Oncologie

Pour mesurer le rôle d'une hormone du métabolisme du fer dans l'arthrite, 400 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. 320 d'entre elles reçoivent deux injections dans l'abdomen à 72 heures d'intervalle qui déclenchent une arthrite, 70 sont gavées deux fois par jour pendant dix jours. Le porteur décrit une inflammation et des douleurs articulaires du septième au onzième jour, terme du protocole, puis un prélèvement de sang par ponction dans le cœur sous anesthésie avant la mise à mort. Il indique qu'une perte de poids supérieure à 20 % arrête l'expérimentation et déclenche la mise à mort des souris concernées.

Objectifs

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie auto-immune chronique touchant 0,5 à 1% de la population. Cette pathologie dépend du développement d’auto-anticorps et d’un recrutement de cellules inflammatoires dans les articulations, menant à une destruction des os et du cartilage. Des molécules activées par l'inflammation perturbent le métabolisme du fer en régulant l’expression de l’hepcidine. L’hepcidine est un petit peptide circulant, il réduit le fer sanguin en inhibant son absorption par l’intestin et sa libération des tissus de stockage. L’hepcidine est principalement exprimée par le foie, mais des études ont montré une synthèse extra-hépatique de l’hepcidine dans plusieurs organes périphériques. Dans un contexte inflammatoire, l’hepcidine aurait un rôle délétère dans ces tissus puisque localement, elle peut augmenter la rétention du fer toxique et accentuer l’inflammation. En effet, l’hepcidine est une protéine inflammatoire de phase aigue. Cependant, le rôle de l’hepcidine dans la PR, reste à ce jour non élucidé. L’équipe a montré que l’hepcidine est produite au niveau de l’articulation de manière significativement supérieure chez des patients atteints d’arthrite comparés à ceux atteints d’arthrose (maladie articulaire non inflammatoire). Des inhibiteurs d'une des voies de régulation importante de l’hepcidine représentent une nouvelle classe thérapeutique capable de cibler l’inflammation des patients atteints d’arthrite. Ainsi nos objectifs dans ce projet sont d’évaluer d’une part l’implication de l’hepcidine locale dans l’exacerbation de l’inflammation et dans les mécanismes de destruction ostéo-articulaire, et d’autre part, d’évaluer ses consequences sur le métabolisme du fer et sur le développement de la pathologie dans un modèle murin d’arthrite.

Bénéfices attendus

La polyarthrite rhumatoïde est une maladie inflammatoire touchant les articulations qui affecte actuellement en France 0.5 à 1% de la population, ce qui représente plus de 300 000 personnes. De ce fait, une meilleure compréhension de cette pathologie et le développement de traitements ciblés représentent un enjeu de santé publique majeur. Nos données récentes chez les patients ont montré que l’hepcidine, un peptide qui régule le métabolisme du fer, était présente au niveau de l’articulation en conditions d’arthrite et qu’elle pouvait jouer un rôle important dans la pathologie. Ce projet permettra d’apporter de nombreuses connaissances sur le métabolisme du fer local dans la polyarthrite rhumatoïde, un domaine non étudié à ce jour. Parmi les derniers traitements développés, le filgotinib montre des résultats encourageants chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde modérée à sévère. Ce projet nous permettra d’apporter plus de connaissances concernant les mécanismes d’action de ce traitement dans la polyarthrite rhumatoïde. De plus nous apporterons des résultats sur l’impact de ce traitement sur le métabolisme du fer qui intervient dans de nombreux processus physiologiques.

Procédures

320 animaux subiront 2 injections intrapéritonéales réalisées à 72h d’intervalle. Ce geste, rapide (quelques millisecondes à quelques secondes) et indolore pour les animaux, sera réalisé sur animaux vigiles. 70 animaux seront soumis à des gavages deux fois par jour pendant 10 jours (de J0 à J9). Cette technique réalisée en quelques secondes sera réalisée par des personnes expérimentées sur animaux vigiles. L’ensemble des souris subiront également un prélèvement sanguin intracardiaque (quelques secondes) réalisé sous anesthésie avant leur mort.

Impact sur les animaux

Les animaux qui développeront une arthrite peuvent subir une inflammation et des douleurs articulaires à partir de la mise en place de la pathologie (J7) jusqu’à la fin du protocole expérimental (J11).

Devenir

Notre projet nécessite la récupération de prélèvements moléculaires, cellulaires et tissulaires, ce qui ne nous permet pas de garder les animaux en vie après prélèvements. De plus le projet ne nécessite pas de faire une cinétique sur nos animaux. De ce fait, tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure expérimentale.

Remplacement

Notre projet repose sur des études préliminaires réalisées in vitro ayant montré que l’arthrite modulait le métabolisme du fer et que ce dernier avait un impact sur la pathologie. La polyarthrite rhumatoïde étant un système complexe impliquant de nombreux partenaires cellulaires, les études in vitro ne permettent pas de représenter l’ensemble de la pathologie. De ce fait, le modèle in vivo reste le meilleur modèle permettant d’étudier la polyarthrite rhumatoïde dans le cadre de notre projet. Nos résultats in vitro nous permettent de justifier l’intérêt scientifique de notre projet dans un système concret qu’est le système in vivo.

Réduction

Notre projet a été pensé afin de réduire au maximum le nombre d’animaux. Sur un même animal, nous réaliserons des analyses anatomiques (histologie des articulations), cellulaires (analyse des cellules articulaires et circulantes), et moléculaires (dosages). Les techniques utilisées dans notre projet sont des techniques que nous maitrisons et que nous réalisons régulièrement au laboratoire. Les analyses statistiques seront effectuées à l’aide d'un logiciel adapté. Des tests statistiques pertinents seront utilisés.

Raffinement

Notre projet a été conçu afin de limiter le mal-être des animaux. Afin de réduire au maximum les douleurs et l’inconfort des animaux, notre étude sera conduite par un expérimentateur formé à l’expérimentation animale. Afin de limiter le stress des animaux, les souris seront acclimatées pendant une semaine suite à leur arrivée dans la zootechnie et avant de débuter l’expérimentation. De plus, elles seront hébergées avec d’autres souris tout au long du protocole (5 souris par cage) dans des cages d’une superficie de 500 cm2 à 20-24°C et 30-50% d’hygrométrie, en portoirs ventilés, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Des objets enrichissants seront disposés dans chaque cage pour limiter le stress des animaux. Notre projet nécessite un suivi quotidien du développement de la maladie chez les animaux. De ce fait, nous observerons attentivement les animaux de manière quotidienne et si ces derniers présentent des altérations physiques, des signes de douleur et/ou des comportements anormaux (flan creusé, dos voûté, poils sales, perte de poids, déshydratation, agressivité, prostration…), un analgésique sera administré si necessaire et si cela n’améliore pas leur état ou si une perte de poids de plus de 20% est observée, l’expérimentation sera immédiatement arrêtée et les animaux concernés seront euthanasiés. A la fin de la procédure, avant l’euthanasie des animaux, un prélèvement intracardiaque sera réalisé. Pour réduire la douleur et le stress des animaux générés par cette procédure, les animaux seront anesthésiés au préalable avec un mélange de kétamine et de xylazine.

Choix des espèces

Les modèles murins de polyarthrite rhumatoïde sont couramment utilisés pour étudier la physiopathologie de cette maladie. De plus, le choix d’utiliser des modèles murins a été conforté par le fait que nous possédons de nombreuses connaissances sur ce modèle, nous permettant un plus grand nombre d’analyses possibles. Les souris utilisées seront âgées de 7 à 8 semaines, ce qui est en conformité avec les études publiées utilisant ce modèle murin d’arthrite.

Testée seize fois et manipulée dix-huit fois sur trente-six semaines, chaque poulette suivie passe par des épreuves de persévérance alimentaire, de réactivité face à un objet nouveau, de motivation sociale, de témérité, de biais d'attention et de contagion émotionnelle. 224 poules pondeuses vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, dont 200 suivies individuellement. L'objectif déclaré est de fournir aux éleveurs une grille pour repérer tôt les futures piqueuses, l'épointage du bec restant autorisé en France. Le porteur reconnaît que le picage sévère ne pourra pas être évité puisqu'il s'agit précisément de l'observer, 28 poules choisies pour leur tempérament seront tuées par injection pour prélever leur cerveau, les autres partant à l'abattoir.

Objectifs

La filière de production des œufs est en pleine mutation, avec l’abolition progressive à la fois de l’élevage en cages mais aussi de pratiques pouvant compromettre le bien-être des animaux. L’épointage du bec chez la poule pondeuse, une pratique consistant à cautériser l'extrémité du bec à l’aide d’un rayon laser, potentiellement douloureuse, a déjà été interdite dans plusieurs pays. Elle reste cependant couramment utilisée en France pour limiter les effets du picage sévère en élevage, tels que le cannibalisme. L’arrêt de l’épointage s’avère compliqué, car les quelques initiatives actuelles (enrichissement du milieu, contrôle de l’intensité lumineuse, apports nutritionnels spécifiques) ne permettent pas de limiter suffisamment le risque de picage sévère chez les poules non épointées. Pour limiter son apparition, il est nécessaire de mettre en place le plus précocement possible des actions préventives. Or, les méthodes actuelles pour détecter précocement les problèmes de picage, telles que la dégradation de l’état du plumage ou l’observation de comportements agressifs, sont trop tardives pour anticiper les épisodes de picage et intervenir efficacement pour les limiter. L’enjeu est ainsi d’agir le plus tôt possible grâce à des observations comportementales en lien avec le niveau de tempérament “piqueur” des animaux. Ce travail a pour ambition de proposer un outil d’évaluation du risque de picage chez la poule à un stade précoce. Cet outil repose sur une grille d’évaluation du comportement des poulettes à destination des éleveurs. La présente étude visera à compléter et à valider des indicateurs comportementaux/de tempéraments reliés à une propension plus ou moins forte de l’individu à piquer.

Bénéfices attendus

Le but de cette étude est d’élaborer une grille d’indicateurs de traits comportementaux/tempéraments chez la poulette qui servira à évaluer à un stade précoce un risque de picage sévère ultérieur. En effet, les mesures prises pour endiguer et gérer le picage sévère en élevage sont trop tardives. La finalité est d’avoir un outil qui permettra aux éleveurs et éleveuses d’identifier les premiers signes précurseurs du picage dès le stade poulette, sur la base de leur tempérament, afin de prendre les mesures nécessaires pour la bonne gestion de leur lot (ex : apport d’enrichissements supplémentaires dans le milieu de vie, la gestion très douce des transitions alimentaires, le suivi renforcé des animaux (comportement, emplumement) pour déceler le moindre écart, la limitation des changements brusques et les sources de stress, etc….).

Procédures

La procédure n’implique pas d’actes invasifs. Lors des trois sessions de tests (session 1 : 4 tests et sessions 2&3 : 6 tests), chacun des 200 individus sera testé une fois par semaine. Un minimum de deux semaines sera laissé entre les sessions pour laisser la place à des périodes sans perturbation. Au total, une même poule sera donc testée 16 fois, dont trois fois par groupe de 10, et manipulée à deux autres moments pour la pose et le changement des dossards et des bagues. Chacun des 200 individus sera donc manipulé 18 fois, étalé sur 36 semaines d’élevage. Les objectifs des tests de comportement, choisis pour leur lien avec un comportement de picage d'après la littérature scientifique et une étude pilote, sont de pouvoir identifier des comportements contrastés afin de dresser un profil de tempérament d'individus qualifiés de "très piqueur" et un profil d'individus qualifiés de "peu piqueur". Les comportements étudiés sont la persévérance pour accéder à une ressource alimentaire appétante, la réactivité émotionnelle des animaux face à un environnement ou à un objet nouveau, leur motivation sociale, leur témérité, leur activité, leur biais d'attention et leur contagion émotionnelle. L'ensemble de ces 6 tests répétés à trois âges différents (sauf 2 d'entre eux en session 1 car jugés plus exploratoires, permettant de laisser davantage de temps de récupération entre les deux premières sessions de tests) dureront entre 5 minutes et 20 minutes au maximum chacun en fonction du test. Concernant les 24 poules surnuméraires, elles seront manipulées deux fois pour la pose des dossards et dans un maximum de 20 fois sur toute la durée de l’expérimentation au cours de deux tests comportementaux qui nécessitent la présence de congénères dans la zone où seront testés individuellement les 200 individus suivis (elles seront placées par groupe de 2-3 dans une aire dédiée).

Impact sur les animaux

Les contentions que les tests impliquent sont ponctuellement stressantes pour les animaux. Les tests comportementaux individuels (20 minutes maximum) peuvent engendrer du stress lié à l’isolement social. Le but de l’expérimentation étant d’observer du picage pour le relier à des tempéraments, nous ne pourrons pas l’éviter. En cas de picage sévère, les animaux pourront subir un stress ou de la douleur lié à une blessure (une observation vigilante et quotidienne est prévue ainsi qu'une infirmerie pour traiter les animaux qui seraient blessés).

Devenir

La majorité des animaux seront abattus en circuit classique (abattoir) pour commercialisation. Un total de 28 poules choisies pour leur tempérament « fortement piqueur » et « peu piqueurs » seront mises à mort par injection pour un prélèvement du cerveau pour analyses génomiques futures comme mesure complémentaire aux observations comportementales.

Remplacement

L'impact du tempérament des poulettes sur le comportement de picage sévère ultérieur ne peut être évalué que par des essais sur animaux vivants. De plus, le projet concerne spécifiquement l’espèce de la poule domestique.

Réduction

Ce protocole expérimental est pensé de façon à minimiser le nombre de poules utilisées tout en conservant un effectif suffisant pour être à minima représentatif des conditions d’élevage et pour avoir des résultats statistiquement significatifs. Le tempérament est propre à chaque individu. Il existe donc une forte variabilité interindividuelle qui nécessite l’implication d’un nombre suffisant d’animaux. Ce projet impliquera donc au total 224 poules, dont parmi elles 200 seront suivies et testées. L’analyse des résultats d’une étude préliminaire nous a permis de conclure que 200 individus étaient un minimum pour nous permettre de différencier statistiquement des poules avec un tempérament « très piqueur » d’un tempérament « peu piqueur » (prévalence de 10% d’individus très piqueurs au sein d’un lot, d’après une étude précédente). Les 24 poules surnuméraires permettent d’augmenter la taille de groupe pour provoquer davantage de comportements d’interactions sociales entre les poules et serviront d’individus familiers lors de deux tests comportementaux impliquant les individus suivis.

Raffinement

Le raffinement des conditions d’hébergement visera à assurer au sein du parc des conditions similaires à celles rencontrées sur le terrain en élevage standard avec des pratiques un peu améliorées (présence de perchoirs dès le stade de poulettes, suivi rapproché quotidien). La densité d'élevage sera très légèrement plus faible que celle rencontrée sur le terrain afin de nous permettre de mieux observer les animaux : 14 poulettes/m² au lieu de 16. Un contrôle des paramètres d'ambiance sera fait quotidiennement de manière automatique dans toutes les salles. L’alimentation et la conduite des animaux seront adaptées à la génétique utilisée en suivant son cahier des charges. Les poules feront l’objet de visites quotidiennes pour la surveillance afin de mettre fin immédiatement aux souffrances des individus malades ou blessés et pour l’entretien (nourrissage, nettoyage, tests). Des visites supplémentaires seront instaurées au besoin selon l’évolution de leur état de santé. L’examen individuel comprendra : une observation des points limites associés au suivi du picage ou à un état léthargique. De plus des observations quotidiennes sont prévues par analyse de vidéo pour suivre l’évolution des comportements de picage. Aussi, lors des tests comportementaux individuels, l’isolement social ne sera que visuel. Les tests seront conduits dans la même salle que l’enclos de vie, ce qui permettra aux animaux de garder un contact auditif et olfactif avec leurs congénères.

Choix des espèces

Ce projet concerne directement la filière d’élevage de poules pondeuses, affectée par la problématique du picage sévère qui est une vraie problématique de santé et bien-être animal et de perte économique en élevage. Le projet vise donc à l’élaboration d’une grille pour évaluer le risque de picage dès le stade de poulettes sur la base de tempéraments. Cette évaluation précoce leur permettra de ne pas attendre les premiers signes visuels de picage sévère pour prendre des mesures de régulations nécessaires du picage. La poule pondeuse est l’espèce cible et est donc la seule espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de la procédure expérimentale. Une souche très répandue dans la filière d'élevage française, plus sujette au picage, a été choisie pour le projet. Les animaux seront élevés dès leur arrivée en tant que poussins de 1 jour jusqu’à 36 semaines au maximum. Cela nous permettra ainsi de confirmer le lien entre les indicateurs de la grille présumant le tempérament « piqueur/non piqueur » des poulettes et la présence/absence réelle de ce comportement de picage à un stade plus avancé, chez la poule pondeuse, là où il est censé se produire plus fréquemment qu’au stade poulettes.

78 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans le derme une injection de Borrelia afzelii, la bactérie de la maladie de Lyme, puis passent cinq anesthésies, une par semaine, pour suivre en imagerie la dissémination des bactéries. La dernière anesthésie ne se termine pas par un réveil : les souris sont tuées pour que soient prélevés peau, articulations, cœur, cerveau, rate et sang. Les retombées annoncées, des molécules ciblant le gène étudié, sont renvoyées au plus long terme, et le porteur indique qu'aucun modèle in silico ne permet aujourd'hui de reproduire ces interactions.

Objectifs

En 10 ans, l'incidence de la borréliose de Lyme en France a pratiquement doublé, constituant ainsi un problème majeur de santé publique. Cette maladie infectieuse est causée par une bactérie du genre Borrelia, transmises par les tiques, ces dernières agissant comme de véritables vecteurs de ces agents pathogènes en infectant l'homme ou les animaux domestiques lors de leur repas sanguin. En France et en Europe, l'espèce Borrelia afzelii est très fréquente et s'étend. L'objectif principal de ce projet est d'étudier in vivo le rôle d’un gène particulier de Borrelia afzelii dans la dissémination des bactéries chez la souris et la réponse inflammatoire qui en découle. Ce gène de la bactérie Borrelia permet la production d’une molécule qui leur sert à communiquer entre-elles impactant ainsi leur virulence et leur résistance aux antimicrobiens. Dans notre projet, des souris seront infectées par voie intradermique, pour mimer la voie de pénétration chez l’homme, par Borrelia afzelii qui aura été ou non préalablement modifiées génétiquement pour supprimer l’expression du gène du gène d’intérêt. Les bactéries ayant le gène d'intérêt normal sont appelées sauvage alors que les bactéries où le gène d'intérêt a été supprimé sont dites mutées. A partir de ce point de départ cutané, l’infection sera suivie chez l’animal pendant 28 jours à l’aide d’un système d’imagerie in vivo pour étudier la dissémination des bactéries dans les différents organes et tissus cibles. Au terme de ce suivi, ces tissus cibles de l’infection par Borrelia seront collectés (peau, articulations, tissu cardiaque, système nerveux central, rate, sang) dans le but de quantifier la charge bactérienne ainsi que l’expression des médiateurs de la réponse inflammatoire. La contribution du gène d’intérêt à la dissémination bactérienne et à la réponse inflammatoire développée par les animaux infectés sera mise en évidence par la comparaison des infections entre les souches sauvages et mutées.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude nous permettront de faire progresser les connaissances sur le rôle d’un gène particulier de Borrelia afzelii dans la dissémination de la bactérie lors de l’infection d’un organisme hôte, sa virulence et la réponse inflammatoire de ce dernier. Ils permettront à plus long terme d’envisager l’utilisation de molécules ciblant le gène d’intérêt pour le traitement de la borréliose de Lyme. Ce champ d’investigation présente un intérêt manifeste, étant donné que l’Homme et les animaux domestiques sont de plus en plus exposés aux tiques et susceptibles d’être infectés par Borrelia afzelli, une espèce qui s’étend en France et en Europe.

Procédures

Tous les animaux (78) seront anesthésiés 5 fois à raison d'une fois par semaine pour faire le suivi de la dissémination bactérienne par imagerie. Lors de la première anesthésie d'une durée de 30 min maximum, les animaux seront rasés au point d'injection et une injection de bactéries dans le derme sera pratiquée avant l'imagerie. Les anesthésies suivantes dureront 10 min environ. Lors de la dernière anesthésie, après l'imagerie, les animaux encore anesthésiés seront mis à mort pour des prélèvements.

Impact sur les animaux

- L’injection pour induire l’anesthésie au début et à la fin du protocole crée une douleur légère et transitoire. - L'induction de l'anesthésie gazeuse et le réveil après anesthésie provoque un stress léger et transitoire des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort de manière à collecter les différents tissus cibles au sein desquels la bactérie Borrelia est susceptible de se propager à partir du point d'injection cutané. Pour chaque échantillon biologique collecté, la charge bactérienne sera déterminée et les marqueurs de la réponse inflammatoire seront également analysés.

Remplacement

Des expériences in vitro ont été réalisées au préalable pour étudier l’impact de la mutation du gène d’intérêt de Borrelia afzelii sur la croissance bactérienne. Cependant, il est nécessaire d’effectuer des expériences in vivo chez l’animal afin d’étudier l’impact de cette délétion du gène d’intérêt sur la dissémination de la bactérie dans l’organisme hôte, ainsi que sur la réponse inflammatoire de l’organisme en réponse à l’infection, qu’il est impossible d’étudier in vitro, compte-tenu de la complexité des mécanismes mis en jeu. De plus, il n'existe pas encore de modèle in silico pour mimer ces interactions complexes.

Réduction

A partir des données de la littérature scientifique, nous avons pu calculer un effectif de souris minimum nécessaire pour assurer une validation statistique de l’étude, à l’aide d'une formule mathématique appropriée. Ainsi, nous proposons d’utiliser 18 animaux par lot en effectuant 3 expériences indépendantes avec 6 souris par lot. Ce découpage en 3 expériences indépendantes permettra d’envisager une démarche de réduction par analyse de tendance en cours de projet, dans le cas où des différences statistiques significatives seraient observées.

Raffinement

Afin de satisfaire les besoins comportementaux des souris, celles-ci seront maintenues en groupes de 3 individus par cage ventilée. Leur milieu sera enrichi de structures adaptées répondant à leur besoin naturel de ronger (buchettes de peuplier) et leur permettant de se cacher (nid). Afin de limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse des animaux, ceux-ci seront anesthésiés lors des phases d’expérimentation les plus longues (rasage, injection de bactéries, imagerie) avec contrôle de la température par tapis chauffant. Des points limites gradés, précis et adaptés sont listés dans une grille et feront l’objet d’une surveillance quotidienne des animaux. Une prise en charge par un traitement antalgique sera mise en œuvre précocement en cas de besoin.

Choix des espèces

Les modèles murins d’infection bactérienne par la bactérie Borrelia sont fréquemment utilisés pour étudier in vivo la dissémination de la bactérie dans l’organisme hôte et la réponse inflammatoire induite. La réponse inflammatoire de la souris est par ailleurs décrite et étudiée depuis des décennies et autorise des comparaisons avec la réponse inflammatoire humaine. Les modèles murins, bien que pouvant présenter certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier la réponse inflammatoire de l’hôte en réponse à l’infection et évitent d’avoir recours à des espèces animales plus proches de l’Homme. Les animaux seront inclus dans le projet à partir de l’âge de 8 semaines, lorsque leur système inflammatoire est bien développé.

1 080 souris vont être utilisées dans le premier volet du projet, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Anesthésiées pour la greffe d'un fragment tumoral pancréatique, elles reçoivent une chimiothérapie deux fois par semaine pendant quatre semaines, une radiothérapie quotidienne pendant cinq jours, et cinq séances d'IRM d'une heure trente. Le bénéfice avancé tient à des marqueurs d'imagerie que le porteur juge "facilement transposables" en clinique, quand la perte de poids et la croissance tumorale sont, elles, décrites comme attendues. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité du milieu tumoral, et compte l'IRM comme une réduction puisqu'elle évite de tuer des souris à chaque temps d'imagerie.

Objectifs

Le cancer du pancréas est un cancer digestif diagnostiqué à un stade avancé avec un des plus mauvais pronostics, moins de 8% des patients survivent au-delà de 5 ans. Au moment du diagnostic, 80% des patients ont déjà des métastases, rendant la chirurgie impossible. Actuellement, très peu de thérapies sont proposées. La réponse tumorale aux traitements existants reste très difficile à évaluer en clinique par manque de biomarqueurs. De plus, ce cancer résiste à la chimiothérapie et à la radiothérapie. Ces échecs peuvent être expliqués par les caractéristiques de la maladie ainsi que par le manque de biomarqueur permettant la sélection des patients traités. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) est un outil permettant l’acquisition d’images anatomiques in vivo de haute résolution, mais également d’images fonctionnelles. La combinaison de nouvelles modalités IRM a permis l’élaboration de nouveaux biomarqueurs en imagerie pour la caractérisation tumorale. Ce projet vise à étudier l’efficacité de l’association de chimiothérapies suivie par de la radiothérapie externe in vivo grâce à l’utilisation de ces nouveaux biomarqueurs en imagerie. Ce projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs: EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’étudier in vivo les modifications biophysiques des tumeurs mesurées par IRM dues aux différents traitements étudiés dans ce projet. Il s’agira, in fine, de pouvoir évaluer quel traitement sera le plus efficace selon les paramètres biophysiques initiaux de la tumeur, ainsi que d’évaluer rapidement l’efficacité du traitement. Dans les études cliniques, ces techniques IRM seront facilement transposables,

Procédures

Les animaux seront anesthésiés en vue d'une greffe tumorale puis traités par chimiothérapie et radiothérapie (EU1). Durée de la greffe : 2 minutes Durée de la chimiothérapie : injection IP d'environ 1 min, 2 fois par semaine pendant 4 semaines. Durée de la radiothérapie : 5 minutes/jour pendant 5 jours. Durée des injections d'anesthésiant et d'agent de contraste : inférieure à 1 min. Les souris seront suivies 5 fois par IRM sous anesthésie d'1h30 (avant, pendant et après le traitement) (EU2).

Impact sur les animaux

Effets indésirables direct: - douleur associée à une injection ou implantation d'un fragment tumoral - douleur associée à une injection intraveineuse et Intra péritonéale. - stress occasionné par le transport des souris entre les 2 sites. Effets indésirables indirects conséquence des produits injectés: - croissance tumorale - perte de poids. Les nuisances qui pourront être engendrées par la croissance tumorale chez ces animaux seront parfaitement surveillées et maîtrisées afin de limiter toute souffrance animale.

Devenir

A l'issue des procédures expérimentales les animaux seront euthanasiés et les tumeurs seront analysées

Remplacement

Il n’existe pas de modèles in vitro reproduisant la complexité du milieu tumoral et permettant de déterminer l'efficacité thérapeutique par imagerie IRM.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en conservant une puissance statistique suffisante pour le traitement du résultat. L’utilisation de l’IRM pour le suivi de la réponse au traitement de manière non invasive, nous permet de réduire le nombre d’animaux utilisés dans les protocoles expérimentaux puisqu’il n’y a pas d'euthanasie à chaque temps d’imagerie.

Raffinement

La première mesure prise afin de limiter le stress chez nos animaux est une semaine de stabulation à leur arrivée sur les sites. Ceci afin de les habituer à leurs nouvelles conditions d'hébergement. Les conditions d'entretien de manipulation des animaux permettent de les protéger via les équipements et procédures de travail d'une contamination par des pathogènes ou opportunistes. Ensuite les procédures expérimentales seront uniquement réalisées par des ingénieurs expérimentés. De plus, celui-ci avec l'aide de l'équipe gérant la zone surveilleront quotidiennement les animaux. De nombreux critères ont été mis en place afin d'évaluer toute forme de détresse chez les animaux qui entraineront l'arrêt de la procédure si nécéssaire.

Choix des espèces

Pour l’évaluation de cancers d’origine humaine, il est indispensable d’utiliser des animaux immunodéprimés, et la souris présente de nombreux modèles adaptés, notamment les souris athymiques nudes. L’étude de l’effet des thérapies des modèles possédant un système immunitaire demande l’utilisation de souris immunocompétentes greffées avec une tumeur murine. Age 6 semaines, âge ou l’on observe une forte incidence de prise de greffe.

La lignée de souris retenue est dépourvue de certaines cellules immunitaires, ce qui écarte le rejet des cellules cancéreuses greffées. 50 de ces souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe tumorale sur les deux flancs, dix d'entre elles se voyant en plus implanter une pastille d'hormones quatre jours plus tôt, et les tumeurs sont ensuite mesurées au pied à coulisse trois fois par semaine pendant quatre semaines. Le porteur écrit que les animaux sont tués à l'issue parce qu'ils "servent d'individu receveur de greffe" et ne serviront pas à d'autres projets, cette étude pilote visant seulement à choisir le modèle qui sera utilisé ensuite.

Objectifs

La sénescence cellulaire est un programme cellulaire déclenché en réponse à divers stimuli tels que des dommages à l’ADN. Les cellules sénescentes sécrètent un cocktail de molécules appelé SASP (Senescence Associated Secretory Phenotype) qui peut modifier l’architecture de la tumeur et ainsi promouvoir la croissance tumorale, l’évasion immunitaire et les métastases. La compréhension des interactions entre cellules sénescentes, leur SASP et les cellules cancéreuses offre l’opportunité de découvrir de nouvelles thérapies efficaces.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer notre compréhension des effets des cellules sénescentes et les molécules qu’elles sécrètent sur plusieurs types de cancer (cancer du poumon, du sein ou du foie). Cette étude pilote nous permettra de déterminer quel modèle est le plus pertinent pour la suite de notre étude in vivo.

Procédures

Toutes les souris recevront une greffe de cellules cancéreuses sur chaque flanc (deux au total par animal) qui formeront des tumeurs solides. Chaque greffe sera réalisée sous anesthésie générale qui durera moins de 5 minutes, le temps d'une piqure d'aiguille. Pour les souris receveuses de greffe de cellules de cancer du sein : chaque animal (10 au total) recevra la greffe d'une pastille d'hormones 4 jours avant la greffe de cellules pour que la tumeur se forme. Cette intervention durera moins de 5 minutes sous anesthésie générale. Après une semaine d'acclimatation et trois fois par semaine jusqu'à euthanasie : l'état global de chaque animal sera observé et pesé (10 secondes par pesée), le volume de chaque tumeur sera mesuré avec un pied à coulisse.

Impact sur les animaux

Nous allons greffer des cellules cancéreuses à des souris et le suivre le développement de tumeurs. Le greffes seront réalisées sous anesthésie légère qui durera moins 5 minutes pour chaque animal. Les procédures que vont subir les animaux peuvent causer du stress et de légères douleurs. Les animaux seront euthanasiés 4 semaines après la greffe ou lorsque la tumeur atteindra une taille limite. Certaines souris (10 au total) recevront la greffe d'une pastille d'hormones qui durera moins de 5 minutes et sera réalisée sous anesthésie générale. Cette procédure peut causer du stress et de légères douleurs au niveau de la zone de greffe. Le bien-être des animaux sera surveillé de manière attentive, le poids des animaux et la croissance tumorale suivie par mesure avec un pied à coulisse et seront ainsi enregistrés tout au long de l’étude 3 fois par semaine. Les possibles nuisances liées aux gestes et intervention que vont subir les animaux : stress dû à l'anesthésie, douleur au niveau de la zone de greffe de cellules, douleur au niveau de la zone d'incision pour la pastille d'hormone, stress dû à la manipulation régulière.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure car ils servent d'individu receveur de greffe et ne serviront pas pour d'autres projets.

Remplacement

La souris constitue un bon modèle pour l'étude en oncologie. Il s'agit d’un mammifère au système immunitaire et à la physiologie assez proche de l'Homme qui permet d’utiliser les données générées dans une approche translationnelle valide. La lignée de souris choisie ne possède pas les cellules immunitaires, cela veut dire qu’il n’y a pas de risque de rejet des cellules greffées.

Réduction

Les effectifs de 5 animaux par groupe ont été choisi. Chaque animal recevra deux greffes identiques (une sur chaque flanc), cela nous permet d’obtenir un grand nombre de tumeurs en réduisant le nombre d’animaux utilisés. Nous obtiendrons une réponse statistiquement significative et exploitable tout en réduisant le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Afin de maintenir le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement, stabulation en groupe) permettant une réduction du stress. En raison du déficit immunitaire partiel des souris choisies, des cages ventilées avec de l’air filtré seront utilisées. La nourriture ansi que l’eau sera desinfecté ou stérilisé. Par ailleurs, nous avons mis en place les points limites nécessaires. Les animaux seront observés quotidiennement pour s'assurer que leur état de santé n'est pas détérioré et nous suivrons à chaque pesée (trois fois par semaine) l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation et les sites d'injection. Les tumeurs seront aussi palpées (pour détecter leur présence précoce), leurs volumes seront mesurés 3 fois par semaine et nous observerons aussi leur aspect. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites, le cas échéant pouvant entrainer la mise à mort de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. Le cas échéant, des soins locaux par spray seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

La souris constitue un bon modèle pour l'étude en oncologie. Il s'agit d’un mammifère au système immunitaire et à la physiologie assez proche de l'Homme qui permet d’utiliser les données générées dans une approche translationnelle valide. La lignée de souris choisie ne possède pas certaines cellules immunitaires, cela veut dire qu’il n’y a pas de risque de rejet des cellules greffées. Nous utiliserons des souris âgées de 5 à 6 semaines. C'est un âge où l'animal est considéré adulte et peut supporter au mieux la greffe de cellules.

Anesthésiées pour recevoir une greffe de tumeur pancréatique, les souris reçoivent ensuite une chimiothérapie deux fois par semaine pendant quatre semaines, puis une radiothérapie de cinq minutes par jour pendant cinq jours, avant cinq passages en IRM d'une heure trente sous anesthésie. 1 080 souris vont être utilisées dans ce volet du projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont transportées entre deux établissements, ce que le porteur compte parmi les sources de stress, et développent des tumeurs entraînant une perte de poids. Toutes sont tuées à l'issue pour que les tumeurs soient analysées.

Objectifs

Le cancer du pancréas est un cancer digestif diagnostiqué à un stade avancé avec un des plus mauvais pronostics, moins de 8% des patients survivent au-delà de 5 ans. Au moment du diagnostic, 80% des patients ont déjà des métastases, rendant la chirurgie impossible. Actuellement, très peu de thérapies sont proposées. La réponse tumorale aux traitements existants reste très difficile à évaluer en clinique par manque de biomarqueurs. De plus, ce cancer résiste à la chimiothérapie et à la radiothérapie. Ces échecs peuvent être expliqués par les caractéristiques de la maladie ainsi que par le manque de biomarqueur permettant la sélection des patients traités. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) est un outil permettant l’acquisition d’images anatomiques in vivo de haute résolution, mais également d’images fonctionnelles. La combinaison de nouvelles modalités IRM a permis l’élaboration de nouveaux biomarqueurs en imagerie pour la caractérisation tumorale. Ce projet vise à étudier l’efficacité de l’association de chimiothérapies suivie par de la radiothérapie externe in vivo grâce à l’utilisation de ces nouveaux biomarqueurs en imagerie. Ce projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs: EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’étudier in vivo les modifications biophysiques des tumeurs mesurées par IRM dues aux différents traitements étudiés dans ce projet. Il s’agira, in fine, de pouvoir évaluer quel traitement sera le plus efficace selon les paramètres biophysiques initiaux de la tumeur, ainsi que d’évaluer rapidement l’efficacité du traitement. Dans les études cliniques, ces techniques IRM seront facilement transposables,

Procédures

Les animaux seront anesthésiés en vue d'une greffe tumorale puis traités par chimiothérapie et radiothérapie (EU1). Durée de la greffe : 2 minutes Durée de la chimiothérapie : injection IP d'environ 1 min, 2 fois par semaine pendant 4 semaines. Durée de la radiothérapie : 5 minutes/jour pendant 5 jours. Durée des injections d'anesthésiant et d'agent de contraste : inférieure à 1 min. Les souris seront suivies 5 fois par IRM sous anesthésie d'1h30 (avant, pendant et après le traitement) (EU2).

Impact sur les animaux

Effets indésirables direct: - douleur associée à une injection ou implantation d'un fragment tumoral - douleur associée à une injection intraveineuse et Intra péritonéale. - stress occasionné par le transport des souris entre les 2 sites. Effets indésirables indirects conséquence des produits injectés: - croissance tumorale - perte de poids. Les nuisances qui pourront être engendrées par la croissance tumorale chez ces animaux seront parfaitement surveillées et maîtrisées afin de limiter toute souffrance animale.

Devenir

A l'issue des procédures expérimentales les animaux seront euthanasiés et les tumeurs seront analysées

Remplacement

Il n’existe pas de modèles in vitro reproduisant la complexité du milieu tumoral et permettant de déterminer l'efficacité thérapeutique par imagerie IRM.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en conservant une puissance statistique suffisante pour le traitement du résultat. L’utilisation de l’IRM pour le suivi de la réponse au traitement de manière non invasive, nous permet de réduire le nombre d’animaux utilisés dans les protocoles expérimentaux puisqu’il n’y a pas d'euthanasie à chaque temps d’imagerie.

Raffinement

La première mesure prise afin de limiter le stress chez nos animaux est une semaine de stabulation à leur arrivée sur les sites. Ceci afin de les habituer à leurs nouvelles conditions d'hébergement. Les conditions d'entretien de manipulation des animaux permettent de les protéger via les équipements et procédures de travail d'une contamination par des pathogènes ou opportunistes. Ensuite les procédures expérimentales seront uniquement réalisées par des ingénieurs expérimentés. De plus, celui-ci avec l'aide de l'équipe gérant la zone surveilleront quotidiennement les animaux. De nombreux critères ont été mis en place afin d'évaluer toute forme de détresse chez les animaux qui entraineront l'arrêt de la procédure si nécéssaire.

Choix des espèces

Pour l’évaluation de cancers d’origine humaine, il est indispensable d’utiliser des animaux immunodéprimés, et la souris présente de nombreux modèles adaptés, notamment les souris athymiques nudes. L’étude de l’effet des thérapies des modèles possédant un système immunitaire demande l’utilisation de souris immunocompétentes greffées avec une tumeur murine. Age 6 semaines, âge ou l’on observe une forte incidence de prise de greffe.