Oncologie
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Origine et suivi des cellules du système cardiovasculaire
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
Les souris de ce projet portent une recombinase qu'une injection déclenche, pour marquer certaines cellules du cœur et suivre leur descendance. 224 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit une ou deux injections dans l'abdomen, sur deux jours consécutifs quand la seconde est jugée utile, les femelles gestantes étant injectées entre le sixième et le treizième jour de gestation. Toutes sont ensuite tuées pour prélever des organes, alors que le porteur écrit n'avoir jamais observé d'effet délétère chez les animaux injectés.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'étudier les gènes et cellules qui participent au développement du système cardiovasculaire chez l'embryon et au maintien de l'homeostasie du cœur chez l'animal adulte afin de mieux appréhender l'étiologie des cardiopathies congénitales et acquises qui se développent après la naissance. Le développement du cœur et l’homéostasie cardiaque dépendent de l'expression d'un nombre important de gènes et la contribution de différents types cellulaires. Dans cet objectif, nous utiliserons des souris transgéniques chez lesquelles on peut induire l'activité d'une recombinase qui permet la détection des cellules recombinées et de leurs dérivées. Différentes lignées sont ciblées: les progéniteurs cardiaques, les cellules dérivées de l’épicarde, les cellules des crêtes neurales et enfin les cardiomyocytes. Les études sur le développement cardiaque nécessiteront l’induction au cours de la gestation tandis que les études après la naissance seront réalisées par des inductions chez les mâles et femelles. Ce projet permettra d'étendre nos connaissances sur le développement et le maintien du système cardiovasculaire ainsi que sur l'étiologie des pathologies congénitales et acquises.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'étendre nos connaissances sur le développement cardiaque depuis les stades précoces du développement cardiaque. Il étudiera l’importance de ces évènements précoces sur le maintien du système cardiovasculaire. Les résultats attendus doivent également permettre de mieux aborder l’étiologie des pathologies cardiaques congénitales et acquises.
Procédures
Les animaux seront soumis à une ou deux injections intrapéritonéales. Si deux injections sont réalisées, elles seront réalisées sur 2 jours consécutifs.
Impact sur les animaux
Nous n'avons jamais observé d'effet délétère sur les animaux injectés lors de nos expériences précédentes. Une possible infection peut apparaître au site d'injection, mais cela n’a jamais été observé lors de nos expériences précédentes.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organe.
Remplacement
L'utilisation de modèle in vitro ne permet pas de reproduire le développement cardiaque ni celle du coeur dans leur compléxité physiologique chez l'animal. Les stratégies de remplacement n'existent pas et l'utilisation d'animaux génétiquement modifiés telle que présentée ici est la seule approche qui nous permette actuellement de répondre à nos objectifs de suivi des cellules qui contribuent au développement et à l'homéostasie du coeur.
Réduction
Nous nous efforçons à limiter le nombre d’animaux par groupe en tenant compte des controles et à utiliser au maximum les données de chaque animal. L’utilisation d’outils statistiques permet d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaires. Nos études précédentes nous montrent qu’il faut en moyenne 10 souris par groupe pour avoir des données exploitables. Nous arrêterons de générer des animaux aussitôt que nos résultats seront exploitables statistiquement..
Raffinement
La réglementation est appliquée selon la législation en vigueur pour tous les animaux en procédure pour ce qui concerne l’hébergement, la surveillance et la mise à mort. Les injections sont toujours des actes planifiés à l'avance et rapides ce qui permet de limiter le stress de l'animal. L'apparition d'infection au site d'injection si elle a lieu sera traitée par un antiseptique. Si l’animal présente un signe de souffrance il recevra une injection d'anti-inflammatoire. Une grille de score avec les différents points limites est disponible et adaptée aux besoins du projet.
Choix des espèces
Chez la souris, le développement et le fonctionnement physiologique du coeur sont similaires à ceux décrits chez l’Homme. Les souris génétiquement modifiées représentent donc un modèle pertinent pour nos recherches fondamentales afin d'appréhender au mieux les maladies humaines. Les femelles gestantes seront injectées au plus tôt au stade embryonnaire de 6.0 jours après l'accouplement, stade qui correspond à l'identification des premiers progéniteurs cardiaques, et au plus tard avant le 13ème jour embryonnaire, la gestation chez la souris étant de 21 jours. Lorsque l'étude s'adressera à des animaux après la naissance, les injections seront réalisées entre le stade P0 et P3 ou au stade adulte lorsque requis, entre 8 et 12 semaines. Les animaux seront injectés deux fois sur deux jours consécutifs lorsque nécessaire afin de s'assurer de la recombinaison de l'ensemble des cellules ciblées. La nécessité de deux injections pour une recombinaison fiable résulte de l'expérience acquises au cours des années et est en faveur de la règle des 3R car cela permet d'obtenir des résultats plus stables rapidement et de réduire le nombre d'animaux injectés.
Etude d’une molécule clef dans la lamination du cortex cérébral chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Sur les 656 souris de ce projet, 336 sont des embryons prélevés par césarienne au terme de la gestation pour leur retirer le cerveau, 245 sont tuées parce qu'elles n'ont pas le génotype recherché et 18 mâles géniteurs le sont parce que leur génotype interdit de les utiliser ailleurs. Les 57 femelles gestantes, contenues puis injectées dans la veine de la queue, sont tuées au stade embryonnaire de 18,5 jours. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger pour 263 animaux et modéré pour 393. Le tamoxifène injecté peut dérégler l'équilibre hormonal de la gestation et faire mourir les embryons in utero, et le porteur justifie l'ensemble en indiquant qu'aucun organoïde de cerveau, murin ou humain, n'a à ce jour reproduit la formation des six couches de neurones du cortex.
Objectifs
Des anomalies génétiques chez l’homme affectant les processus de prolifération, de migration et de différentiation cellulaire peuvent aboutir à des malformations du cerveau. L’effet des mutations dans des gènes orthologues sur le développement embryonnaire est modélisé chez la souris. Ce projet vise en particulier à étudier le rôle clef d’une molécule dans la formation des couches de neurones dans le cortex cérébral et à déterminer si la quantité de cette protéine est un facteur déterminant dans la sévérité du phénotype. Pour contrôler la quantité, une stratégie d’invalidation génétique conditionnelle est utilisée reposant sur l’injection de tamoxifène chez la femelle gestante pour induire la perte de fonction de la molécule ciblée au cours du développement embryonnaire. 336 embryons seront collectés par césarienne et mis à mort pour prélever leur cerveau et une biopsie cutanée. Des études histologiques et biochimiques seront réalisées sur ces cerveaux pour quantifier la sévérité de la malformation corticale et le génotypage sera effectué sur la biopsie cutanée.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués dans des anomalies du cortex cérébral observées chez l’homme. L’utilisation d’un modèle génétique contrôlé chez la souris permet de reproduire ces malformations corticales et les connaissances acquises sur les mécanismes permettent de tester chez l’animal des approches thérapeutiques qui pourraient être appliquées à l’Homme.
Procédures
Les femelles gestantes (57) subiront une contention permettant l'injection intraveineuse (10 secondes) dans la veine caudale d'un produit.
Impact sur les animaux
L’injection par voie intra-veineuse de la souris adulte peut entrainer une douleur légère de courte durée. Le tamoxifène, antagoniste des œstrogènes peut altérer l’équilibre hormonal pendant la gestation et entrainer une mortalité prénatale avec une résorption des embryons.
Devenir
Toutes les 656 souris du projet seront mises à mort. - 245 souris issues du croisement des lignées simples car elles n’auront pas les génotypes d’intérêt. - 57 femelles gestantes pour collecter les embryons au stade embryonnaire 18.5 après leur fécondation. - 336 embryons collectés pour prélever leur cerveau et une biopsie cutanée. - 18 mâles géniteurs utilisés pour les croisements contrôlés car ils ne pourront pas être réutilisé pour d’autres projets en raison de leur génotype unique.
Remplacement
Les questions scientifiques adressées dans ce projet ne peuvent être étudiées qu’in vivo, sur des cerveaux prélevés sur des embryons. Il s’agit ici d’études sur le développement du cortex cérébral, qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère en développement. Aucun modèle in vitro même les plus sophistiqués comme les organoïdes de cerveau ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de son développement dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part. Jusqu’à présent la lamination complète du cortex c’est-à-dire la formation des 6 couches de neurones n’a jamais été observé dans les organoïdes de cerveau qu’ils soient d’origine murine ou humaine.
Réduction
La stratégie de croisement contrôlée permettra de générer tous les génotypes nécessaires à l’étude et tous les embryons générés seront analysés sans sélection. Il a été montré dans ce type d’études de modèles animaux qu’un échantillon de 7 animaux par condition est suffisant pour mettre en évidence une différence de 20%.
Raffinement
Les animaux progéniteurs sont maintenus dans un environnement enrichi avec eau et nourriture ad libitum et en groupe social avant leur croisement. Après croisement contrôlés, les femelles gestantes sont regroupées par paire. Les males reproducteurs sont placés avec des femelles âgées qui ne sont plus fertiles pour éviter leur isolement en attendant les croisements contrôlés suivants. Au stade embryonnaire 9,5 jours après le coït (E9,5), la queue de la femelle gestante à injecter en intraveineux (IV) est imprégnée de crème analgésique pendant 15 minutes. La souris est ensuite maintenue dans une boite de contention et sa queue chauffée sous une lampe afin de provoquer une dilatation de la veine caudale et faciliter l’injection du produit par voie IV. Les femelles injectées sont regroupées et surveillées quotidiennement en application des points limites stricts et spécifiques du projet jusqu’au stade de leur mise à mort à E18.5. Les embryons collectés à E18.5 sont endormis par le froid avant leur mise à mort.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle pour mener les études sur le développement du cerveau, principalement en raison de la similarité́ des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral entre les rongeurs et l’Homme. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce pour la réalisation du projet tels que les modèles génétiquement modifiés. L'expérimentation est menée sur des embryons en fin de gestation, stade qui nous permet de voir l'effet des modifications génétiques sur cette étape critique du développement dans le cerveau.
Étude des propriétés biologiques, de la sécurité sanitaire et de la qualité nutritionnelle d’une alimentation à base de farine d’insectes chez le rat
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Isolés en cage individuelle pendant quatorze semaines, soumis à treize prélèvements de sang à la queue étalés sur deux heures, à 72 heures en cage de mesure de la dépense d'énergie puis à 48 heures en cage de recueil des urines et des fèces, 144 rats subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués à la fin pour doser leurs organes. Le projet évalue l'intérêt nutritionnel et les risques toxicologiques de quatre farines d'insectes, présentées comme une alternative durable aux protéines animales. Le porteur annonce vouloir étudier la motricité, la mémoire, le stress et l'anxiété de ces rats, sans nommer un seul des tests comportementaux prévus.
Objectifs
La production alimentaire actuelle est indissociable de son empreinte écologique. En effet, notre façon de nous alimenter devra changer en raison de l'épuisement de certaines ressources, de la dégradation de l'environnement et de la biodiversité liée à certaines pratiques agricoles et habitudes de consommation. Pour nourrir la population mondiale de demain, il y a un enjeu majeur à trouver d'autres sources de protéines riches en composés nutritionnel d'intérêt pour pallier la consommation de viandes et de poissons (dont la disponibilité diminue). Les insectes riches en protéines de haute qualité sont considérés comme une alternative durable aux protéines animales face à la raréfaction des ressources naturelles et à l’augmentation de la population mondiale. Actuellement, 2/3 des terres agricoles dans le monde sont consacrées à l’élevage ou à la production d’aliments pour le bétail. Ce mode de production a des répercussions négatives sur notre environnement, notamment sur l’émission de gaz à effet de serre, sur l’eau potable et sur les surfaces agricoles. L’élevage des insectes, plus vertueux, utilise des déchets agricoles et nécessite en moyenne quatre fois moins de nourriture qu’un élevage conventionnel. Face à cette problématique, la consommation de farine d’insectes se présente comme une solution durable et écologiquement viable pour nourrir l’ensemble de la population. Néanmoins, il est essentiel d’évaluer les impacts sur la santé d’un remplacement des protéines de notre alimentation actuelle par des protéines d’insectes. Ainsi notre objectif est d’évaluer les impacts sur la santé d’une consommation de farine d’insectes. De plus, nous nous intéressons aux différentes conditions d’élevage des insectes car l’alimentation donnée aux insectes pour leur croissance peut impacter leur qualité nutritionnelle et leur potentielle contamination. Notre évaluation des impacts sanitaires reposera sur deux objectifs : 1) l’évaluation des bénéfices nutritionnels et 2) l’évaluation des risques toxicologiques, le tout en fonction des conditions d’élevage.
Bénéfices attendus
Nous pensons que le statut nutritionnel de ces farines d’insectes sera comparable, voire supérieure, à celui des produits animaux traditionnellement consommés et représentant l’apport protéinique dans notre alimentation. Notre étude pourra potentiellement mettre en évidence un bénéfice nutritionnel à la consommation de ces farines dont il est envisagé qu'elles puissent être utilisées pour remplacer les protéines d'origine animale dans notre alimentation. De plus, pour promouvoir une alimentation humaine à base de farine d’insectes il est nécessaire d’évaluer les impacts sur la santé d’une consommation de ces farines d’insectes et donc d’étudier leur contamination en résidus de pesticides et contaminants de l’environnement. Une évaluation approfondie du rapport bénéfice/risque est donc indispensable pour déterminer s’il est possible de promouvoir une augmentation de la consommation de farine d’insectes et si ces farines peuvent être consommées en quantités suffisantes pour remplacer les protéines animales. L’étude inclut également l’analyse de différentes méthodes de production d’insectes afin de mieux maîtriser les modes d’élevage dans le but d’optimiser les avantages nutritionnels tout en minimisant les risques pour la santé. En conséquence, cette recherche pourra offrir des recommandations précises aux producteurs en matière d’élevage, ainsi qu’à la population concernant leur consommation. Si la qualité nutritionnelle et la sécurité sanitaire des farines d’insectes sont confirmées, leur utilisation pour remplacer les protéines animales pourrait avoir un impact environnemental positif. En effet, remplacer la consommation de poisson par celle d’insectes présenterait un avantage notable, notamment en réduisant la pression sur la biodiversité marine, menacée par la pêche intensive répondant à la demande croissante en protéines animales.
Procédures
Les animaux seront en isolement physique pendant 14 semaines. Ils pourront cependant se sentir, s’entendre et se voir. Treize prélèvements sanguins au niveau de la queue, espacés sur 2 heures, seront réalisés pendant les tests de glucose et d’insuline, à la 12ème et 13ème semaine. De plus, ce protocole nécessite de placer les animaux en cage de mesure de dépense d’énergie pendant 72 heures afin d’évaluer l’impact de l’alimentation sur le métabolisme et sur leur activité locomotrice spontanée. Au cours de cette intervention les rats sont placés dans des cages de dimension similaire à celle utilisée pour l'hébergement standard. Seul le couvercle est différent : dans ce cas, il est équipé des capteurs nécessaires au recueil des données. Les cages sont disposées dans une enceinte dotée de capteurs infrarouge permettant de suivre le déplacement de l'animal. Ce protocole nécessite également de placer les animaux en cage spécifique de recueil d’urines et de fèces pendant 48h pour le recueil des urines et fèces en fin de protocole. Pour les mesures de tolérance au glucose, à l’insuline et avant l’euthanasie, la durée de mise à jeun ne dépasse jamais 15 heures consécutives et permet d’obtenir des résultats fiables et en accord avec ce qui est réalisé dans la littérature. Ces éléments classent la procédure en classe de gravité modérée selon les recommandations réglementaires.
Impact sur les animaux
Ce protocole nécessite l’isolement des animaux en cage individuelle tout au long du protocole afin de contrôler la consommation quotidienne d’eau et d’aliment de chaque animal et maîtriser ses refus. Le milieu sera enrichi le plus possible à l'aide de jouets. Treize prélèvements sanguins au niveau de la queue, espacés sur 2 heures, seront réalisés pendant les tests de glucose et d’insuline, à la 12ème et 13ème semaine. Pour le test du glucose, un gavage oral sera réalisé sur quelques secondes. Pour le test de l’insuline, une injection sera réalisée en quelques secondes. De plus, ce protocole nécessite de placer les animaux en cage de mesure de la dépense d’énergie pendant 72 heures afin d’évaluer l’impact de l’alimentation sur le métabolisme. Ce protocole nécessite également de placer les animaux en cage spécifique de recueil d’urines et de fèces pendant 48 heures pour le recueil des urines et fèces en fin de protocole. Pour les mesures de tolérance au glucose, à l’insuline et avant l’euthanasie, la durée de mise à jeun ne dépasse jamais 15 heures consécutives et permet d’obtenir des résultats fiables et en accord avec ce qui est réalisé dans la littérature. Ces éléments classent la procédure en classe de gravité modérée selon les recommandations réglementaires.
Devenir
Tous les rats seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de pouvoir réaliser l’ensemble des prélèvements nécessaires, notamment des dosages au niveau des organes.
Remplacement
Cette étude fait suite à une étude in vitro réalisée au sein de notre projet. Ils démontrent une faible toxicité en test sur cellules pour une exposition à une fraction d’insecte. Dans ce même projet nous avons également analysé la composition nutritionnelle et la contamination de plusieurs farines d’insectes. Ceci a révélé une teneur en métaux lourds à étudier plus en détail. Notre étude vient donc dans la suite de ces résultats, évaluer l’impact sur un organisme entier. De même, aucun modèle de simulation ne pourra reproduire la complexité de l’organisme et il n’existe pas, dans ce cas-là, d’alternative expérimentale. L'étude du métaolisme ainsi que les effets bénéfiques nutritionnels d’une alimentation enrichie en farine d’insectes ne peut pas être évaluée in vitro. Une étude épidémiologique ne peut pas être réalisée dans ce cas car la farine d’insectes est très peu consommée (et de manière irrégulière) en France. Cette consommation par quelques individus est anecdotique et correspond à des quantités très faibles de farine d’insectes. Une étude épidémiologique ne pourrait pas être réalisée avec les données de consommations de pays consommant régulièrement des insectes car la production d’insectes est différente de celle aujourd’hui réalisée en Europe. De plus, cette étude s’intéresse à la métabolisation et l’élimination par un organisme entier de substances toxicologiques tels des contaminants ou résidus. Le modèle de rat correspond à l'espèce la plus pertinente et la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance ou de l'angoisse de façon durable sans qu'il soit possible de la soulager. Aucun modèle in vitro ne permet d'atteindre les objectifs fixés, le rat est un modèle approprié et bien validé pour ce genre d’étude De plus, le recours à l’expérimentation animale permet de maîtriser les apports et les consommations en nourriture enrichie en farines d’insectes sur la durée totale du projet (95 jours) ainsi que tous les facteurs qui pourraient influencer ces paramètres.
Réduction
Le nombre d’animaux s’appuie sur une étude statistique de l’effectif nécessaire basée sur des données de la littérature qui permet chez un groupe ayant consommé des protéines d’insectes de mesurer des modifications des statuts nutritionnels statistiquement différentes d’un groupe témoin. Selon nos évaluations statistiques et ce qui a été retrouvé dans la littérature scientifique, nous estimons un nombre de sujets nécessaires de douze rats par groupe afin de pouvoir visualiser une différence statistique entre les groupes. De plus, nous souhaitons tester quatre farines insectes différentes qui présentent des propriétés nutritionnelles et des contaminations en polluants différentes afin d’identifier celle qui sera la plus pertinente à commercialiser. Le nombre de rats dans chacun des groupes expérimentaux a été décidé afin d'assurer des résultats scientifiques fiables et robustes tout en utilisant un nombre total d'animaux minimal. Notre protocole utilisera des rats femelles et des rats mâles. Ce choix est fait en regard de différences connues entre le métabolisme chez la femelle et chez le mâle.
Raffinement
Les rats seront nourris avec un régime standard auquel sera incorporé de la farine d’insectes qui permet de couvrir l’ensemble des besoins nutritionnels et caloriques des rats. Ce protocole nécessite l’isolement des animaux en cage individuelle tout au long du protocole afin de contrôler la consommation quotidienne d’eau et d’aliment de chaque animal et maîtriser ses refus. Le milieu sera enrichi le plus possible. De même, les cages des animaux seront placées dans une même salle de stabulation et les animaux pourront se voir et se sentir tout du long du protocole. Des méthodes d’enrichissement social seront mises en place pour tous les animaux : une remise en groupe sociaux une fois par semaine pendant 15 minutes et deux séances de tickling par semaine de 5 minutes. Les animaux bénéficieront d'une surveillance quotidienne avec des critères d'observation stricts. Au-delà du non-respect d’un certain nombre de ces critères, ils seront considérés en souffrance et sortiront de l'étude.
Choix des espèces
Le modèle rat a été choisi en tenant compte de la littérature récente et des études de biodisponibilité et de toxicologie. En effet, les études sur le sujet ont pour la plupart été réalisées sur des modèles de rat. Nous comptons nous appuyer sur les données décrites dans ces études pour l’analyse de nos résultats. Le choix du rat se justifie également par les connaissances déjà accumulées dans le laboratoire sur ce modèle. Le rat est un modèle qui a la capacité de prendre des décisions et de s'adapter à son environnement avec des zones cérébrales fonctionnelles analogues à celles de l'homme notamment pour la motricité, la mémoire et le stress ou l’anxiété. Nous souhaitons étudier ces comportements dans notre étude pour évaluer l'impact des apports nutritionnels. C'est également une espèce plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants et la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Les rats seront âgés de 10 semaines pesant environ 250g au démarrage de l'étude. Les rats seront âgés de 24 semaines à la fin de l'étude. Notre étude cible une population de jeunes adultes plus disposée à consommer des protéines issues d’insectes. Nous souhaitons donc avoir des rats « équivalents » à cette tranche d’âge. De plus, plusieurs études de biodisponibilité de protéines ou d’impact toxicologique via une exposition alimentaire ont été menées sur des rats de cet âge. Réaliser l’expérimentation dans des conditions similaires à ces études nous permettrait de comparer nos résultats avec ceux de la littérature.
Evaluation de l’effet thérapeutique de la molécule soluble CSF1R-Fc dans des modèles murins de xénogreffe de cellules tumorales de mélanome.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
178 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune portant sous la peau une greffe de cellules de mélanome mesurée au pied à coulisse deux à trois fois par semaine. Une fois la tumeur passée 50 mm3, les injections de traitement se succèdent tous les deux jours, avec une séance de bioluminescence hebdomadaire sous anesthésie. La molécule testée bloque un récepteur immunitaire, dans l'espoir déclaré d'un transfert vers la clinique pour les patients en échec thérapeutique. Le projet déclare un niveau de souffrance léger, tout en indiquant qu'une tumeur à un stade avancé peut gêner les déplacements des animaux.
Objectifs
Des études ont montré que les patients atteints de mélanome malin avancé présentaient des concentrations sériques élévées de la protéine CSF1, et une corrélation de cette expression avec la progression de la maladie. L'analyse de biopsies de mélanomes primaires et métastatiques ont révélé une corrélation de l’expression de cette protéine CSF1 et de son récepteur avec l'abondance de lymphocytes T spécifiques de la tumeur. Des études in vitro ont également montré que les lymphocytes T spécifiques de la tumeur, induisaient après activation, la sécrétion de CSF1 par divers types de cellules du microenvironnement tumoral. Enfin, des études précliniques ont montré que le blocage du récepteur du CSF1 combiné au blocage d'un point de controle immunitaire retardaient la croissance tumorale dans certains modèles de cancer de souris, dont le mélanome. L’ensemble de ces données suggère que l'induction de la protéine CSF1 dans le mélanome représente un mécanisme de résistance adaptatif conservé déclenché par des lymphocytes T activés, qui est corrélé à la progression de la maladie. L’objectif de cette étude est donc d’évaluer l’efficacité thérapeutique d'une molécule soluble bloquant le CSF1 Récepteur dans deux modèles de mélanomes, réfractaires à d'autres thérapies.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont dans un premier temps la mise en place d’un modèle de mélanome le plus représentatif de la pathologie et de la problématique thérapeutique qui permettra l’évaluation thérapeutique de notre molécule bloquant le CSF1R mais qui pourra également par la suite servir à tester d’autres stratégies en développement dans notre équipe ou par des collaborateurs. L’étude de l’efficacité de notre molécule soluble bloquant le CSF1 Récepteur nous permettra dans un premier temps de l’optimiser en fonction des résultats obtenus puis dans un second temps d’envisager un transfert vers la clinique afin de proposer un nouveau traitement au patients atteints de mélanome, particulièrement ceux en échec thérapeutique.
Procédures
Injection des cellules tumorales en sous-cutané (15 minutes par souris, animaux anesthésiés). Suivi de la croissance tumorale 2-3 fois par semaine par mesure avec un pied à coulisses et prise de poids (animaux anesthésiés). Injection des traitements tous les 2 jours lorsque la tumeur est >50mm3 (animaux vigiles). Suivi de la croissance tumorale par mesure bioluminescence 1 fois par semaine (animaux anesthésiés).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont principalement liés à l’implantation de la tumeur. L’implantation de la tumeur, bien que réalisée sous anesthésie et analgésie, peut conduire à une douleur légère et de courte durée aux animaux. Une fois la tumeur développée à un stade avancé il est possible qu’elle provoque une gêne aux déplacements des animaux mais sans conséquence sur leur alimentation …. Les points limites de l’expérience seront bien sûr adaptés dans le cas, peu probable, où le développement de la tumeur induirait un changement important du comportement lié à la douleur ou autre. De plus, la réalisation du traitement nécessitera de multiples injections qui peuvent également induire une douleur légère et éphémère ainsi qu’un stress.
Devenir
Les souris seront euthanasiées à l'atteinte de points limites. Des prélèvements sanguins et post-mortem (tumeur, rate) seront effectués sur l'ensemble des animaux afin de réaliser une analyse comparative entre les groupes, et ainsi évaluer les effets de notre molécule sur les réponses anti-tumorales intervenant dans ce modèle.
Remplacement
La nature de cette étude ne permet pas de s’affranchir de l’utilisation d’animaux ; le même niveau d’information ne pouvant être apporté par des études in vitro ou in silico, étant donné la complexité de la réponse immune. Toutefois, l’utilisation d’animaux démarrera seulement une fois que notre molécule sera parfaitement caractérisée et son efficacité validée in vitro dans plusieurs modèles en 2D de mélanome.
Réduction
Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, chaque étape sera réalisée successivement et les modèles/protocoles les plus pertinents seront finement sélectionnés à chaque étape. Chaque protocole sera réalisé dans un premier temps sur un petit nombre d’animaux avec le nombre minimum de groupe. Si la stratégie fonctionne, elle sera alors reproduite pour confirmer les résultats et le cas échéant des groupes contrôles seront ajoutés et le nombre d'animaux augmenté à 10 animaux final par groupe. Ce nombre est suffisant pour réaliser des tests statistiques pour évaluer la survie des animaux. D’autres tests statistiques seront également réalisés sur les données de mesure au pied à coulisse, de bioluminescence ainsi que les analyses sur organes en fin de protocole, afin d’exploiter au maximum les résultats obtenus.
Raffinement
Afin de prévenir au maximum le stress des animaux, les souris sont maintenues en groupe sociaux, dans un environnement enrichi (frisottis + tunnels) et observées quotidiennement afin d’identifier tout changement de comportement lié au stress ou à la douleur et sacrifiées en cas de souffrance. L’implantation des cellules tumorales et le suivi des animaux par bioluminescence seront réalisés sous anesthésie générale et analgésie locale. Les points limites seront définis sur de nombreux critères incluant le poids et le comportement des animaux en plus de la taille/aspect de la tumeur et résumé dans un tableau pour obtenir la définition des poids limites la plus précise possible et éviter toute souffrance inutile aux animaux.
Choix des espèces
Les souris sont de bons modèles d'étude, notamment pour évaluer le bénéfice de nouvelles stratégies antitumorales, de par leur facilité d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. L'utilisation préalable de ces animaux par des équipes scientifiques internationales permet à d’autres travaux de recherche de débuter avec une base solide (connaissances théoriques, modèles, équipement,...). Ce projet sera réalisé sur des souris immunocompétentes afin de pouvoir analyser le système immunitaire infiltrant la tumeur. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (8-12 semaines) pour des raisons de maturité du développement squelettique et nerveux, facilitant les gestes liés aux greffes de cellules tumorales, à la réalisation du traitement et renforçant également la pertinence des effets thérapeutiques (transfert clinique chez des patients adultes).
Evaluation d’agonistes inverses du GPER dans la neuropathie chimioinduite
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Rendues douloureuses par administration répétée d'un anticancéreux, les souris de ce projet portent une neuropathie chimio-induite depuis la mise en place du modèle jusqu'à leur mort, soit deux semaines. Elles sont 552, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La douleur est mesurée par application d'un filament sur la patte, 64 animaux subissant en plus l'immersion de la patte dans un bain thermostaté et 16 une chirurgie de trente minutes sous anesthésie. Le porteur qualifie cette douleur de modérée, quand le projet déclare l'ensemble des 552 souris en souffrance sévère. Toutes seront tuées, la souffrance de l'animal ne pouvant pas être supprimée selon le porteur.
Objectifs
Le cancer du sein triple négatif, qui représente environ 17% des cancers du sein, a un pronostic très défavorable. Plus de 50% des patientes recevant une chimiothérapie développent des douleurs dites douleurs neuropathies induites par la chimiothérapie. De telles douleurs imposent des réductions de dose et des interruptions de traitement qui affectent inévitablement la survie. Il a été montré qu'un composé modulant le récepteur GPER (pour "G protein-coupled estrogen receptor") était doté d'une action anticancéreuse sur des cancers triple négatif chez la souris. Plus récemment, il a été montré chez l’animal que ce composé exerçait une action antalgique et anti-inflammatoire. Cela suggère qu'il serait possible de contrôler en même temps et chez un même sujet la croissance tumorale et la douleur en ciblant ce récepteur GPER. Ce projet s’intègre dans une collaboration avec une équipe de chimiste qui réalise la synthèse et la sélection de molécules modulatrices du GPER. Les meilleurs composés sont testés in vitro sur la croissance tumorale. Ainsi, nous souhaitons, chez des souris, évaluer l’action des meilleurs molécules précédemment identifiées sur la douleur neuropathique induite par la chimiothérapie.
Bénéfices attendus
Le produit attendu est un nouvel antalgique et antitumoral permettant non seulement de lutter contre la progression du cancer mais aussi les douleurs neuropathiques induite par la chimiothérapie. L’utilisation d’animaux est indispensable dans ce contexte d’interaction entre système nerveux, diffusion sanguine et système immunitaire. Le marché visé est principalement celui des cancers du sein triple négatif, permettant d’améliorer non seulement le pronostic vital de nombreuses patientes, mais aussi leur qualité de vie.
Procédures
L’ensemble des animaux (552 souris) subiront des injections pour administrer l’anticancéreux et des composés à tester. Une injection dure quelques secondes sur animal vigil. L’évaluation de la douleur sera réalisée par l’application d’un filament au niveau de la patte de l’animal. La douleur chez certains animaux (64 animaux) sera évaluée par le test d’immersion de la patte. Ce test consiste à immerger la patte de l’animal dans un bain thermostaté. Ces deux tests sont susceptibles d’entrainer une douleur de quelques secondes chez l’animal. L’animal est libre de retirer sa patte. 16 animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale qui durera environ 30 minutes par animal.
Impact sur les animaux
L’ensemble des animaux du projet présenterons une douleur neuropathique induite par la chimiothérapie à l’exception des animaux contrôles. L’induction de cette douleur neuropathie chez l’animal sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. Elle sera induite par administrations répétées d’anticancéreux. Elle peut être associée à une diminution du gain de poids des animaux. La douleur est modérée et sera ressentie de la mise en place du modèle jusqu’à sa mise à mort, c’est-à-dire 2 semaines. Les animaux de l’ensemble du projet subiront des injections pour administrer les composés testés. La piqure d'aiguille pour l’injection entraîne une douleur légère de courte durée. L’application d’un filament au niveau de la patte de l’animal ou l’immersion de la patte de l’animal dans un bain thermostaté est susceptible d’entrainer une douleur de quelques secondes chez l’animal. L’animal est libre de retirer sa patte. Après la chirurgie de certains animaux, ils seront isolés pendant environ 30 minutes pour la vérification du bon déroulement de l’étape de réveil.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort puisque la souffrance de l’animal ne peut être supprimée.
Remplacement
Les composés synthétisés seront, avant tout passage sur modèle animal, testé in silico pour leur capacité à interagir avec le récepteur GPER, ainsi que in vitro sur culture cellulaire pour évaluer et comparer leur effet avec le peptide de référence. Seuls les composés possédant une meilleure activité pharmacologique que le peptide de référence seront étudiés chez l’animal. S'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est nécessaire pour explorer et évaluer les troubles nociceptifs par le biais de tests comportementaux. Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Ces approches alternatives ne permettent pas de prendre en compte l’organisme vivant dans sa totalité et ne peuvent, à l’heure actuelle, se substituer à l’utilisation de modèles animaux. Ce type d'étude sur modèle animal est donc pour le moment nécessaire avant le passage en phase clinique chez l’Homme.
Réduction
Ces travaux seront précédés par des études in vitro permettant de sélectionner les molécules les plus prometteuses à des doses adaptées. Une forte expertise du laboratoire s’étendant sur plusieurs années d’expériences concernant les tests comportementaux et modèles animaux permet d’affiner le nombre d’animaux. De plus, le nombre d’animaux de ce projet a été défini de façon à utiliser le minimum d’animaux tout en obtenant des données statistiquement suffisantes. Si les résultats de la 1ère procédure sont négatifs (pas d’effet antalgique de chaque composés) alors l’étude s’arrête et les procédures suivantes ne seront pas réalisées.
Raffinement
Pour les animaux subissant une chirurgie, une anesthésie adaptée sera mise en place ainsi qu’une analgésie post-opératoire. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel de l’animalerie qui est sensibilisé aux différents modèles. Après leur arrivée à l’animalerie, une période de repos d’une semaine est observée afin d’acclimater les animaux à leur nouvel environnement. Pour limiter l’anxiété des animaux, ils sont habitués à la contention dès leur arrivée à l’animalerie et à l’appareillage des tests comportementaux pendant 3 jours avant le test. Afin de limiter la souffrance liée au prélèvement de queue et de phalangectomie des animaux issus de croisement génétiques, l’identification de l’animal se fera par tatouage à l’âge d’une semaine et l’évaluation du génotype se fera sur prélèvements de follicules pileux. Une grille de score adaptée au modèle utilisé a été réalisée et fournie en pièce jointe. Des points limites ont été définis pour cette étude et seront mis en place. Ils sont suffisamment prédictifs et précoces pour limiter la douleur à son minimum.
Choix des espèces
La souris est habituellement utilisée pour ces travaux portant sur les CIPN. D’autres travails antérieurs de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche, ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures ainsi que du modèle de neuropathie chimio-induite (choix des doses et du temps de traitement). Enfin, la souris possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux permettant de confirmer l’induction de la neuropathie. Les animaux auront 8 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 9 semaines au début des expérimentations. L’âge de 9 semaines est communément choisi pour ce type de projet.
Développement et évaluation de l’effet thérapeutique de cellules immunitaires modifiées pour l’immunothérapie dans des modèles de tumeurs solides chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système nerveux
7 969 souris vont être utilisées, 7 744 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune recevant une greffe de cellules tumorales dans le cerveau ou dans le vitré des deux yeux. Après une chirurgie d'une heure trente sous anesthésie, certaines portent un dispositif intracérébral relié à une pompe implantée dans le dos, et toutes passent deux à trois séances d'imagerie par semaine, avec trois ponctions de liquide céphalorachidien de trente minutes et une prise de sang toutes les deux semaines. La perte de vision provoquée par les tumeurs oculaires est présentée comme sans conséquence, la vue n'étant pas l'organe sensoriel prédominant chez les rongeurs, et les deux yeux sont greffés pour diviser par deux le nombre d'animaux. Les bénéfices annoncés pour les patients atteints de lymphome cérébral primitif ou de glioblastome restent renvoyés à des travaux précliniques que le porteur reconnaît nécessaires, toutes les souris étant tuées pour des analyses post-mortem.
Objectifs
Le système immunitaire est l’ensemble des éléments du corps qui surveillent et détruisent les cellules anormales. Malheureusement les cellules cancéreuses arrivent souvent à passer outre ce système. L’immunothérapie a été développée ces dernières années afin de réactiver le système immunitaire contre les tumeurs et de très bons résultats cliniques ont été rapportés. En utilisant une technique appelée thérapie cellulaire adoptive, nous permettons à certaines cellules du système immunitaire de reconnaitre spécifiquement la tumeur. Elles sont ensuite perfusées chez les patients cancéreux dans le but de reconnaître, de cibler et de détruire les cellules tumorales. L'immunothérapie cellulaire a montré récemment des résultats extrêmement prometteurs en utilisant des cellules modifiées et particulièrement dans le cas des cancers hématologiques (certains lymphomes et leucémies). Cependant, des résultats moins encourageants ont été observés dans certains cancers. Dans ce projet, nous allons génétiquement modifier les cellules immunitaires afin de les rendre plus efficaces et élargir leur utilisation à d’autres cancers. Les expériences proposées vont permettre d’identifier de nouveaux mécanismes anti-tumoraux et de nouvelles méthodes de traitement qui seront directement applicables dans le domaine d’immunothérapie des cancers.
Bénéfices attendus
De façon générale, la thérapie cellulaire adoptive correspond à l’expansion in vitro de cellules qui reconnaissent spécifiquement les tumeurs avant leur réinjection chez les patients. Ce nouveau type de stratégie thérapeutique anti-cancéreuse a montré des résultats prometteurs dans les essais cliniques récents mais des améliorations doivent encore être apportées pour notamment augmenter l'activité et la persistance des cellules immunitaires modifiées en évitant les effets indésirables tels l'épuisement (rendant les cellules insensibles à une activation ultérieure) Dans notre laboratoire, nous avons identifié un gène agissant comme un régulateur clé de la différenciation et formation de la mémoire immunologique de ces cellules. Nous avons observé que des cellules modifiées où ce gène a été génétiquement désactivé, sont beaucoup plus efficaces pour éradiquer des cellules tumorales dans un modèle de leucémie aigüe. Dans ce projet, nous souhaitons étudier les bénéfices de ces modifications, dans des modèles de tumeurs solides. Dans un premier temps, nous travaillerons sur des tumeurs associées à un mauvais pronostic chez les patients : comme le lymphome cérébral primitif (LCP) et le glioblastome. Les cellules modifiées que nous allons développer dans cette étude représentent une option thérapeutique intéressante pour ces patients mais des travaux précliniques restent nécessaires. Le projet permettra de faire des avancées majeures dans le domaine de la thérapie cellulaire adoptive dans le but d’améliorer le pronostic des patients atteints par ces cancers.
Procédures
Dans un premier groupe d’animaux, des cellules tumorales seront injectés dans le cerveau des animaux anesthésiés (durée anesthésie 30min). Ces animaux seront ensuite traités par voie intraveineuse (injection unique sur animal vigile – durée du geste inf à 20sec) Dans un second groupe d’animaux, des cellules tumorales seront injectées dans le cerveau des animaux anesthésiés. Au cours de cette chirurgie, un dispositif intracérébral sera installé (durée de l’anesthésie environ 1h30). Une semaine après l’intervention, les souris vigiles recevront des traitements directement dans le cerveau grâce au dispositif intracérébral (injection unique – durée du geste 5 min) Dans un troisième groupe d’animaux, des cellules tumorales seront injectées dans le cerveau des animaux anesthésiés. Au cours de cette chirurgie, un dispositif intracérébral relié à une pompe sous-cutanée implantée au niveau du dos de l’animal seront installés (durée de l’anesthésie environ 1h30). Ces animaux seront ensuite traités par voie intraveineuse (injection unique sur animal vigile – durée du geste inf à 20sec) Les trois groupes d’animaux seront suivis par imagerie à raison de 2 à 3 imageries/semaine. Les imageries seront réalisées sur animaux anesthésiés et dureront environ 15 min. De plus, nous prélèverons du liquide céphalorachidien sous anesthésie générale (3 prélèvements à au moins deux semaines d’intervalle, durée du geste 30 min) ainsi que du sang sur animal vigile (1prélèvement toutes les deux semaines, durée du geste inférieur à 20sec) Concernant les greffes intraoculaires de cellules tumorales, les cellules seront injectées dans le vitré, sous anesthésie générale et avec antalgie adaptée. La procédure dure entre 10 et 15 minutes par œil. L’évaluation de la croissance tumorale sera réalisée de façon non invasive, soit par examen ophtalmologique (ophtalmoscopie indirecte ou par photographie du fond d’œil, quotidiennement pendant 3 jours après la greffe puis 1 fois par semaine, durée de l’examen 15 min) soit par bioluminescence (2 fois par semaine, durée de l’examen 15 min), sous anesthésie. Le traitement sera délivré 1 fois par voie intraveineuse sur animal vigile (durée du geste inf à 20 sec), ou par injection intravitréenne sur animaux anesthésiés ((durée 15 min). L’évaluation de la réponse au traitement sera réalisée de façon identique à l’évaluation de la croissance des cellules tumorales greffées.
Impact sur les animaux
Les animaux greffés avec des cellules tumorales au niveau du cerveau vont développer des tumeurs. Les souris peuvent perdre du poids dans les jours qui suivent la chirurgie et/ ou présenter, dans de rares cas, des troubles moteurs (comportement rotatoire et/ou troubles de l’équilibre). Le traitement des souris par voie intraveineuse provoque uniquement la douleur de l’aiguille utilisée pour l’injection. Dans certains cas, des dermatites peuvent se développer 3 semaines après l’injection provoquant une perte de poils à long terme. Le traitement des souris par voie intracérébrale peut provoquer des douleurs ainsi qu’une légère perte de poids durant 2-3 jours. Le prélèvement sanguin provoque la douleur de l’aiguille et dans de rares cas une perte de poids de l’animal. Le prélèvement de liquide céphalo-rachidien peut provoquer des douleurs ainsi qu’une légère perte de poids durant 2 jours. Les animaux greffés au niveau de l’œil développeront une tumeur dont la croissance n’est pas douloureuse mais qui entrainera une baisse de la vision. Cette baisse de la vision n’aura pas de conséquence sur les animaux (sociabilisation, alimentation), ni sur le poids de l’animal, la vue n’étant pas l’organe sensoriel prédominant chez les rongeurs. Dans de rares cas, des réactions inflammatoires ou infectieuses pourront être observées suite à la greffe ou l’administration de traitements
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Ce projet découle de résultats obtenus in vitro à l'aide de lignées cellulaires en culture. En résumé, on a découvert que certaines modifications comme l’inactivation d’un gène spécifique induit une survie prolongée de certaines cellules immunitaires, appelés les lymphocytes T. L’association de plusieurs modifications génétiques sur ces cellules devrait améliorer l’effet antitumoral des cellules modifiées. D’autre part, un grand nombre d’études ont montré l’effet délétère de certains messagers, appelés cytokines, sur le système immunitaire . Le fait de bloquer certains de ces messagers, en ajoutant des inhibiteurs de cytokines au traitement, devrait améliorer, in vivo, l’effet antitumoral des cellules modifiées. Pour valider cette hypothèse, le modèle animal est nécessaire. En effet, après la validation in vitro des bénéfices de ces traitements par différents types de cellules, il est nécessaire de les évaluer dans un système plus physiologique avant d'envisager une application clinique chez l'homme en thérapie cellulaire. A ce stade, l’utilisation d’animaux est indispensable pour valider les mécanismes de régulation et d’action de ces traitements, ainsi que la toxicité éventuelle de cette thérapie cellulaire.
Réduction
Le nombre de souris par groupe est de 10 afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante, car de notre expérience, il y a toujours une certaine hétérogénéité entre souris. Ce nombre d’animaux tient compte de la nécessité d'utiliser le moins de souris possible et de pouvoir effectuer des statistiques fiables pour valider les effets biologiques observés. Pour finir, le suivi de croissance tumorale et évaluation de la réponse au traitement se fait in vivo, par imagerie de façon longitudinale et répétée, ce qui évite de devoir prévoir des animaux pour différents time points précis. Les deux yeux sont greffés afin de diminuer par deux le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Pour limiter le stress des animaux, un délai minimal de 7 jours est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale associée à des analgésiques adaptés aux interventions chirurgicales mises en place. Toutes les expérimentations sont réalisées sur tapis chauffant, et le réveil est réalisé sur tapis chauffant ou sous lampe chauffante. Pour les animaux ayant subis une chirurgie cérébrale ou une injection intraoculaire des soins pré et post-opératoires sont appliqués pour prévenir et/ou gérer la douleur. Un supplément alimentaire hydratant est mis à disposition dans les cages jusqu’au rétablissement complet de la souris (récupération du poids, absence de signes extérieurs de souffrance, absence de troubles moteurs). Pour limiter les effets secondaires dus à l’injection des cellules modifiées, comme les dermatites, nous étudierons l’effet de la délétion d’un gène potentiellement responsable de ces effets secondaires. Ces animaux sont surveillés quotidiennement pour évaluer leur état général et deux à trois fois par semaine pour mesurer la taille de la tumeur afin d'appliquer les points limites décrits dans une grille bien définie. Cette grille de score permet d’évaluer, de façon objective et spécifique, l’état global de l’animal (poids, état physique général, comportement moteur). Elle est adaptée à chaque type de procédure. En cas d’atteinte d’un point-limite tel que décrit dans la grille de score, l’animal est mis à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche en immunologie anti-cancéreuse car la connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques d’intérêt ainsi qu’un grand nombre de modèles de tumeurs transplantées.
Mécanismes l’infection et de la transmission de Plasmodium
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 125
Quinze à trente minutes de piqûres de moustiques sur un animal profondément anesthésié, une ponction cardiaque, ou une perfusion du foie qui tue: 5 025 souris et 125 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 150 d'entre eux anesthésiés et tués avant tout réveil. Infectés par une injection unique, ils subissent ensuite une ponction quotidienne de la queue pendant sept jours au maximum, jusqu'à ce que la parasitémie voulue soit atteinte. L'objet est d'amplifier un parasite du paludisme murin pour étudier ses formes dormantes dans le foie, le porteur écrivant que la souris et le rat servent de "simples flacons de culture cellulaire" à une étape du cycle parasitaire, et reconnaissant que le projet "ne comporte pas de considérations statistiques". Les rats sont retenus pour le volume de sang qu'ils fournissent, et les animaux sont inoculés à trois ou quatre semaines parce qu'ils ne sont pas encore immunocompétents, ce qui favorise l'infection.
Objectifs
Le principal objectif de ce projet est de comprend la biologie du parasite Plasmodium et de ses interactions avec l'hôte, en particulier dans le foie. Le foie est le premier organe humain ciblé par les parasites du Paludisme dès leur entrée dans le corps par la piqûre de moustiques Anopheles infectés, où une première phase d'amplification massive aura lieu avant que les parasites matures ne soient libérés dans le sang pour causer la maladie. Le foie est également le réservoir des formes dormantes du parasite, qui provoquent des rechutes et maladie chronique. Malgré son importance reconnue pour les stratégies d'éradication, le développement de médicaments antipaludiques ciblant les formes hépatiques du parasite est entravé en raison de l'accès limité aux échantillons de parasites et aux moustiques infectés avec des souches humaines. Le modèle murin de paludisme surmonte ces limitations et permet de recréer l'ensemble du cycle de vie du parasite dans un environnement in vivo. Le projet concerne spécifiquement l'utilisation d'animaux de laboratoire.
Bénéfices attendus
En utilisant les parasites produits dans ce projet, nous espérons : 1) identifier les mécanismes moléculaires codés par les parasites impliqués dans l'induction et le maintien de la dormance, de l'activation et de la conversion sexuelle dans le foie, et 2) établir les relations bidirectionnelles entre le métabolisme de l'hôte et les développements cellulaires distincts du parasite et leur impact sur les résultats des traitements. Ce projet révélera les mécanismes moléculaires sous-jacents à la dormance, aux rechutes et à la transmission des parasites du paludisme, et posera les bases du développement futur de biomarqueurs et nouvelles thérapies ciblant les réservoirs d'infection hépatique.
Procédures
Les animaux vigiles sont infectés par une injection unique. Une goutte de sang est prélevée à l'extrémité de la queue par ponction avec une aiguille à usage unique. Ce prélèvement est effectué quotidiennement, sur animal vigile, généralement à partir du troisième jour après l’injection et pour une durée maximale de 7 jours et nécessite moins d’une minute pour être réalisé. Lorsque la parasitémie désirée est atteinte, les animaux pour des prélèvements sanguins (par les moustiques pendant 15 à 30 minutes ou par ponction cardiaque). Les animaux non infectés utilisés pour la perfusion de foie sont profondément anesthésiés avant de procéder à la perfusion qui est létale.
Impact sur les animaux
Au cours de nos expériences, les animaux pourront subir quelques effets indésirables suite à des injections ou à des prélèvements sanguins. Ces effets indésirables sont de sévérité légère de courte durée. Le rongeur vigile ne souffrira que de l'inconfort causé par des injections (intrapéritonéale, sous-cutané et intraveineuse), ainsi que par le prélèvement d'échantillons de sang à la queue. Ces effets seront limités par l’utilisation d’aiguilles à la taille adaptée et à usage unique pour chaque animal. De plus, des analgésiques et un anesthésique local seront utilisés pour réduire les effets indésirables liés à l’injections. Les animaux infectés par le parasite seront mis à mort par des méthodes validées par le CEEA avant que l'infection palustre ne devienne symptomatique. Un prélèvement de sang sans réveil par piqûre des moustiques ou par ponction cardiaque sera réalisé dans l’animal profondément anesthésié. La perfusion hépatique sera réalisée uniquement sur des animaux profondément anesthésiés et constitue une classe sans réveil.
Devenir
Les animaux injectés avec le parasite ne peuvent pas être réutilisés. Les animaux utilisés pour le repas sanguin des moustiques sont anesthésiés puis mises à mort par dislocation cervicale avant leur réveil. Les animaux non infectés utilisés pour fournir des hépatocytes sous mis sous analgésie et profondément anesthésiés avant d’être perfusés ce qui est un acte létal.
Remplacement
Le modèle animal ne sera utilisé qu'à trois fins : 1) démontrer la transmission précoce des formes parasitaires sexuelles issues du foie, 2) générer des lignées de parasites transgéniques exprimant les régulateurs de la dormance ou de l'activation, et 3) produire des cellules hépatiques sauvages et transgéniques exprimant des biosenseurs métaboliques. Dans le cas où une nouvelle méthodologie est établie et devient disponible pour produire des lignées de parasites transgéniques dans le parasite du paludisme humain causant des rechutes (Plasmodium vivax), le modèle animal sera remplacé par des modèles de foie humain in vitro infectés par les lignées de parasites transgéniques humaines.
Réduction
Les animaux seront utilisés uniquement dans les situations où les expériences sur les animaux sont inévitables. Les protocoles de ce projet sont optimisés pour minimiser l'utilisation d'animaux et réduire au maximum la souffrance pendant les procédures expérimentales. Nous sommes conscients de l'impératif de réduire le nombre d'animaux utilisés dans la recherche scientifique et la majeure partie de nos activités de recherche est réalisée in vitro. Cependant, certaines étapes nécessitent encore l'utilisation d'animaux, car il n’existe pas actuellement de système qui permette de reproduire le cycle de vie complet de Plasmodium berghei in vitro. Ce projet ne comporte pas de considérations statistiques, car l'utilisation des animaux se justifie principalement par la nécessité d'amplifier les populations de parasites Plasmodium chez les rongeurs. En termes simples, la souris ou le rat sont utilisés comme de simples "flacons de culture cellulaire" pour accomplir une étape très spécifique du cycle de vie du parasite – la réinfection des globules rouges – qui ne peut être réalisée ni in vitro ni ex vivo. Mis à part cette étape, toutes les autres phases du cycle de vie du parasite seront effectuées in vitro, en accord avec le principe de réduction. Des procédures similaires sont approuvées pour d'autres équipes de recherche à l'Institut Pasteur ainsi que dans des laboratoires à travers le monde. Nous adopterons des protocoles expérimentaux issus de publications largement citées et nous travaillerons à les améliorer en réduisant le nombre d'animaux nécessaires grâce à l'utilisation de nouvelles technologies plus efficaces pour éditer le génome du parasite.
Raffinement
La conception des protocoles prendra toutes les mesures appropriées pour éviter ou soulager la souffrance, la douleur, la détresse et l'inconfort. Nos points limites sont établis de manière à éviter la phase symptomatique du paludisme chez les animaux infectés, ainsi les animaux sont mis à mort avant l'apparition des symptômes et des complications physiologiques potentiellement mortelles. De plus, nous surveillons le comportement des animaux tous les jours en utilisant une échelle de détresse pour détecter d'éventuels problèmes de santé non prévus afin d'améliorer rapidement leur bien-être. Si nécessaire, du dietgel ou un enrichissement supplémentaire seront fournis. Enfin, les interventions potentiellement douloureuses sont réalisées sous anesthésie générale profonde et analgésie, et les animaux sont mis à mort avant leur réveil. Une grille d’évaluation de la douleur, du stress et de l’inconfort sera utilisée. Le poids sera enregistré une fois avant de démarrer l'expérience et ensuite tous les jours dès qu'un score dans l'Apparence ou le poids corporel est >0. Prises de décision : dès qu'un score est à 2, l'animal sera mis à mort.
Choix des espèces
Les hôtes naturels des parasites P. berghei sont des espèces de rongeurs sauvages telles que Grammomys et Thamnomys, originaires d'Afrique centrale. Des isolats de ces parasites ont été transmis et adaptés aux souris et aux rats de laboratoire depuis de nombreuses années par plusieurs équipes. Il est largement reconnu dans la communauté scientifique que l'infection des rongeurs par ces parasites constitue un modèle biologiquement pertinent pour étudier plusieurs aspects du paludisme chez l'homme. Ainsi, la valeur d'une recherche rigoureuse sur les rongeurs pour éclairer ou orienter la recherche chez l'homme est désormais solidement établie. L’utilisation de rats, tout aussi susceptibles à l’infection que les souris, a essentiellement pour but d’obtenir un volume sanguin important tout en limitant le nombre d’animaux nécessaires pour préparer de grandes quantités d’érythrocytes infectés. Les animaux sont acclimatés pendant une période de 7 jours. Les inoculations de parasites seront effectuées sur des souris et des rats jeunes adultes âgés de 3 à 4 semaines, car ils ne sont pas encore immunocompétents, ce qui favorise l'infection par le parasite.
La sécrétion d’un transgène par le muscle pour traiter l’ensemble de l’organisme
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
366 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune reçoit une injection intraveineuse ou intramusculaire, puis cinq prélèvements sanguins sous anesthésie à deux, sept, quatorze, vingt-et-un et vingt-huit jours, avant d'être tuée au bout d'un mois pour prélèvement du foie, du cœur, des muscles et du cerveau. L'objet réel est de comparer des peptides de sécrétion pour qu'un médicament développé au laboratoire diffuse mieux depuis le muscle, l'un des transgènes testés étant déjà engagé dans ce développement. Le porteur affirme qu'un "organisme entier" est nécessaire pour suivre la sécrétion du muscle vers le sang puis l'absorption par les autres tissus, et revendique le "besoin" de mesurer la réponse immunitaire contre le médicament.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de faire sécréter une protéine d’intérêt par le muscle via une approche de thérapie génique. La thérapie génique consiste à introduire du matériel génétique dans un tissu ciblé afin de restaurer une protéine manquante ou non fonctionnelle. Le traitement des maladies musculaires est souvent complexe, car il nécessite des doses élevées de médicaments pour cibler efficacement l’ensemble des muscles, ce qui conduit généralement à une réponse immunitaire élevée ou à des complications cardiaques ou hépatiques. Pour améliorer l’efficacité de la thérapie génique ciblant les muscles, nous souhaitons développer un médicament qui sera exprimé et produit dans un tissu, puis fortement sécrété vers la circulation sanguine pour être réabsorbé par des tissus plus difficiles à atteindre. Cette approche permettra d’améliorer l’efficacité du médicament tout en réduisant les doses injectées. Pour augmenter la robustesse des résultats générés, nous évaluerons les peptides de sécrétion couplés à deux transgènes sécrétés utilisés dans notre laboratoire, dont un médicament est actuellement en cours de développement.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de sélectionner un ou plusieurs peptides de sécrétion efficaces dans le muscle cardiaque ou squelettique afin d’augmenter la sécrétion de notre médicament par le muscle et, par conséquent, d’accroître sa disponibilité pour l’ensemble de l’organisme. Une protéine-médicament plus disponible permettra d’augmenter l’efficacité de notre traitement et de réduire les doses nécessaires ainsi que les effets indésirables potentiels. Dans un cadre plus large, ces peptides de sécrétion seront utilisés pour développer un traitement pour des pathologies étudiées dans notre laboratoire.
Procédures
Pour les deux procédures, chaque animal sera soumis à une injection (intraveineuse ou intramusculaire, en moins de 30 secondes). Chaque animal subira 5 prélèvements sanguins (J2, J7, J14, J21, J28 après l'injection) après anesthésie (en moins de 30 secondes). Chaque animal sera euthanasié après anesthésie, à la fin de l'étude (1 mois).
Impact sur les animaux
Les souris subiront une injection, ce qui induira un stress (contention ou anesthésie) et une douleur due à la piqûre liée à l’injection. Les souris subiront également des prélèvements sanguins répétés (J2, J7, J14, J21 et J28), ce qui induira un stress lié à la contention et une douleur due à la piqûre ; un minimun de sang sera prélevé. Les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude (1 mois), et elles subiront un stress lié à la contention et à l’anesthésie.
Devenir
Après chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin que nous puissions prélever différents tissus (foie, cœur, muscles, cerveau, etc.) pour mesurer la présence du médicament en fonction de la sécrétion.
Remplacement
Le nombre de peptides de sécrétions musculaires a été préalablement été réduit grâce à des tests in vitro, permettant d’éliminer les candidats non fonctionnels. Néanmoins, le modèle animal ne peut être remplacé, car le muscle est un tissu complexe, difficile à reproduire en laboratoire. De plus, nous avons besoin d'un organisme entier pour étudier certains paramètres, tels que la sécrétion du muscle dans la circulation sanguine, puis l’absorption du médicament dans les tissus périphériques. Il est également nécessaire de suivre la réponse immunitaire contre le médicament, ce qui n’est pas possible in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera le minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiquement et statistiquement fiables. Les souris témoins seront mutualisées pour les différentes études.
Raffinement
Les deux procédures seront réalisées uniquement sur des mâles afin de limiter la variabilité des résultats et d’obtenir des données plus robustes. Une période d'acclimatation d’environ une semaine avant de débuter l'étude sera mise en place pour permettre aux souris de s'adapter à leur nouvel environnement. Les prélèvements sanguins seront effectués au niveau de la veine faciale sur des souris préalablement anesthésiées, afin de réduire leur stress. Le nombre de mâles par cage sera limité à 5 souris pour éviter les bagarres et les éventuelles blessures. Si des bagarres sont tout de même observées, les mâles agressifs seront séparés. Raffinements prévus pour l'hébergement : Afin de garantir le bien-être des animaux utilisés dans ce projet, plusieurs mesures seront mises en place pour optimiser leurs conditions d'hébergement. Les souris seront logées dans des cages équipées de litière et de matériel d'enrichissement (roues, tunnels, abris) pour encourager les comportements naturels et réduire le stress. Un accès libre à la nourriture et à l'eau sera assuré en permanence. L'environnement sera contrôlé en termes de température, avec un cycle lumière/obscurité respectant les besoins physiologiques des animaux (12h/12h). De plus, une surveillance régulière permettra de s'assurer du bon état de santé et du confort des animaux tout au long de l'étude.
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle murin pour étudier l’efficacité de nos peptides de sécrétion car c’est un modèle facile d’accès et pour lequel nous avons déjà démontré la capacité de sécrétion de notre médicament en utilisant une approche par le foie. En utilisant le même modèle, nous pourrons comparer l’efficacité de la sécrétion par le muscle versus le foie en utilisant nos données internes. Les animaux seront injectés à l’âge de jeune adulte (environ 6 semaines).
Etude du rôle d’une hormone sur la gestion du fer lors de la gestation chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Évaluer une hormone comme "possible médicament" dans les pathologies de grossesse, tout en entretenant une colonie de souris génétiquement modifiées: 2 490 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont tatouées, subissent un prélèvement de queue pour le génotypage, trois prises de sang submandibulaires sur animal vigile et de neuf à treize injections intrapéritonéales chacune. Le régime enrichi en fer, peu apprécié des souris, peut provoquer un trouble de l'alimentation et une perte de poids, et l'isolement des mâles reproducteurs est reconnu comme un facteur de stress. Les souris soumises à une expérimentation sont tuées à l'issue de chaque procédure, sans que le texte suive le sort de celles que mobilise l'entretien de la colonie, et le porteur justifie l'espèce par le nombre d'organes qu'implique l'étude de la gestation, du duodénum au placenta.
Objectifs
Nous étudions le rôle d'une hormone dans un contexte de gestation. Si cette hormone est bien connue dans de nombreuses fonctions de notre organisme, son rôle lors d'une grossesse est encore mal connue. Ce projet a pour but de préciser son rôle au niveau du développement de l'embryon et du placenta ainsi que d'évaluer son rôle comme un possible médicament dans diverses pathologies de grossesse.
Bénéfices attendus
L’étude permettra de comprendre le rôle d'une hormone dans la gestation, et d’évaluer l’intérêt thérapeutique de cette molécule dans un contexte de gestation chez des femmes dont le taux de fer est perturbé.
Procédures
Les animaux seront soumis à des tatouages pour identification et subiront un prélèvement de queue pour être génotypés. Sur animaux vigiles il sera effectué trois prélèvements sanguins, temps estimé par souris : 1 minute (contention et prélèvement) Injection : temps estimé : 15s par souris (contention et injection) avec entre 9 et 13 injections intra-péritonéale par souris.
Impact sur les animaux
Il peut exister un stress lors de la contention de la souris ou de l’injection du produit. Le prélèvement sanguin réalisé en état d’éveil au niveau submandibulaire est aussi inducteur d’un stress et de douleur légère pour la souris. La modification du régime alimentaire de la souris altère l'état général de la souris. Notamment le régime riche en fer qui est peu apprécié des souris et peut engendrer, au début du régime, un trouble de l’alimentation associé à une perte de poids. Enfin l’isolement des mâles reproducteurs sera également facteur de stress pour ces derniers.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux soumis à une expérimentation seront mis à mort à la fin de cette dernière
Remplacement
L’altération de la gestion du fer par la modification du taux de l'hormone d'intérêt a déjà été étudiée sur des modèles cellulaires in vitro. Nous continuerons en parallèle des expériences sur modèle murin, nos études in vitro, notamment pour préciser le mécanisme d’action sur des modèles cellulaires de placenta. Le principe actif testé a été choisi parmi un panel de molécules testé in vitro.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la robustesse de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée.
Raffinement
Les souris vivront en groupes sociaux. Elles seront élevées dans le respect des règles du bien-être animal en limitant au maximum leur douleur et leur stress. Nous effectuerons toutes nos manipulations de l’animal en s’efforçant de maximiser notre efficacité et réduire le risque d’induire stress et douleur à l’animal. Des scores ont été établis pour surveiller au mieux les animaux et entraîner la fin de l’expérimentation plus précoce si nécessaire.
Choix des espèces
Nous utilisons un modèle de souris car l’étude de la gestation implique de nombreux organes clefs (duodénum, foie, placenta…). Ce modèle murin nous permettra de modéliser une gestation en situation de déficience dans notre hormone d'intérêt dans tous les organes de l’organisme. Les souris seront utilisées autour de 3 mois au stade adulte, une fois arrivée à maturité sexuelle.
Rôle des circuits thalamo-corticaux dans les déficits d’attention dans l’autisme
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Maintenues à 90 ou 95 % de leur poids initial par un rationnement alimentaire pouvant durer deux mois, les souris doivent rester assez affamées pour travailler contre une récompense. 560 souris porteuses d'une mutation modélisant l'autisme vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie d'entre elles subit une chirurgie cérébrale d'environ une heure pour l'injection d'un virus et l'implantation de fibres, avec inconfort, fatigue et parfois douleur dans les jours qui suivent. Ce rationnement, dont le porteur juge l'impact très faible, accompagne une "claire perspective translationnelle" annoncée pour le trouble du spectre autistique, quand l'expérience consiste à faire exécuter une tâche d'attention une heure par jour pendant deux mois.
Objectifs
Les déficits attentionnels affectent une large proportion des autistes (jusqu’à 80%). De récentes études suggèrent que les difficultés sensorielles et attentionnelles des autistes seraient étroitement liées. Ainsi, les autistes auraient des difficultés à sélectionner les stimuli sensoriels appropriés, ce qui entrainerait une surcharge cognitive. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle que joue l’attention dans le trouble du spectre de l’autisme. Plus précisément, ce projet examinera l’implication de différentes régions du cerveau et leur interaction lors d’une tâche comportementale permettant d’évaluer la capacité de transition attentionnelle dans un modèle transgénique d’autisme chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure connaissance des structures et circuits impliqués dans l’attention ainsi qu’une meilleure compréhension de l’implication des déficits attentionnels dans un modèle animal d’autisme. Ce projet fondamental a donc une claire perspective translationnelle, en particulier pour le trouble du spectre autistique.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une tâche comportementale d'environ 1h/jour pendant 2 mois maximum ainsi qu'à un rationnement alimentaire léger qui n'exédera pas deux mois. Les animaux de la procdure 2 subiront une chirurgie cérébrale qui dure en moyenne 1h.
Impact sur les animaux
Les chirurgies d’injection intra cérébrale de virus et d’implantation de fibres présentent un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur). Afin de garantir la motivation des animaux pour la tâche comportementale ils seront mis en rationnement alimentaire léger (pour les maintenir à 90-95% de leur poids corporel initial) ce qui impacte très peu leur bien-être (légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à obtenir une récompense alimentaire). Cette restriction temporaire est en partie compensée par la nourriture obtenue au cours de la tâche comportementale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour l’analyse des marqueurs biologiques et les vérifications anatomiques.
Remplacement
Elucider les bases neuronales de fonctions cognitives ne peut, par définition, s’étudier que chez des organismes entiers. L’approche cognitive chez l’humain n’autorise pas la manipulation fine des circuits neuronaux qui est nécessaire à la compréhension de leur fonctionnement. De plus, les espèces d'invertébrés n'ont pas la capacité pour les comportements décisionnels étudiés dans ce projet et, à l'heure actuelle, ces comportements n'ont été démontrés que chez les mammifères et les corvidés. De même, l’approche neurocomputationelle faisant appel à la modélisation est utile, mais complémentaire des approches invasives in vivo permettant de vérifier la véracité des modèles prédictifs. Dans ce contexte il demeure nécessaire d’avoir recours à l’expérimentation animale.
Réduction
Nous cherchons à utiliser le nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs et exploitables. Le nombre d’animaux par groupe est le minimum requis pour que nos tests conservent assez de puissance en tenant compte des pertes inévitables. Le recours à des méthodes réversibles (inactivation transitoire de certaines voies anatomiques par la technique d’optogénétique) permet de diminuer le nombre d’animaux nécessaire.
Raffinement
Le bien-être animal étant essentiel pour garantir des données comportementales exploitables dans notre recherche, toute souffrance sera évitée. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement adapté (matériel de nidification, maisonnette) et seront hébergés en cage collective. Les protocoles de chirurgie ont été optimisés afin de garantir des conditions optimales (analgésie centrale, locale, gel oculaire, tapis chauffant, scoring post-opératoire). Le suivi post-opératoire sera effectué quotidiennement pendant 7 jours pour s’assurer de la récupération complète des souris. Des points limites généraux et spécifiques ont été identifiés afin de permettre une prise en charge optimale de la douleur et de l’inconfort. Tous les expérimentateurs et soigneurs sont formés et compétents dans les procédures requises pour ce projet et ont suivi les formations obligatoires.
Choix des espèces
D’une façon générale les rongeurs sont un bon modèle d’étude du système nerveux. De plus, de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez la souris des aptitudes cognitives complexes que l’on retrouve chez l’humain. Enfin, la souris permet l’utilisation de modèles transgéniques, dans notre cas un modèle induisant un phénotype autistique. Les animaux utilisés pour ce projet seront des jeunes âgés de 6-8 semaines au début des expérimentations. Ils atteindront 10-12 semaines avant le début des chirurgies et des protocoles comportementaux afin de limiter la variabilité de taille. Cet âge a également été choisi pour être cohérent avec les données de la littérature.
Déchiffrer le code de compatibilité entérofécal après transplantation de microbiote fécal pour contourner la resistance aux inhibiteurs des points de contrôle immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Une tumeur implantée, deux administrations orales de matières fécales murines, jusqu'à quatre injections d'immunothérapie et des prises de sang hebdomadaires: 1 508 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie d'entre elles subit en plus une intervention chirurgicale de cinq minutes sous anesthésie générale pour l'injection d'un traceur. Le porteur ramène les contraintes à une douleur et une gêne modérées liées à l'implantation de la tumeur, à un inconfort lors du gavage fécal et à une perte de poids possible. Il ne précise ni la nature du traceur, ni les immunothérapies employées, ni le calcul qui aboutit à cet effectif, dont il indique seulement qu'il découle d'un "nombre maximal théorique d'animaux par groupe".
Objectifs
Des précédentes études ont montré l'impact de la composition du microbiote intestinal (MI) sur la réponse immunitaire et la réponse aux traitements par immunothérapies contre le cancer. Il a d’abord été montré que la prise d’antibiotiques (ATB), en créant une dysbiose intestinale, est associée à une diminution de l’efficacité de ces immunothérapies dans de nombreux types de cancers. Puis, des compositions spécifiques du microbiote intestinale ont été mises en évidence comme étant associées à la réponse ou à la résistance aux immunothérapies. Ensuite, des travaux sur des modèles de souris ont permis de démontrer que la transplantation de microbiote fécal (TMF) à partir de selles de patients répondeurs ou résistants aux immunothérapies conduisait à la réponse ou à la résistance aux immunothérapies chez ces souris, respectivement. Finalement, la transplantation de microbiote fécal chez les patients parait être une approche efficace pour contourner la résistance aux immunothérapies induite par une dysbiose intestinale. Malgré des résultats prometteurs en clinique, il est nécessaire de comprendre les mécanismes qui expliquent la réussite ou l'échec de la transplantation de microbiote fécal à contourner la résistance aux immunothérapies. L'objectif principal de ce projet est de décrire les effets de la transplantation de microbiote fécal sur le système immunitaire et son implication dans la réponse antitumorale.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de comprendre les mécanismes expliquant la réussite ou l'échec de la transplantation de microbiote fécal à contourner la résistance aux immunothérapies. Cela permettra par la suite de mieux sélectionner les donneurs pour la transplantation, ainsi que de mieux sélectionner les patients pouvant recevoir la transplantation de microbiote fécal. De plus, ce projet apportera plus de compréhension sur les liens existants entre le microbiote intestinale, le cancer et la réponse aux immunothérapies. Enfin, par la compréhension des ces mécanismes, les patients ayant une dysbiose intestinale et résistants aux immunothérapies pourront bénéficier d'une tranplantation de microbiote fécal afin de contourner cette résistance.
Procédures
Les interventions prévues seront pour certaines procédures l'implantation d'une tumeur (une fois, d'une durée d'1 minute), l'administration orale de matières fécales murines (2 fois, durée 1 minute), l'administration de traitements d'immunothérapie (4 fois maximum, durée 1 minute), l'injection au niveau de la queue (une fois, durée 1 minute, anesthésie locale). De plus, il est prévu pour certaines procédures d'utiliser un traceur pour suivre la migration cellulaire, nécessitant une procédure chirurgicale, sous anesthésie générale, d'une durée de 5 minutes (une fois). Enfin, des prélèvements de sang seront réalisés, au maximum 1 fois par semaine (durée 5 minutes). Les injections seront réalisées sous anesthésie locale.
Impact sur les animaux
Les contraintes principales pour les animaux seront pour certaines procédures une douleur et une gêne modérée liée à l'implantation d'une tumeur, un inconfort lié à l'administration de matières fécales par voie orale au moment de l'administration, ainsi qu'une potentielle perte de poids liée à la tumeur, aux traitements et à l'administration des matières fécales.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure, afin de prélever les organes pour analyser les tissus, les cellules, doser des protéines ou de l'ADN.
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale, intestinale et périphérique et l’effet de la transplantation de microbiote fécal sur l'immunité et la réponse antitumorale, avec toutes les interactions nécessaires, impossibles à reproduire in vitro ou ex vivo.
Réduction
Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Par la suite, l’étude est divisée en plusieurs procédures séquentielles, dont certaines dites "GO-NO-GO", et sera arrêtée si une des procédures invalide l’hypothèse de travail ; le nombre de souris sera ainsi diminué. Le nombre d’animaux est scrupuleusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. Notre critère de jugement principal est le suivi de la croissance tumorale. D'après nos études antérieures avec des lignées tumorales, nous avons défini un nombre maximal théorique d'animaux par groupe. Cela a permis de définir le nombre d'animaux nécessaire et suffisant pour observer l'effet recherché. L'analyse des résultats sera faite en utilisant des méthodes statistiques.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être : stabulation conventionnelle, régime alimentaire normal et de l’eau ad libitum, ainsi qu’un enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière quotidienne permettra le suivi clinique de la souris ainsi que de son comportement, permettant l’éventuelle mise en place de mesures d'analgésie. Toutes les injections seront réalisées sous anesthésie locale. Les souris auront un examen clinique quotidien et des pesées régulières. Les points limites précoces seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques. La génétique et l'immunotlogie sont proches de celle de l’Homme et bien connues. La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques, la plus susceptible d’apporter les résultats satisfaisants pour nous au vu des objectifs du projet. Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des bactéries et de la transplantation de microbiote fécal sur l’immunité et la réponse antitumorale. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à partir de 6-7 semaines de développement, les cancers cibles touchant l’adulte. De plus, à cette âge là, les animaux sont matures du point de vue immunologique.
Le rôle des fibroblastes dans le développement, l’homéostasie et le vieillissement intestinal.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Un dernier produit injecté deux heures avant la mise à mort : le protocole est réglé au geste près pour 949 souris réparties en cinq lots, toutes tuées pour des analyses post-mortem. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger pour 877 d'entre elles et modéré pour 72. Selon les lots, elles reçoivent une injection par jour pendant trois à cinq jours, puis un second produit, parfois un troisième sous anesthésie, parfois un prélèvement sanguin. Le projet porte sur le rôle des fibroblastes dans l'intestin et utilise aussi bien des embryons que des souris de vingt-quatre mois, le porteur indiquant produire à partir de ces animaux des organoïdes extensibles "presque indéfiniment", qu'il présente comme un moyen de limiter le nombre d'animaux utilisés.
Objectifs
Il existe différents types cellulaires, dont les fibroblastes, qui constituent le tractus gastro-intestinal (tube digestif de la bouche à l’anus). Les fibroblastes synthétisent un réseau complexe de protéines et de sucres nécessaires à la bonne santé de l'intestin. Mais ce n'est qu'au cours des dernières années que nous avons commencé à apprécier l'implication des fibroblastes dans le développement intestinal, l’homéostasie intestinale (fonctionnement normal et sain de l'intestin) et les maladies. Ces découvertes ont été suivies d'une analyse génétique approfondie de ces cellules qui a permis d'explorer la diversité des fibroblastes intestinaux de manière remarquablement détaillée. De plus, l'impact du vieillissement sur les fibroblastes reste mal compris. Le déclin de la fonction gastro-intestinale qui accompagne le vieillissement entraîne divers problèmes digestifs, une absorption compromise des nutriments et une susceptibilité accrue aux maladies. Compte tenu des rôles cruciaux que jouent les fibroblastes dans l'homéostasie chez les jeunes adultes, il devient impératif d'explorer leurs fonctions dans le contexte du vieillissement. En outre, le rôle précis des différents sous-types de fibroblastes dans le développement reste également mal compris. Grâce à ce projet, nous souhaitons recenser la fonction et l'identité des fibroblastes intestinaux, en mettant en lumière leur rôle dans l'homéostasie mais aussi lors du vieillissement.
Bénéfices attendus
Les avantages à court terme résident dans les connaissances immédiates acquises pendant la durée du projet, qui permettront de mieux comprendre les fonctions et les identités des fibroblastes intestinaux. Ces connaissances pourraient potentiellement conduire à des traitements et des interventions plus ciblés pour les pathologies gastro-intestinales, ce qui profiterait aux individus à moyen terme. À long terme, les connaissances scientifiques cumulées générées par cette recherche pourraient favoriser des développements innovants dans le domaine des soins de santé. La compréhension de l'impact du vieillissement sur les fibroblastes et de leur rôle dans le maintien de la santé intestinale à différents stades de la vie et du développement embryonnaire pourrait ouvrir la voie à des stratégies préventives, à des approches thérapeutiques et à l'amélioration des résultats pour des pathologies telles que problèmes digestifs : la fibrose intestinale ou la malnutrition. En outre, la communauté scientifique dans son ensemble devrait bénéficier des progrès réalisés dans notre compréhension de la biologie cellulaire des fibroblastes, ce qui ouvrirait la voie à de futures recherches sur ces cellules, même dans d'autres organes. En résumé, la valeur de ce projet ne réside pas seulement dans ses contributions immédiates à la compréhension des fonctions des fibroblastes, mais aussi dans l'impact durable qu'il pourrait avoir sur les traitements médicaux, les connaissances scientifiques et, en fin de compte, le bien-être des individus.
Procédures
Dans un premier lot, les animaux vigiles recevront un premier traitement à raison d’une administration par jour pendant 5 jours (durée du geste inf à 10 sec). 24h après, un second produit sera injecté aux animaux vigiles (injection unique – durée du geste inf à 10 sec). Dans un deuxième lot, les animaux vigiles recevront un traitement à dose unique (durée du geste inf à 10 sec). Dans un troisième lot, les animaux vigiles recevront un premier traitement à raison d’une administration par jour pendant 5 jours (durée du geste inf à 10 sec). Au moins 24h après, un second produit sera administré aux animaux vigiles (injection unique – durée du geste inf à 10 sec). Enfin, 2h avant la mise à mort un dernier traitement sera administré (injection unique – durée du geste inf à 10 sec). Une partie de ces animaux recevront que le premier traitement en continu jusqu’à leur mise à mort. Dans un quatrième lot, les animaux vigiles recevront un premier traitement à raison d’une administration par jour pendant 5 jours (durée du geste inf à 10 sec). Une partie d’entre eux auront un traitement sous anesthésie pendant 5 à 20 min. L’autre partie, recevra un traitement différent à dose unique (durée du geste inf à 10 sec). Enfin, les animaux de la deuxième partie seront anesthésiés et analgésiés pour un prélèvement sanguin (durée du geste 5 min). Dans un cinquième lot, les animaux vigiles recevront un premier traitement à raison d’une administration par jour pendant 3 à 5 jours (durée du geste inf à 10 sec). Au moins 24h après, un second produit sera injecté aux animaux vigiles (injection unique – durée du geste inf à 10 sec).
Impact sur les animaux
Suites aux interventions subies par les animaux, des conséquences directes et courtes sont à prévoir : - Douleur liée aux injections - Stress lié aux contentions - Gêne de courte durée dans la gorge lors des gavages. Aucunes conséquences indirectes et à long terme (c'est-à-dire jusqu'à la mise à mort) ne sont à prévoir suites aux interventions subies par les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
L'intestin est un organe complexe impliquant de nombreux composants : bactéries, circulation sanguine et lymphatique, neurones, muscles, système immunitaire, etc. Le but de ce projet est d'identifier le rôle des fibroblastes dans l'homéostasie, le développement et le vieillissement de l’intestin. Réduire le projet à un système in vitro pourrait nous priver de découvertes pertinentes liées à la complexité des interactions présentes dans l'intestin. Cependant, nous produirons des lignées cellulaires et des organes en boîte de laboratoire (organoïdes) à partir de nos animaux d’intérêts pour des études in vitro. Ces organoïdes peuvent être étendus, presque indéfiniment, pour limiter le nombre d'animaux utilisés. Nous isolerons également des fibroblastes de souris mutantes et de type sauvage et testerons l'effet de différents médicaments in vitro, ainsi que leur interaction avec les organoïdes épithéliaux. De plus, nous utiliserons des méthodes de substitution partielles telles que des explants de tissus utilisés ensuite ex vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est ajusté au plus bas mais compatible avec l’obtention de résultats statistiquement fiables. Tous les animaux, quel que soit leur génotype et leur sexe seront utilisés, ce qui permet d’avoir à la fois des animaux contrôles et des animaux d’intérêts. Pour réduire la variabilité de l'échantillon, nous utiliserons autant que possible des animaux de mêmes portées. Plusieurs types d'analyses seront effectués sur la même souris, comme le suivi de la prolifération et de la migration. Les tissus extraits seront utilisés pour des expériences multiples afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les croisements de souris seront optimisés pour produire le plus grand nombre d'animaux de tous les génotypes d’intérêts. Des outils statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre minimal de souris nécessaires pour chaque expérience, afin de produire des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Pour les injections dans l’abdomen ou l’administration orale d’un produit non douloureux, une surveillance sera mise en place une fois par semaine jusqu’à la récupération post-mortem des tissus. Durant cette période, la mise au point de points limites permettra la détection de signes précoces de détresse ou de mal être avant que cela n’impacte les souris ou le projet. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d’atteinte d’un point limite, les animaux seront mis à mort. Pour les nouveau-nés, aucun changement de cage ne sera effectué durant la première semaine après la naissance, afin de limiter le stress. De plus, la mère sera manipulée à chaque fois avant les jeunes, de manière à incorporer son odeur sur les gants, afin d'éviter tout risque d'abandon de la part de la mère. La mère sera contrôlée pour s'assurer qu'elle s'occupe bien des jeunes souriceaux. Pour l'effet à long terme, les animaux seront surveillés tous les 2-3 jours. Leur poids, leur comportement général et leur apparence seront notés, et les signes d'inconfort seront évalués selon la grille de score. Si des signes de douleur sont identifiés, l'animal sera mis à mort dans les 24 heures.
Choix des espèces
La souris de laboratoire est largement utilisée car ce modèle apporte plusieurs avantages : la maîtrise de son élevage, sa reproduction facile et rapide qui permet l’obtention de cohortes d’animaux d’un génotype approprié, la relative facilitée de modification génétique. De plus, les bases de données d'expression chez la souris, les lignées de souris et les protocoles déjà établis permettraient d'étendre facilement ce projet à l'avenir en utilisant des modèles déjà existants, ou de comparer les résultats du projet à différents ensembles de données provenant d'autres projets. Également, la souris est très proche de l'Homme au niveau génétique mais aussi métabolique et immunitaire, c'est donc un excellent modèle d'étude pour notre projet. Le système intestinal des souris, semblable à celui de l'Homme, nous aidera à mieux comprendre sa fonction dans la vie quotidienne et les maladies. Des embryons de souris (E = jour du développement embryonnaire) à l'âge de E15 et E18 seront utilisés pour étudier le rôle des fibroblastes dans l'embryogenèse et le développement de l'intestin. Des nouveau-nés de 2 jours, 3, 7, 10, 14 et 21 jours ainsi que des souris adultes âgées de 2 et 12 mois, seront utilisées pour tester le rôle de différents groupes de fibroblastes dans le développement postnatal de l'intestin. À ces âges, la morphologie de l'intestin change considérablement et nous aimerions tester l'implication des fibroblastes dans ces changements Pour tester le rôle des fibroblastes dans l'homéostasie, nous utiliserons des souris adultes âgées de 2 à 4 mois. À cet âge, le système intestinal est considéré comme mature et sa fonction est connue, ce qui constitue une bonne base pour étudier le rôle des fibroblastes dans l'homéostasie et la maladie. De plus, comme nous nous intéressons au rôle des fibroblastes chez les souris âgées, nous utiliserons également des souris âgées (16 à 24 mois).