de la souris (Mus musculus) est le seul qui permette de reproduire fidèlement l'ensemble des étapes de formation du cancer, la diversité des cellules impliquées ainsi que la complexité des mécanismes biologiques clés. Les souris seront étudiées uniquement à l'âge adulte (à partir de 8 semaines), une fois le développement de leur pancréas totalement achevé, et jusqu'à l'âge de 7 mois maximum pour l'analyse de leurs organes.

Rendues obèses par un régime enrichi en lipides pendant 14 à 16 semaines, 80 souris reçoivent aussi, sous anesthésie, un tatouage d'identification et une injection de vecteurs viraux AAV dans le muscle. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis transportées vers un second établissement pour un test terminal avec injection d'insuline, glucose radiomarqué et trois prises de sang pour la moitié d'entre elles. La description des procédures affirme qu'après l'injection les souris "ne subiront ensuite qu'une expérimentation terminale", sans mentionner le régime que le porteur dit susceptible d'"engendrer un inconfort significatif". Toutes sont tuées et nécropsiées à l'issue pour prélever tissus et organes, et le porteur fixe leur nombre d'après ses "habitudes expérimentales".

Objectifs

Les sphingolipides constituent une vaste famille de lipides complexes impliqués dans de nombreux mécanismes physiopathologiques. Les céramides, à la base de leur métabolisme, sont connus pour influencer la sensibilité à l’insuline dans plusieurs tissus, y compris le muscle squelettique. Plus récemment, plusieurs travaux ont démontré que l’inhibition de la synthèse de novo des céramides chez la Souris permet de prévenir le déclin de la masse musculaire et de la performance physique dans plusieurs contextes pathologiques. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’effet de la réduction des concentrations intramusculaires de ces espèces de céramides sur la masse musculaire et l’homéostasie glucidique et ce chez des animaux adultes jeunes dans le contexte de l’obésité qui favorise le développement de la résistance à l’insuline. Ce projet est multisite sur deux établissements utilisateurs, EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait nous apporter de nouvelles connaissances théoriques sur la physiologie des muscles squelettiques et plus précisément sur l'importance de certains lipides sur la dégradation de certaines fonctions musculaires dans le contexte de l’obésité et/ou du vieillissement. La compréhension du rôle de ces espèces de sphingolipides dans le muscle squelettique dans le contexte précité nous permettra d’envisager de nouvelles stratégies dans la prévention de la perte de la sensibilité à l’insuline.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur (EU1/2), les animaux seront individuellement identifiés par tatouage sous anesthésie (moins d’une minute). Ensuite, ils recevront une injection par voie intramusculaire (env. 30 sec). Cette procédure sera réalisée une seule fois sur animaux anesthésiés et ayant reçu un antalgique ce qui diminuera grandement la douleur, avec une procédure de réveil adaptée. Les animaux ne subiront ensuite qu’une expérimentation terminale nécessitant une injection (env. 30 sec), effectuée par un expérimentateur maîtrisant le geste. Dans le second établissement utilisateur (EU2/2) et pour la moitié des animaux, l’expérimentation terminale nécessite le prélèvement de sang à 3 reprises durant le test (moins d’une minute).

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables allant de l’inconfort à des douleurs légères sur de courtes durées pourraient être observés au cours de la vie des animaux. Un inconfort, une mobilité légèrement réduite et une légère douleur pourraient être constatés suite à leur identification par tatouage. Le régime enrichi en lipides pendant 14 à 16 semaines, en créant une obésité associée éventuellement à une insulino-résistance, pourrait engendrer un inconfort significatif pour l'animal. Un inconfort et/ou un stress pourrait intervenir lors des pesées de suivi. Les injections intramusculaires pourraient entrainer des douleurs et une mobilité réduite pendant quelques minutes. Un stress et une légère douleur liée à la contention et aux injections par voie intrapéritonéale pourrait survenir lors des expérimentations terminales (test de transport de glucose et injection d’insuline). Les prélèvements répétés de sang (3 prélèvements) lors du test terminal de flux de glucose radiomarqué peut provoquer du stress, des douleurs légères, œdèmes et gonflements. Enfin le transport d’un établissement utilisateur à l’autre dans les cages d’origine des animaux peut entraîner de l’inconfort et/ou du stress même si la distance est restreinte et qu’il sera réalisé selon des procédures établies et bien éprouvées.

Devenir

A l'issue des procédures, tous les animaux seront nécropsiés, des tissus et organes collectés pour des analyses histologiques, d'expressions génique et/ou protéique.

Remplacement

Des expériences préliminaires sur des cultures cellulaires issues de muscles squelettiques ont déjà été réalisées et ont montré l'importance de l'intérêt porté aux lipides intramusculaires. Cependant, pour faire le lien entre les quantités de certaines espèces lipidiques, ici les céramides, et la masse musculaire, ainsi que l'homéostasie glucidique, l'animal en tant que modèle intégré est indispensable.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en œuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en œuvre seront des tests non paramétriques utilisés soit pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, ou pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, et encore pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche du centre.

Raffinement

A l’arrivée des animaux en zootechnie, ils seront répartis en cages de 4 à 5 individus et acclimatés à minima 5 jours. Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans le Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés en accord avec la SBEA du site. Un suivi quotidien sera réalisé soit par les zootechniciens soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permet une habituation à l'Homme ce qui diminue le stress des animaux et indirectement la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées ; ce paramètre permet également de se rendre compte de l’état de l’animal. Si des lésions cutanées apparaissent suite à des bagarres, une pommade sera appliquée. 30 minutes avant l’injection des AAV, les animaux recevront une injection sous-cutanée d’antalgique. Le réveil de l'animal, après anesthésie et injection des AAVs, se fera dans une cage posée sur tapis chauffant. Du collyre sera appliqué sur les yeux de l’animal. Une vérification de l’absence d’œdème ou de rougeur au point d’injection des AAV sera effectuée dans les 48 heures post-injection. Si le cas se présentait nous consulterions le vétérinaire référent afin de soigner les animaux ; l’utilisation d’une crème type Cortanmycétine ou Meloxicam sont envisagés. Des critères d’arrêt stricts sont mis en place et détaillés dans une grille de scoring en annexe. Les animaux seront suivis toute leur vie avec une grille de scoring permettant d’évaluer, par l’attribution de points, l’état de santé de chaque animal. En fonction du score obtenus, le RMO sera capable de déterminer si des points limites adaptés à chaque procédure sont atteints et les actions à réaliser pour soulager ou mettre fin aux souffrances relevées. Pour l’expérimentation terminale dans l’EU 2/2, les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages d’origine des animaux incluant des enrichissements type igloos ou tunnels sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettant un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est prédéterminé et évite la rencontre avec le public.

Choix des espèces

L'espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d'Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux adultes jeunes (8 semaines lors de leur arrivée dans le service de zootechnie et 7-8 mois en fin de protocole) seront utilisés, ce qui correspond à un âge Humain compris entre jeune adulte et adulte d’âge moyen. En effet, nous souhaitons analyser divers paramètres et facteurs (cf description du projet et procédures) sur des animaux jeunes rendus obèses par un régime nutritionnel approprié pour lesquels une insulino-résistance peut se développer. Les animaux seront hébergés entre 8 semaines et 7 mois, ce qui correspond à un âge Humain compris entre jeune adulte et adulte d’âge moyen. La mise en régime obésogène débutera à 3 mois, afin d’induire une obésité et une insulino-résistance chez la souris adulte.

Tuées à la fin du protocole pour l'analyse de leurs organes et tissus, 396 souris mâles et femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules de cancer du sein sous la peau, puis six jours d'injections de chimiothérapie par anthracyclines, avec cinq semaines d'échographies cardiaques hebdomadaires sous anesthésie et des prises de sang dans le sinus derrière l'œil. Le porteur indique que la tumeur "pourrait être douloureuse" et que la chimiothérapie peut causer des douleurs, et les souris qui restent au-delà des points limites sont "exclues de l'expérience", sans autre précision sur leur sort. Pour justifier le choix de l'espèce, il cite l'homologie avec l'humain et des souris "relativement peu coûteuses à élever".

Objectifs

Depuis longtemps la cardio-toxicité des agents chimiothérapiques est établie chez l'Homme, cependant la chronologie et les facteurs aggravant de la maladie ne sont pas connus. Aussi, aucune stratification des patients n’est réalisable en amont du traitement car les mécanismes précis de cette cardiotoxicité restent complexes et imparfaitement étudiés. L’objectif du projet est de déterminer l’impact de notre protéine, une protéine fréquemment surexprimée dans différents cancers, sur le devenir des animaux traités aux anthracyclines , un des traitement de base du cancer du sein. Ce qui nous intéresse tout particulièrement sera la capacité du coeur à se contracter lorsque nous initierons le traitement.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples : 1. De valider l’hypothèse que les effets toxiques de la tumeur sur le coeur pré-traitement sont médiés par la protéine retrouvé dans la circulation 2. De confirmer l’intérêt d’utiliser la protéine dans la circulation comme biomarqueur prédictif de cardiotoxicité associée à la chimiothérapie 3. De prévenir la cardiotoxicité associée aux anthracyclines par l’utilisation d'un anticorps dirigé contre notre protéine.

Procédures

Pose de bague d'identification à l'oreille: 1 fois au moment du sevrage à 21 jours. Biopsie de 2mm à l'oreille au moment du sevrage à 21 jours. Anesthésies par voie intrapéritonéales: 1/semaine pendant 5 semaines, durée 15 minute. Prélèvements rétroorbitaires sur animaux anesthésiés: 1/ deux semaines pendant 5 semaines, durée 2 min. Injection rétro-orbitaires 1 fois à la 4ème semaine, durée 1 min. Injection sous cutané 1 fois en début de protocole, durée 2 min.

Impact sur les animaux

Concernant la méthode de prélèvement pour le génotypage : inconfort ponctuel lors de la pose de la bague auriculaire et du prélèvement de tissu (2mm à l'oreille). A la suite de l’injection sous-cutanée des cellules cancéreuses, les souris développeront une tumeur, et cette croissance de la tumeur pourrait être douloureuse. La chimiothérapie utilisée peut elle aussi engendrer des douleurs pour l’animal.

Devenir

L'euthanasie de tout les animaux à la fin de la procédure permettra une analyse histologique des organes d'intérêts, ainsi qu'une analyse protéique et génétique de divers tissus selon les groupes d'appartenance des animaux.

Remplacement

Les expérimentations in vitro ne permettent pas de représenter la complexité d’un organisme vivant. L'effet d'un traitement sur une monocouche de cellules cancéreuses in vitro nous permet de montrer l'efficacité de ce traitement sur ce type cellulaire mais le traitement devra être étudié in vivo pour être sûr de son efficacité dans un organisme vivant complexe qui contient une multitude de tissus et organes qui peuvent être touchés.

Réduction

Nous avons effectué un calcul nous permettant d’avoir le nombre précis de souris nécessaire à l’étude. En utilisant les résultats d’une précédente étude de notre laboratoire sur un projet relativement similaire, nous sommes arrivés au chiffre de 12 souris par groupe en début de protocole. Enfin, le suivi par échographie cardiaque permet également une réduction du nombre d'animaux car cette technique permet un suivi longitudinal sur le même animal sans mise à mort à des temps intermédiaires.

Raffinement

Les animaux disposeront d’une période d'acclimatation de 5 jours et seront observés quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie ainsi que par l'expérimentateur. Différents points limites seront particulièrement surveillés et seront notifiés dans un cahier de suivi des animaux. Les animaux âgés de 12 à 18 semaines recevront une injection sous cutanée de 100 microlitres de cellules cancéreuses du sein. A cette occasion, ils seront surveillés de manière visuelle (fréquence respiratoire) pendant 1h après injection. Deux semaines après l'injection de la tumeur, les animaux, mâles et femelles, recevront une injection intrapéritonéale de chimiothérapie tous les jours pendant 6 jours, laquelle peut engendrer des douleurs et donc une analgésie adaptée sera administrée en cas de besoin. Chaque semaine pendant 5 semaines, l’échocardiographie et le prélèvement sanguin (fait une semaine sur deux en l'occurence pour éviter un excès de prélèvement de sang) seront faits l’un après l’autre pour limiter le nombre d’anesthésie hebdomadaire. Nous évaluerons la fonction cardiaque par échographie sous anesthésie générale, puis nous ferons des prélèvements sanguins via le sinus rétro-orbitaire, environ 100 microlitres à chaque prélèvement, 5 min après l'application d'un anesthésique locale. Une pommade ophtalmique afin de réhydrater l'oeil de l'animal sera utilisée post prélèvement. La même procédure aura lieue pour l'injection de notre médicament candidat. Différents points limites seront particulièrement surveillés tels que la perte de poids, le comportement, l’apparence physique et la gêne pour sedéplacer. En cas d’atteinte des points limites, les souris concernées auront alors un suivi adapté avec analgésie quotidienne, nourriture en gelée dans la cage, et si les points limite persistent, elles seront alors exclues de l'expérience.

Choix des espèces

La souris est utilisée en sciences expérimentales pour plusieurs raisons essentielles. Tout d’abord les souris partagent une grande homologie génétique et physiologique avec les humains, ce qui permet de mieux comprendre les processus biologiques et les maladies chez l’humain. Ensuite, les souris se reproduisent rapidement et sont relativement peu coûteuses à élever, ce qui permet d'obtenir rapidement des cohortes expérimentales. Troisièmement, les souris peuvent être facilement génétiquement modifiées pour étudier l'impact de gènes spécifiques sur les processus biologiques, offrant ainsi des informations précieuses sur la fonction des gènes. Pour notre étude, nous avons choisis des souris mâles et femelles C57Bl/6. Ces souris sont utilisées fréquemment dans la recherche en cancérologie et en cardiologie pour leur robustesse, leur survie malgré de forte dose de chimiothérapies, leur facilité de manipulation génétique, et d’après des recherches bibliographiques la croissance tumorale est la même pour les deux sexes, ce qui nous permettrait donc de comparer les effets du PCZ selon le sexe. Les animaux seront agés de 12 à 18 semaines dans un but de prendre des souris adultes, car le cancer du sein est une maladie fortement liée à l'âge. Prendre des animaux plus jeunes risquerait de masquer certaines observations, et ne serait pas cliniquement relevant lorsque nous voudrions transposer les résultats à l'homme. Prendre des animaux plus agés risquerait d'augmenter la probabilité de morts liés aux traitements, ainsi que la survenue de comorbitidés ou d'autres tumeurs spontanées chez nos souris. Par ailleurs, le cancer du sein triple négatif touche particulièrement les jeunes femmes, donc nous avons choisis des souris dans la première moitié de leur vie.

Les souris gestantes ou allaitantes reçoivent des molécules actives ou un régime gras, puis leurs souriceaux sont identifiés par un prélèvement à l'oreille ou à la queue et, pour certains, injectés de molécules ou de vecteurs viraux. Viennent ensuite, selon les groupes, jusqu'à douze mois de régime gras, dix jours de restriction alimentaire, des jeûnes de 24 heures, des isolements de 24 heures à deux semaines, quatre expositions de 24 heures à 4 °C, et des chirurgies de deux à quatre heures pour enregistrer l'activité cérébrale. 12 134 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et les tests de comportement prévus vers huit semaines ne sont pas nommés. La narration annonce la mise à mort des souris à l'issue des procédures, alors que le champ structuré en compte 500 réutilisées.

Objectifs

Les premiers mois de vie constituent une période essentielle pour le développement du cerveau et de l’organisme. Durant cette phase, des facteurs tels qu’une naissance prématurée, une alimentation maternelle déséquilibrée, des variations hormonales ou certaines maladies génétiques peuvent influencer durablement la santé. Ces perturbations précoces peuvent augmenter, à long terme, le risque de développer des troubles métaboliques (comme l’obésité ou le diabète), des problèmes de fertilité (par exemple le syndrome des ovaires polykystiques), ainsi que des difficultés cognitives. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre comment l’environnement précoce influence le développement du cerveau, en particulier les circuits neuronaux qui contrôlent des fonctions essentielles comme l’alimentation, l’équilibre énergétique et la reproduction. Plus précisément, ce projet vise à : - explorer l’impact des perturbations précoces sur le développement du cerveau et sur certaines fonctions essentielles tout au long de la vie, de la naissance à l’âge adulte ; - comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans ces processus ; - identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour prévenir ou corriger certaines maladies, comme l’obésité, le diabète ou les troubles de la fertilité (par exemple le syndrome des ovaires polykystiques). Ce projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs EU 1/2 et EU 2/2 et le transfert des animaux entre les établissements sera limité au maximum.

Bénéfices attendus

Les premiers mois de vie sont une période cruciale pour le développement du cerveau. Des perturbations durant cette phase, comme une naissance prématurée, des déséquilibres hormonaux ou une alimentation maternelle inadaptée, peuvent avoir des conséquences durables sur la santé de la descendance. Elles augmentent notamment le risque de troubles métaboliques (comme l’obésité, le diabète ou certaines maladies cardiovasculaires), de difficultés reproductives, ainsi que de troubles du développement cognitif à l’âge adulte. Les résultats de ce projet présentent un double intérêt. D’une part, ils permettront d’acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes cellulaires et neuronaux impliqués dans le développement postnatal des circuits cérébraux qui régulent ces fonctions essentielles. D’autre part, ils pourraient contribuer à la santé publique en ouvrant la voie à de nouvelles stratégies de prévention ou de prise en charge des maladies métaboliques et reproductives. Enfin, ces travaux participeront au développement de modèles expérimentaux plus fiables et mieux adaptés pour la recherche en endocrinologie, en neurodéveloppement et en reproduction.

Procédures

Les interventions décrites ici pourront avoir lieu dans les 2 établissements utilisateurs. Les interventions d’une même procédure auront lieu soit intégralement dans l’EU1/2 soit intégralement dans l’EU2/2. Aucun transport d’animaux n’aura lieu en cours de procédure. Les animaux dont le modèle aura été créé dans l’EU2/2 seront transportés vers l’EU1/2 pour l’évaluation métabolique et comportementale. Chez les mères: Des femelles gestantes et/ou allaitantes recevront des molécules actives (par voie orale ou par injection) ou feront l’objet d’interventions nutritionnelles (régime enrichi en graisses). Les effets de ces traitements seront évalués chez les souriceaux dès la naissance, au cours d’un suivi longitudinal à moyen et long terme. Ce suivi comprendra différentes procédures d’évaluation de la reproduction (à partir de 8 semaines), du métabolisme (entre 4 et 20 sem.), du comportement (vers 8 sem.) et de l’activité cérébrale (jusqu’à 8 sem.). Chez la descendance: Tous les animaux issus des mères gestantes seront identifiés et prélevés au niveau de l’oreille ou de la queue. Des souriceaux (mâles et femelles) recevront, à des âges définis, des injections de molécules ou de vecteurs viraux. Ils feront ensuite l’objet d’un suivi longitudinal similaire, incluant des analyses de la reproduction, du métabolisme, du comportement et de l’activité cérébrale. Types d’interventions et durée : Les animaux pourront recevoir différents types de traitements par voie orale, par injections ou implantation de dispositifs. Des prélèvements sanguins seront réalisés (veines mandibulaire, caudale ou latérale), en respectant les volumes et fréquences maximaux autorisés. La durée de ces interventions est généralement comprise entre 5 et 20 minutes. Certains groupes seront soumis à des interventions chirurgicales dans le but d’évaluer la reproduction (anesthésie: 1h; intervention: 15 à 20 minutes) ou de réaliser un enregistrement de l’activité cérébrale (anesthésie et intervention: 2 à 4 h). Au cours de ces procédures, des anesthésiques et des analgésiques seront utilisés chaque fois que nécessaire. Les anesthésies seront réalisées par injection ou par inhalation et l’analgésie sera administrée par injection ou par application locale. Les animaux impliqués dans l’étude du métabolisme pourront recevoir des régimes spéciaux (régime enrichi en graisses pendant 3 à 12 mois), une restriction alimentaire (jusqu’à 10 jours) ou des périodes de jeûne (durée maximale de 24 heures).

Impact sur les animaux

Les manipulations réalisées sur les animaux peuvent entraîner du stress, de la fatigue et un certain inconfort. Certaines procédures, telles que les interventions chirurgicales, les injections ou les prélèvements sanguins, peuvent provoquer des douleurs légères de courte durée pouvant être répétées. Dans le cadre des études métaboliques ou comportementales, les animaux seront soumis à des conditions d’hébergement dérogeant aux standards réglementés. En effet les animaux pourront être privés de leur congénères (sans isolement visuel et olfactif) pendant des durées allant de 24h à 2 semaines et pouvant être répétées. Les animaux pourront être restreints en quantité de nourriture (maximum 10 jours) et/ou être exposés à des jeûnes allant jusqu’à maximum 24h. Enfin, pour évaluer la réponse aux changements de température, les conditions standards de température d’hébergement pourront également modifiées (maximum 24h d’exposition à 4°C, 4 expositions au maximum espacées d’au minimum 72h OU 24-72h à 30°C).

Devenir

À l’issue des procédures, les animaux sont mis à mort selon des méthodes réglementaires et encadrées, afin de permettre le prélèvement des tissus nécessaires aux analyses scientifiques. Ces prélèvements sont indispensables pour comprendre en détail les mécanismes étudiés et ne peuvent pas être réalisés autrement.

Remplacement

Pour évaluer l’impact de l’environnement périnatal sur le développement des systèmes neuroendocriniens, il n’existe actuellement pas d’alternative à l’expérimentation animale. La complexité des phénomènes étudiés, notamment l’influence de l’environnement maternel sur le développement de l’organisme, implique des interactions étroites entre plusieurs organes (cerveau, tissus périphériques, systèmes hormonaux) qui ne peuvent pas être reproduites de manière fiable par des modèles informatiques. Les animaux invertébrés ne peuvent pas être utilisés dans ce contexte, car leur organisation biologique est très différente de celle des mammifères. Ils ne possèdent pas les mêmes structures cérébrales ni les mêmes systèmes hormonaux, ce qui ne permet pas d’étudier les mécanismes neuroendocriniens pertinents pour la santé humaine. Par ailleurs, les modèles in vitro, tels que les organoïdes ou les cellules souches, bien qu’utiles pour certaines questions spécifiques, ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions entre les organes ni les réponses physiologiques intégrées de l’organisme entier. Or, ces interactions sont essentielles pour répondre aux objectifs de nos recherches en physiologie intégrée.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires a été déterminé à l’aide de calculs de puissance statistique, afin de garantir l’obtention de données fiables tout en limitant leur utilisation au strict minimum. La taille de chaque groupe expérimental a été définie à l’aide d’outils de planification adaptés, permettant d’éviter l’utilisation d’animaux en excès tout en assurant la robustesse des résultats. Par ailleurs, certaines expériences ne seront entreprises que si les résultats des étapes précédentes le justifient, ce qui permet d’éviter des expérimentations inutiles. Enfin, les protocoles expérimentaux ont été conçus pour optimiser l’utilisation de chaque animal. Lorsque cela est possible, plusieurs types d’analyses seront réalisés sur un même individu (par exemple, des évaluations physiologiques et des analyses moléculaires sur différents organes), réduisant ainsi le nombre total d’animaux nécessaires.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions strictement contrôlées, garantissant leur bien-être et un bon état de santé. Ils ont accès en permanence à l’eau et à la nourriture, et leur environnement est enrichi (par exemple avec des matériaux pour construire un nid), afin de leur permettre d’exprimer des comportements naturels et de réduire le stress. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé et les animaux sont progressivement habitués à être manipulés afin de diminuer leur stress. Une attention particulière est portée à la réduction de toute douleur, peur ou inconfort. Lorsque des interventions sont nécessaires, elles sont réalisées sous anesthésie adaptée et des traitements contre la douleur sont administrés si besoin, avant et après les procédures. Après chaque intervention, les animaux sont surveillés attentivement jusqu’à leur réveil complet, puis leur état de santé est suivi quotidiennement (activité, alimentation, poids, comportement) avec le moins de perturbations possibles. Une attention particulière sera apportée afin de prévenir tout transfert d‘odeurs étrangères à la cage qui pourraient compromettre le lien entre la mère et ses petits. Des critères précis sont définis pour intervenir rapidement en cas de problème. Si un animal montre des signes de souffrance ou de détresse, il est immédiatement pris en charge et, si nécessaire, retiré de l’étude afin d’éviter toute souffrance prolongée. Dans le cadre des études métaboliques ou comportementales, les différentes contraintes sont appliquées de manière séquentielle avec des périodes de récupération permettant la stabilisation physiologique entre étapes et les animaux disposent d’un enrichissement compatible avec les mesures (litière et matériel de nidification). Lors du déplacement des animaux de l’EU2/2 vers l’EU1/2, les animaux seront transportés dans un véhicule climatisé dans des cages de transport agréées sous condition d’autorisation pour le statut sanitaire (distance 11,1 km ; statuts sanitaires équivalents) entre les EU. Les animaux seront acclimatés pour une période de 7 jours sur le site d’accueil avant toute manipulation. Des points limites ont été définis et seront appliqués. Tout animal présentant des signes s’approchant ou atteignant l’un d’entre eux seront retirés de l’étude et si nécessaire, mis à mort.

Choix des espèces

Nos projets de recherche en physiologie intégrée visent à comprendre les interactions entre le corps et le cerveau afin d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques pour des pathologies telles que le diabète, l’obésité et l’infertilité. Nous étudierons des souris de la naissance à l’âge adulte afin de couvrir l’ensemble des étapes clés du développement et de la maturation des systèmes biologiques. La période néonatale correspond à une phase critique de mise en place et d’organisation des structures, notamment au niveau neuroanatomique et neuroendocrinien, tandis que l’âge adulte reflète un état fonctionnel stabilisé de ces systèmes. Cette approche permet d’appréhender la dynamique des mécanismes physiologiques au cours du temps et d’identifier d’éventuelles origines développementales aux altérations observées à l’âge adulte. Le recours aux animaux est strictement limité aux situations dans lesquelles aucune méthode alternative ne permet d’obtenir un niveau d’information équivalent. L’espèce utilisée a été choisie de manière à maximiser la pertinence scientifique tout en minimisant la douleur, la souffrance et le nombre d’animaux utilisés. La souris est privilégiée car des données essentielles à l’interprétation des résultats ne sont disponibles que dans cette espèce, ce qui contribue également à réduire la variabilité expérimentale et, par conséquent, le nombre d’animaux nécessaires. De plus, les études physiologiques en neuroendocrinologie ainsi que les recherches sur l’obésité et l’infertilité ont historiquement été menées chez la souris, facilitant la comparaison avec les données existantes. Enfin, certaines expériences proposées nécessitent l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour lesquels la souris constitue de loin le modèle expérimental le plus pertinent et le mieux caractérisé.