Oncologie

200 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales sous la peau, un suivi quatre fois par semaine pendant douze à quinze jours, trois injections du composé testé en cinq jours, puis des séances quotidiennes de radiothérapie. Le porteur signale que l'irradiation peut provoquer une brûlure au site de la tumeur et que la masse peut gêner la locomotion. Il décrit un projet de pré-maturation destiné à positionner un composé au fer comme agent thérapeutique, et qualifie le passage à l'expérimentation animale d'étape "indispensable" pour la suite.

Objectifs

Le cancer est une maladie de plus en plus fréquente, causant environ 10 millions de décès en 2020. Parmi les thérapies anticancéreuses, la radiothérapie est un traitement clé, utilisé chez près de la moitié des patients pour cibler et éliminer les tumeurs. Cependant, elle peut aussi affecter les cellules saines, entraînant des effets secondaires. Les séances sont donc réparties sur plusieurs jours pour limiter ces impacts. Afin de réduire ces effets secondaires tout en maintenant l'efficacité du traitement, nous travaillons sur une molécule prometteuse capable de renforcer l'action de la radiothérapie. Ce composé pourrait rendre certaines cellules cancéreuses plus sensibles aux effet de la radiothérapie. Après des résultats encourageants en laboratoire, notre objectif est de confirmer son efficacité sur des modèles de tumeurs. Si cela se confirme, cela permettrait de diminuer le nombre de séances, améliorant ainsi le confort des patients. Le projet se déroulera dans 2 Établissements Utilisateurs (EU).

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un projet pré-maturation afin de pouvoir positionner un nouveau composé comme agent thérapeutique pouvant potentialiser l’efficacité de traitements anticancéreux par radiothérapie.

Procédures

-1- Injection de cellules tumorales (UE1): Chaque souris reçoit une injection sous-cutanée de cellules tumorales pour initier la croissance tumorale. La manipulation est réalisée sous anesthésie par injection (durée environ 5 minutes par animal) -2- Croissance tumorale (UE1): Durée de 12 à 15 jours pour atteindre un volume suffisant. Les souris subissent un suivi 4 fois par semaine (prise de poids, mesure tumorale avec un pied à coulisse, durée 5 minutes) -3-Traitement (UE1): Chaque souris reçoit 3 injections du médicament sur une durée de 5 jours. Les injections sont associées ou non à des séances de radiothérapie quotidienne (5 séances par jour), (UE2). Toutes les manipulations sont réalisées sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Le développement des tumeurs sur le flan peut engendrer une légère gène lors de la locomotion du fait de l'encombrement de la tumeur. La contention sur animal vigile réalisée lors de la mesure de la tumeur au pied à coulisse peut engendrer un léger stress. L'irradiation sur le site tumoral peut engendrer une légère brûlure. Une légère douleur peut persister aux points d'injections

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les tumeurs

Remplacement

Ce projet est basé sur des études préliminaires réalisées sur cellules en culture montrant un effet fort du composé testé sur les cellules cancéreuses. Toutefois, ces études sur cellules ne permettent pas de prendre en considération l’impact des tissus autour de la tumeur sur la réponse au traitement anticancéreux. A ce jour, seules les expériences in vivo permettent de prendre en compte ces paramètres, En effet, il n'existe pas d'autre modèle capable de reproduire, de façon fiable, l'ensemble de ces paramètres. C'est pourquoi, la planification d'expériences in vivo est une étape indispensable pour la suite de ce projet.

Réduction

L'effectif du nombre d'animaux requis, par groupe expérimental, a été calculé statistiquement en nous basant sur des études similaires menées au sein de notre laboratoire. Ces données, ont permis de montrer un effet fort de ce type de traitement sur le développement de tumeur. C'est pourquoi, basé sur ces données et sur nos analyses statistiques, ce projet a été défini en utilisant le nombre minimal de souris requis pour pouvoir interpréter correctement les résultats obtenus.

Raffinement

Des mesures de raffinement sont prévues pour l'hébergement d'animaux immunodéficients. Les injections seront effectuées sur animaux anesthésiés. Des critères d'arrêt anticipé de l'expérimentation en cas de survenue d'une complication ont été identifiés.

Choix des espèces

Le modèle de souris sélectionné est le plus adéquate car il permet d’éviter les rejets de greffes de cellules cancéreuses humaines. Ce modèle permet donc d’induire le développement d’une tumeur et étudier l'impact de traitement anticancéreux.

216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit par chirurgie une greffe de cellules cancéreuses directement dans le pancréas, puis une injection de chimiothérapie et six injections d'immunothérapie. Le porteur attend une masse tumorale intra-abdominale, une possible dissémination au péritoine avec ascite et une altération de l'état général. Il annonce que comparer ce modèle au modèle sous-cutané évitera "des expériences inutiles" à l'avenir, et conclut que l'évaluation de nouvelles combinaisons doit se faire sur des organismes vivants.

Objectifs

Le cancer du pancréas fait partie des cancers les plus fréquents et les plus meurtriers. Leur traitement repose sur l’utilisation de médicaments, qui malheureusement ne conduisent que rarement à une guérison totale du patient, en particulier dans les cas de cancers avancés. Il a été montré que le système immunitaire jouait un rôle important dans la réponse aux traitements. Ainsi, des médicaments supplémentaires agissant sur le système immunitaire sont maintenant ajoutés aux traitements afin d’augmenter leur efficacité dans de nombreux cancers. Cependant, ils ne sont pas efficaces pour le cancer du pancréas. Il apparait donc important d’étudier les mécanismes responsables de cette résistance. L’inflammation a un rôle ambigu dans la réponse aux traitements.. Le but du projet est d’évaluer les effets du blocage de l’inflammation sur l’efficacité antitumorale des traitements, dans un modèle de cancer chez la souris. Nous étudierons également les infiltrats immunitaires dans les tumeurs. Cette étude nous permettra également de comprendre les mécanismes de résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique.

Bénéfices attendus

Les traitements combinant chimiothérapie et immunothérapie ont montré une réelle efficacité pour de nombreux cancers. En ce qui concerne le cancer du pancréas ces traitements sont totalement inefficaces chez l’Homme. L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes responsables de cette résistance dans les tumeurs générées dans le pancréas. Notre travail précédent sur des tumeurs du pancréas générées en sous-cutané montre un réel impact de cette voie sur la réponse à la chimio-immunothérapie. Mais ces résultats doivent être confirmés sur des tumeurs localisées au sein de l’organe, pour être plus proche de la maladie chez l’Homme. Ainsi, comparer ces 2 modèles nous permettra de savoir si nous pouvons continuer à utiliser le modèle sous-cutané (moins invasif pour la souris) ou en cas de discordance de résultats, nous devons utiliser seulement le modèle intra-pancréatique (plus représentatif de la réalité). Cela nous permettrait à l’avenir de ne plus réaliser des expériences inutiles sur le modèle sous-cutané. L’identification du rôle de l’inflammation dans la résistance aux traitements aura des avantages à court terme, comme la validation (ou non) de nos résultats précédents et à long terme en confirmant l’intérêt de trouver et tester des molécules bloquant cette voie chez la souris (futur projet) puis chez l’Homme.

Procédures

3 interventions : - Implantation chirurgicale de cellules de cancer du pancréas murines dans le pancréas : - Geste réalisé sous anesthésie - Une seule implantation chirurgicale par animal - Durée : 15 minutes - Nombre de souris : 216 souris - Traitements par chimiothérapie ou solution contrôle : - Geste réalisé sur animal vigile - Une seule injection par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 216 souris - Traitements par immunothérapie ou solution contrôle : - Geste réalisé sur animal vigil - 6 injections par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 216 souris

Impact sur les animaux

- Injection de cellules tumorales dans le pancréas : croissance d’une masse tumorale intra-abdominale. Possible dissémination de la maladie au niveau du péritoine avec apparition d’ascite. -Possible altération de l’état général du fait de la pathologie cancéreuse induite. - Éventuels effets secondaires des traitements anti-cancéreux : les chimiothérapies utilisées ont déjà fait l’objet de recherches sur l’animal, il n’est pas attendu d’effet secondaire important. - Possibles complications au niveau du site opératoire et de la cicatrice : infection, déhiscence de plaie, douleur. -Des effets cumulés liés à la chirurgie, l’implantation des cellules tumorales, le développement des tumeurs et les traitements ne sont pas attendus étant donné la chronologie et le temps écoulé entre chaque événement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever les tumeurs et réaliser des expériences.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

- Les expériences seront réalisées sur des petits effectifs ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. De plus, une étape de faisabilité pour évaluer la pertinence des modèles a déjà été réalisée dans le laboratoire. - Les expériences visant à étudier la taille des tumeurs et les infiltrats immunitaires seront réalisées sur les mêmes souris. - Les différents modèles utilisés dans ce projet sont nécessaires. En effet, selon les mutations intrinsèques des cellules cancéreuses utilisées, le microenvironnement tumoral sera différent et affectera par conséquent la réponse aux traitements.

Raffinement

Les animaux seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Une anesthésie générale gazeuse sera réalisée avant chaque greffe et entretenue tout au long de la procédure, avec contrôle de l’absence de réflexe de la patte et surveillance de la fréquence respiratoire et protection de la cornée avec un collyre ophtalmique. Pour l’analgésie, des anti-inflammatoires seront administrés en sous-cutanée en pré-opératoire à distance du site opératoire et prolongé pendant 48h après l’opération, ainsi que des anesthésiques locaux au niveau du site opératoire. La surveillance post-interventionnelle sera réalisée 2 fois par jour durant les 3 premiers jours, puis quotidiennement pendant 2 jours et enfin espacée à 3 fois par semaine. L’apparition des points limites sera régulièrement recherchée.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Diverses souches de souris sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. De plus, l’existence de souris génétiquement modifiées renforce le choix de cette espèce. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.

Douze rats vont être utilisés pour mettre au point au laboratoire une méthode d'isolement et d'analyse des microparticules sanguines, sans question scientifique posée sur l'accident de décompression lui-même. Ils sont soumis à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tous tués à l'issue, pour prélever leur sang et leurs tissus. Chacun subit une contention et un prélèvement sanguin sous anesthésie, puis, un mois plus tard, 135 minutes en caisson hyperbare qui simulent une plongée. Le porteur range parmi les effets attendus la douleur provoquée par les symptômes d'accident de décompression, et indique que l'effectif de douze repose sur des expériences précédentes sans qu'aucun test statistique ait été réalisé.

Objectifs

Il est communément admis que le facteur déclencheur de l’Accident de Décompression est la formation de bulles subséquente à la réduction de la pression ambiante. Les microparticules sont des vésicules extracellulaires circulantes libérées par les cellules sanguines (plaquettes, leucocytes, cellules endothéliales). Par les protéines qu’elles arborent à leur surface mais aussi par les molécules (protéines, microARN, …) qu’elles renferment, les microparticules jouent un rôle important dans la transmission d’information et, notamment, l’inflammation. Ainsi, par exemple, leur nombre et leurs caractéristiques sont modifiés dans les pathologies vasculaires. Il a été montré (i) : que leur nombre augmente après la décompression et (ii) : qu’elles sont capables d’induire certains symptômes de l’accident de décompression. De plus, certaines d’entre elles contiennent du gaz et pourraient constituer un site de formation des bulles circulantes pendant la décompression. L’objectif principal de ce projet est de mettre en place, dans notre laboratoire, une méthode d’isolement, d’analyse et de caractérisation des microparticules dans le cadre d’études sur l’accident de décompression. Pour ce faire, nous avons besoin dans un premier temps, de récupérer chez des rats, des échantillons sanguins afin de valider le protocole d’isolement des microparticules à l’état de base et après l’exposition hyperbare. Dans un deuxième temps, la méthode d’analyse de ces microparticules nécessite de déterminer la concentration d’anticorps optimale pour le marquage des cibles d’intérêt, indispensable à leur détection et à leur analyse.

Bénéfices attendus

A court terme, le bon fonctionnement du protocole d’isolement des microparticules et de leur analyse permettra la mise en place d’une nouvelle expertise au laboratoire. A moyen terme, cette méthode sera utilisée pour la réalisation de projets nécessitant l’analyse de microparticules circulantes chez le rat. A plus long terme, cette méthode pourra être utilisée dans d’autres projets relatifs à l’accident de décompression dans notre laboratoire mais également dans des projets liés à l’inflammation ou à la dysfonction vasculaire.

Procédures

Les rats seront contentionnés une fois pour être anesthésiés/analgésiés (durée 1 min) afin de subir un prélèvement sanguin unique (durée 1 à 2 min). Un mois après, ils seront placés dans le caisson hyperbare pendant 135 min (30 min d’acclimatation + 105 min de plongée simulée).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont : (1) : le stress lié à la pesée hebdomadaire (acte de gravité légère, d’une durée de 5 min/pesée) ; (2) : le stress lié à la contention et à l’anesthésie (acte de gravité légère, d’une durée estimée à 5 minutes, et réalisé 1 fois) pour la réalisation des prélèvements sanguins ; (3) : le stress et l’angoisse liés à la plongée (acte de gravité modérée, d’une durée totale de 2h30) ; (4) : La douleur induite par l’apparition de symptômes d’accident de décompression lors de la période d’observation (ces nuisances seront modérées, d’une durée moins de 1 minute).

Devenir

Les 12 animaux sont mis à mort à l'issue de la procédure afin de procéder aux prélèvements de sang et de tissus pour les analyses prévues dans le projet.

Remplacement

Notre travail porte sur l’étude des mécanismes à l’origine de l’accident de décompression. Les connaissances actuelles ne nous permettent pas de travailler sur un modèle cellulaire car il n’existe pas encore de biomarqueur fiable permettant de définir une sensibilité accrue à l’accident.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans cette étude a été déterminé sur la base des expériences précédentes et aucun test statistique n’a été réalisé. Les effectifs demandés vont nous permettre de réaliser toutes les mises au point nécessaires à la mise en place de cette nouvelle méthode d’analyse. Les animaux seront intégrés progressivement par lot de 4. Nous commencerons par un premier lot de 4 animaux, puis, si besoin, nous passerons à un deuxième lot, puis à un troisième. Si les mises au point sont terminées avant d'utiliser tous les lots, le projet peut être arrêté, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés par rapport aux estimations initiales. Nous estimons à 12 le nombre d’animaux nécessaire au vu de la faible quantité de sang que nous pouvons prélever pour réaliser ces mises au point.

Raffinement

Une habituation au dispositif expérimentale (caisson hyperbare) sera réalisée avant l’entrée dans l’étude afin d’habituer les rats à l’environnement et de réduire le stress. Tout au long du projet, un suivi quotidien des animaux est réalisé avec une grille de score adaptée.

Choix des espèces

Le rat est un modèle très utilisé pour l’étude des mécanismes de l’accident de décompression. De fait, nous disposons d’un important corpus de données pour ce type d’étude. Nous possédons de nombreuses données biologiques concernant les effets de l’exposition hyperbare et une bonne connaissance des symptômes de l’accident de décompression. Cette expertise acquise au cours des projets précédents permettra une meilleure gestion du projet et de ses résultats. Nos travaux précédents ont été effectués sur des animaux matures sexuellement. Nous souhaitons donc utiliser des animaux au stade de « jeunes adultes », matures sexuellement.

80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune isolée en cage individuelle jusqu'à vingt-quatre jours, toutes tuées à l'issue pour prélèvement. Une injection de cellules tumorales dans la veine de la queue ouvre le protocole, suivie de quatre séances d'imagerie, de quatre prélèvements de sang à la queue et de deux périodes de quatre jours en cage de mesure de la dépense énergétique. L'objet est de relier la croissance d'une tumeur à l'hypermétabolisme observé chez les patients, et de tester une molécule qui réduit la dépense énergétique. Le poids et la prise alimentaire sont surveillés chaque jour pour que la perte de poids n'excède pas 20 % du poids initial, le protocole devant être arrêté dès qu'une dégradation apparaît.

Objectifs

La perte de masse est une cause majeure de décès en cancérologie et aggrave la toxicité des traitements. Elle résulte de la fonte des graisses et des muscles, d’une augmentation de la dépense énergétique au repos et d’une plus grande fatigabilité, entraînant un déficit énergétique appelé hypermétabolisme. Ce phénomène apparaît avant les premiers signes visibles de perte de masse chez les patients atteints de tumeurs. L’étude de la dépense énergétique et des marqueurs cliniques et biologiques des patients montre un impact négatif et une moindre réponse aux traitements. Pourtant, le lien entre le développement tumoral et l’hypermétabolisme reste inexploré. Cette étude chez l’animal vise à : -caractériser les paramètres métaboliques liés à l’hypermétabolisme à différents stades du développement tumoral grâce à des cages d'enregistrement de la dépense énergétique ; -évaluer ces paramètres chez des souris atteintes de tumeurs en présence d’une molécule réduisant la dépense énergétique. L’objectif est de mieux comprendre le lien entre hypermétabolisme et cancer et d’explorer une nouvelle piste thérapeutique.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à mieux comprendre les mécanismes responsables de l’hypermétabolisme, c’est-à-dire l’augmentation de la dépense énergétique au repos, chez les animaux porteurs d’une tumeur. L’objectif est d’identifier les principaux facteurs impliqués, comme la dépense d'énergie au repos et ou issue de l’activité physique afin de mieux expliquer ce phénomène chez les patients. En analysant le métabolisme des animaux atteints de tumeurs et en testant un médicament qui réduit la dépense énergétique, nous pourrons évaluer le lien entre l’hypermétabolisme et la progression du cancer observée chez les patients.

Procédures

Une injection unique de cellules tumorales sera réalisée dans la veine caudale (moins d'une minute). Les mesures par imagerie se feront 4 fois, chaque mesure ne dépassant pas 10 minutes, cela inclut également un prélèvement sanguin (donc 4 prélèvements de 50 microlitres) chaque prélèvement prenant 2 minutes. La mesure de la dépense énergétique sera effectuée 2 fois, sur une période de 4 jours à chaque fois.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle ce qui entraine un stress modéré susceptible d'apparaitre durant la totalité de l'expérimentation. La durée maximum de l'isolement des animaux est de 24 jours. Les prélèvements à la queue induisent une douleur légére. Le poids et la prise alimentaire de ces animaux seront surveillé quotidiennement pour s'assurer que la perte de poids n'excède pas les 20% du poids initial. La croissance tumorale peut induire un dysconfort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser les prélévements nécessaires à l'étude.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire, car il est impossible de reproduire sans animaux les interactions entre la croissance d’une tumeur, le système immunitaire et l’équilibre énergétique de l’organisme. L’étude de la dépense énergétique et des comportements associés doit se faire sur un organisme entier, car les tissus impliqués fonctionnent ensemble. La souris est un modèle adapté, car ses mécanismes de régulation énergétique sont similaires à ceux de l’Homme, ce qui permet d’extrapoler les résultats.

Réduction

Dans les procédures 1 et 2, nous utiliserons 10 souris par groupe, un nombre suffisant pour détecter des différences significatives de perte de poids liée à la tumeur. Le suivi du poids, de la composition corporelle et de la croissance tumorale par imagerie permettra de limiter le nombre d’animaux nécessaires aux analyses de l’équilibre énergétique. Pour réduire encore leur utilisation, nous étudierons l’alimentation, la dépense énergétique et la composition corporelle sur les mêmes animaux. Les données issues d’études précédentes indiquent que 10 souris par groupe sont suffisantes malgré la variabilité des mesures. L’évaluation métabolique sur 4 jours aidera à réduire cette variabilité, optimisant ainsi le nombre d’animaux requis. Enfin, des outils statistiques adaptés permettront d’analyser l’impact de la tumeur, du traitement et du sexe sur ces paramètres.

Raffinement

Les interventions (imagerie, injections et échocardiographies) seront réalisées sous anesthésie générale afin d’éviter toute douleur. Une technique d’imagerie non invasive sera utilisée pour suivre l’évolution de la tumeur au fil du temps et la mettre en relation avec la balance énergétique, le poids et la composition corporelle. Pendant la phase d’individualisation, le poids et la consommation alimentaire seront enregistrés. Les analyses de la balance énergétique et de la composition corporelle, totalement non invasives, se dérouleront dans des cages classiques équipées de capteurs intégrés, sans perturber les animaux. L’hébergement inclura un enrichissement avec un abri en plastique rouge, du coton et une nacelle pour favoriser le bien-être des souris. Les mesures de la dépense énergétique seront automatisées, effectuées en continu de jour comme de nuit, sans intervention humaine. Une surveillance quotidienne permettra de détecter tout changement de comportement ou de santé (observation, suivi du poids et de la prise alimentaire et hydrique). Des points limites stricts ont été définis : en cas de signe de souffrance ou de dégradation de l’état des souris, le protocole sera immédiatement arrêté.

Choix des espèces

La souris a été choisie car elle constitue un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux. Elle est particulièrement adaptée à l'étude des dysfonctionnements métaboliques, car de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre la souris et l'Homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, la souris est le modèle de référence pour l'étude du développement tumoral, de la réponse immunitaire et du métabolisme énergétique. Pour les deux procédures, les souris seront utilisées à l’âge adulte (12 semaines). Ce choix est justifié par plusieurs facteurs : (1) l’âge adulte garantit que toutes les structures cérébrales sont stabilisées, ce qui évite d'impacter leurs comportements alimentaires et locomoteurs au fil du temps; (2) le poids de l’animal est plus stable à cet âge, permettant une analyse fiable et robuste durant toute la durée de l’expérimentation.

Jusqu'à un prélèvement de sang par heure pendant quarante-huit heures, pour un total annoncé de 4 104 ml sur quatorze jours de protocole. Huit génisses vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, maintenues à l'attache, porteuses d'un cathéter posé dans la jugulaire gauche, avec un contrôle de l'hématocrite prévu pour vérifier qu'elles supportent la saignée, et toutes gardées vivantes à l'issue. L'objet déclaré est un biocapteur qui suivrait en continu les hormones de la reproduction pour repérer les ovulations et fiabiliser l'insémination artificielle. Le porteur annonce des gains de performances de reproduction et de résultats économiques pour les élevages, la longévité des vaches découlant de la baisse des réformes pour échec de reproduction.

Objectifs

Les résultats économiques d’un élevage bovin sont fortement tributaires des performances de reproduction du troupeau. Ces dernières décennies, l’utilisation de l’insémination artificielle (IA) s’est très largement répandue en particulier dans les élevages laitiers. L’utilisation de l’IA nécessite de détecter de façon fiable le moment des ovulations chez les femelles, quelle que soit leur conduite et leur environnement d’élevage. Traditionnellement, la détection des ovulations repose sur l’observation de l’œstrus que les vaches expriment dans les heures qui précèdent l’ovulation. La détection des œstrus se heurte toutefois à deux problèmes majeurs : 1/ l’agrandissement de la taille des troupeaux qui rend cette activité particulièrement chronophage et 2/ la dégradation de l’expression de l’œstrus observée chez les animaux à fort potentiel laitier. Ces problèmes remettent en question les outils d’aide à la détection des ovulations basés sur l’enregistrement des signes comportementaux exprimés durant l’oestrus et orientent les réflexions vers le développement d’outils s’appuyant sur le suivi des dynamiques hormonales annonciatrices de l’ovulation et indicatrices du statut reproducteur de la femelle. Le projet a pour objectif de développer un dispositif microfluidique porté par l’animal permettant le prélèvement sous-cutané de fluides interstitiels et le dosage à haute fréquence des hormones impliquées dans la régulation du cycle ovarien et le déclenchement de l’ovulation. Le dispositif doit, à terme, associer 1/ des microaiguilles creuses pour le prélèvement des fluides interstitiels, 2/ des biocapteurs électrochimiques permettant le dosage des hormones, 3/un circuit et une pompe microfluidiques pour assurer la circulation des fluides interstitiels au sein du dispositif et 4/ une électronique de mesure et de transfert des données permettant d’informer l’éleveur sur le statut hormonal de ses vaches via une interface dédiée. Les trois premières briques constituent les principaux verrous technologiques identifiés en amont du projet. La stratégie de travail consiste à robustifier le dosage des hormones par les biocapteurs électrochimiques retenus.

Bénéfices attendus

Le projet doit permettre la mise au point d’un dispositif de monitoring des hormones de la reproduction à partir du prélèvement de fluides interstitiel. Un tel dispositif permettra chez les bovins laitiers et allaitants d’améliorer les performances de reproduction dans les systèmes utilisant l’insémination artificielle (80% des vaches laitières et 12% des vaches allaitantes). L’amélioration des performances de reproduction contribuera à améliorer les performances économiques des élevages mais aussi la longévité des animaux puisqu’il permettra de réduire les réformes pour cause d’échec de la reproduction. A terme, un tel dispositif devrait également profiter à d’autres filières animales et notamment la filière brebis laitière qui fait face à une mise en cause de l’utilisation des traitements hormonaux pour réaliser l’IA. Pour ces filières, le bénéfice du projet sera économique et environnemental.

Procédures

Les 8 animaux seront soumis à la pose d'un cathéter au niveau de la jugulaire gauche sous anesthésie locale, puis à la réalisation de prélèvements sanguins durant la phase expérimentale. - Suivi de la cinétique des hormones durant la phase folliculaire : De J4 à J17, 4 prélèvements seront réalisés par jour à 7h, 11h, 16h et 21h, chacun correspondant à 5 tubes de 9 ml. Soit un total de 5 x9= 45 ml/prélèvement. Le temps de récupération associé à ce volume de sang prélevé est de 14 minutes, de sorte que la récupération sera totale entre chaque prélèvement. Le volume total de sang prélevé par jour sera de 4 x 45 = 180 ml. - Captation du pic d'hormone : J9 à J11. Sur cette fenêtre de 48h, les prélèvements passeront à une fréquence de 1 prélèvement par heure. Les 4 prélèvements par jour seront maintenus aux mêmes horaires que décrits précédemment (7h, 11h, 16h et 21h). Pour le suivi du pic, 3 tubes de 9 ml seront prélevés à chaque point de mesure, soit un total de 27 ml de sang prélevé / h (soit un temps de récupération de 6 minutes). Le volume total de sang prélevé par jour pour la captation du pic sera de 648 ml/j. Sur cette période se rajouteront les 4 prélèvements /j (7h, 11h, 16h et 21h) soit un total de 4 prélèvements/j x 4 tubes /prélèvement x 9ml/tube = 144 ml/j. Le volume total de sang prélevé sur cette fenêtre de 48h sera de (648+144) x 2j= 1584 ml. Sur l’ensemble de l’essai (14 jours de prélèvements), le volume total de sang prélevé sur les animaux sera de 180 x 14 + 1584 = 4104 ml.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont associés aux prélèvements sanguins. La pose du cathéter permettra de garantir moins de douleur et de traumatismes (hématomes) que dans le cas de prises de sang ponctuelles et répétées au niveau de la veine caudale. Cela permettra également de garantir un meilleur confort aux animaux en limitant le stress du fait d’une moindre contention comparativement aux prises de sang. La contrepartie est que les animaux doivent être conduits à l’attache durant l’expérimentation mais nous limitons au maximum la durée de celle-ci par rapport à nos objectifs scientifiques et nous avons prévu une phase d’habituation. Par ailleurs les génisses seront en contact visuel et auditif durant toute la durée de l’essai.

Devenir

A l'issue de la procédure expérimentale, tous les animaux seront gardés en vie. Cette décision sera prise par le responsable de l'établissement ou son délégataire.

Remplacement

La mise au point d’un biocapteur capable de détecter l’occurrence d’ovulations à partir du monitoring, in situ, de la cinétique des hormones de la reproduction, implique, par principe, de tester sa capacité à doser les hormones dans un fluide biologique complexe tel que le plasma. De façon à limiter le recours aux échantillons de plasma issus d’animaux, cette étape interviendra lorsque tous les tests préliminaires visant à démontrer la capacité du biocapteur à doser différents niveaux de concentrations en hormone dans des fluides artificiels de complexité croissante aura été réalisée : solutions tampons enrichies de molécules ioniques puis de molécules organiques (acides gras, protéines) de structure et de charge connues et enfin plasma artificiel.

Réduction

Deux éléments ont été pris en compte pour évaluer le nombre d’animaux à utiliser et prendre en compte le principe de réduction : 1/ d ‘une part, la nécessité de disposer d’une gamme de concentrations hormonales qui reflète une certaine variabilité interindividuelle. Pour cela nous avons considéré qu’un effectif de 5 animaux serait suffisant pour explorer cette variabilité dans la mesure où la variabilité des niveaux de concentrations hormonales que l’on peut observer chez des génisses est moindre que celle attendue chez des vaches en lactation. 2/ d’autre part, le taux de réponse des animaux au traitement hormonal. Celui-ci a été apprécié en se basant sur les connaissances rapportées dans la littérature, et qui indiquent des taux de réponse variant de 50 à 66% pour des femelles cyclées. Ainsi pour espérer atteindre un effectif minimal de 5 animaux présentant des cinétiques hormonales de phase folliculaire suite au retrait de l’implant, nous avons choisi d’inclure 8 génisses dans l’étude.

Raffinement

Une phase d’habituation de 7 jours aux conditions de vie à l’attache sera réalisée pour tous les animaux avant le début des prélèvements de façon à identifier ceux qui ne supporteraient pas d’être maintenues à l’attache (agitation, baisse d’ingestion, comportements ou attitude anormale). La pose des cathéters sera réalisée par une personne habilitée et en conditions d’asepsie. Un système de maintien et de protection du cathéter (bandage) sera mis en place de façon à éviter que celui-ci ne se déloge ou soit arraché par frottement contre les parois de la logette. Les animaux seront surveillés tous les jours lors de la distribution de l'alimentation par un animalier responsable de la mise en œuvre et du suivi du protocole. L'évaluation de la gêne et d’éventuelles lésions générées par le cathéter ou les conditions de vie à l’attache sera faite par observation de l’état physique et du comportement des animaux. Une évaluation du niveau d’anémie sera également réalisée via la mesure de l’hématocrite des animaux avant le début de l’essai, avant la phase de prélèvements intenses (1/h) à J7 et 3 jours après (J14) afin de vérifier si les animaux peuvent être maintenus dans l’essai. En cas d'observation de signes inhabituels, de lésion ou d’anémie sévère (taux d'hématocrite entre 10 et 13 %), le vétérinaire référent de l'installation expérimentale sera contacté immédiatement et un traitement approprié sera administré, pouvant aller jusqu'au retrait de l'animal de l'essai.

Choix des espèces

Le premier élément de pertinence associé au choix de l’espèce bovine est qu’il s’agit de l’espèce cible pour l’utilisation du biocapteur. Sa mise au point nécessite donc de s’assurer qu’il sera en mesure de fonctionner sur des fluides complexes de composition similaire à celle des fluides interstitiels qui seront prélevés par les microaiguilles. Le deuxième élément de pertinence est associé à la taille de la vache qui permet de prélever les quantités de sang nécessaires à l’étude en restant bien en deçà des seuils maximum à ne pas dépasser. Les animaux utilisés seront des génisses plutôt que des vaches laitières car les installations expérimentales disponibles ne nous permettent pas de conduire des vaches laitières à l’attache. Par ailleurs du fait de la nécessité d’amener les animaux deux fois par jour en salle de traite, les risques de déplacement ou d’arrachage du cathéter auraient été trop importants. Nous avons donc choisi de travailler sur des génisses qui devront être pubères (>13 mois) pour pouvoir suivre leur cyclicité. Ces génisses n’excèderont pas l’âge de 27 mois qui correspond à leur mise à reproduction pour un premier vêlage visé à 36 mois.

480 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun subissant jusqu'à douze séances hebdomadaires d'enregistrement cardiaque d'une heure, deux chirurgies et jusqu'à six séries d'injections. La première opération, de soixante minutes, sert à administrer un produit qui provoque l'accumulation d'alpha-synucléine dans le cœur, et les injections répétées détruisent la fonction des nerfs vagues, ce dont le porteur affirme que cela reste sans impact sur l'état général des animaux dans les conditions de l'étude. La seconde chirurgie, de quatre-vingt-dix minutes, est menée sans réveil, tous les rats étant tués pour l'analyse histologique des cœurs et des cerveaux. L'effectif repose sur des groupes de 15 animaux, le porteur reconnaissant que la moitié pourrait suffire si aucune différence n'apparaît entre mâles et femelles à mi-parcours.

Objectifs

La maladie de Parkinson est liée à la dégénérescence de certains neurones dans le cerveau, associée à l’accumulation de la protéine alpha-synucléine. En plus des symptômes moteurs caractéristiques de la maladie, il existe de nombreux symptômes non-moteurs qui sont très invalidants. Parmi ces symptômes non-moteurs, l’hypotension orthostatique (baisse soudaine de la pression artérielle lors du passage d’une position couchée ou assise à une position debout) est fréquente chez les patients, provoquant des étourdissements et vertiges qui augmentent le risque de chute. On observe également une diminution de la variabilité de la fréquence cardiaque et d’autres troubles de la régulation du rythme cardiaque dont la fréquence et l’intensité varient d’un patient à l’autre. Cependant, il existe des preuves que l’accumulation d’alpha-synucléine ne se restreint pas au cerveau et touche également des organes périphériques dont le cœur. En effet, il existe des neurones situés dans le cœur qui constituent le système nerveux intracardiaque et qui jouent un rôle important dans la régulation de la fonction cardiaque. Les neurones cardiaques intègrent les informations en provenance des systèmes nerveux sympathique et parasympathique, permettant ainsi d’assurer le contrôle de l’activité du cœur. Ils pourraient être affectés dans la maladie de Parkinson et ainsi contribuer directement aux troubles cardiaques. Le rôle potentiel de ces neurones cardiaques dans la maladie de Parkinson reste inconnu à ce jour et c'est ce que nous cherchons à mettre en évidence dans ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mettre en évidence les effets cardiaques retrouvés dans la maladie de Parkinson en déterminant comment le système nerveux cardiaque est modulé par l'agrégation protéique pathologique d'alphasynucléine, quelle serait la vulnérabilité des neurones cardiaques et les dysfonctionnements cardiaques qui en découlent. L'évaluation des troubles cardiaques permettrait de mettre en évidence l'intérêt probable de modifier la prise en charge thérapeutique des patients en incluant de nouvelles molécules permettant de limiter ces dysfonctionnement.

Procédures

Tous les animaux (n=480) seront soumis à deux tests comportementaux moteurs (un spontané et un nécessitant une légère contention de quelques secondes) puis à une anesthésie gazeuse de moins de 10 minutes permettant de raser l'animal et de poser des électrodes au niveau du thorax pour mesurer pendant 1 heure l'activité cardiaque sur l'animal vigile. La mesure se fait par télémétrie ; l'animal est libre de ses mouvements pendant la mesure. Cette mesure est répétée une fois par semaine soit 6 fois pour la moitié des animaux et 12 fois pour les animaux restants. Une chirurgie d'une durée de 60 minutes sera réalisée sous anesthésie et couverture médicamenteuses anti-douleurs. Cette chirurgie permet d'administrer un produit qui provoque une accumulation d'alpha synucleine aun niveau cardiaque. Les animaux vigiles recevront une injection 1 fois par jour pendant 3 jours, à deux semaines d'intervalle (3 fois pour la moitié des animaux (n=240) et six fois pour la seconde moitié (n=240)) permettant la perte de fonction des nerfs vagues. Puis après six et/ou douze semaines, les animaux passeront de nouveau les deux tests comportementaux. 240 animaux seront soumis à une seconde chirurgie de 90 minutes permettant de faire des mesures de l'activité cardiaque et de la pression artérielle. Les animaux seront endormis et sous couverture médicamenteuses anti-douleurs à la suite de laquelle les animaux seront mis à mort sans réveil préalable (pour prélèvements). 240 animaux auront une seconde chirurgie sans réveil et sous couverture anesthésique et analgésique (pour d'autres prélèvements).

Impact sur les animaux

Léger stress transitoire lors des pesées, injections, inductions et réveil d'anesthésie, et tests comportementaux. Légère douleur transitoire lors des injections. Légère gêne pendant l'heure de port des électrodes. Léger inconfort transitoire lors du réveil après anesthésie. Pendant les jours suivant la chirurgie, douleur et inconfort minimisés par les antalgiques et légère perte de poids transitoire. Dans les conditions de vie des animaux dans ce projet, la perte de fonction des nerfs vagues n'a pas d'impact sur l'état général des animaux.

Devenir

Tous les animaux (n=480) seront mis à mort à la fin de l'étude de façon à obtenir des résultats de plusieurs paramètres physiologiques tels que l'activité électrique du coeur et la pression artérielle, ainsi que la réalisation des analyses histologiques des coeurs et cerveaux récupérés.

Remplacement

Des approches in silico ou in vitro ou des données obtenues chez les patients existent et donnent de l'information mais ces approches ont des limites et à ce stade d'avancée des connaissances, il est nécessaire de passer au modèle in vivo pour avoir un système entier et intégré.

Réduction

Le nombre d’animaux dans chaque lot expérimental a été obtenu grâce à des calculs de puissance statistique. Ces critères prenent en compte le risque de possibles décès expérimentaux ou d'origine non contrôlée et impliquent d’utiliser pour des groupes expérimentaux de 15 animaux par lot soit 480 rats mâles et femelles. Des analyses statistiques à plusieurs variables seront effectuées. Les deux sexes seront étudiés en parallèle. Après avoir expérimenté la moitié des animaux mâles et femelles, si une différence est mise en évidence, l'intégralité des animaux du projet seront nécessaires, en revanche si aucune différence n'apparait, nous pourrons grouper les résultats sur les deux sexes et ainsi n'utiliser que la moitié de l'effectif total des animaux de ce projet.

Raffinement

Les expérimentations sont réfléchies de façon à minimiser au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse des animaux au cours des différentes procédures de ce projet (médicamentation définie avec le vétérinaire référent et tests comportementaux basés sur le comportement spontané des animaux ou très rapide et ne nécessitant qu'une légère contention). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale (gazeuse, facilement modulable et permettant un réveil rapide et plus confortable) avec contrôle de la température corporelle, additionnée d’une analgésie locale en présence d’antalgique périphérique. Le traitement antalgique sera poursuivi en postopératoire. Des points limites gradés, précis et adaptés ont été définis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites et aboutir à une gestion optimale et sans délai de ceux-ci. Les rats sont hébergés deux par cage avec eau et nourriture ad libitum. Un enrichissement par bâton de bois est disposé dans les cages d'hébergement permettant aux rats d'assouvir leur besoin de ronger. Une phase d'habituation à l'animalerie et aux expérimentateurs est prévue en amont de l'étude. Le binôme d'expérimentateur reste le même tout au long de l'étude.

Choix des espèces

L'espece animale utilisée est le rat (Rattus norvegicus). Il sagit de l'espèce la plus utilisée pour l'étude de la maladie de Parkinson puisque les réseaux neuronaux sont similaires à ceux de l'Homme. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (8 semaines au moment de la première chirurgie) puisque nous avons besoin d'avoir des circuits et systèmes entièrement développés.