Oncologie

3 850 souris privées de système immunitaire complet vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées puis disséquées. Chacune reçoit sous la peau un fragment de tumeur prélevé sur un patient métastatique, quelques-unes une injection de cellules tumorales dans le cœur, et celles qui reçoivent un traitement subissent un prélèvement de sang hebdomadaire à la mandibule qui laisse des hématomes plusieurs jours. Le porteur retient des souris dépourvues de poils parce que la tumeur se suit mieux sous la peau et que les poils rayent les lames des microtomes, et prévoit 670 animaux par an rien que pour entretenir les lignées de xénogreffes. Il écrit qu'il n'est pas possible de se passer de ces greffes pour proposer des traitements personnalisés aux patients, tout en notant que ces souris sont plus exposées aux infections opportunistes.

Objectifs

Depuis ces dernières années, l’incidence des cancers augmente de par le monde. Avec l’avancé des traitements, la survie des patients s’est améliorée. Toutefois, la maladie métastatique reste un problème majeur et implique une morbidité et une mortalité importante. Dans le cancer, la maladie métastatique est un problème majeur et une cause importante de décès. Si les chiffres sont difficiles à obtenir, une étude estime que 66.7 pourcent des décès par cancers sont dues à des métastases. Leur traitement est rendu d’autant plus difficile que ces métastases ont tendance à résister aux traitements conventionnels. C'est pourquoi nous cherchons à identifier des biomarqueurs de résistance ou de toxicité aux anti-cancéreux, dans l’optique du développement de nouveaux traitements personnalisés.

Bénéfices attendus

La première partie du projet doit permettre de maintenir et de mettre en place de nouveaux modèles de xénogreffes de tumeurs humaines issues de prélèvements métastatiques de patients. Le recrutement des prélèvements métastatiques greffés est fonction de l'incidence des métastases dans chaque type de cancer. Pour le cancer du sein, qui est aujourd’hui le cancer le plus diagnostiqué et la 5eme cause de décès par cancer dans le monde, la maladie métastatique est responsable de la majorité des décès avec, pour ces cas, une médiane de survie à 5 ans de 30 pourcent. Outre les cancers du sein, les autres types de cancers très pourvoyeurs de métastases sont les cancers de la prostate, du pancréas, du poumon, du rein, le cancer colorectal et le mélanome. Le cancer du poumon, du rein et le mélanome métastatiques ont un pronostique particulièrement sombre avec une survie à 5 ans inférieure à 10 pourcent. Ces modèles de xénogreffe consistent à greffer un fragment tumoral humain sous la peau de la souris et constituent des modèles uniques et particulièrement pertinents pour l'étude de la pathologie humaine. Une fois établis, ces modèles doivent permettre de mieux comprendre les mécanismes de développement des tumeurs humaines, ainsi que permettre de proposer des traitements personnalisés aux patients. La seconde partie; qui consiste à traiter les souris xénogreffées avec des thérapeutiques déjà utilisées dans le cadre du soin, ou de nouveaux composés innovent; doit permettre de proposer des nouvelles alternatives au traitement de ces pathologie, comprendre les mécanismes d'échappement des tumeurs et, dans le cas de nouveaux composés, évaluer leur potentiel thérapeutiques en vue d'essais cliniques. L'objectif étant d'améliorer la prise en charge des patients.

Procédures

Les animaux utilisés sont immundéficients. Leur système immunitaire n'est pas complet ce qui limite les risques de rejets de la greffe. Tous les animaux de ce projet seront greffés avec des tumeurs humaines. La plupart recevront un fragment sous-cutané. A de rares exceptions, certains animaux pourront recevoir une injection sanguine de cellules tumorales. Dans les 2 cas, le geste s'effectue sur animal anesthésié et la durée de l'acte ne dépasse pas les 5 minutes. Les greffes sous cutanées se feront sous analgésie générale. Les injections sanguines de cellules tumorales se feront sous analgésie locale. Une partie des animaux xénogreffés sera traité afin d'évaluer l'efficacité des traitements sur la progression des tumeurs. Dans ce cas, les modalités de traitement varient. Les modalités retenues étant le gavage, l'injection intra-péritonéale et l'injection intraveineuse. Le choix des voies d'injection et des posologies étant soumis à la molécule thérapeutique employée. Les animaux en traitement seront également soumis à un prélèvement de sang hebdomadaire effectué à la mandibule. Le traitement et le prélèvement d'un animal s'effectue sur animal vigile et ne dure pas plus d'une minute.

Impact sur les animaux

La xénogreffes d'une tumeur humaine ; dans la mesure où il s'agit d'insérer un petit fragment tissulaire en sous-cutané ; est un acte peu invasif et peu douloureux. Les injections sanguines présentent un risque hémoragique au moment de l'injection. La croissance des xénogreffes sous cutanées occasionnera une gêne pour l'animal si elle est trop volumineuse. En sous cutanée, les greffes sont peu métastatiques et nous n'avons pas constaté que cela entrainait une diminution du bien-être animal. Les cellules tumorales injectées dans le sang auront une dissémination systémique entrainant la formation de tumeurs dont nous suivrons l'évolution par l'évaluation des signes cliniques de l'animal. Enfin, les traitements qui seront réalisés n'entraineront pas d'effets indésirables majeurs dans la mesure où les doses, les voies et les fréquences d'administration seront établies à partir de la pratique clinique. Les nuisances sont liées à la contention, l'insertion de la canule de gavage et la piqure à l'aiguille. Les prélèvements de sang à la mandibule occasionnent des hématomes localisés pendants quelques jours. Les souris sont immunodéficientes car athymiques, mais nous n'avons pas constaté d'impact de ce caractère sur leur qualité de vie. L'immunodéficience des animaux utilisés peut leur conférer une sensibilité aux infections opportunistes plus grandes.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés à la fin de l'expérimentation. La survenue de l'euthanasie est soumise à l'atteinte des points limites fixés. La dissection complète des animaux est systématique après l'euthanasie. Les prélèvements effectués permettent d'effectuer des analyses histologiques et moléculaires. Le recueil systématique des échantillons participe au raffinement des modèles.

Remplacement

L’objectif de notre projet est de pouvoir étudier les mécanismes de résistance aux traitements de tumeurs métastatiques de patients. Des cultures de cellules peuvent être réalisées dans certains cas mais avec des résultats très variables. Par ailleurs, la culture cellulaire sélectionne un type cellulaire, et on perd donc la richesse et l’organisation structurelle de la tumeur telle qu’elle existe chez le patient. Ceci constitue un biais analytique important car on sait qu'une tumeur est constituée d'une variété de cellules tumorales, plus ou moins sensibles aux agents thérapeutiques. Les cellules et les structures qui entourent les tumeurs jouent également un rôle dans les mécanismes de résistance. C’est pourquoi il n’est actuellement pas possible de nous passer de ces modèles de xénogreffes pour la prise en charge personnalisée des patients et la mise au point de nouveaux agents thérapeutiques.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour maintien des lignées de xénogreffes a été évalué en fonction de notre expertise de plusieurs années dans le domaine. Pour chaque tumeur, 4 souris sont greffées pour limiter le risque d’échec de prise de greffe. Ce risque varie en fonction de l’agressivité tumorale. Nous utilisons en moyenne 670 souris pour entretenir ces xénogreffes par an. Pour 5 ans, 3350 animaux seront donc nécessaires. Pour les traitements, 10 animaux par groupes est un nombre minimum pour avoir une puissance statistique suffisante. Nous testons une dizaine d’agents ou de combinaisons d’agents thérapeutiques par an, soit 100 animaux traités par an (soit 500 pour 5 ans). Pour 5 ans, 3850 animaux seront nécessaires.

Raffinement

Pour les xénogreffes réalisées en sous-cutanée, les animaux sont anesthésiés. La technique chirurgicale de greffe est peu douloureuse mais une analgésie générale est donnée au préalable. Pour les xénogreffes de cellules tumorales en intracardiaque, les animaux sont anesthésiés durant toute la procédure. La posologie des traitements administrés aux animaux est adaptée des traitements faits chez l’homme. Les doses administrées sont donc bien en dessous des doses létales et la toxicité des molécules se rapproche des effets observés chez l’homme. Les traitements sont administrés par gavage, intraveineuse ou intrapéritonéale. Afin de limiter les nuisances subies par les animaux tout au long du projet, des points limites suffisamment précoces ont été établis. Un suivi quotidien des animaux est opéré par du personnel qualifié. Les animaux sont élevés en groupe sociaux (4-5 par cage) avec enrichissement. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Une surveillance quotidienne est assurée par le personnel de l'animalerie et les membres de l'équipe de recherche. Les souris utilisées sont immunodéficientes mais nous n'avons pas constaté d'impact de ce caractère sur leur qualité de vie. Néanmoins, conformément aux recommandations du fournisseur, les animaux seront hébergés en cages à couvercles filtrant. Le change sera effectué sous atmosphère contrôlée et propre. Enfin, la stérilisation des consommables (litière, enrichissement, eau et nourriture) et des équipements (cages, portoirs, bouteilles, etc.) limitera le risque d'infection chez ces animaux.

Choix des espèces

Ce projet utilise des souris immunodéficientes adultes, de 6 semaines. Le caractère d'immunodéficience limite le risque de rejet de la greffe des cellules humaines Par ailleurs, le choix d’animaux dépourvus de poils nous permet de suivre plus facilement le développement sous cutané de la tumeur. L’évaluation de la taille tumorale est facilitée. L’absence de pilosité est un critère important pour les analyses histologiques. En effet, les poils ont tendance à rayer les rasoirs de microtomes. Les souris xénogreffées sont choisies jeunes adultes afin de maximiser les chances de prise de greffe. En effet, les cellules de la graisse brune situées entre les omoplates constituent un terreau nutritif pour les tumeurs xénogreffées, favorisant leur développement. Cette graisse brune disparait avec l’âge.

Immunodéficientes par construction, donc vulnérables à la moindre infection, 180 souris reçoivent sous la peau des cellules de cancer du sein humain. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyser les tissus, dans le seul but de vérifier in vivo une hypothèse déjà établie en culture cellulaire et sur des cohortes de patientes. Le porteur affirme que cette vérification exige un "organisme entier" dans lequel cellules et médiateurs circulent, et annonce une veille bibliographique pour éviter de refaire des expériences déjà publiées. La tumeur peut faire perdre l'appétit et le poids aux souris, que le porteur prévoit de mettre à mort dès l'atteinte des points limites fixés.

Objectifs

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent des cancers féminins. Il représente 33 pour cent des cancers de la femme. En 2023, en France, on estime à 61 214, le nombre de nouveaux cas, soit une augmentation de 0,3 pour cent par an depuis 2010. Nous avons mis en évidence, via des études in vitro et des analyses ex vivo sur des cohortes de patients, que l’absence de notre gène d’intérêt est impliquée dans la progression du cancer du sein. L’objectif de ce projet est de valider in vivo cette hypothèse.

Bénéfices attendus

Le dépistage rapide du cancer du sein, qui touche 1 femme sur 3 dans le monde (par an), est un défi important pour la santé publique. Ce projet nous permettra de valider un gène non connu comme un nouveau facteur pronostique et diagnostique de cette maladie.

Procédures

Tous les animaux du projet seront soumis à une inoculation de cellules tumorales (1 injection sous-cutanée sous anesthésie, 3 min/souris/injection). Tous les animaux seront manipulés brièvement (moins d’une minute) tous les 2-3 jours pour mesurer la croissance tumorale. Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Certains effets indésirables peuvent être observés chez la souris lors des expérimentations, notamment la manipulation et la contention régulière peuvent leur engendrer un certain stress. Les sites d’injections peuvent s’infecter. L’anesthésie peut induire un stress thermique. Par ailleurs, la croissance tumorale peut entrainer une baisse ou perte d’appétit qui peut causer une perte de poids des animaux. Les souris immunodéficientes présentent une sensibilité accrue aux infections.

Devenir

Tous les animaux à la fin de la procédure seront euthanasiés selon une méthode réglementaire. La procédure requiert l’injection de cellules tumorales, ce qui implique l’impossibilité de garder les souris en vie à la fin de l’expérience. De plus, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Cette étude ne peut être conduite qu’in vivo, car il est essentiel d’utiliser un modèle reproduisant au mieux l’environnement tumoral. Cela se traduit par la nécessité d’utiliser un organisme entier dans lequel les cellules et les médiateurs de l’organisme peuvent circuler, permettant ainsi une représentation plus fidèle des interactions biologiques complexes à l’intérieur du corps.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 180 souris. Pour sa réalisation, des groupes de 15 souris seront utilisés afin de garantir une évaluation statistique robuste des effets analysés. Nous appliquerons des tests statistiques pour comparer l’effet étudié entre les groupes, les croissances tumorales et la survie des animaux. Dans un souci de réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lors que cela est possible. Une veille bibliographique attentive et continue sera réalisée afin de vérifier que les expériences planifiées n'ont pas déjà été rapportées dans la littérature scientifique existante. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet présentent un phénotype considéré comme dommageable du fait que ce soit des animaux immuno-déficients. Elles seront hébergées donc, afin d’assurer leur protection, au sein de notre structure dans une zone d’expérimentation dédié aux animaux immunodéprimés, sur portoirs ventilés et toute manipulation sera faite sous hotte pour ne pas perdre leur statut et éviter que leur phénotype ne s’exprime (développement d’une quelconque maladie). Des tests de statut sanitaire réguliers montrant l’absence d’infection des animaux par des pathogènes opportunistes sont réalisés chaque mois dans l’animalerie, dans le cadre de l’hébergement de ces animaux. Les animaux seront soumis à 7j d’acclimatation dès leur arrivée dans la structure. Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification, bâtons à ronger et tunnels en cartons). Les souris seront soumises à un suivi quotidien afin d’évaluer leur niveau de stress et leur poids sera mesuré une fois par semaine tout au long de l’expérience de croissance tumorale. Toutes les interventions seront effectuées par des personnes expérimentées et éloignées des animaux hébergés. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (anesthésie, tapis chauffants, désinfection, ...). Les critères définis pour atteindre un point limite seront strictement appliqués, et les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude ou en cas d’atteint de ces points limites préétablis.

Choix des espèces

Le choix d’utiliser la souris dans cette étude est justifié par des considérations scientifiques et éthiques. Tout d’abord, la souris est un organisme complet et fonctionnel dont le système immunitaire peut être comparé à celui de l’homme, ce qui en fait un modèle pertinent. De plus, sa génétique est bien caractérisée, ce qui facilite les études génétiques et moléculaires. La souris est largement reconnue et utilisée comme modèle animal standard dans la recherche scientifique, notamment dans les études précliniques. Sa large utilisation au sein de la communauté scientifique internationale permet une meilleure comparabilité des résultats et une meilleure validation des observations entre différentes études. Nous disposons d’installations adaptées pour les souris, ainsi que d’une expertise solide en matière de techniques d’expérimentation animale et de suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Les animaux seront utilisés au stade adulte (à partir de 6 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

Soumises à un régime hyperlipidique pendant quinze semaines, mises à jeun de façon répétée et passées vingt-cinq à trente fois dans un test d'apprentissage, 255 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées, le prélèvement de sang se faisant directement dans le cœur sous anesthésie. Le projet cherche le rôle du récepteur aux xénobiotiques AhR dans la détection des lipides par la bouche, dans un contexte d'obésité. Le porteur qualifie ces tests de non invasifs et de gravité légère, puis relève lui-même que la répétition des épreuves et les privations de nourriture justifient un classement en modéré, sans nommer un seul des tests employés.

Objectifs

Le récepteur nucléaire d’aryl hydrocarbone (AhR) est impliqué dans la toxicité des substances comme les dioxines, dans les maladies du foie et des reins, et sur le fonctionnement du système immunitaire. Des études ont également mis en évidence l'influence de l'AhR sur la perméabilité intestinale. Cependant, aucune étude n'a encore analysé son rôle dans la détection orale des lipides Or, une perturbation de ce système de détection lipidique peut avoir des conséquences néfastes sur le métabolisme et le comportement. Les individus en condition d’obésité présentent un dérèglement de ce système. Cette étude vise ainsi à décrypter le rôle de l'AhR dans la détection orale des lipides, notamment dans un contexte d’obésité. En menant cette recherche, nous espérons contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans l'obésité et ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les perspectives par rapport aux résultats obtenus devraient : - Etablir les rôles « physiologiques » de l’AhR au niveau de la sphère orale - Déterminer si les effets obésogènes des xénobiotiques environnementaux ligands de AhR, pourraient avoir pour origine des interactions sur la détection orale des lipides

Procédures

La composition corporelle des animaux sera évaluée 4 fois dans un dispositif non invasif durant 2 minutes. Les souris seront soumises à des tests comportementaux non invasifs : les souris sont placées dans les dispositifs puis replacées dans leur cage de vie. Un test permettant d'analyser le niveau d'anxiété et la mobilité des souris aura lieu durant 30 minutes et n'aura lieu qu'une fois. Un test permettant l'analyse de la perception orale aura lieu 4 fois durant 30 minutes. Un test qui permet l'analyse de la préférence alimentaire aura lieu durant 16h dans leur cage de vie, 2 fois. Un test qui évalue la motivation des souris à consommer un aliment appétissant aura lieu 4 fois durant 10 minutes maximum. Un test qui permet l'analyse de l'apprentissage aura lieu entre 25 et 30 fois durant 3 minutes maximum. Un prélèvement intracardiaque sera effectué sous anesthésie, de moins d’une minute.

Impact sur les animaux

La majorité des analyses sont des études du comportement alimentaire des animaux. N'étant pas invasifs, ces tests sont de gravité légère. En revanche, la gravité des procédures a été placée en modérée, à cause des mises à jeun et de la répétition des différents test qui peuvent stresser les animaux. En effet, les effets indésirables attendus sont un stress dû aux mises à jeun et la possibilité de bagarres qui nécessitera l’isolement des animaux pour la réalisation de ces tests qui seront minimisés aux durées d’expérimentation. Les autres nuisances possibles sont associées à l’utilisation d’un régime gras (hyperlipidique) qui entrainera un surpoids chez les animaux (sauf le modèle de souris spécifique utilisé dans ce projet, étant résistantes au développement de l’obésité). La durée du régime (15 semaines) qui sera appliquée permet de mettre en place une obésité mais sans aller jusqu’au développement d’une insulino-résistance ni d’un diabète. Les animaux en régime hyperlipidique peuvent également avoir des difficultés à se mouvoir en raison du surpoids. Toutefois, cela n’a jamais été observé sur la durée (15 semaines) du régime. Les animaux pourront également être stressés à cause des manipulations, un minimum de personnel, auquel les souris auront été habituées, réaliseront les protocoles.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés sous anesthésie afin de réaliser des prélèvements sanguins et tissulaires.

Remplacement

Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu plusieurs organes (intestin, tissu adipeux et foie). Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée. Ce projet est couplé à des expériences réalisées in vitro dans l’objectif à terme de développer des études sur la détection des lipides dans ces modèles cellulaires sans nécessité d’avoir recours à des animaux.

Réduction

Les effectifs ont été minimisés tout en garantissant une pertinence biologique et une solidité statistique afin d’obtenir des résultats fiables. De plus, les analyses seront réalisées rapidement, dans le but d’arrêter les expérimentations dès que l’effectif sera suffisant pour obtenir des résultats fiables et diminuer ainsi le nombre d’animaux utilisé à son minimum.

Raffinement

Hormis les périodes de tests de comportement les animaux seront hébergés trois par cages transparentes, pour garantir le maintien des interactions sociales. Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales avec un enrichissement de leur milieu adapté. Ils bénéficieront d’un suivi quotidien de leur état général. Lors des procédures expérimentales, les actes susceptibles d’entrainer une souffrance ou une douleur seront réalisés soit sous anesthésie locale soit sous anesthésie générale pour le prélèvement sanguin intracardiaque, par des personnes expérimentées. S’agissant d’un projet nécessitant l’utilisation d’animaux vivants, l’utilisation de techniques non invasives et indolores ainsi que de tests comportementaux est privilégiée afin d’acquérir les paramètres physiologiques nécessaires au projet tout en respectant les questions d’éthiques en expérimentation animale et la règle des 3Rs. Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet.

Choix des espèces

Beaucoup d’études sur la thématique associée au projet ont été réalisées chez la souris. La confrontation de nos résultats avec la littérature s’avèrera donc plus pertinente. En effet, la souris et notamment la lignée C57Bl/6 est un modèle couramment utilisé dans les études sur l’obésité et les organes associés. D’autre part, dans le cas présent, le modèle transgénique utilisé est également sous fond génétique C57Bl/6, ce qui permet d’éviter le passage sous un autre fond génétique et la génération d’animaux que cela engendre. Les animaux seront à l’âge adulte car tous les systèmes biologiques étudiés doivent être matures, hors phase de puberté et avant la phase de dégénérescences physiologiques liées à l’âge.

Commandées à sept semaines chez un fournisseur agréé, ou nées de lignées génétiquement modifiées comparées à leurs contrôles de portée, 1 940 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever peau, cerveau, moelle épinière, rate et ganglions rachidiens. Le dos est dépilé puis exposé vingt minutes aux ultraviolets sous anesthésie, et la sensibilité mécanique de la zone brûlée est mesurée dix minutes par jour sur animal éveillé. Une partie subit l'ablation des glandes surrénales sous anesthésie profonde à l'âge de quatre semaines, d'autres reçoivent du LPS pour déclencher une inflammation aiguë, de la toxine diphtérique ou du tamoxifène jusqu'à trois fois par semaine. Le porteur affirme que ces interactions entre système nerveux et système immunitaire ne peuvent pas encore être modélisées in vitro ou in silico, tout en annonçant l'emploi de cocultures de neurones et de cellules immunitaires déjà maîtrisées au laboratoire.

Objectifs

Lors d’un coup de soleil, les cellules immunitaires orchestrent la réparation cutanée. La peau est aussi densément innervée par des neurones sensoriels qui communiquent avec les cellules immunitaires pour optimiser la cicatrisation, puis transmettent les informations vers le cerveau. Nous avons récemment observé qu’une zone particulière du cerveau appelée hypothalamus était sollicité suite aux coups de soleils et induisait la libération de neurohormones, les glucocorticoïdes, aux propriétés anti-inflammatoires. Notre objectif dans ce nouveau projet est de caractériser comment la peau et le cerveau dialoguent pour assurer un processus de cicatrisation optimal. Notre modèle de lésion cutanée aux ultraviolets est idéal pour étudier les échanges entre le système nerveux et le système immunitaire. En effet, il permet de suivre à la fois le processus de cicatrisation et la transmission nerveuse des messages de toucher et de douleur vers la moelle épinière jusqu’au cortex cérébral. Notre équipe a déjà démontré l’importance des neurones sensoriels au cours de la réparation de la peau, cependant, comment le cerveau perçoit les lésions cutanés et y réponds, reste encore mal compris. Ainsi, le projet a pour but de répondre aux objectifs suivants : (1) identifier les étapes clés de la réparation cutanée après lésion chez des souris de type sauvage, et sa perception par le système nerveux périphérique et central. (2) Déterminer les rôles respectifs des neurones sensoriels et de l’hypothalamus dans la réparation cutanée. (3) Déterminer les mécanismes moléculaires, médiés par le cerveau, qui orchestrent la réponse immunitaires de réparation cutanée. Comprendre ces mécanismes nous permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter les pathologies inflammatoires, prévenir les douleurs chroniques et favoriser la régénération tissulaire.

Bénéfices attendus

L’orchestration du processus de régénération tissulaire après lésion, par le système nerveux périphérique et central, reste encore très inexplorée. L’un des avantages majeurs de la neuro-immunologie est d’identifier des cibles pharmacologiques qui pourraient simultanément soigner les pathologies inflammatoires, et prévenir les douleurs qui y sont associées. Outre son aspect fondamental, la compréhension des mécanismes régulateurs sous-jacents, permettrait d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter l’inflammation et favoriser la réparation tissulaire tout en traitant les douleurs associées. Cette approche est particulièrement intéressante pour des personnes souffrant de défaut de cicatrisation telles que les personnes âgées ou bien atteintes de diabète. Nous proposons d’étendre nos résultats précédents à l’étude des interactions bidirectionnelles entre la peau et le cerveau. La douleur et le stress associé à une blessure (invalidité, chirurgie) constituent un problème majeur de santé public. Mieux comprendre comment ces deux processus modulent le système immunitaire au cours de la cicatrisation est primordial pour améliorer à terme le confort des patients, prévenir l’escalade de la douleur vers un stade chronique et approfondir notre compréhension de son mécanisme d’action. A terme, cette étude permettra de développer de nouveaux médicaments pour traiter la douleur inflammatoire tout en minimisant les potentiels effets secondaires.

Procédures

Toutes les souris subiront une anesthésie générale afin de subir une dépilation sur la peau du dos puis une exposition aux ultraviolets pendant 20 minutes de la zone dépilée, toujours sous anesthésie. Nous réaliserons ensuite des études de comportement pour tester l’évolution de la perception de la douleur (mesure de sensibilité mécanique ; 10 min/jour) suite à l’exposition aux ultraviolets sur animaux vigiles. Plusieurs des injections à réaliser (1 min) sont faites en intrapéritonéal, en sous cutané, ou en intradermique, sur animaux vigiles. Des prélèvements sanguins seront faits sur la veine sous-mandibulaire (2 min). Certaines procédures nécessiteront une chirurgie (ablation des glandes surrénales ; 10 min) sous anesthésie profonde (45 min), après laquelle la plaie sera suturée et les souris suivies quotidiennement et traités avec des analgésiques, crème cicatrisante et anti-inflammatoires.

Impact sur les animaux

Les animaux seront amenés à subir une irradiation aux ultraviolets (20 minutes) sur une petite zone de la peau du dos qui pourraient induire une perte de poids (sur 2 jours), des modifications de comportement en plus de l’inflammation cutanée. La procédure pourra aussi provoquer une sensibilité mécanique ainsi qu’un potentiel prurit (démangeaisons) au niveau de la peau irradiée. Les mesures de sensibilité mécanique (5 min.) peuvent engendrer du stress. Toutes ces procédures seront réalisées par un personnel qualifié et expérimenté et tout sera mis en œuvre pour minimiser la nuisance provoquée. Les injections, en intrapéritonéale ou sous cutanée, réalisées sur animaux vigiles peuvent générer un stress de courte durée (5 min.). Les modèles génétiques utilisés ne présentent pas de phénotypes dommageables. L’effet principal des déplétions génétiques que nous réalisons est une diminution de la sensibilité à la douleur chez ces animaux (perte de sensibilité à la chaleur, ou aux stimulations mécaniques). Le suivi de certaines souris impliquera une anesthésie légère à l’isoflurane (5 min.) jusqu’à 3 fois par semaine, ce qui induira du stress à l’animal. De même, certaines méthodes de traçage génétique nécessiteront une injection de tamoxifène jusqu’à 3 fois par semaine. La déplétion de certaines cellules immunitaires nécessitera une injection intrapéritonéale unique de toxine diphtérique. Pour notre approche pharmacologique, les traitements (injection ou application topicale) seront effectués journalièrement pendant 4 jours sous isoflurane et pourront engendrer du stress. La procédure (No3) chirurgicale visant à enlever les glandes adrénales (20 min/souris) nécessitera un traitement pré- et post-opératoire analgésique pour minimiser la douleur et le stress des animaux avant, pendant et après la chirurgie. Les souris traitées au LPS subissent une inflammation aigue pour une période de temps très courte (6 heures) au bout de laquelle les souris seront sacrifiées et analysées. La dose utilisée (100ng/10g) n’induit pas de choc septique. Cependant, il se peut que ces souris subissent une baisse transitoires (45 min.) de leur température corporelle. Nous utiliserons un tapis chauffant (37C) ainsi qu’un milieu enrichi pour prévenir cette hypothermie avant analyse.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures et les organes d'intérêts (peau, DRG, cerveau, moelle épinière, rate, ganglion lymphatique) seront prélevés post mortem pour analyse. Les animaux seront euthanasiés car le prélèvement des différents tissus est indispensable pour étudier le recrutement cellulaire de la réponse inflammatoire au niveau des tissus étudiés.

Remplacement

Le modèle animal (in vivo) est indispensable pour étudier les interactions entre système immunitaire et système nerveux sensoriel. En effet, ce sont des événements progressifs et multifactoriels qui dépendent des interactions tissulaires, cellulaires et moléculaires, localement sur le site inflammatoire mais également à distance dans les ganglions rachidiens de la racine dorsale (DRG) qui innervent la peau. Ces interactions ne peuvent pas encore être modélisées in vitro ou in silico, en particulier l’étude de l’innervation dans un tissu donné. Cependant, pour la recherche de mécanismes d’interaction neurone/cellule immunitaire ou des neuropeptides produits par ces neurones sensoriels, nous veillerons à utiliser dès que possible des techniques ex vivo déjà maîtrisées au laboratoire, telles que la coculture de neurones et de cellules immunitaires.

Réduction

Le plan de nos expériences est construit de manière à limiter le nombre de souris au maximum. Sur la base de nos résultats précédents, pour une différence biologiquement pertinente, nous avons estimé que 10 souris par expérience sont nécessaires : Des groupes de 5 souris seront générés en adéquation avec l’âge, le sexe et le fond génétique contrôle à chaque lignée murine (5 souris dites « test » et 5 souris « contrôles », soit 10 souris par expérience) pour chaque procédure. Chaque expérience sera répétées au moins une fois, soit 20 souris pour chaque condition testée pour répondre aux exigences statistique. Nous utiliserons à la fois des mâles et des femelles dans nos expériences, pour éviter de produire des animaux sans les utiliser. Tous les paramètres quantifiables seront vérifiés (poids, score d’inflammation, comportement) et tous les organes nécessaires à notre étude seront prélevés (peau, rate, et ganglion rachidien de la racine dorsale, moelle épinière et cerveau) afin d’éviter des expériences inutiles. Nous avons choisi de comparer les groupes de souris génétiquement modifiées avec leurs contrôles de portée respectifs et non avec des souris de type sauvage. Le contrôle des paramètres environnementaux et le statut sanitaire des animaux permettront de limiter la variabilité des résultats expérimentaux, et de réduire le nombre d’animaux nécessaire.

Raffinement

Nous avons optimisé le modèle UV dans notre Apafis précédent pour minimiser le stress et la souffrance liée à la lésion tissulaire. Seule une zone tres restreinte de la peau du dos des souris sera exposée aux ultraviolets. Les animaux utilisés dans ce projet sont élevés en groupes sociaux, la présence d’objets permet le raffinement de l’environnement dans des cages standards à toit ouvert (couvercle à filtre) avec de la sciure de bois utilisée comme litière et un accès ad libitum à un bidon d’eau et à un régime alimentaire standard. Nous utilisons alternativement des carrés de ouates pour que les animaux puissent faire un nid, des dômes en cellulose ou des tunnels en carton, qui sont changés chaque semaine. Les élevages sont effectués au sein d’un établissement agréé où 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages. L’état sanitaire et environnemental des animaux est contrôlé tous les jours. Nous avons recours à l’anesthésie/analgésie lors de l’exposition aux UV. Une planification fine des procédures expérimentales est effectuée (disponibilité des locaux d’expérimentation, du matériel, période d’acclimatation d’une semaine minimum des animaux aux pièces d’expérimentation et l’animalerie) pour diminuer le stress des animaux. Notamment lors du test comportemental par Von Frey les animaux seront acclimatés à l’enceinte 30 minutes avant les mesures pour minimiser le stress. Enfin l’établissement des points limites selon les grilles en annexe sera suivi au quotidien (vérification du poids, de la vivacité et de l’état du pelage des animaux) pour decider de continuer l’expérience ou non en fonction des signes vitaux des animaux. Une souris ayant perdu 20% de son poids sera systématiquement euthanasiée. Ces stratégies seront mises en place dans le but de réduire/supprimer la souffrance animale. Les modèles génétiques, ainsi que les déplétions chimiques ne présentent pas de phénotype dommageable. Les procédures incluant une chirurgie suivront un protocole strict pour réduire la souffrance de l’animal avant, pendant et après la chirurgie. Les souris seront maintenues profondément anesthésiées lors de l’opération et des soins pré-(Buprénorphine), per- (lidocaïne localement) et post-opératoires (Buprénorphine) adéquats sont administrés en plus de creme cicatrisante et nourriture humide pour éviter toute carences hydrique/alimentaires). Un tapis chauffant (37C) est utilisé pour éviter toute hypothermie pendant l'anesthésie.

Choix des espèces

Le niveau de similarité entre la souris et l’homme justifie son utilisation. L’état des connaissances actuelles, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation font de la souris le modèle idéal à l’étude des systèmes immunitaires et nerveux. En effet les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires entre la Souris et l’Homme. De plus, l’existence de modèle murins génétiquement modifiés fait de la souris un modèle animal de choix pour étudier ces phénomènes physiologiques. Des souris de 8 à 12 semaines seront utilisées car à ce stade elles ont atteint leur maturité en termes de défenses immunitaires et de développement du système nerveux. Ainsi, les animaux auront été commandés à 7 semaines auprès du fournisseur agréé de manière à ce qu'ils s'acclimatent à notre animalerie pendant au moins une semaine. Pour l’adrénalectomie, des souris de 4 semaines sont utilisées pour leur donner une période de rétablissement de 4 semaines avant induction de la lésion cutanée aux UV et étude de la réparation tissulaire.

Isolés deux heures par jour dès l'âge de quatorze jours, puis séparés un par un après le sevrage, 80 porcelets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avant d'être tués pour prélever leurs tissus intestinaux et leurs muscles. Ils subissent un prélèvement de fèces et deux prises de sang, chaque contention étant limitée à cinq minutes. L'objet du projet est de mesurer la digestibilité de la crème de pois, un coproduit de l'industrie alimentaire aujourd'hui mal valorisé, et son effet sur la croissance des porcelets au sevrage. Le porc est ici à la fois l'animal utilisé et le destinataire annoncé des résultats, le porteur présentant le projet comme un moyen de limiter les diarrhées et l'usage d'antibiotiques en élevage.

Objectifs

En production porcine, le sevrage est une période critique pour le porcelet car à cette période il subit de nombreux stress (séparation avec la mère, mélange avec d’autres portées, changement d’alimentation…). Cela entraîne des désordres digestifs avec notamment des incidences de diarrhées élevées. L’alimentation est un levier majeur pour améliorer cette étape clé du développement. La crème de pois est un coproduit de l’industrie alimentaire, riche en fibres facilement métabolisables et en protéines. De par sa composition et sa texture (entre la phase liquide et solide), la crème de pois pourrait être un aliment intéressant pour améliorer la santé digestive et pour favoriser la transition alimentaire des porcelets lors du sevrage. Dans ce contexte, le projet vise à décrire la digestibilité d’un coproduit du pois (la crème de pois) à étudier l’influence de l’ajout de ce coproduit sur la santé digestive des porcelets au sevrage (absorption des protéines, intégrité de la barrière intestinale), sur leurs performances zootechniques et leur développement musculaire. L’objectif est d’assurer une meilleure transition alimentaire au sevrage pour limiter les problèmes de santé digestive, d’améliorer la croissance des porcelets, et de diminuer/supprimer l’utilisation d’antibiotiques.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des connaissances sur la digestion d’un coproduit de pois, qui présente une texture (entre liquide et solide) et une composition (riche en fibres et protéines) pouvant être bénéfiques aux porcelets. Le projet permettra effectivement de déterminer les effets positifs sur la santé digestive (intégrité de la barrière intestinale) et la croissance musculaire des porcelets. Cette expérimentation apportera de nouvelles connaissances sur les différents liens entre les protéines issues de la digestion de la crème de pois et le développement des muscles squelettiques chez le porc. Ce projet permettra également d’optimiser l’utilisation d’un coproduit qui n’est pas totalement valorisé à l’heure actuelle, ainsi limiter les déchets et promouvoir une circularité des systèmes alimentaires. Pour une perspective à long terme, ce projet fournira des pistes pour adapter au mieux les régimes des porcelets, réduire les problèmes digestifs au sevrage et ainsi limiter voire supprimer l’utilisation d’antibiotiques en élevage. De plus ce projet fournira des données (activité enzymatique, pH) qui serviront à mettre au point un modèle de digestion in vitro spécifique au porcelet. Cela permettra par la suite de privilégier l’utilisation de ce modèle in vitro plutôt que celle d’animaux.

Procédures

Les interventions prévues pour les porcelets sont : un prélèvement de fèces, et 2 prélèvements de sang. Ces interventions nécessitent une immobilisation de l’animal qui est limitée à 5 min. La durée de la prise de sang est limitée à 2 min.

Impact sur les animaux

Quotidiennement, les porcelets seront isolés par groupe de 2 pendant 2 h, à partir de 14 jours de vie, pour accéder à leur régime. De même en post-sevrage, les porcs seront isolés individuellement pour obtenir un suivi précis de l’ingéré. L’isolement d’un groupe ou d’un porc en individuel peut être source de stress. Des prélèvements de sang (1 ou 2 selon la procédure) et de fèces (1) seront effectués sur les porcelets. Ces prélèvements ne sont pas douloureux, mais nécessitent une contention qui peut être stressante pour les porcelets.

Devenir

La mise à mort des porcelets est nécessaire lors des procédures 1 et 2, pour permettre le prélèvement d’organes (tissus intestinaux et muscles).

Remplacement

Les modèles in vitro de digestion sont limités dans leur capacité à reproduire la physiologie complexe du tractus gastro-intestinal et ses nombreuses interactions. A l’heure actuelle, aucun modèle ne permet de reproduire la sécrétion d’hormones digestives, et les mécanismes de régulations suite à l’ingestion d’un aliment. De plus ces modèles ne permettent pas d’étudier plusieurs organes en même temps en réponse à un traitement (exemple : alimentation). L’objectif du projet étant d’étudier les interactions digestives des nutriments et la réponse physiologique qui en découle, il nécessite d’être réalisé sur des animaux vivants pour explorer ces deux domaines de recherche conjointement.

Réduction

Le nombre de porcelets prévus pour ce projet est de 80 au maximum. Il correspond à 20 porcelets par régimes alimentaires (une étude pilote avec 4 porcelets par régime et 2 répétitions de 8 porcelets par régime pour l’expérimentation finale). Ce nombre d’animaux est suffisant pour observer un effet significatif sur la digestibilité des protéines entre la crème de pois et le contrôle. Le nombre d’animaux a été déterminée grâce à des essais préliminaires réalisés pour ce projet sur la digestibilité in vitro des protéines des différents régimes. Ces essais ont été réalisés suivant le modèle de digestion in vitro utilisé pour le porc en croissance

Raffinement

Le bien-être des animaux sera évalué tout au long de l’expérience. Les régimes expérimentaux (crème de pois et contrôles) seront adaptés pour couvrir les besoins nutritionnels des porcelets tout au long de leur développement (quantité, composition en minéraux, protéines…). Tous les porcelets seront surveillés quotidiennement avec des grilles d’évaluation de bien-être, afin de prévenir toute souffrance. Les grilles seront collectives pour la période précédant le sevrage et individuelle en post-sevrage. Les procédures seront réalisées par un personnel expérimenté, en respectant les durées de contentions (5 min) et de prélèvements (2 min). Le comportement des animaux sera également suivi par caméra surveillance pour veiller au bien-être des porcelets et leur alimentation.

Choix des espèces

Le projet sera mené sur des porcelets jusqu’à leur sevrage et une partie en post-sevrage. Le porc est l’espèce cible du projet qui consiste à déterminer la digestibilité de la crème de pois et d’étudier le lien avec la santé digestive et les performances musculaires des porcs sur le long terme. Les connaissances serviront pour améliorer la transition alimentaire au sevrage du porcelet et limiter les incidences de diarrhées en élevage.abba

Cinquante souriceaux âgés de deux à quatre jours vont être gavés ou piqués sous la peau pour que le personnel maîtrise le geste sur des nouveau-nés. 118 souris en tout vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour examiner leurs ganglions lymphatiques au microscope. Chaque animal reçoit trois gavages ou trois injections sous-cutanées sur trois jours consécutifs, avec une contention par la nuque, le gavage pouvant irriter à force de répétition. Le projet valide une nouvelle lignée de souris génétiquement modifiée, et le porteur justifie ses 68 autres animaux par le fait que le génotype reste inconnu à l'âge de l'administration, un quart environ formant les groupes utiles, pour une lecture qualitative de lames sans analyse statistique.

Objectifs

Les ganglions lymphatiques permettent l’initiation de la réponse immunitaire. Leur structure est formée par des cellules stromales qui forment un espace tridimensionnel dans lequel les cellules hématopoïétiques transitent et se regroupent en zones distinctes. Les cellules stromales mésenchymateuses du ganglion lymphatique organisent ainsi l’organe pour son bon fonctionnement. Des modèles de souris sont requises pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires pour la formation de ces cellules organisatrices. Dans ce projet, nous évaluerons une nouvelle souris génétiquement modifiée pour sa capacité de marquer les cellules mésenchymateuses et suivre leur différenciation.

Bénéfices attendus

Ces expériences permettront de valider le nouveau modèle de souris génétiquement modifiée et de faire avancer la recherche sur la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires. Les cellules mésenchymateuses jouent notamment un rôle clé dans la réponse immunitaire humorale impliquant des anticorps contre des maladies infectieuses, ou dans la formation des structures lymphoïdes retrouvées dans des cancers, ou des organes affectés dans des maladies autoimmunes. Ces résultats apporteront ainsi à court terme des données importantes sur la régulation et le développement du système immunitaire. Etant donné que des thérapies anti-cancer et anti-maladies autoimmunes visent le système immunitaire, ces résultats auront des retombées sur la thérapie anti-cancer et contre des maladies autoimmunes.

Procédures

Trois gavages ou 3 injections par voie sous-cutanée sont réalisés sur animal vigile sur une période de 3 jours consécutifs (duée de chaque injection ou gavage: 2-3 minutes). Le génotypage sera réalisé sur un surplus de tissu provenant de l'identification des animaux ou sur biopsie de queue réalisée post-mortem.

Impact sur les animaux

Le gavage peut être source d'irritation, du fait de la répétition du geste. Les injections répétées par voie sous-cutanée peuvent induire un certain inconfort. Ces voies d'administration nécessitent une contention au niveau de la nuque, source d’inconfort pour l’animal pendant quelques secondes.

Devenir

Euthanasie de tous les animaux à l'issue de la procédure et analyse post-mortem des ganglions lymphatiques par microscopie

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant la differenciation des cellules mésenchymateuses dans les ganglions lymphatiques ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduits de manière fiable par des expériences en culture cellulaire.

Réduction

Nous avons identifié des données dans la littérature scientifique, tels que la quantité de tamoxifène à administrer ou le moment choisi dans le développement de l’animal, permettant une meilleure réussite de l’expérience et ainsi de réduire le nombre de souris. Les moyens de l’administration (gavage oral ou injection par voie sous-cutanée) ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale. Une étude-pilote sera réalisée sur un maximum de 50 souriceaux âgés de 2-4 jours afin de maitriser les gestes techniques chez le nouveau-né, et ainsi minimiser la souffrance qui pourrait être induite lors de la manipulation. La validation de notre modèle sera ensuite réalisée avec un total de 68 animaux, en comparant l’efficacité d’excision suite à l’administration du tamoxifène par voie orale ou par injection sous-cutanée, versus des animaux contrôles qui recevront le véhicule. Ce total de 68 animaux est nécessaire dans la mesure où les produits seront administrés à 2-4 jours d’âge, où le génotype des animaux n’est pas connu. Théoriquement ¼ des animaux constitueront ainsi les cohortes expérimentales, soit environ 22-23 souris (15 animaux expérimentaux + 7-8 contrôles), effectif suffisant pour valider notre hypothèse. Cette validation est notamment basée sur une méthode d’analyse histologique qualitative, et n'implique donc pas d'analyse statistique, mais repose uniquement sur l'observation microscopique des lames.

Raffinement

Les injections sous-cutanées et les gavages sont effectués par un personnel formé et expérimenté. Les souriceaux sont rapidement retournés à la mère après injection ou gavage. Les souriceaux sont observés et surveillés dans les minutes qui suivent le gavage afin de s’assurer qu’il n’y a pas eu de fausse route. Un temps de récupération après les administrations est accordé (24h) aux animaux. Le bien-être de l’animal est évalué par un personnel expérimenté, prenant en compte l’attention accordée aux souriceaux par la mère, le lieu d’injection (sous-cutané au niveau de la nuque) et la croissance des animaux, le poids, l’apparence, le comportement, l'hydratation, la respiration et l’aspect des fèces. Lorsque qu’une anomalie est observée, l’animal bénéficie d’une prise en charge adaptée aux problèmes observés. A l’aggravation, la Structure du Bien-Être Animal est contactée et des mesures conseillées appliquées. Des points limites spécifiques ont été établis permettant de soustraire l’animal à la souffrance. Les souris seront hébergées par fratrie au sevrage tout en respectant le nombre de souris admis par cage. Si un animal devient agressif, il est aussitôt séparé du groupe. L’hébergement bénéficie d’un enrichissement des cages (matériel de nidification) et un tunnel sera utilisé lors de chaque manipulation et change.

Choix des espèces

La fonction du ganglion lymphatique et sa structuration sont identiques entre l’homme et la souris. Il existe chez la souris des moyens de suivre la différenciation des cellules par marquage génétique (lineage tracing) et d’invalider des gènes dans un type de cellules afin de pouvoir étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant la différenciation des cellules des ganglions lymphatiques à partir des cellules progénitrices. Des nouveaux-nés de 2 à 4 jours seront utilisés, en lien avec le développement du ganglion lymphatique qui commence au stade embryonnaire et se termine environ 5 à 7 jours après la naissance. Des souris adultes (8 semaines) où la différenciation des des cellules des ganglions lymphatiques est complétée, recevront également le tamoxifène et seront utilisées comme contrôles.