Oncologie

Les souris mâles de ce projet sont génétiquement modifiées pour développer un cancer du testicule dans 75 % des cas. 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le seul acte que le porteur décrit est le prélèvement de deux phalanges au maximum à sept jours, pour l'identification et le génotypage, et il annonce comme nuisances la tumeur elle-même, une gêne au déplacement quand elle se développe au niveau du scrotum, une baisse d'activité. Les animaux surnuméraires et ceux dont le génotype ne sert pas au projet sont tués, les autres le sont en fin de procédure pour le prélèvement d'organes.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’analyser la survenue et/ou la progression des cancers germino-testiculaires et la sensibilité aux traitements par chimiothérapie.

Bénéfices attendus

Le cancer du testicule (CT) est le plus fréquemment diagnostiqué chez l'homme jeune (15-35 ans). Son incidence n'a cessé d'augmenter dans les pays industrialisés depuis plusieurs décennies. L'étiologie des CT est peu connue. L'identification d'acteurs impliqués dans la prédisposition et la survenue de ces cancers permettra une meilleure compréhension des mécanismes impliqués. Ceci est d'autant plus important que 10% des malades décèdent des suites de leur cancer. L'étude de la physiologie des cellules germinales est fondamentale, puisqu'elles sont à l'origine de la majorité (95%) des CT. Des études récentes ont démontré les rôles des signalisations des xénobiotiques dans la régulation de la physiologie testiculaire et notamment celle des cellules germinales. L’objectif de ce projet est d’analyser l’implication de ces signalisations cellulaires dans la survenue et/ou la progression des cancers germino-testiculaires.

Procédures

Sur ces animaux, il y aura 1 prélèvement à 7 jours de deux phalanges maximum par souris pour la numérotation et le génotypage.

Impact sur les animaux

Seulement les animaux obtenus des croisements avec la lignée exprimant la recombinase Cre développeront des tumeurs. Les nuissances et effets indésirables attendus seront d'une part développement de la tumeur, ce qui au niveau du scrotum pourrait entrainer une gêne pour le déplacement de la souis, aussi nous abserverons les troubles au niveau de son activité (hypoactivité).

Devenir

Les animaux surnumérères et de génotypes sans intérêt pour le projet seront mis à morts. De même à la fin de la procédure, les animaux d'intérêt seront mis à morts pour les prélèvements d'organes.

Remplacement

Le remplacement par des approches alternatives n'est pas possible car aucune approche ne permettrait d'analyser les mécanismes de l'étiologie la tumorigenèse testiculaire avec une origine potentiellement au cours de la vie empbryonnaire et un développement de la patholgie et période postnatale.

Réduction

Nous réduirons au maximum le nombre de souris utilisées et présentant des attente délétère grâce à l'utilisation du système de ciblage tissulaire de l'altération génétique dans le tissus d'intérêt. Le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence l'effet des altérations génétiques dans la survenue des tumeurs germinales du testicule. Avec une incidence attendue selon la litérrature de 75%; nous utiliserons 20 animaux par groupe et par âge afin d’obtenir des résultats valides pour définir les différences entre les différents génotypes.

Raffinement

Le raffinement reposera sur la surveillance quotidienne des animaux effectuée par du personnel qualifié (expérimentateurs et personnel animalier). De plus, les animaux seront maintenus en groupes sociaux (5 au maximum) dans des cages de tailles conformes à la législation en fonction du nombre de souris, avec un enrichissement (tunnel en carton et maisons à souris) des cages. De plus, nous avons défini un arbre décisionnel (annexe) avec des critères adaptés d'arrêt de l'expérimentation en cas de souffrance de l'animal. Si un animal devait présenter des signes de douleur, l’animal sera isolé et un analgésique sera administré à des intervalles qui seront définis avec le vétérinaire référent.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris mâles modifiés génétiquement et qui développent dans 75% des cas un cancer germino- testiculaire. il s'agit d'un des rares modèles permettant de développer ce type de pathologie avec un incidence suffisante pour réaliser des études moléculaires et physiologiques donnant des résultats fiables.

Toutes tuées pour le prélèvement de leurs tissus, 768 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 240 d'entre elles reçoivent de trois jours à quatre semaines un régime enrichi en graisses destiné à les faire grossir, 160 subissent deux prélèvements sanguins à la mâchoire, d'autres passent vingt-quatre heures à jeun avant un test de réalimentation. La mesure des paramètres métaboliques impose d'isoler des souris pendant quatre semaines, un enfermement que le porteur range parmi les sources d'inconfort. Sur le remplacement, il affirme avoir déjà obtenu la preuve de concept in vitro et écrit avoir "maintenant besoin de la souris", la régulation de l'énergie mobilisant selon lui plusieurs organes à la fois.

Objectifs

L'homéostasie énergétique se définit comme l'équilibre entre les entrées et les dépenses énergétiques. Les dépenses résultent principalement du métabolisme basal et de l’activité physique, tandis que les apports trouvent leur origine dans l’alimentation. Quand cet équilibre est rompu, le terrain est favorable à l’installation de maladies métaboliques telles que l’anorexie ou l’obésité. Récemment, nous avons mis en évidence le rôle neuronal d'une protéine dans la régulation de la balance énergétique. Nous avons récemment observé, chez la souris, qu'en invalidant cette protéine dans les cellules microgliales (cellules immunitaires du cerveau impliquées dans la neuroinflammation) les animaux soumis à un régime riche en graisse présentent une prise alimentaire et une prise de poids réduites. Or, ce régime alimentaire est bien connu pour induire une inflammation de bas grade qui contribue à l'obésité, établissant ainsi un lien entre notre protéine d'intérêt dans les cellules microgliales et l'obésité induite par un régime gras. Cependant ces observations ont été réalisées aprés plusieurs semaines de régime gras. Dans ce projet, nous voulons déterminer les mécanismes moléculaires précoces de la neuroinflammation induite par un régime gras conduisant à l'obésité.

Bénéfices attendus

Au cours de la dernière décennie, l'humanité a été confrontée à une épidémie d'obésité et de diabète de type 2 (DT2) en rapide augmentation. Le nombre de sujets touchés continue d'augmenter dans les économies de marché établies. Plus important encore, la propagation de l'épidémie est encore plus spectaculaire dans les économies émergentes et en développement très peuplées. Le mode de vie sédentaire et la suralimentation, caractéristiques de notre société moderne, expliquent cette propagation épidémique de la maladie. Une approche simple consisterait donc à adapter les habitudes personnelles en conséquence. Malheureusement, cette approche ne fonctionne que pour un petit sous-ensemble de la population, car elle exige une maîtrise de soi très forte et n'est pas suffisante lorsque le diabète à part entière est déjà apparent. Si d'énormes efforts de recherche ont été déployés pour élucider et cibler les mécanismes responsables de l'obésité et du DT2, le tableau est encore loin d'être complet. Par conséquent, de nouvelles perspectives de recherche menant à des approches thérapeutiques sont fortement demandées pour prévenir les énormes coûts de santé et les conséquences négatives du mode de vie moderne. Cette étude servira à identifier les mécanismes moléculaires qui font le lien entre la suralimentation et la mise en place de l'obésité et, par conséquent, le développement du DT2. L'identification de ces mécanismes permettra de savoir si notre protéine d'intérêt constitue une cible thérapeutique pour prévenir le développement de l'obésité. En effet, les médicaments réduisant l'obésité sont particulièrement intéressants pour l'industrie pharmaceutique, notamment en combinaison avec des médicaments qui agissent pour restaurer la fonction des cellules sécretrices d'insuline. Ainsi, notre approche jettera les bases de nouvelles perspectives thérapeutiques pour les patients atteints de DT2.

Procédures

Des prélèvement sanguins seront réalisés sur 160 animaux vigiles. Ces animaux subiront un prélèvement temporo-mandibulaire (1min) à l'age de 9 semaines et un autre à l'âge de 15 semaines avant euthanasie. Au cours du test de tolérance au glucose, des gouttes de sang seront prélevées (6x10 secondes). 240 souris seront soumises à un régime enrichi en gras pendant 3 jours, 1 semaine ou 4 semaines, qui entrainera une prise de poids.

Impact sur les animaux

Le test de réalimentation après un jeûne prolongé nécéssite une mise à jeun des souris pendant 24H. Une diète riche en gras pour créer une environement obésogène sera mise en place chez les souris, ce qui peut créer un inconfort chez les souris. Pour les expériences nécessitant la mesure de la prise alimentaire, les souris seront individualisées dans les cages. La tolérance au glucose nécessite l'injection d'un bolus de glucose qui peut entrainer un inconfort chez la souris. La détermination des paramètres métaboliques par calorimétrie indirecte nécessitent d'isoler les souris pendant 4 semaines.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leurs tissus seront prélevés pour des études histologiques ou moléculaires

Remplacement

Toutes nos données in vitro convergent vers une fonction de notre gène d'intétêt dans la neuroinflammation induite par l'obésité. Nous avons apporté la preuve de concept in vitro que notre approche expérimentale fonctionne. Pour tester nos hypothèses, nous avons maintenant besoin de la souris. En effet, la régulation de l'homéostasie énergétique nécessite la participation de plusieurs organes interdépendants (foie, îlots de Langerhans dans le pancréas, muscles, tissus adipeux, cerveau). Ces mécanismes de régulation ne sont présents que dans des organismes complexes tels que la souris.

Réduction

Nous utiliserons un total de 768 animaux. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Par ailleurs, toujours par souci de réduction, plusieurs procédures expérimentales (avec un temps de récupération adaptée pour les animaux) seront réalisées chez les mêmes cohortes de souris. L'invalidation du gène n'est pas fiable à 100%, pour cette raison, le nombre d'animaux a été déterminé en prennant en compte cette difficulté. Afin d’analyser les paramètres évalués (poids des souris, nourriture consommée) nous déterminerons les tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages avec un enrichissement essentiel pour leur bien-être (Coton + Carton). La litière des animaux est remplacée une fois par semaine. Le stress lié aux procédures nécessitant L'isolement des animaux sera diminué par l'usage de cages transparentes rendant leurs congénères visibles. L'habituation des souris à l'opérateur aura systématiquement lieu quelques jours avant l'expérience par du personnel qualifié afin d’éviter le stress lié à la manipulation des animaux. Un tube sera disposé dans la cage pour déplacer les animaux en limitant le stress dû à la préhension. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié pour prendre les mesures appropriées en cas d'apparition de signes d'inconfort ou de douleur après avis vétérinaire. Des points limites seront déterminés pour éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

Pour étudier le métabolisme, la souris est le modèle animal de référence. L’utilisation des souris se justifie également par l’existence de lignées génétiquement modifées dans lesquelles le gène pour notre protéine d'intérêt est invalidé. Les animaux seront injectés avec du tamoxifène à l'age de 5 semaines, stade auquel toutes les structures cérébrales sont pleinement développées. Les animaux seront nourris avec de la nourriture riche en gras dès l'âge de 9 semaines afin de favoriser une prise de poids optimale

Trois à cinq injections d'antigène, des séries de cinq jours d'instillations nasales, des gavages répétés puis jusqu'à quatre prélèvements sanguins à la mâchoire : 750 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par ponction cardiaque terminale. L'objet est la production d'anticorps polyclonaux destinés à des activités de recherche ou de diagnostic, un consommable de laboratoire fabriqué dans le corps de ces souris. Le porteur indique que l'inoculation peut provoquer une hyperthermie, une forte inflammation locale, une ulcération ou une nécrose au point d'injection. Il qualifie pourtant ces mêmes gestes de douleur "légère de courte durée".

Objectifs

Produire sur des souris de très bons anticorps polyclonaux spécifiques avec une haute affinité dirigée contre des protéines d'intérêt, pour des activités de recherche ou de diagnostic pour lesquels ils n’existent pas des alternatives accessibles. Éventuellement : Utiliser les cellules B pour préparer des hybridomes et/ou extraire les séquences des portions variables des chaines légères et lourdes des anticorps.

Bénéfices attendus

De nombreuses analyses de diagnostic ou de recherche nécessitent de détecter, de visualiser ou de quantifier une protéine dans un échantillon biologique. La plupart d'entre elles reposent sur l'utilisation d'anticorps qui reconnaissent spécifiquement la protéine d'intérêt. Ces anticorps sont produits en immunisant un animal contre la protéine.

Procédures

- 3 à 5 iInjections sous-cutanées, intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale ou espacées de 14 à 21 jours sur animaux vigiles : quelques secondes - 3 à 5 series de 5 jours d’iInstillations intranasales (20ul) sur animaux anesthésiés espacées de 14 à 21 jours : 6 à 10 min - Gavage avec sonde gastrique sur vigiles : jusqu’à 3 séries de 5 jours consécutives espacées de 21 jours: quelques secondes - Prélèvement sanguin (retro mandibulaire) sur souris vigiles (100ul, J-7, J24, J45 ou 48 et éventuellement J66 et J87: quelques secondes - Prélèvement sanguin (cœur) sur souris anesthésiés (acte terminal) animaux : quelques minutes

Impact sur les animaux

Il se peut que l'inoculation d'une protéine (ou l'adjuvant utilisé) induise une réaction inhabituelle plus générale (hyperthermie) ou intense (forte inflammation locale, ulcération, nécrose). Pour cette raison, l'état général des animaux et les points d'injection seront surveillés pendant les 48h premières heures, puis régulièrement. Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention. Pour ce geste les animaux sont susceptibles d’éprouver une douleur légère de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour un prélèvement sanguin terminal afin de répondre à l’objectif scientifique.

Remplacement

La production d'anticorps polyclonaux de forte affinité dirigés contre un antigène résulte de la stimulation de différentes populations leucocytaires qui ne peut être reproduite de façon satisfaisante et efficace in vitro. L’initiation de la réponse immunitaire dans les souris naïves est unique pour chaque antigène et possible grâce à l’expression d’une grande diversité d’anticorps par les cellules B in vivo. Cette diversité est assurée par la recombinaison de différents segments de gènes qui ensemble composent les anticorps (germline répertoire). Au début d’une immunisation, certaines de ces anticorps (cellules B) vont se lier à l’antigène avec une affinité souvent très faible, mais suffisante pour initier une réaction immunitaire. Lors de cette réactions les cellules B reconnaissant de l’antigène vont se multiplier et commencer à secréter des anticorps. Au fur et à mesure de l’immunisation et des boosts, les cellules B accumulent des mutations aléatoires dans les gènes codant pour les anticorps, permettant ainsi d’augmenter (ou diminuer) de manière significative l’affinité des anticorps produits. Ce processus nécessite des interactions des plusieurs types cellulaires dans des tissues immunitaires et ne peuvent pas être reproduits in vitro ni prédit de manières satisfaisant par des méthodes in silico.

Réduction

Dans la très grande majorité des cas, un lot de 5 animaux sera suffisant pour obtenir la quantité d'anticorps nécessaire pour les travaux scientifiques. Dans certains cas (échec de l'immunisation ou besoin de très grandes quantités d'anticorps), il peut être nécessaire de répéter l’immunisation 2 ou 3 fois. Nous estimons que le nombre de demandes de production d'anticorps polyclonaux portera sur un total d'environ 30 antigènes et donc 150 animaux par an.

Raffinement

Il se peut que l'inoculation d'une protéine (ou l'adjuvant utilisé) induise une réaction inhabituelle plus générale (hyperthermie) ou intense (forte inflammation locale, ulcération, nécrose). Pour cette raison, l'état général des animaux et les points d'injection seront surveillés pendant les 48h premières heures, puis régulièrement. Le protocole d'immunisation sera interrompu si des signes généraux sont observés. Les soins adéquats seront apportés à l'animal (anti-inflammatoires, antibiotiques, soins locaux…). L’animal sera mis à mort si aggravation des signes cliniques malgré le traitement. Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention, une préparation aseptique et une anesthésie locale et une réhydratation sous-cutanée. Le prélèvement terminal (grand volume) sera réalisé sous anesthésie générale.

Choix des espèces

L’espèce utilisée est la souris de laboratoire. Le recours à des lignées consanguines de souris permet de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental. Les souris de laboratoire restent des modèles dont la pertinence biologique et biomédicale est établie. De plus, l’utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées permettra d’évaluer plus précisément les mécanismes moléculaires et cellulaires de la pathologie humaine. L’ensemble des animaux expérimentaux seront utilisés au stade « jeune adulte » : entre 6 et 12 semaines au début de l’expérience, âge à partir duquel le système immunitaire est mature et ne subit plus de changements majeurs.

Injectées de cellules leucémiques puis maintenues en boîte de contention pour recevoir jusqu'à trois injections de lymphocytes modifiés, 120 souris immunodéficientes subissent aussi trois prises de sang dans la joue et une ponction de moelle osseuse dans le fémur. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à l'issue. Les souris témoins, laissées sans traitement, développent la leucémie jusqu'à la restriction des mouvements des pattes arrière, la perte d'appétit et la perte de poids. Le porteur écrit avoir déjà démontré en culture que ces cellules tuent les cellules tumorales, et juge pourtant l'étape chez la souris "indispensable et incontournable" avant tout usage clinique.

Objectifs

L’objectif de cette étude est d’étudier différents modes d’administration de cellules qui ont été génétiquement modifiée dans le but de reconnaître puis d'éliminer des cellules cancéreuses (lymphocyte T modifié, CAR-T) afin d’étudier la réponse immunitaire dirigée contre la leucémie dans un modèle murin. La thérapie par cellules CAR-T consiste en la greffe autologue de lymphocytes T préalablement modifiés par thérapie génique pour leur faire exprimer un récepteur dirigé contre une protéine tumorale et permettre son élimination. Cependant, la réponse dirigée contre la tumeur provoque le relarguage massif de certaines molécules pouvant donner lieu à des complications plus grave jusqu’à la mort du patient. De plus, suite à leur activation, les cellules administrées meurent, ce qui nous emmene à une autre problématique : la persistance de ces cellules CAR-T in vivo. Enfin à cause de la pression thérapeutique, les cellules tumorales peuvent perdre l'expression de la cible du CAR-T conduisant aux rechutes des patients traités. Ainsi, le développement de nouveaux modèles d’administration est donc un enjeu majeur pour inhiber ces réponses et permettre le succès thérapeutique sur le long terme. Dans ce projet, nous allons utiliser de 2 types de cellules CAR-T en comparant la méthode d’administration standard telle qu'elle est utilisée à ce jour en clinique à une injection de manière séquentielle (fractionnée). Ainsi, la même dose sera administrée soit en une seule injection soit en deux injections. L’objectif principal sera d’évaluer la tolérance de la dose fractionnée ainsi que l'effet antileucémique comparativement à la dose unique. Secondairement, nous évaluerons la persistance des cellules CAR-T in vivo.

Bénéfices attendus

Cette approche devrait nous permettre d’évaluer dans un modèle murin l’intérêt d’une telle stratégie d’injection chez l’homme afin d’améliorer la sécurité du traitement et d’optimiser l’injection des cellules CAR-T afin d’en améliorer l’efficacité thérapeutique.

Procédures

Injection en intra-veineuse sur souris vigile maintenue en boite de contention, 1 injection de cellules à J0 puis 1 ou 2 autres (J10 et J17 selon les groupes de souris), moins de 10 secondes par injection. Des prélevements sanguins seront réalisés en submandibulaire sur souris anesthésiée avec un volume n’excédant pas 75 µl tous les 10 jours et un maximum de 3 prélèvements au total par souris, durée de prélèvement moins de 5 secondes. 1 prélèvement de moelle osseuse sur souris anesthésiée, moins de 10 secondes par prélèvement. Suivi par utilistion d'un bioimageur du développement des tumeurs sur souris anesthésiée. Prélèvements de sang et de moelle sur souris après le mise à mort.

Impact sur les animaux

Les souris contrôles vont développer la leucémie et l'avancée de la maladie va conduire à une restriction des mouvements des souris notamment des pattes arrières, une perte d'appétit et de poids. Une réaction de greffon contre l'hote plusieurs semaines après l'injection des CAR-T peut également se produire chez les souris, faisant partie des points limites de la procédure expérimentale.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de la procédure expérimentale.

Remplacement

Nous avons déjà étudier le phénotype et la fonctionnalité des CAR-T cells in vitro en démontrant leur capacité à tuer les cellules tumorales. Cette validation in vitro nous a permis de démontrer la qualité et l'efficacité des cellules CAR-T à court terme. Pour nous rapprocher des conditions physiologiques chez le patient, une étude de l'efficacité des CAR-T à long terme dans un modèle in vivo reste cependant indispensable et incontournable avant leur utilisation en thérapeutique clinique.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit au minimum grâce à l’expérience acquise d’autres protocoles expérimentaux dans lesquels la réponse antitumorale des CAR-T cells chez des souris greffées de cellules leucémiques a été évaluée. Le nombre minimum de souris utilisées prend en compte les variabilités des mesures par bioluminescence du signal tumoral chez les souris (pouvant varier selon l’âge, le sexe, le délai de prise de greffe tumorale) et des réponses immunologiques observées durant ces protocoles. Les résultats obtenus seront analysés statistiquement.

Raffinement

L'ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, statut SPF, où les conditions d’hébergement sont contrôlées quotidiennement : température (23°C), hygrométrie (50%), cycle jour/nuit (12/12), change et nourriture. Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec un abri de cellulose et des fibres de coton. Des points limites ont été mis en place et dans l'éventualité où un ou plusieurs animaux atteindraient le point limite, ils seront mis à mort. Pour les animaux présentant des difficultés de locomotion, la nourriture et l’eau seront apportés directement dans la cage sous forme de gel. L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Toutes les interventions sur les souris seront réalisées sous hotte à flux laminaire pour éviter tout risque d'infection. Afin de répondre au principe de raffinement les prélèvements de sang seront effectués en sub-mandibulaire sous anesthésie générale. Les volumes de sang prélevés aux différentes étapes seront limités à 2 gouttes. Une analgésie par injection en sous-cutané (au niveau du genou) d'un analgésique sera mis en place 5 minutes avant le prélèvement de la moelle osseuse pour renforcer l’analgésie locale. Un maximum de 2 prélèvements par souris sera autorisé (1 prélèvement par fémur). En cas de douleur des souris (évaluation physique et comportementale) un anti douleur adapté sera injecté en sous-cutané, toutes les 6 à 12 heures durant 24 à 48 heures.

Choix des espèces

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des populations lymphocytaires et le suivi des réponses immunitaires. L’utilisation d’animaux immunodéprimés nous permet de n’observer que les effets des cellules CAR-T sur la leucémie. Les mécanismes immunologiques observé dépendront donc des cellules injectées et non des cellules murines. Les animaux seront âgés entre 8 et 12 semaines (adultes) au début des protocoles, car il faut que le système immunitaire soit totalement mature. Le poids des souris varient entre 20 et 30g.

1 200 truites, chabots et ombres communs capturés en rivière vont être marqués dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis remis à l'eau vivants. Chaque poisson est anesthésié, mesuré, pesé, puis ouvert par une incision ventrale pour l'implantation manuelle d'un transpondeur, l'ensemble se déroulant hors de l'eau pendant trente secondes à une minute. Le porteur annonce moins de 1 % de mortalité après l'opération, mais table aussi sur une perte du marqueur chez 5 à 10 % des salmonidés et jusqu'à 20 % des femelles au moment de la fraie, ce qui gonfle l'effectif capturé. Il affirme qu'aucune méthode de remplacement n'existe pour évaluer si les poissons franchissent une passe aménagée, et la version modifiée du projet porte l'effectif à 1 500 individus.

Objectifs

L’objectif principal est d’évaluer, grâce à la technologie RFID (Radio Frequency Identification) la franchissabilité des ouvrages et des aménagements réalisés pour rétablir la continuité écologique dans un cours d'eau salmonicole. Dans cette rivière, de nombreuses actions de restauration de la continuité écologique ont été réalisées sur un secteur long de 6.7 km, sur lequel 8 seuils ont être arrasés ou modifiés pour faciliter la mobilité piscicole mais aussi sédimentaire. En 2022, le dernier des seuils de ce secteur a été aménagé pour permettre aux poissons de franchir un obstacle considéré jusqu’ici comme infranchissable (création d’une rivière de contournement). Dans la suite des efforts réalisés par le syndicat gestionnaire pour améliorer la continuité écologique sur ce secteur dit « renaturé », une étude écologique pluriannuelle, par la technologie RIFD devra confirmer que la mobilité piscicole et sédimentaire y est à nouveau assurée. Cette étude devrait aussi permettre d’identifier les zones de déplacements des poissons en tenant compte des contraintes physiques et morphologiques du milieu (thermie, disponibilité en habitat).

Bénéfices attendus

Les projets permettront de mettre en lumière la « transparence » des ouvrages à la migration des espèces cibles, c’est à dire l’absence de sélectivité et de retard à la migration. Dans le cas de blocage avéré des individus, des aménagements seront envisagés pour restaurer la continuité écologique et permettre à ces espèces de rejoindre des habitats piscicoles de qualité, notamment pour la reproduction.

Procédures

Après anesthésie générale, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale sera réalisée et un transpondeur PIT tag sera implanté manuellement sur 1'200 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau. MODIFICATION du 30/04/2024 : 1'500 poissons.

Impact sur les animaux

La capture, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux. Des précautions seront prises à chaque étape pour limiter le stress et la douleur des animaux. La cicatrisation après implantation des PIT tags est généralement très bonne, tant sur des lots conservés en pisciculture qu'en milieu naturel.

Devenir

Tous les individus capturés puis marqués seront remis à l’eau vivants pour l'étude de leur comportement in situ.

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement des passes à poissons doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire des espèces considérées, dans le cas présent la truite de rivière et le chabot. Il est nécessaire de capturer des animaux sauvages en rivière, de les marquer individuellement et de les relâcher vivants à l’aval des ouvrages étudiés. Ensuite, les déplacements sont évalués en utilisant des dispositifs de détection fixes et mobiles.

Réduction

Le projet est prévu sur une durée de 3 ans, avec captures et marquages les deux premières années (maximum 5 ans si reports des marquages en cas de conditions environnementales défavorables). Les effectifs prévus par espèce sont un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire des « patterns » comportementaux, et évaluer in fine la franchissabilité et la sélectivité de l'ouvrage. Ils ont été adaptés au gabarit du cours d’eau et à la densité de population en place. Chez la truite, il peut être attendu un taux de montaison de 10 à 30%, taux moyen constaté dans les différentes études réalisées. Cet effectif théorique attendu doit être nuancé par plusieurs facteurs : - L’implantation des PIT tags ne génère en principe pas (ou très peu,

Raffinement

Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Le maintien des conditions thermiques et d’oxygénation optimales sera assuré. Les animaux capturés seront soit stockés dans un vivier placé dans la rivière, soit dans un bac de 50L oxygéné et refroidi. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. Le bac d'anesthésie sera renouvelé toutes les 20 minutes en moyennes ou plus souvent si le temps d’anesthésie augmente, ceci pour éviter que la température ne varie de plus de 2°C et soit toujours 80mm ; 23 mm au-dessus. Un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés en bon état sanitaire (absence de blessure, de parasites, d’infections visibles) seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision (pommade recommandée et fournie par E. Meunier, vétérinaire référent).

Choix des espèces

L’espèce cible principale est la truite commune (Salmo trutta). Cette espèce caractéristique de la rivière étudiée et à fort enjeu halieutique est la plus susceptible de migrer sur des longues distances notamment en période de pré-reproduction, et donc d'être le plus fortement impactée par les obstacles à la migration. En complément, une petite espèce d’accompagnement de la truite, le chabot (Cottus gobio), sera également intégrée dans le suivi en raison de son abondance sur certains secteurs et de sa faible capacité de nage. Pour les truites, seuls les individus d’un an et plus dont la longueur totale excédera 120 mm seront marqués à l’aide de PIT tags 23 mm. Pour les chabots, les stades sub-adultes et adultes seront visés, avec une longueur minimale de 80 mm. Ces individus seront marqués par PIT tag de 13 mm. Ces tailles minimales assurent un ratio « poids du l’émetteur / poids du poisson » inférieur à 2%, ce qui est en adéquation avec les préconisations tirées de la littérature scientifique. Les individus plus petits que les tailles minimales indiquées seront relâchés sans être marqués, après une phase de réveil dans un vivier placé dans la rivière. MODIFICATION du 30/04/2024 : l’ombre commun a été ajouté en tant qu’espèce protégée présente sur le secteur d'étude et fortement impactée par la fragmentation des cours d’eau. Les ombres de plus de 180 mm seront marqués.

1 515 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir jusqu'à vingt échographies abdominales sous anesthésie de quinze minutes et dix prélèvements de sang, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des vecteurs viraux sont injectés avant la naissance ou sur des souriceaux de deux, cinq et quinze jours, pour déclencher un cancer du foie de l'enfant, d'autres animaux recevant une greffe de fragment tumoral au cours d'une chirurgie abdominale. Le porteur signale que l'usage d'animaux à des âges aussi précoces peut conduire la mère à les abandonner, voire à les manger. Toutes sont tuées à l'issue, pour une maladie qui touche vingt enfants par an en France et dont quatre sur cinq guérissent avec les traitements actuels.

Objectifs

L’hépatoblastome (HB) est le cancer du foie le plus fréquent chez l’enfant. La survie globale à 5 ans actuellement est de 80 pour cent. Le traitement associe de la chimiothérapie à base de Cisplatine à une résection chirurgicale de la tumeur. Mais 20 pour cent des enfants traités vont développer une résistance au Cisplatine au cours de la chimiothérapie néoadjuvante ou au cours de la récidive de la maladie. Il existe actuellement peu d’alternatives thérapeutiques, avec des données insuffisantes sur les alternatives proposées. Il est donc crucial de pouvoir tester de nouvelles associations de traitement ou de nouveaux traitements. Les modèles pré-cliniques d’hépatoblastome qui existent aujourd’hui sont réalisés sur des souris nude, souris immunodéprimées, chez qui un fragment d’HB humain, ou des suspensions cellulaires issues de culture cellulaires d’HB sont implantés en sous cutané ou en situation orthotopique, c’est-à-dire directement dans le foie. Cependant le système immunitaire a un rôle primordial dans la réponse anti-tumorale. Il est donc très important de développer des modèles syngéniques d’hépatoblastomes chez la souris immunocompétente afin de pouvoir, une fois le modèle établi, étudier l’effet de nouveaux traitements et également étudier la réponse immunitaire impliquée dans la réponse anti-tumorale. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Notre équipe s’intéresse à deux grands types de tumeurs malignes du foie : les carcinomes hépatocellulaires (CHC) principalement développés chez l’adulte et les hépatoblastomes (HB) qui se développent chez l’enfant de moins de 5 ans. L’HB est une maladie rare mais c’est le cancer du foie le plus fréquent chez l’enfant. L'incidence est de 1 à 1,5 /1000000 d'enfant de moins de 15 ans, et cette incidence est en cours d'augmentation. Il touche 20 enfants par an en France. Dans le cas des HB, bien que la majorité des patients répondent aux traitements conventionnels, environ 20 pour cent sont réfractaires et décèdent. Les modèles de xénogreffes de lignées tumorales ou de greffes orthotopiques de tumeurs dérivées de pièces opératoires de patients représentent les modèles précliniques les plus pertinents actuellement pour étudier la réponse thérapeutique. Mais ces modèles sont développés chez des souris immunodéficientes et ne permettent pas d’étudier le rôle du système immunitaire. Cette étude nous permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu, et notamment les mécanismes immunitaires, et de tester de nouvelles approches thérapeutiques pouvant être bénéfiques aux patients réfractaires aux traitements habituels.

Procédures

Les animaux pourront être soumis, selon les cas, à l’un des gestes suivants : 1) une chirurgie abdominale ou lombaire pour injection dans le foie ou la rate (une seule fois, animal anesthésié et analgésié, 15min maximum) (réalisé dans l'établissement utilisateur 1 (EU1), 2) injection percutanée (animal vigile, 1 fois maximum, 15sec) (EU1), ou 3) une chirurgie abdominale pour greffe d’un fragment tumoral dans le foie (une seule fois, animal anesthésié et analgésié, 15min maximum) (EU1). L’ensemble des animaux seront amenés à avoir : des prélèvements de sang de faible volume (animal anesthésié, 10 fois maximum avec une intervalle d’une semaine minimum entre chaque, 1min) ; un suivi par échographie abdominale (animal anesthésié, 20 fois maximum, 15 min) (EU1) ; pour certains un transport dans un autre établissement afin d’effectuer une imagerie non invasive par IRM (animal anesthésié, 2 fois, 30 min) (réalisé dans l'établissement utilisateur 2 (EU2)). En fin de période de maintien les animaux seront anesthésiés, un dernier prélèvement sanguin (1 min) sera réalisé et ils seront immédiatement euthanasié par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les nuisances prévues sont principalement celles engendrées par les procédures chirurgicales réalisées, qui peuvent engendrer une douleur au niveau de l’incision au réveil de l’animal et avoir une incidence sur l‘état général de santé de l‘animal (perte d‘appétit, baisse de l‘activité, infection de la cicatrice, détresse de l’animal dans les cas les plus grave), ainsi qu’entrainer une légère gêne dans la locomotion. Un risque anesthésique est également à prendre compte (détresse respiratoire, réveil intempestif). L’utilisation d’animaux à des âges précoces peut engendrer un abandon de la part de la mère, voir du cannibalisme dans le cas des nouveau-nés. Un stress de l’animal peut aussi être constaté lors des contentions, ainsi qu’un inconfort lors des injections. Le développement des tumeurs hépatiques est généralement asymptomatique et n’entraîne donc pas de nuisances en soit, car les animaux seront euthanasiés avant que les tumeurs entrainent une dégradation de l’état général des animaux. Une imagerie non invasive (IRM) sera réalisée dans un autre établissement utilisateur, ce qui nécessite un transport des animaux qui peut entraîner une nuisance. Une imagerie non invasive (IRM) sera réalisée dans un autre établissement utilisateur, ce qui nécessite un transport des animaux qui peut entraîner une nuisance du fait du stress lié à la néophobie des rongeurs. Un risque anesthésique est également à prendre compte car l'IRM est effectuée sous anesthésie générale (détresse respiratoire, risque d'hypothermie, réveil intempestif).

Devenir

Le prélèvement des tissus d’intérêt étant nécessaire pour la réalisation de nos analyses, l’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin des procédures grâce à une méthode réglementaire, et dans le respect des bonnes pratiques.

Remplacement

Les modèles in vitro ne miment que partiellement la pathologie humaine car ils ne permettent pas de modéliser certains paramètres biologiques pouvant influencer le développement tumoral ou la réponse thérapeutique, tels que les interactions des cellules tumorales avec leur environnement ou encore l'hétérogénéité intra-tumorale. Il est donc essentiel de disposer de modèles in vivo reproduisant le plus fidèlement possible les caractéristiques de la pathologie humaine. Le recours à des modèles animaux est donc indispensable pour mieux comprendre l'histoire naturelle de la maladie et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Les effectifs ont été réduits au maximum et les groupes seront composés de 8 à 12 animaux. Cet effectif a été déterminé grâce à un calcul de puissance, afin d’utiliser le moins d’animaux possibles tout en permettant d’obtenir des résultats suffisamment robustes, et les expériences pourront être réitérées jusqu’à 3 fois si nécessaire. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Afin de limiter au maximum les éventuelles variations entre les expériences, les paramètres d’hébergement et de soin des animaux seront contrôlés. Le suivi tumoral hépatique sera réalisé grâce à une méthode non invasive, l’imagerie par échographie et par IRM, ce qui diminue également le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total d'animaux utilisés sur la totalité du projet s'élève à 1515.

Raffinement

Les paramètres d'hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur. Les cages seront enrichies avec du coton de nidification, des maisonettes en plastique ainsi que des batônnets à ronger. Les femelles gestantes seront regroupées à 2 par cages afin d’éviter leur isolement, et ne seront séparées qu’après avoir mis bas afin d’éviter la surpopulation au sein d’une même cage. Les animaux issus d’établissement fournisseur observeront une durée d’acclimatation de 7 jours minimum avant toute utilisation. Un change sera réalisé par le personnel de l’animalerie une fois par semaine (sauf indication contraire) et une surveillance quotidienne rigoureuse des animaux sera réalisée tout au long de leur vie. Des pesées seront également réalisées à intervalles réguliers et une grille de suivi est utilisée. Les procédures seront raffinées afin de limiter au maximum la douleur et l’inconfort des animaux (personnel formé et compétent, anesthésie et analgésie adéquate suite aux procédures chirurgicales puis surveillance rapprochée des animaux avec étiquetage spécifique des cages concernées), et des points limites précis seront établis. Si un animal présente des signes de douleur ou de détresse, il sera immédiatement euthanasié par une méthode réglementaire afin d’éviter toute souffrance animale. La Structure chargée du Bien-Etre Animal et/ou le vétérinaire pourront être sollicités pour conseil si besoin. Les transposrts des animaux entre l'EU1 et l'EU2 est assuré par un transporteur agréé, dans des boîtes de transport appropriées, ventilées, sécurisées et suffisament spacieuses. Un apport en nourriture et en eau gélifiée sera fourni durant le transport. Le temps de transport est de moins de 20 minutes entre les 2 EU.

Choix des espèces

La souris est un modèle expérimental de choix pour l'étude des pathologies humaines car c'est un petit mammifère qui se reproduit rapidement, est facile à manipuler, et dont nous avons une bonne connaissance du comportement et de la génétique. De plus, le génome de la souris est identique à plus de 95 pour cent à celui du génome humain, ce qui suggère une bonne homologie des mécanismes observés. On peut également facilement apprécier les modifications physiques et/ou comportementales traduisant une souffrance et/ou douleur, ce qui conduirait à l’euthanasie de l’animal. De nombreux outils moléculaires sont également disponibles chez ce modèle animal. La première procédure sera réalisée sur des femelles gestantes âgées de 2 à 3 mois, ce qui correspond à l’âge adulte et également à l’âge optimal permettant le bon déroulement de la gestation d’une part, et une bonne récupération de l’acte chirurgical d’autre part. Les vecteurs viraux seront injectés à différents âges (prénatal, 2, 5 et 15 jours de vie post natal), présentant un foie encore immature et en prolifération, afin de développer un hépatoblastome.

Toutes tuées en fin de procédure pour des analyses post-mortem, 205 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales, puis pour certaines des injections deux fois par semaine pendant quatre semaines, toujours sur animal vigile. Un second groupe est irradié trois minutes sous contention avant de recevoir des cellules par voie intraveineuse, puis des cellules tumorales six semaines plus tard et deux prises de sang. Le porteur reconnaît que l'irradiation peut dégrader l'état général des animaux et que des nécroses peuvent apparaître sur les tumeurs, et conclut que le recours aux souris reste "indispensable" malgré les méthodes alternatives auxquelles son laboratoire a eu recours.

Objectifs

Notre système immunitaire est capable de détecter la présence d’un élément étranger dans notre organisme et de déclencher une réponse immunitaire efficace afin d’éliminer ce pathogène. La réponse immunitaire résulte de l’action combinée des cellules de l’immunité innée comme les cellules dendritiques dont la mission est de patrouiller dans l’organisme à la recherche de cellules infectées ou tumorales, et des cellules de l’immunité adaptative comme les lymphocytes B et T qui reconnaissent de manière spécifique les pathogènes. Le contrôle de la réponse immunitaire est un mécanisme très important pour empêcher par exemple une suractivation des lymphocytes pouvant aboutir à la destruction des cellules saines de l’organisme. Pour cela, les lymphocytes sont équipés de récepteurs dits de contrôle (checkpoint). L’engagement de ces récepteurs avec leurs ligands (molécule qui se lie de manière réversible à son récepteur) régule la durée et l’intensité de l’activation lymphocytaire. Mais ce mécanisme peut être détourné par les cellules tumorales qui en exprimant les ligands des récepteurs checkpoint freinent le système immunitaire au lieu de l’activer. Les médicaments anti-checkpoints sont déjà utilisés en clinique contre plusieurs types de cancers. Cependant ces traitements dit « d’immunothérapie » ne sont pas efficaces chez tous les patients et uniquement pour certains cas de cancers. Comprendre la raison d’une telle variation est un défi important pour la communauté scientifique. Tout comme l’identification de molécules avec lesquelles les inhibiteurs de checkpoint pourraient être combinés pour augmenter leur efficacité. Parmi celles-ci, les kinases sont une cible particulièrement intéressante. Ce sont des protéines dont le rôle principal est d'ajouter un petit groupe chimique appelé phosphate à d'autres protéines, ce qui peut les activer ou les désactiver. Dans le contexte du cancer, certaines kinases peuvent être hyperactives, contribuant ainsi à la croissance incontrôlée des cellules cancéreuses. En ciblant spécifiquement ces kinases avec des médicaments inhibiteurs, les chercheurs espèrent ralentir ou arrêter la croissance des cellules cancéreuses. Plus de 30 de ces médicaments sont déjà utilisés, et d'autres sont en cours d’essai clinique. Le but de ce projet est d’explorer si notre protéine kinase d’intérêt peut améliorer les mécanismes de défense anti-tumeurs des lymphocytes en combinaison avec des traitements anti-checkpoints.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de définir si notre protéine kinase d’intérêt joue un rôle dans la réponse des lymphocytes T contre les tumeurs solides et pourrait améliorer la réponse aux traitements d’immunothérapie. Si tel était le cas, elle pourrait être considérée comme une nouvelle cible thérapeutique dans le traitement du cancer.

Procédures

Dans un premier lot de souris, des cellules tumorales seront injectées une fois par expérience aux animaux vigiles (durée du geste inf à 10 sec). Certains animaux seront ensuite traités deux fois par semaine pendant maximum 4 semaines par injection sur animaux vigiles (durée du geste inf à 10 sec). Dans une deuxième expérience, des souris vigiles seront irradiées (3 minutes) puis 4H après, elles seront injectées avec des cellules par voie intraveineuse et sous anesthésie gazeuse rapide (durée de l’anesthésie inf à 5 minutes). Six semaines après cette manipulation les animaux seront injectés une fois par expérience avec des cellules tumorales. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur les animaux vigiles 7 jours et 14 jours après cette dernière injection (durée du geste inférieur à 20 secondes)

Impact sur les animaux

Les animaux greffés avec des cellules tumorales développeront des tumeurs. Une nécrose peut apparaitre sur la tumeur en fin d’expérience. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection de produits non douloureux et non toxiques (douleur légère de courte durée liée à la piqûre elle-même). Une légère douleur de très courte durée est attendue lors des prélèvements sanguins ou des injections par voie intraveineuse. La procédure d’irradiation n’est pas douloureuse pour les animaux néanmoins un stress de courte durée, lié à la contention est attendu. Dans de rares cas, l’irradiation peut entrainer une altération de l’état général des animaux (déshydratation, prostation……) dans les jours suivants l’irradiation.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin des procédures pour analyses post-mortem.

Remplacement

Après des premières étapes d’analyse et de validation dans des lignées cellulaires in vitro, le projet a pour but maintenant d’étudier le rôle de notre molécule d’intérêt dans la réponse des lymphocytes T contre les tumeurs et nécessite donc le système immunitaire d’un organisme vivant et intégré comme la souris. En effet, le développement des tumeurs met en jeu de multiples types cellulaires et de nombreux mécanismes qui ne peuvent pas être reproduits dans des modèles in vitro. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation des souris reste indispensable pour le présent projet.

Réduction

Les croisements des lignées de souris ont été optimisés afin d’obtenir le maximum d’animaux avec un phénotype utilisable dans nos expériences. Plusieurs analyses (imagerie et cytométrie) seront réalisées sur la même tumeur pour permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le nombre de souris par groupe est de 10 avec 3 manips afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Dans l’ensemble des procédures, une grille de score est mise en place pour évaluer de manière objective l’état des animaux. En cas d’atteinte d’un point-limite tel que décrit dans la grille de score, l’animal en souffrance est mis à mort. Dans le cadre des greffes de tumeurs, les animaux sont surveillés quotidiennement pour l’état général, et deux fois par semaine pour mesurer la taille de la tumeur ayant été greffée par voie sous-cutanée, afin d’appliquer les points limites de la grille de score. Après l’irradiation, du gel nutritif et hydratant sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire, et limiter la perte de poids et la déshydratation qui peuvent apparaitre.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche thérapeutique du cancer, car la physiologie de la souris est proche de celle de l’homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté pour étudier les réponses immunitaires anti tumorales. La connaissance complète du génome murin permet d’utiliser de nombreux outils bien caractérisés, ce qui sera particulièrement pertinent dans le cadre de ce projet.