Oncologie
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Optimisation des traitements antibiotiques dans des modèles souris d’infections bactériennes
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent sous anesthésie une injection rétro-orbitaire de staphylocoque doré multirésistant, puis jusqu'à six injections intrapéritonéales d'antibiotiques par jour sur animal vigile, pendant deux à cinq semaines. L'infection du sang et des articulations ainsi provoquée entraîne douleur et troubles du déplacement, et les prélèvements réalisés après la mise à mort servent à compter les bactéries restantes. Sur le remplacement, le porteur écrit que les modèles cellulaires ne permettent pas d'étudier l'élimination des bactéries dans une infection générale et que le "modèle animal est indispensable" au projet.
Objectifs
Le staphylocoque doré est une bactérie responsable d'infections graves. Certaines bactéries sont dites multi-résistantes car résistantes à plusieurs familles d'antibiotiques et posent de nombreux problèmes thérapeutiques. Nous proposons une approche innovante avec l'association de deux antibiotiques qui leur permet un meilleur accès au site infecté pour traiter les infections graves à staphylocoque doré multi-résistant. Il a été identifié plusieurs combinaisons antibiotiques dont l'action est efficace en laboratoire. Ce projet vise à tester ces combinaisons d'antibiotiques dans des modèles souris d'infections sévères du sang et des articulations.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier de meilleures stratégies thérapeutiques contre les infections sévères à staphylocoque. Le projet déterminera l’efficacité de nouvelles combinaisons d'antibiotiques administrées de manière à mieux accéder directement au site de l'infection.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une anesthésie d'une durée de 5 à 15 minutes. Tous les animaux seront soumis à une injection intraveineuse rétro-orbitaire d'une durée de 5 secondes réalisée sous anesthésie. Les animaux recevront des injections sous-cutanées d'analgésiques tous les 3 jours, soit un total de 5 à 12 injections selon les études menées (2 à 5 semaines). Les injections sous-cutanées d'une durée d'environ 5 secondes seront réalisées sur souris vigiles. Les animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales quotidiennes d'antibiotiques au nombre de 2 ou de 6 selon l’étude menée. Les injections intrapéritonéales d'une durée d'environ 5 secondes seront réalisées sur souris vigiles.
Impact sur les animaux
Le développement des bactéries sera susceptible de générer un stress chez l’animal dans les 24h qui suivent l’inoculation. L'infection est susceptible de générer douleur et problèmes de déplacement.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des deux procédures. Des prélèvements post-mortem seront effectués pour quantifier le nombre de bactéries et évaluer l'efficacité des différents traitement antibiotiques.
Remplacement
Les modèles cellulaires ne permettent pas l'étude de la clairance bactérienne et de l’efficacité des traitements antibiotiques dans des modèles d’infection systémique. Aussi, le modèle animal est indispensable à ce projet et permettra également de mesurer l’impact des différentes molécules à court terme sur le microbiote intestinal. Les combinaisons d’antibiotiques qui seront testées ont démontré leur efficacité dans des modèles simples de culture.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé a été réduit au minimum en homogénéisant strictement les conditions expérimentales. Nous utilisons des animaux de même sexe et même âge obtenus chez le même fournisseur afin de limiter au maximum la variabilité expérimentale.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, avec nourriture et eau ad libiditum, dans un environnement enrichi avec maisonnette en carton et coton compacté. Ils seront observés quotidiennement, jours fériés et week-end inclus, par les expérimentateurs, pour détecter tout signe anormal de douleur, de souffrance ou de stress et nous avons raffiné la méthodologie par l’introduction de points limites entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal pertinent qui permet de reproduire l'infection du sang et des articulations. Le modèle souris permet d'étudier les différents organes impliqués dans la physiopathologie de l'infection humaine. Nous utiliserons des souris juvéniles de 7 semaines car elles disposent d'un système immunitaire mature.
Modèle de neurofibromatose pour l’évaluation de la réponse thérapeutique
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Des cellules tumorales humaines sont injectées directement dans le nerf sciatique de souris immunodéficientes anesthésiées une heure, puis la tumeur est suivie par imagerie chaque semaine pendant quatre semaines. 225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyses post-mortem, 170 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Il s'agit de tester des combinaisons de médicaments contre les neurofibromes plexiformes de la neurofibromatose de type 1, un traitement approuvé existant déjà mais ne fonctionnant que partiellement. Le porteur annonce une douleur pouvant persister pendant la croissance de la tumeur et une perte de poids limitée à 20 %, seuil dont l'atteinte déclenche la mise à mort de l'animal.
Objectifs
La neurofibromatose de type 1 (NF1) est une maladie génétique caractérisée par une modification de la séquence génétique qui inactive la fonction du gène NF1 (Neurofibromine 1). Cette pathologie se caractérise par diverses manifestations cliniques qui peuvent affecter le système nerveux, la peau, les os, les yeux, ainsi que d'autres organes, entraînant entre autres le développement de tumeurs appelées neurofibromes plexiformes (PNF). Le PNF est une tumeur bénigne rare de la gaine des nerfs périphériques, dont les conséquences peuvent être variées, en fonction de leur localisation. La seule option de traitement des PNF est le traitement des symptômes ou la résection chirurgicale, bien que cette approche soit rarement complète en raison de la relation étroite entre la tumeur et les nerfs. En 2020, le Selumetinib a été approuvé pour le traitement en clinique aux Etats-Unis pour les patients pédiatriques âgés de 2 ans et plus, atteints de neurofibromes périphériques symptomatiques et inopérables. Toutefois, la réponse à ce traitement est partielle. Notre objectif est de valider un traitement alternatif et plus efficace pour les neurofibromes plexiformes. En résumé, ce projet vise à confirmer l'efficacité et la synergie de ces médicaments dans les cellules tumorales du neurofibrome plexiforme, dans le but de trouver un traitement alternatif plus efficace que celui actuellement approuvé et réduisant les risques secondaires.
Bénéfices attendus
La neurofibromatose est une maladie pour laquelle il existe peu de traitement efficace. Par ailleurs, une fraction importante des patients souffrants de neurofibromatose va subir une évolution maligne vers la Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNST). Cette tumeur, particulièrement agressive, est très résistante à la chimiothérapie et est donc associée à un très mauvais pronostique. Elle constitue la principale cause de mortalité chez les patients atteints de la NF1. Il est donc crucial d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques pour soigner la neurofibromatose et éviter son évolution en MPNST. Nous avons identifié des combinaisons thérapeutiques prometteuses sur des modèles de lignées cellulaires qui reproduisent la neurofibromatose. L’étape suivante pour pouvoir progresser vers leur utilisation en clinique est de valider ces résultats dans un modèle, in vivo, plus proche de la complexité du patient.
Procédures
Dans un premier lot d’animaux, des cellules tumorales seront injectées dans le nerf sciatique de souris anesthésiées (durée de l’anesthésie : 60 minutes ). 3 jours et 5 jours après l’intervention chirurgicale, les animaux anesthésiés seront imagés pour vérifier l’implantation de la tumeur (durée de l’anesthésie : 10 minutes) Dans un second lot, les animaux vigiles recevront des traitements par voie orale à raison d‘une fois par jour (5j/7) pendant 30 jours. Dans un troisième lot d’animaux, des cellules tumorales seront injectées dans le nerf sciatique de souris anesthésiées (durée de l’anesthésie : 60 minutes ). 3 et 5 jours après l’intervention chirurgicale, les animaux anesthésiés seront imagés pour vérifier l’implantation de la tumeur (durée de l’anesthésie : 10 minutes). Puis les souris seront traitées 1 fois par jour pendant 30 jours. En parallèle, les animaux anesthésiés seront suivis par imagerie à raison d’une imagerie par semaine pendant 4 semaines (durée d’anesthésie : 10 minutes).
Impact sur les animaux
Les principaux gestes qui seront effectués sur les animaux impliquent la greffe de cellules humaines dans le nerf sciatique des souris puis le traitement des animaux avec les différents médicaments que nous avons identifiés. Les nuisances attendues sont donc la douleur liée à l’intervention chirurgicale au niveau du nerf sciatique (douleur qui peut persister lors du développement de la tumeur) et une perte de poids ne dépassant pas 20 % du poids corporel normal . Lors de l’administration des produits par injection, une douleur de courte durée et d’intensité légère liée à la piqûre elle-même est attendue au point d’injection.
Devenir
À la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Nous avons effectué un grand nombre d’expériences préliminaires sur des lignées cellulaires afin de limiter au maximum le recours aux animaux. Toutefois, en raison de l’importance des interactions avec le microenvironnement, l’étude de la progression tumorale dans un contexte aussi proche que possible de celui du patient reste une phase indispensable avant de passer aux essais cliniques impliquant des patients. L’objectif de cette demande est de pouvoir valider un traitement sur une tumeur dans son environnement ‘naturel’ donc au niveau des nerfs.
Réduction
Nous prévoyons d'utiliser une cohorte limitée à 10 animaux par condition expérimentale. L’efficacité de la greffe orthotopique est estimée à près de 90% chez la souche de souris immunodéficiente que nous utiliserons, limitant ainsi le nombre d’animaux nécessaires. Le nombre d’animaux par condition expérimentale ou « bras » a été déterminé de façon à d’une part obtenir une puissance statistique optimale et d'autre part éviter tout gaspillage en termes d'animaux. Le nombre d'animaux a été calculé à l'aide d'outils statistiques.
Raffinement
Pour le bien-être des animaux, les procédures techniques seront limitées au strict nécessaire. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et avec recours aux analgésiques. Dans le cas où un animal présenterait des signes d'inconfort ou de douleur au cours de l'expérience, de l’analgésique sera administrée, conformément aux protocoles établis de gestion de la douleur. De plus, nous avons établi des points d'arrêt pour chaque expérience, l'expérience se terminant au plus tard 6 semaines après le début du traitement ou plus tôt, selon les objectifs spécifiques de chaque phase expérimentale. Cette approche garantit que l'exposition des animaux à un éventuel inconfort soit minimisée. Une grille de score permettra d’évaluer de façon objective, l’état des animaux. Dès l’atteinte d’un point-limite, l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour tester le développement de nouvelles cibles thérapeutiques en environnement contrôlé. C’est un mammifère dont la physiologie est suffisamment proche de celle de l’espèce humaine. Les souris immunodéprimées permettent de créer un modèle de xénogreffes de tumeurs humaines, sans provoquer de rejet de la greffe. Les xénogreffes de tumeurs de patients chez les souris immuno-déficientes récapitulent remarquablement bien les tumeurs humaines et constituent donc un modèle idéal pour l’étude des gènes impliqués dans la progression tumorale.
Prélèvements planctoniques – un inventaire de larves de poissons côtier (façade atlantique française)
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Autres poissons : 2995
Capturées au filet à plancton par des plaisanciers puis comprimées au fond de la poche pendant la remontée, la plupart des larves de poissons meurent avant même d'arriver sur le pont. Les 5 % encore vivantes sont plongées dans un flacon d'eau de mer posé sur de la glace, pour un choc hypothermique létal. 3 000 larves, dont 5 loups de mer et 2 995 individus d'autres espèces, sont tuées de cette façon sur cinq ans sans jamais reprendre conscience, pour dresser un inventaire des espèces côtières de la façade atlantique. Le porteur écrit ne définir aucun point limite puisque tous les individus sont mis à mort dès la capture, et présente la collection de référence ainsi constituée comme un "remplacement" futur qui évitera de recapturer des animaux.
Objectifs
Le projet de recherche participatif écocitoyen « Objectif Plancton » vise à étudier le plancton des côtes de la Bretagne. Ce projet à dimension régionale réunit scientifiques, plaisanciers, médiateurs scientifiques et grand public pour contribuer à la connaissance de la biodiversité marine, notamment les larves de poissons. L’objectif est d’identifier et d’impliquer les citoyens dans la collecte des données, en analysant leurs pêches. Les dernières recherches sur les larves de poissons dans cette zone datent de la fin des années 1960 et il apparaissait donc nécessaire d’actualiser ces données bien anciennes. L’objectif est de connaître la diversité des espèces des larves de poissons présentes dans cette zone marine aujourd'hui pour pouvoir détecter des changements potentiels dans le futur. Les espèces sont inventoriées et caractérisées, d’une part d’un point de vue morphologique, et d’autre part d’un point de vue génétique. Objectif Plancton permet ainsi d’élaborer un suivi spatio-temporel de ces larves de poissons et d’analyser à terme les fluctuations de ce zooplancton en lien avec le changement global en milieu côtier.
Bénéfices attendus
Nous organisons la collecte de plancton par des plaisanciers, afin d’impliquer le grand public dans la démonstration de l’importance du plancton dans le fonctionnement écologique et la diversité de l’océan. Par ailleurs, cette initiative citoyenne représente une opportunité unique d’échantillonner simultanément différents points d’un même écosystème (les scientifiques en mission ne peuvent échantillonner qu'une seule station à la fois). Après l’echantillonage deux types d’identification sont réalisés : à partir d’observations réalisées à la loupe binoculaire et avec une analyse génétique. Les larves et œufs de poissons sont déterminés, autant que possible, à l’espèce sur la base de critères morphologiques. Les spécimens sont également analysés à partir d’une identification génétique. Ainsi, une larve non-identifiée morphologiquement peut être reconnue grâce à son ADN. Une fois identifiés, les spécimens sont inventoriés et vont alimenter la collection patrimoniale. C’est la première collection d’ampleur de larves de poissons osseux marins de la façade atlantique nord-est pour cette collection. Entre 2015 et 2022 ce sont environ 1300 larves qui ont été récoltées. Ces larves correspondent à 34 espèces appartenant à 20 familles différentes. Ce projet doit se poursuivre pour permettre de documenter objectivement (protocole standardisé) les changements en cours de la composition en espèces, et identifier les effets des changements environnementaux du milieu. Les poissons marins ont une fécondité élevée (de l'ordre de 10 000 à 10 000 000 œufs par femelle) et pondent des œufs en pleine mer. Des cohortes d'œufs fécondés éclosent et passent par différents stades de durée variable. Les agents de mortalité (prédation, famine, changements environnementaux) agissent à chaque étape. Ces facteurs naturels sont les principaux facteurs qui réduisent le nombre d’individus atteignant le stade juvénile voire adulte.
Procédures
sans objet
Impact sur les animaux
Les larves de poissons prélevées meurent majoritairement sous l’effet de la pression de l'eau qui les compriment au fond du filet. Environ 5% des larves sont encore vivantes au moment de la remontée du filet, elles sont immédiatement soumises à un choc hypothermique létal (~ 3 – 5°C) en les plaçant dans un flacon d’eau de mer sur de la glace.
Devenir
L'objectif du projet est de dénombrer les poissons de chaque espèce selon leurs stades de développement. Seules les identifications basées sur des analyses morphologiques et/ou génétiques des larves de poissons sont précises, ce qui nécessite leur mise à mort. En effet, les méthodes d'analyses indirectes et non létales (ADN environnemental, photographie d'échantillons) n'offrent pas une précision suffisante pour identifier aussi précisément les larves de poissons.
Remplacement
Le projet vise à réaliser l’inventaire des larves de poissons à différents points de prélèvements sous différentes conditions. Les mesures d’analyses indirectes (ADN environnemental, photographie d’échantillons) ne permettent pas de dénombrer les individus par espèce et leur stade de développement – données essentielles pour caractériser les animaux planctoniques à suivre dans le temps. Ces spécimens collectés et sélectionnés alimentent par ailleurs des collections de références stockées pour le long terme qui sont et pourront étre étudiées sans nécessiter de recapturer des animaux (« Remplacement » futur).
Réduction
Les campagnes d’inventaire sont calibrées et programmées de manière à répondre aux besoins de l'étude. Il s’agit d’une date de prélèvement à différentes saisons (avril, juin et septembre) avec quinze prélevements par campagne, ce qui nous permet d’évaluer la qualité et la quantité de larves de poissons à différents moments de l’année. Ces trois dates de collecte sont choisies en fonction de la représentativité des larves de poissons dans le plancton selon les saisons. En général, une forte activité planctonique est observée du printemps à la fin de l’été. Pour ce projet, plusieurs zones et périodes de forte activité planctonique (avril, juin et septembre) ont été sélectionnées afin de ne pas manquer le « pic » annuel. Moins de collectes entraveraient la réalisation des objectifs définis, tandis que davantage ne serait pas utile pour atteindre les objectifs fixés. Il est important d'avoir un certain nombre de larves (ca. 600) par an pour obtenir des résultats fiables et des statistiques solides. Normalement, pour un suivi sur les larves de poissons, un filet double est utilisé pour obtenir un échantillon à des fins d’analyse, tandis qu’un deuxième sert de contrôle (et est très souvent même non analysé). Nous avons choisi de réduire notre prélèvement à un seul filet avec un seul collecteur (avec une ouverture de filet plus petite - 50 cm de diamètre - que celle qui est normalement utilisée dans les études sur les larves de poissons ≥ 60 cm). Ces filets à plancton ne prélèvent qu’une fraction pendant un temps donné (15 min à 2 nœuds). Un tel échantillon représente une quantité négligeable par rapport à l'ensemble. Le protocole est réduit dans le temps en été. En raison d'une forte densité planctonique en été, la durée d'échantillonnage est réduite à 10 minutes. C'est déjà un échantillon représentatif et cela évite que les filets soient surchargés. Sur la base des prélèvements passés, j’estime que 600 larves autonomes de poissons sont prélevées par an. Soit une estimation de 3000 larves de poissons sur 5 ans.
Raffinement
De la capture à la mort, les larves sont maintenues dans la même eau de mer (celle du lieu de capture), assurant ainsi le maintien des animaux dans des conditions physico-chimiques constantes. Après la capture, l’échantillon est immédiatement maintenu à 4 °C pour induire une hypothermie, qui représente un choc thermique létal efficace pour l’ensemble des larves de poissons. Nous ne définissons pas de point limite de souffrance/douleur, puisque dans tous les cas, la totalité des individus est mise à mort dès la capture.
Choix des espèces
L’objectif de ce projet est de connaître la biodiversité des larves de poissons présentes dans des habitats côtiers et étudier ses changements à long terme. Seule l'étude des espèces sauvages vivant dans leur habitat naturel permet d’atteindre les objectifs scientifiques fixés. Le projet vise à étudier les larves de poissons. Après le stade sac vitellin les larves de poissons deviennent autonomes. Dans les échantillons, nous observons différents stades de larves de poissons, et environ 80% d’entre elles sont autonomes. Il est plus pertinent et étique, avec moins d’impact sur la population de faire un suivi sur les larves plutôt que directmenet sur les adults. En plus de l’objectif principal qui est d’identifier la biodiversité, un suivi sur l’ichtyoplancton a été démontré comme étant un bon indicateur de la taille d’une population, mais aussi d’un écosystème sain ou stressé.
Ecologie et physiologie évolutives des mésanges charbonnières dans un gradient urbain
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Jusqu'à quarante minutes d'exposition à des températures atteignant 46 °C, et des mesures respiratoires de douze heures la nuit : 764 mésanges charbonnières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes relâchées dans leur milieu d'origine. Les prises de sang durent trois à cinq minutes, les mesures de métabolisme jusqu'à deux heures en journée. L'objet du projet est de tester si les oiseaux des villes, déjà exposés à l'îlot de chaleur urbain, seraient pré-adaptés au réchauffement climatique. Le porteur retient la mésange charbonnière parce qu'elle niche dans les nichoirs, se comporte bien en captivité et se laisse manipuler sans abandonner sa nichée, et parce que la généalogie des individus suivis est connue.
Objectifs
En écologie évolutive, le changement climatique et l'urbanisation sont surtout étudiés séparément. Pourtant l’effet d'îlot de chaleur urbain constitue un défi supplémentaire pour des organismes déjà confrontés au changement climatique, en particulier durant les événements climatiques extrêmes (ex. vagues de chaleur). La chaleur accrue en ville représente de ce fait un théâtre d’étude unique pour les scientifiques cherchant à comprendre comment les organismes s’adaptent (ou non) au réchauffement. Ce projet vise à comprendre et à prévoir l'impact des effets interactifs du changement climatique et de l'urbanisation sur l’évolution et la dynamique des populations en utilisant une espèce modèle en écologie évolutive : la mésange charbonnière. L’objectif des expériences décrites ici est de comparer les adaptations physiologiques (depuis les phénotypes jusqu’aux gènes) aux variations de température chez les oiseaux des forêts et des villes, et de tester l'hypothèse selon laquelle les organismes vivant en ville pourraient être pré-adaptés au réchauffement climatique parce qu'ils sont exposés à l'effet d'îlot de chaleur urbain. Le projet permettra une meilleure compréhension de la façon dont l'environnement urbain peut façonner l'adaptation des oiseaux au changement climatique.
Bénéfices attendus
Le suivi à long terme permet d’étudier de façon pérenne les populations de mésanges charbonnières. Couplé avec une démarche expérimentale, l’analyse des données issues de ce programme permet une compréhension fine des capacités de réponse des organismes aux changements de leur environnement. Nous envisageons que le projet apporte des réponses sur les adaptations des mésanges charbonnières aux pressions anthropiques. L’étude inédite de l’élévation des températures sur des traits physiologiques et comportementaux pourra être menée dans l’expérience unique de jardin commun. Les mésanges charbonnières se comportent bien en captivité et nichent facilement dans les nichoirs quel que soit l’habitat. Ainsi, cette espèce commune est adaptée aux questions qui sont posées.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prises de sang ou à des mesures de métabolisme (consommation d'oxygène, rejet de CO2, et évaporation d'eau par la respiration). Les prises de sang ne durent que maximum 3 à 5 minutes. Les mesures de métabolisme sont opérées durant un maximum de 2 heures (la journée) dont entre 15 et 40min à des températures élevées (jusqu'à 46°C) ou 12 heures (la nuit, pendant que les animaux dorment).
Impact sur les animaux
Les nuisances possibles sont les évènements de capture qui mèneront à du dérangement, ainsi que les manipulations visant à identifier les animaux (baguage, mesures morphométriques et de comportement), et à quantifier leurs adaptations physiologiques à la température. Une douleur peut être attendue lors des prises de sang, causée par l'introduction d'une aiguille effectuée conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les prises de sang ne dépasseront jamais les quantités recommandées pour un animal de cette taille. L'exposition brève à des températures élevées peut générer un inconfort transitoire, mais les mesures de respirométrie seront faites sous surveillance constante des oiseaux. L'objectif de l'étude étant de mettre en parallèle des mesures physiologiques avec des comportements exprimés la plupart du temps en milieu naturel (y compris des mesures de reproduction postérieures à nos mesures physiologiques), les résultats ne pourront être pertinents que si les animaux n'ont subi ni stress aigu, ni effets indésirables. Enfin, toutes les manipulations seront effectuées par des manipulateurs formés et sûrs de leurs gestes.
Devenir
Tous les oiseaux seront libérés dans leur milieu naturel d'origine après chaque procédure.
Remplacement
Il s’agit ici de recherche scientifique fondamentale sur des animaux sauvages, et en particulier de leurs physiologies et comportements naturels. Il n’est pas possible de pouvoir déduire ces mécanismes sans recourir à des animaux vivants et à de l’expérimentation.
Réduction
Les protocoles ont été pensés de façon à utiliser un nombre restreint d’individus pour donner des résultats statistiquement adéquats. Ces nombres sont choisis en s’appuyant sur des expériences précédentes et de la littérature scientifique. Les nombres limités d’oiseaux impliqués sont aussi permis grâce à leurs utilisations pour la mesure de plusieurs traits phénotypiques. En effet les mesures physiologiques sont connues pour présenter une variabilité inter-individuelle importante nécessitant des tailles d'échantillon en conséquence. La mesure de traits multiples sur chaque oiseau que nous envisageons a justement pour but d'expliquer cette variabilité et de permettre de limiter les tailles d'échantillons. A titre d'exemple, dans le jardin commun nous élèverons 120 poussins issus de 2 villes, 2 types d'habitat et des 2 sexes, ce qui revient à une taille d'échantillon de 15 individus par groupe.
Raffinement
Les expérimentateurs ne manipuleront jamais seuls, permettant de réduire les risques de nuisance due aux manipulations et favorisant l'entraide. Les expérimentateurs sont formés de façon à avoir des gestes assurés et permettant de faire les manipulations le plus rapidement et calmement possible. Les opérateurs sont régulièrement ré-entrainés aux gestes adéquats. Les oiseaux en captivité seront maintenus dans des espaces prévus et enrichis (e.g. volières de grande taille avec végétation naturelle et de nombreux perchoirs), leur fournissant des conditions de vie semi-naturelle. Tous les protocoles sont pensés pour réduire au maximum les nuisances et le stress des animaux, d'autant plus qu'un intérêt scientifique majeur du projet tient au suivi ultérieur en populations naturelles (paramètres démographiques et reproducteurs) des oiseaux qui auront été mesurés.
Choix des espèces
Mésange charbonnière (Parus major) Les mésanges nichent facilement dans des nichoirs et la manipulation de leurs poussins ainsi que la capture des individus n'entrainent aucun abandon de nichées. Nos recherches sur le long terme sur les mésanges nous offrent une opportunité unique de mesurer les traits d’intérêts sur des oiseaux dont toute la généalogie est connue, ce qui permet notamment d’envisager des analyses de génétique quantitative pour estimer l’hérédité des caractères. Par ailleurs, ce modèle d’étude est unique car il permet de travailler à la fois en populations naturelles et à l’aide d’expérimentations en conditions contrôlées au laboratoire. Aucun modèle théorique ne peut remplacer l’étude des oiseaux dans la nature pour répondre aux questions posées. - Oiseaux sauvages : Les prélèvements, prises de sang et respirométrie sont faits sur des oiseaux adultes. Les oiseaux ne sont pas capturés durant certaines phases sensibles de la reproduction, c’est-à-dire durant l’incubation, et durant la fin de l’élevage des poussins. Les poussins ne font l'objet que de mesures morphométriques. - Oiseaux captifs : Les prélèvements, prises de sang et respirométrie sont faits sur des oiseaux adultes. Les seules manipulations sur les poussins seront des prises biométriques pour étudier leurs croissances durant l’élevage.
Ecologie évolutive des mésanges bleues en populations naturelles
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Capturées au nichoir, baguées, pesées et mesurées, des mésanges bleues suivies depuis 1976 près de Montpellier et en Corse sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur déclare 5 500 oiseaux et décrit 1 100 captures, dont 800 avec une prise de sang de 20 µl et un prélèvement de huit à dix plumes de duvet sur la tête et la poitrine. Certains individus passent des tests de personnalité qualifiés de rapides, sans que le document précise lesquels. Tous sont relâchés là où ils ont été capturés, le programme reposant sur leur survie et leur reproduction ultérieures.
Objectifs
Notre programme de recherche étudie la variabilité génétique, phénotypique et comportementale des oiseaux en milieu naturel. Par le suivi d’oiseaux se reproduisant en nichoirs, nous visons à déterminer comment les populations naturelles répondent à la variabilité des pressions de sélection à différentes échelles d’espace et de temps, c'est-à-dire leur capacité d’adaptation. Nous étudions différentes populations de mésanges bleues (Cyanistes caeruleus), deux dans le sud de la France, près de Montpellier et deux plus au Sud encore: en Corse.
Bénéfices attendus
Ce projet est un suivi à long terme, ce qui signifie que les mêmes individus, familles et populations sont étudiées années après années aux mêmes endroits. Initiée en 1976, la mesure de leur succès de reproduction, survie, condition, coloration et comportements donne une compréhension fine des capacités de réponse des populations naturelles d'oiseaux aux changements de leur environnement. Ce projet apporte donc des réponses sur le potentiel d'adaptations d'individus sauvages aux pressions anthropiques et naturelles
Procédures
1100 oiseaux seront capturés, bagués, et 800 d'entre eux auront une quantité de sang prélevée au maximum une fois dans leur vie (le volume de sang visé est de 20 µl). Ils auront aussi entre 8 à 10 plumes de duvet prélevées au niveau de la tête et la poitrine. Le poids et la taille de ces individus seront mesurés et certains seront soumis à des tests de personalités rapides. Nous travaillons sur ces oiseaux depuis de nombreuses années et n’observons pas de nuisances majeures de notre travail sur leur reproduction et survie ultérieures.
Impact sur les animaux
L'objectif de l'étude ést de relier les mesures réalisées sur les individus à leur succès de reproduction et survie donc les résultats ne pourront être pertinents que si les animaux n'ont subi ni stress aigu, ni effets indésirables. Les nuisances possibles sont les évènements de capture qui mèneront à du dérangement, ainsi que les manipulations visant à identifier les animaux (baguage). Une douleur peut être attendue lors des prises de sang, causée par l'introduction d'une aiguille effectuée conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les prises de sang ne dépasseront jamais les quantités recommandées pour un animal de cette taille. Enfin, toutes les manipulations seront effectuées par des manipulateurs formés pour leurs gestes.
Devenir
Tous les individus sont relachés après manipulation car l'objectif de notre programme de recherche est d'étudier les comportements et la démographie des populations dans leur milieu naturel de vie.
Remplacement
Il s’agit ici de recherche scientifique fondamentale sur les comportements naturels d'animaux sauvages et leur adaptation à l’environnement naturel et anthropique. Il n’est pas possible de pouvoir déduire ces mécanismes sans recourir à des animaux vivants en populations naturelles et, dans certains cas, de les capturer. Les études en laboratoire ou les modèles mathématiques ne sont pas envisageables car ils font largement abstraction de la grande variabilité environnementale observée dans la nature et les études de laboratoire induisent du stress chez les animaux sauvages et réduisent souvent leur palette comportementale.
Réduction
Les mesures comportementales sont connues pour présenter une variabilité inter-individuelle importante et nécessitent de ce fait des tailles d'échantillon conséquentes pour arriver à des conclusions pertinentes. Les protocoles sont pensés de façon à utiliser un nombre minimal d’individus pour tout en donnant des résultats statistiquement solides et fiables. Les nombres sont choisis en s’appuyant sur nos connaissances du terrain, des expériences précédentes et la littérature scientifique évaluant des tailles d’effet sur la base d’une taille d’échantillon donnée. Nous limitons les nombres d’oiseaux impliqués en mesurant sur les mêmes individus plusieurs traits phénotypiques.
Raffinement
Nous pensons tous les protocoles pour réduire le temps de manipulation des oiseaux. Nous planifions nos tâches de travail de façon à pouvoir ne pas être en surcharge de travail et ainsi être calme avec les animaux Nous réduisons leur stress en les manipulant efficacement. Pour ce faire les expérimentateurs sont re-formés chaque année par des séances de rappel des procédures et des entraînements à la manipulation. Le suivi ultérieur des paramètres démographiques et reproducteurs des oiseaux qui ont été capturés sur le terrain permet de vérifier que ces paramètres ne sont pas altérés.
Choix des espèces
Les mésanges nichent facilement dans des nichoirs et la capture/manipulation des poussins/parents n'entrainent pas d'abandon de nichées. Nos recherches sur le long terme (40 ans) sur les mésanges nous offrent une opportunité unique de mesurer les traits d’intérêt sur des oiseaux dont toute la généalogie est connue, ce qui permet notamment d'analyser l’hérédité des caractères. Notre but est ici de mesurer la sélection (naturelle et sélection sexuelle) et d’en mesurer les conséquences, par exemple dans le cadre de l’adaptation des oiseaux aux changements climatiques. Aucun modèle théorique ne peut remplacer l’étude des oiseaux dans la nature pour répondre à ces questions.
Gestion du phénotype dommageable de la lignée Aiolos KO durant l’élevage
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Les souris de la lignée utilisée sont privées d'une protéine du système immunitaire et développent un lymphome vers huit à dix mois. 720 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées avant cet âge. Aucune intervention expérimentale n'est décrite sur l'animal vivant, le projet consistant à entretenir la lignée puis à prélever moelle osseuse, ganglions, rate et thymus après la mise à mort. Le porteur affirme n'attendre aucune nuisance, la prévention du phénotype dommageable reposant sur l'utilisation puis la mise à mort des souris bien avant l'âge où le lymphome apparaît.
Objectifs
Notre équipe travaille sur une famille de protéines jouant un rôle crucial dans le développement et la fonction des cellules du système immunitaire. Dans cette famille, l'une d'entre elles, que nous étudions, semble importante pour le développement des cellules T et B, mais beaucoup de questions restent actuellement sans réponses et nécessitent des études supplémentaires. L’objectif de ce projet est de déterminer l'importance de cette protéine dans la vie des cellules T et B, de leur génération à leur localisation dans les organes lymphoïdes secondaires, en utilisant des souris qui ne la possèdent plus. Ces souris mutantes pourraient avoir des effets indésirables en élevage. Des mesures d’élevage spécifiques et l’utilisation des souris avant l’âge d’apparition d’un phénotype potentiellement dommageable seront mises en place pour prévenir l’apparition de nuisances potentielles. Après mise à mort, différents organes seront récupérés afin d'étudier le devenir des cellules T et B dans différentes expériences in vitro et ex vivo.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de comprendre les mécanismes qui contrôlent l'activation et la polarisation des lymphocytes B et T, acteurs principaux de la réponse immunitaire adaptative jouant un rôle crucial dans le développement de cancers et pathologies auto-immunes et inflammatoires. Cela permettra d'établir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies.
Procédures
La mutation créée dans les animaux, permettant la suppression d’Aiolos, pourrait entraîner des effets indésirables comme le développement d’un lymphome à l’âge de 8 à 10 mois. Cependant, grâce aux conditions d'hébergement optimale et l’utilisation des animaux bien avant cet âge critique, cela permet de prévenir l’apparition de ces effets indésirables et nous n’attendons donc pas de nuisances dans ce contexte.
Impact sur les animaux
Le phénotype dommageable attendu sur les souris porteuses de la mutation est le développement d’un lymphome à un âge tardif (8-10 mois). Cependant, grâce à nos méthodes de raffinement que nous avons mises en place (conditions d’élevage spécifiques, études avant l’âge critique), nous n’attendons pas l’apparition de ce phénotype.
Devenir
Mise à mort pour gestion du phénotype dommageable et prélèvement d'organes.
Remplacement
Nous travaillons sur l'influence d'une protéine sur le devenir des cellules B et T. Nous étudions le développement des lymphocytes B dans la moëlle osseuse, des lymphocytes T dans les thymus et leur devenir dans les organes lymphoïdes secondaires. Jusqu’à ce jour, les lignées cellulaires disponibles ne permettent pas de suivre le destin de ces cellules de leur "naissance" à leur "mort". Ces cellules doivent être maintenues dans un environnement in vivo pour maintenir leurs caractéristiques spéciales. C'est pourquoi notre projet nécessite d'utiliser un modèle in vivo et qu'il est impossible de remplacer l'utilisation d'animaux dans ce projet. Cependant, au cours de notre expérimentation, nous nous réservons la possibilité d’employer des méthodes alternatives et des modèles in vitro, dès que cela est possible, afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux.
Réduction
Le but de ce projet sera de récupérer les organes permettant d’étudier le devenir des différentes populations des cellules B et T in vitro. Nos prélèverons le maximum d’organes (moëlle osseuse, ganglions lymphatiques, rate, thymus) pour chaque animal afin de collecter le plus d’informations au cours d’une procédure. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs. Au cours de notre expérimentation, nous nous réservons, cependant, la possibilité d’employer des méthodes alternatives et des modèles in vitro, dès que cela est possible, afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux. Des tests statistiques seront effectués pour comparer les expériences générées in vitro.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans une zone d'élevage spécifique seulement accessible par des zootechniciens. Cette zone protège les animaux de pathogènes spécifiques. Les animaux sont élevés dans des cages ventilées, avec de l'eau et de la nourriture à volonté. Des barrières physiques bloquent l'entrée de pathogènes et des contrôles sanitaires sont effectués régulièrement sur animaux sentinelles afin de s'assurer qu'aucune contamination par des pathogènes éventuels ne soit en cours. Les animaux seront utilisés bien avant apparition d’un phénotype potentiellement dommageable. Afin de récupérer les organes d'intérêt, les animaux seront transférés dans une animalerie au statut sanitaire conventionnel. Les animaux seront élevés en groupe, dans des cages ventilées avec le matériel nécessaire pour qu'elles créent leur nid et leur permettre des conditions d'hébergement optimales. Un suivi règlementaire quotidien sera effectué. Dans ces conditions d'hébergement et à l'âge où ils seront étudiés, nous n'attendons aucun phénotype dommageable pour ces animaux.
Choix des espèces
Les souris présentent l’avantage de pouvoir être modifiées génétiquement (souris- knock-out, transgéniques), ce qui permet de contrôler l’expression d’un ou plusieurs gènes soit dans un type de cellule spécifique, soit dans toutes les cellules. Le système immunitaire de la souris se rapproche de l’Homme, ce qui permet de travailler dans un modèle de référence pour l’étude des cellules T et de certaines pathologies comme les maladies auto-immunes associées à une dérégulation des cellules T. Pour ces raisons, les souris représentent un modèle de référence dans l’étude des mécanismes qui sous-tendent la pathogénicité des cancers ou maladies auto-immunes, ce qui est l’objet de notre recherche. Nous utiliserons les animaux entre 5 et 20 semaines maximum afin de s'assurer de ne pas se rapprocher de l'âge (8-10 mois) où elles pourraient développer un phénotype potentiellement dommageable.
Evaluation de l’effet d’une supplémentation alimentaire en poudre de fruits ou de légumineuses sur le métabolisme, l’inflammation et la résistance à l’insuline dans le modèle d’obésité induite par l’alimentation chez la souris mâle.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Nourries douze semaines avec un régime riche en graisse additionné de poudre de baies de goji ou de lentilles, 72 souris mâles subissent une prise de sang sous contention à la sixième semaine, un test de tolérance à l'insuline à la neuvième, un gavage de glucose à la dixième et un gavage de mesure de perméabilité intestinale à la onzième. Trois recueils de fèces les isolent chacun une trentaine de minutes, les tests de tolérance deux heures. Le porteur reconnaît un stress social lié à ces isolements et des douleurs possibles lors des prises de sang, du marquage, du gavage et de l'injection intrapéritonéale, puis écrit qu'aucune analgésie n'est prévue dans ce protocole. Toutes sont tuées pour prélever les tissus et mesurer l'effet de la supplémentation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré.
Objectifs
L’objectif du projet est de mieux comprendre l’impact des conditions de production et des traitements post-récolte sur la qualité nutritionnelle des fruits ou des légumineuses et les conséquences que cela va engendrer en terme de santé métabolique chez la souris. Plusieurs travaux rapportent un effet protecteur des fruits ou des légumineuses vis-à-vis de l’homéostasie glucidique qui semble en partie lié aux polysaccharides, et est très probablement imputable à un effet sur le microbiote. Pour évaluer les effets santé des fruits ou légumineuses et l'impact des conditions de cultures et de traitements post-récolte, nous comparerons des baies de goji cultivées en plein champ ou en serre (effet des condition de productions), consommées fraiches ou séchées (effet du traitement post-récolte). L'effet des conditions de cultures sera également étudié sur des lentilles (légumineuses) cultivées soit en sol riche en bactéries soit en sol pauvre (effet des conditions de culture). Les différentes modalités de fruits ou légumineuses seront lyophilisés puis administrés à des souris males durant 12 semaines, dans le cadre d'une alimentation riche en graisse. Une prise de sang sera réalisée à 6 semaines, ainsi qu'un test de tolérance à l'insuline à la 9eme semaine et un test de tolérance au glucose à la 10eme semaine. Les fèces seront également récoltés et le microbiote des animaux sera analysé. Les données obtenues permettront d'avancer dans la connaissance et l'objectivation de la contruction de la qualité nutritionnelle des productions végétales et de leurs effets sur la santé métabolique.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer l’impact des conditions de culture (plein champ vs serre, et impact du microbiote du sol) et des traitements post-récolte (frais vs séchés) sur la baie de goji et la lentille et leurs effets sur la santé métabolique des souris et de leur microbiote. Ce projet s’insère dans un projet plus large qui permettra in fine d’améliorer et de mieux caractériser les effets santé de ces aliment dans le cadre de pratiques agricoles plus responsables.
Procédures
Un prélèvement de sang sur animal vigile sera réalisé au début de l'étude et après 6 semaines (2 au total). Pour ce faire les animaux seront mis sous contention durant environ 2 minutes. Un test de tolérance à l'insuline et un test oral de tolérance au glucose seront pratiqués respectivement en 9ième et 10ième semaine. Ces tests necéssitent une mise en contention d'une minute pour réaliser un gavage dans le cas du test de tolérence au glucose, et une injection intrapéritonéale lors du test de tolerance à l'insuline. Le déroulé du test nécessite ensuite une mise en hébergement individuel des animaux de 2 heures afin de suivre l'évolution de leur glycémie. Un test de perméabilité intestinale sera réalisé en semaine 11. Ce test nécessitera une mise en contention d'une minute pour réaliser le gavage avec la solution permettant d'évaluer la perméabilité intestinale. Durant le protocole, 3 recueils de fèces nécessitant d’isoler temporairement (environ 30 minutes) l’animal seront effectués.
Impact sur les animaux
Stress social lié à l'hébergement individuel de l'animal de ses congénères lors du test de tolérance à l'insuline, du test de tolérance au gloucose et du recueil de fecès. Douleurs possibles lors des prises de sang, pour l'identification des animaux, lors du gavage et lors de l'injection intrapéritonéale. Ces nuisances ou effets indésirables sont toutes temporaires et réversibles.
Devenir
Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'interet qui seront ensuite étudiés (expression génique, histologie, dosages protéiques) et de démontrer les effets métaboliques de la supplémentation en poudre de baie de goji ou de lentilles.
Remplacement
L’étude d’une supplémentation en poudre de baie de goji ou de lentilles sur la santé métabolique et le microbiote ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Il n'existe pas de modèle alternatif à l'heure actuelle permettant d'étudier ces paramètres in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux (9 par groupes) est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, à l'aide d'un test statistique, notamment en ce qui concerne la prise de poids. Deux protocoles indépendants ont été regroupés en un meme protocole afin de limiter le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cage de 3, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à rétablissement. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en focntion des observations faites permettra l'application des points limites et la mise en application de critères d'arret. Aucune analgésie n'est prévue lors de ce protocole.
Choix des espèces
Le modèle souris est un modèle reconnu pour les études portant sur l’obésité et les pathologies associées. Les mécanismes d’adaptation à une alimentation riche en matière grasse chez la souris sont très proches des mécanismes observés chez l’Homme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.
Etat sanitaire des populations d’anguilles européennes de Méditerranée occidentale (rivières et lagunes) et développement d’outils non létaux d’évaluation.
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Les anguilles qui présentent une faible vivacité ou un comportement anormal au réveil sont tuées sur place. Vingt anguilles européennes, espèce classée en danger critique d'extinction, vont être capturées par pêche électrique et utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis relâchées à leur lieu de capture. Chaque individu subit sous anesthésie des mesures biométriques et trois prélèvements, mucus cutané, sang et lavement intestinal, en trois à quatre minutes. Le nombre de vingt individus, dix par an sur deux ans, repose sur l'expertise des spécialistes du projet, le porteur indiquant qu'aucune étude comparable publiée ne permettait de le calculer.
Objectifs
La population de l’anguille européenne, Anguilla anguilla, a subi un fort déclin sur l’ensemble de son aire de répartition depuis les années 1980. Il est en effet estimé que cette population a diminué de plus de 90% lors des dernières décennies. Par suite, bien que non protégée, c’est une espèce classée en danger critique d’extinction depuis 2008. Les causes du déclin de l’anguille sont multiples : perte et dégradation des habitats, pêche, pollution, introduction de parasites exotiques et modification des courants océaniques due aux changements climatiques. Tous ces facteurs impactent simultanément la population de l’anguille européenne, mais l’importance de leur contribution respective ne peut pas encore être déterminée. Ce projet a donc pour objectifs : 1) de décrire l’état sanitaire des sous-populations d’anguilles de Méditerranée occidentale (rivières et lagunes), 2) de développer des outils innovants (non létaux) d’évaluation de cet état, objectif fondamental et essentiel pour autoriser la pérennisation des suivis à long terme sur cette espèce, et 3) de préciser l’état écologique des lagunes et des cours d’eau prévus dans le projet. Ces résultats devraient permettre de faire le lien entre l’état sanitaire des anguilles et le niveau de pressions anthropiques s’exerçant sur les habitats aquatiques continentaux afin de proposer des mesures de restauration adaptées à cette espèce et à ces habitats.
Bénéfices attendus
Les résultats devraient permettre de préciser l'état écologique des lagunes côtières et des cours d'eau prévus dans le projet (i.e. niveau de pression anthropique), et de faire le lien avec l’état sanitaire des anguilles, évalué à partir de méthodes non létales, afin de mieux comprendre les causes de son déclin, et plus généralement de la biodiversité aquatique. L'anguille étant une espèce indicatrice de la qualité du milieu aquatique, particulièrement sensible aux contaminations chimiques et aux infestations parasitaires (parasites introduits), le projet permettra de proposer des mesures pertinentes et spécifiques de gestion de cette espèce et de ses habitats, ciblées sur ces pressions anthropiques. Enfin, la démarche et les résultats obtenus dans le projet pourront être transposés à d’autres habitats similaires de Méditerranée voire même d’Europe.
Procédures
Chaque animal sera soumis à des mesures biométriques et à 3 prélèvements non létaux sous anesthésie (1 seule fois par animal) : mucus cutané, sang et lavement intestinal (durée 3 à 4 minutes maximum en tout).
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus seront à priori assez réduits et concernent : 1) la collecte des anguilles par pêche électrique susceptible d’engendrer du stress, et 2) les prélèvements non létaux (mucus cutané, sang et lavement intestinal), effectués sous anesthésie et potentiellement susceptible d’occasionner une légère gêne au réveil des anguilles.
Devenir
Tous les animaux seront relâchés dans leur milieu d’origine au niveau de leur lieu de capture à la fin de la procédure expérimentale après leur réveil.
Remplacement
Le projet visant à décrire l’état sanitaire des sous-populations d’anguilles de Méditerranée occidentale (rivières et lagunes) et de développer des outils innovants (non létaux) d’évaluation de cet état, il n’est pas possible d’utiliser des méthodes de remplacement de cette espèce.
Réduction
Le projet prévoit de collecter, anesthésier et relâcher des individus d’une rivière en vue d’effectuer leur biométrie et de développer des outils non létaux d’évaluation de leur état sanitaire. Nous avons réduit au maximum le nombre d’individus à collecter (en tout 20 anguilles au stade jaune, 10 par an sur 2 années consécutives) pour obtenir des résultats représentatifs et fiables de l’état sanitaire/de stress des anguilles fréquentant cet habitat dans le cas de cette approche innovante. Ce nombre a été déterminé à partir de l’expertise des différents spécialistes impliqués dans le projet en l’absence d’études similaires déjà publiées qui auraient pu être utilisées pour estimer la variabilité attendue des résultats et donc pour calculer la taille minimale de l’échantillon.
Raffinement
Plusieurs mesures seront prises pour limiter l’inconfort, le stress et la souffrance des individus depuis leur collecte jusqu’à leur relâcher. Au moment de la pêche électrique, la collecte des anguilles se fera à l’aide d’une épuisette à maille suffisamment fine et souple pour ne pas les blesser, et en pratiquant des gestes précautionneux pour ne pas les stresser tout en permettant une collecte rapide. Après anesthésie, les anguilles seront toujours maintenues humides (permet la respiration cutanée qui existe chez l’anguille) et leurs yeux seront protégés contre l’exposition à la lumière directe du soleil pour les mesures biométriques et les prélèvements prévus dans le projet. Les anguilles seront ensuite surveillées jusqu’à leur réveil complet avant de les relâcher dans leur milieu d’origine. Cependant, en cas d’apparition de signes suspects au réveil (faible vivacité, comportement anormal), elles seront immédiatement euthanasiées.
Choix des espèces
Bien que non protégée, l’anguille européenne est une espèce classée en danger critique d’extinction depuis 2008. Parmi les multiples causes pressenties à l’origine de son déclin, la perte et la dégradation de ses habitats, notamment par les contaminations chimiques et biologiques, font l’objet des préoccupations actuelles. Dans ce contexte, il convient de faire le lien entre l’état sanitaire des anguilles et le niveau des pressions anthropiques s’exerçant sur les habitats aquatiques continentaux (lagunes et rivières) afin de proposer des mesures de restauration adaptées à cette espèce et à ces habitats. Les individus qui feront l’objet de ces prélèvements sont des anguilles au stade jaune (stade de croissance immature de l'anguille), stade adapté à notre étude car particulièrement exposé aux contaminations chimiques et biologiques en raison d’un comportement benthique et d’un séjour long dans son habitat aquatique continental.
Évaluation de l’effet antalgique d’une crème combinant deux principes actifs dans un modèle murin de neuropathie induite par le paclitaxel
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Une ligature du nerf sciatique sous anesthésie ou des injections répétées d'anticancéreux installent une neuropathie douloureuse chronique chez 648 souris, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Sept fois par animal, un filament est appliqué sur la patte ou la patte est plongée dans un bain à 10 °C, pour mesurer la douleur avant et après l'application d'une crème antalgique. Le porteur décrit ces tests comme entraînant "une douleur de quelques secondes" et précise que l'animal reste libre de retirer sa patte, après avoir écrit que l'induction de la neuropathie constitue une "nuisance à part entière" mais "indispensable" à la conduite de l'étude. Toutes les souris sont tuées, le porteur indiquant que leur souffrance est irréversible.
Objectifs
Nous souhaitons réaliser, chez l’animal, une étude qui permettra de mettre en avant une action additive, potentiellement synergique (c’est-à-dire obtenir un effet supérieur à une simple addition), de deux principes actifs après une application locale sous forme de crème dans des douleurs neuropathiques périphériques. Des données de biologie moléculaire sont également nécessaires afin de localiser l’expression des protéines cibles dans le tissu périphérique.
Bénéfices attendus
Le produit attendu est un nouvel antalgique pour lutter contre les symptômes neuropathiques tels que les douleurs induites par certaines chimiothérapies pour lesquelles il n’existe aucun traitement efficace. Le marché visé est principalement celui des cancers du sein, des cancers colorectaux de stade III (avancé) et IV (métastatique) mais pourrait être ouvert à ceux des cancers ovariens et du tête-cou pour lesquels les mêmes protocoles chimiothérapiques sont prescrits. La forme crème (action topique) permettra de limiter les effets indésirables de ces deux molécules prises par voie orale.
Procédures
Les souris pourront subir, en fonction des procédures, les interventions suivantes : - Induction des modèles de neuropathies chimio-induite : Il s’agit ici d’injection en intrapéritonéal sur animal vigil (durée par animal : 3 secondes) réalisées 2 ou 3 fois par semaines pendant 1 ou 4 semaines, en fonction de l’anticancéreux. - Induction du modèle de neuropathie par ligature du nerf sciatique (modèle SNI ou Spared Nerve Ligation) : une chirurgie sera réalisée chez la souris anesthésiée (durée par animal : 15 min). - Tests comportementaux : ils consistent, soit à appliquer des filaments sur la patte, soit à immerger la patte dans l’eau froide à 10°C. Durée par animal : 5 à 30 secondes). Fréquence : 7 fois par animal : une fois avant l’induction du modèle, puis au jour 7 ou 14 après l’induction du modèle (en fonction du modèle), et enfin 20, 40, 60, 90 et 120 minutes après l’application de la crème. - Application de la crème : elle sera réalisée pendant 5 minutes (fréquence : une fois) sur la patte de l’animal anesthésié sous isoflurane 2,5%.
Impact sur les animaux
L’induction de neuropathie chronique périphérique chez la souris sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. Elle sera associée à des désordres douloureux qui seront évalués dans le cadre du projet. Elle sera aussi responsable d’une diminution du gain de poids des animaux. Le poids des animaux sera suivi régulièrement. Des tests comportementaux pour évaluer la douleur seront réalisés sur souris vigiles. Il s’agira du test du von Frey ou du test d’immersion de la patte. Le test du von Frey consiste à appliquer un filament au niveau de la patte de l’animal et le test d’immersion à immerger la patte de l’animal dans un bain thermostaté. Cela va donc entrainer une douleur de quelques secondes chez l’animal. L’animal est libre de retirer sa patte.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort puisque la souffrance de l’animal est irréversible.
Remplacement
S'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est nécessaire pour explorer et évaluer les troubles nociceptifs par le biais de tests comportementaux. Ce type d'étude sur modèle animal de douleurs neuropathiques périphériques n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Il n’y a pas actuellement de système in silico disponible pour l’étude de la douleur qui est un modèle intégré. Ce type d'étude sur modèle animal de douleurs neuropathiques chimio induites est donc pour le moment nécessaire avant le passage en phase clinique chez l’Homme.
Réduction
Une forte expertise du laboratoire s’étendant sur plusieurs années d’expériences concernant les tests comportementaux et modèles animaux permet d’affiner le nombre d’animaux. De plus, le nombre d’animaux de ce projet a été défini de façon à utiliser le minimum d’animaux tout en obtenant des données statistiquement suffisantes. L’ensemble des résultats, y compris négatifs, feront l’objet d’une publication afin d’éviter la reproduction d’expériences. Enfin, si les résultats de chaque procédure sont négatifs (pas d’effet antalgique de chaque composés) alors l’étude s’arrête et les procédures suivantes ne seront pas réalisées.
Raffinement
Des méthodes de raffinement sont utilisées afin d'augmenter au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet. Pour cela, les conditions d'hébergement seront optimales (température, hygrométrie, luminosité). Le nombre d’animaux est adapté à la taille de la cage et en adéquation avec la règlementation . De plus, le milieu est enrichi par du matériel de nidification (coton), un abri (dôme carton) et des matériaux à ronger (bois tendre). L’hébergement en groupe est maintenu pour le bien-être animal. Une surveillance des conflits sera réalisée. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel de l’animalerie qui est sensibilisé aux différents modèles. Les expérimentateurs sont tous titulaires du niveau « concepteur et réalisateur de projet » ainsi que de la formation de chirurgie sur rongeurs. Après leur arrivée à l’animalerie, une période de repos d’une semaine est observée afin d’acclimater les animaux à leur nouvel environnement. Pour limiter l’anxiété des animaux, ils sont habitués à la contention dès leur arrivée à l’animalerie et à l’appareillage des tests comportementaux pendant 3 jours avant le test. De plus, le personnel de l’animalerie et les expérimentateurs utilisent dès que possible la technique du cupping pour limiter l’anxiété des souris lors du transfert des animaux. Afin de limiter la souffrance liée au tatouage des animaux, ils sont identifiés par un marquage sur la queue réalisé une fois par semaine. Des points limites ont été définis pour cette étude et seront mis en place. Ils sont suffisamment prédictifs et précoces pour limiter la douleur à son minimum. Des points limites ont été définis pour cette étude et seront mis en place. Ils sont suffisamment prédictifs et précoces pour limiter la douleur à son minimum.
Choix des espèces
La souris est habituellement utilisée pour ces travaux portant sur les douleurs neuropathiques périphériques. D’autres travaux antérieurs de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche, ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures ainsi que du modèle de neuropathie chimio-induite (choix des doses et du temps de traitement). Enfin, la souris possède une activité et un comportement spontané tout à fait adapté à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux permettant de confirmer l’induction de la neuropathie. Les animaux auront 8 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 9 semaines au début des expérimentations. L’âge de 9 semaines est communément choisi pour ce type de projet. Il s'agit du stage "adulte" de la souris pour mimer au mieux une douleur neuropathique aussi au stade adulte chez l'homme et pour éviter tout phénomène biologique aux âges extrêmes de l'animal.
Régénération de tissu adipeux à l’aide de matrices en polymères et d’hydrogels résorbables
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 750
Cochons : 84
Deux heures d'anesthésie par mini-porc pour l'implantation, puis un suivi par IRM à un, trois, six et neuf mois et à un an : 840 souris, 750 rats et 84 mini-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des matrices en polymères et des hydrogels leur sont implantés sous la peau ou dans une chambre d'ingénierie tissulaire, avec un prélèvement sanguin pendant la chirurgie, pour mettre au point une reconstruction du sein et de l'hypoderme destinée à remplacer implants en silicone et transferts de graisse. Le porteur annonce des risques de rejet, d'inflammation locale et de toxicité, et prévoit l'explantation ou la mise à mort selon la gravité de l'état de l'animal. Le choix des espèces tient à la ressemblance de leur peau avec la peau humaine et à leur taille, qui permet de tester plusieurs conditions sur un même individu.
Objectifs
Actuellement, les solutions cliniques pour la reconstruction des couches profondes de la peau et du sein à l'aide de tissu adipeux présentent des limitations significatives. Les procédures de transfert de graisse autologue peuvent entraîner des complications au site donneur et ne garantissent pas des résultats prévisibles. L'introduction de corps étrangers comme les implants mammaires en silicone comporte des risques potentiels pour la santé et nécessite une surveillance à long terme. Les approches de reconstruction cutanée après une atteinte profonde se concentrent sur l'utilisation de greffes de peau, négligeant l'hypoderme et limitant ainsi la reconstruction complète. Ce projet vise à développer une approche novatrice et biocompatible pour la régénération du tissu adipeux. Cette solution repose sur l'utilisation synergique d’une matrice en polymères et d'hydrogels cellularisés, offrant ainsi une alternative esthétique et fonctionnelle prometteuse pour les patient(e)s. Le premier objectif est d'évaluer la biocompatibilité des hydrogels utilisés dans cette approche. Il est essentiel de s'assurer que ces matériaux ne provoquent pas de réactions indésirables et qu'ils favorisent la régénération du tissu adipeux. Utilisant un modèle animal, nous chercherons à comprendre les interactions complexes entre les adipocytes, l'hydrogel, la matrice polymère, et l'organisme hôte. Cette étape est cruciale pour optimiser la compatibilité et l'intégration des matériaux dans le corps. Nous évaluerons également la possibilité d'utiliser des cellules souches humaines dans la combinaison hydrogel/matrice, en utilisant un modèle de souris immunodéprimées. Cette approche permettra de simuler au mieux les conditions humaines et d'évaluer l'efficacité de la régénération tissulaire. Afin d’étudier l’influence des matériaux sur un modèle de rongeur qui permet de tester des matériaux de taille moyenne, le rat sera employé pour une première comparaison des différentes combinaisons. Une fois la meilleure combinaison hydrogel/matrice sélectionnée, nous réaliserons des tests sur le porc, un modèle animal plus proche de l'homme en termes de physiologie et de composition cutanée. Cette étape sera cruciale pour valider l'efficacité clinique. Ce projet est porteur d'un potentiel majeur pour l'innovation en chirurgie plastique et reconstructrice, et il pourrait révolutionner les pratiques à l'échelle mondiale.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche vise à déterminer les combinaisons optimales d'hydrogels et de matrices pour la régénération du tissu adipeux, avec des implications majeures à la fois sur le plan clinique et scientifique. Il offre la possibilité d'améliorer considérablement les options de reconstruction mammaire et cutanée actuellement disponibles, en limitant les inconvénients des méthodes traditionnelles et en garantissant une meilleure biocompatibilité et performance.
Procédures
Ce projet se déroule en plusieurs étapes. Après une période d'acclimatation d'au moins une semaine, tous les animaux (840 souris, 750 rats et 84 mini-porcs) seront anesthésiés par inhalation (15 minutes pour les rongeurs et 1 heure pour les mini-porcs). Pour les rats, le pelage sera tondu dans les zones d'implantation (10 secondes). Pour tous les animaux, les zones d'implantation seront désinfectées à l'aide d'un désinfectant (10 secondes). Pour la procédure ayant pour but d'évaluer la biocompatibilité des hydrogels, une injection en sous-cutanée sera effectuée (10 min, 130 souris et 130 rats). Pour obtenir un tissu adipeux vascularisé reconstruit, une combinaison de chambres d'ingénierie tissulaire (pour la reconstruction du sein, 250 souris, 250 rats, 80 porcs) ou de matrices 3D (pour la reconstruction de l'hypoderme, 250 souris, 250 rats, 24 porcs) sera associée à des hydrogels cellules ou à de la graisse (durée totale de l'anesthésie : 30 minutes par rongeur ou 2 heures par mini-porc). Pendant la chirurgie, un prélèvement sanguin sera effectué. Afin d’avoir un applicatif clinique, il est nécessaire d’évaluer si la cryopréservation des construits permet d’obtenir la même performance que des construits préparés extemporanément, de ce fait 150 souris et 130 rats seront implantées avec des construits ayant bénéficié de différentes méthodes de cryopréservation. Toutefois, la procédure appliquée à ces animaux est identique à celles expliquées précédemment. Pour les souris et les rats, un essai de survie cellulaire in vivo sera suivi longitudinalement par bioluminescence. À cette fin, les animaux seront placés sous anesthésie gazeuse (10 minutes). Pour les rats et les porcs (utilisant une chambre d'ingénierie tissulaire pour la reconstruction du sein), le suivi longitudinal de la croissance du lambeau sera effectué par IRM à 1, 3, 6, 9 mois et 1 an après l'implantation. Pour cela, les animaux seront sous anesthésie gazeuse (durée de la procédure : 30 minutes par animal).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pouvant être constatés sont une irritation ou une inflammation locale à proximité du matériau, des risques de rejet ou de toxicité locale et systémique. Afin de limiter les risques, de nombreuses expériences in vitro ont été effectuées, ne montrant pas de signe de toxicité. De plus, des mesures sont mises en place et les animaux feront l’objet d’une vigilance quotidienne et rigoureuse pour détecter tout signe de souffrance ou d’approchement de point limite. Un contrôle du site opératoire sera réalisé lors de chaque visite quotidienne. La prise pondérale sera évaluée deux fois par semaine. Un traitement antidouleur sera administré, et si nécessaire, des mesures telles que l'explantation ou la mise à mort de l'animal seront envisagées en fonction de la gravité de son état.
Devenir
Du fait de notre protocole, nos animaux ne peuvent pas être replacés. Il est nécessaire de mettre à mort nos animaux pour réaliser nos prélèvements histologiques.
Remplacement
Nous avons employé une variété de techniques in vitro pour évaluer l'impact de nos polymères sur le destin des cellules, y compris leur survie et leur différenciation ainsi que sur l'angiogenèse en utilisant la membrane chorioallantoïque de poulet comme modèle. Toutefois, afin de déterminer pleinement les performances de nos biomatériaux en matière de régénération tissulaire, il est impératif de procéder à des essais in vivo. Ces expériences permettront de prendre en compte la complexité d'un système physiologique réel, incluant notamment les réponses inflammatoires, la formation de tissu cicatriciel, et les processus naturels de guérison. Les études in vivo nous fourniront ainsi des données cruciales pour optimiser notre technique avant de franchir l'étape des études cliniques.
Réduction
Une étude pilote sera réalisée dans un premier temps afin de vérifier que les conditions expérimentales choisies sont adéquates. Les études in vitro précédemment réalisées ont démontré l’efficacité des différents polymères résorbables quant à leur influence sur la survie et la prolifération cellulaire ainsi que sur la différenciation adipocytaire. Elles ont permis une sélection des polymères permettant le maintien des adipocytes et favorisant la néovascularisation. Elles ont également pu donner une idée du temps de résorption des polymères dans un liquide physiologique reconstitué à 37°C. Les expériences seront réalisées de manière séquentielle, ce qui permettra de limiter le nombre de répétition en fonction des résultats des groupes précédents. En fonction des résultats, les tests statistiques adéquats seront utilisés pour analyser les résultats.
Raffinement
Afin de limiter au minimum toute souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies à raison de maximum 5 animaux par cage pour les souris et en hébergement unique pour les rats et les mini-pigs. Cet environnement est enrichi (balle pour le mini-pig par exemple) et dans des conditions classiques de stabulation (température régulée, cycle jour/nuit). Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés de 7 à 10 jours dans leur salle d’hébergement. Les animaux seront manipulés individuellement avant la mise en place de l’expérimentation et dans une pièce séparée des autres animaux afin réduire leurs stress et angoisse. Lors de l’expérimentation, les animaux seront anesthésiés avant toute procédure pouvant provoquer un stress, une angoisse ou une souffrance. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement, de manière à pouvoir détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance ou d’angoisse. En cas de souffrance (modification de l’apparence, prostration, poil hérissé, perte de poids…), un traitement analgésique sera envisagé. Des points limites adaptés pour chaque procédure seront définis avant l’expérimentation et dans le cas où ceux-ci seraient atteints ou que le traitement analgésique n’aurait pas d’effet, les animaux seront mis à mort selon la méthode définie (avec anesthésie au préalable). La mise à mort sera réalisée à distance des autres animaux.
Choix des espèces
Le porc et le rat sont des espèces appropriées pour étudier les processus de régénération de la peau car les structures anatomiques et physiologiques de leurs peaux sont celles qui ressemblent le plus à celle des humains. Le rat est un animal que nous avons fréquemment utilisé dans nos études précédentes et dont le modèle est maitrisé. De plus, notre équipe maîtrise maintenant la levée des lambeaux chez ces espèces pour nos modèles de régénération du sein. La taille du porc et du rat nous permet de tester plusieurs conditions sur un seul animal et ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Notre intérêt s’est porté sur les souris standards, immunodéprimées utilisées dans une étude de reconstruction de la peau humaine et humanisées qui permettent d’évaluer le comportement de cellules/tissus humains en présence de nos biomatériaux. Les souris sont âgées de 8 semaines et pesant 20 à 23 grammes afin que les souris aient atteint leur maturité sexuelle. Utiliser des souris matures permet d'avoir une taille adéquate pour réaliser l'implantation. Les rats adultes sont agêes de 15 semaines minimum afin d'avoir une réserve de graisse sous-cutanée suffisante pour réaliser les implantations et permettre de tester plusieurs conditions expérimentales sur un même animal. Pour les porcs, nous utiliserons deux types d'animaux : des porcs 45 à 55kg pour la reconstruction de la peau afin d’éviter d’avoir un hypoderme trop épais (car la zone à reconstruire serait trop importante et peu représentative d’un hypoderme humain) et des porcs de 70 kg pour la reconstruction du sein afin que la taille de l’animal soit compatible avec l’implantation de chambre équivalente à celle que l’on pourrait implanter chez l’humain.
Evaluation de l’effet antitumoral de vaccins anti-CD40 dans les cancers dérivés d’une infection au Papillomavirus Humains (HPV)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Pour mettre au point un vaccin contre le papillomavirus et les cancers qu'il provoque, 695 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une greffe de 20 000 cellules tumorales sous la peau, puis subit des mesures de tumeur au pied à coulisse tous les deux ou trois jours et jusqu'à huit prélèvements sanguins submandibulaires sur animal vigile. Le porteur décrit une tumeur qui se développe sous la peau sans toucher les organes internes, tout en prévoyant le cas d'un échappement métastatique provoquant perte d'appétit, amaigrissement, agressivité et isolement. Deux points limites sont annoncés, la nécrose de la tumeur et sa taille quand elle gêne la mobilité de l'animal, avec une surveillance tous les deux ou trois jours à partir du vingtième jour après la greffe.
Objectifs
Cette étude fait partie d’un projet de recherche translationnelle (d’une étude pré-clinique vers une évaluation clinique) pour déterminer le meilleur protocole de vaccination contre le papilloma virus et contre les cancers en dérivant. Pour cela, différents paramètres vont être affinés : les voies d’injection, la nécessité d’utiliser ou non un adjuvant et la fréquence d’administration du vaccin. Enfin dans le cadre de l’effet anti-tumoral, l’efficacité de cette vaccination sera testée en prophylaxie, mais également en thérapeutique.
Bénéfices attendus
Ce projet est dans la continuité d’études préexistantes utilisant une technologie particulière pour la vaccination. Le vaccin est un anticorps qui cible des cellules importantes dans la mise en place d’une réponse immunitaire vaccinale. Ce type de vaccin a démontré une bonne efficacité pour d’autres pathologies. Pour certains de ces pathogènes, ce vaccin a permis de générer une réponse immunitaire mémoire protectrice. Cette étude nous permettra d’étudier les réponses immunitaires mémoires générées, et en particulier ces cellules avec un plus haut degré de protection. Bien sûr, de manière plus large, ce projet vise à introduire un nouveau type de vaccin contre le Papillomavirus Humain avec des propriétés thérapeutiques anti-tumorales. Ce type de vaccin cible des populations plus vulnérables dans les pays en voie de développement qui ont une faible couverture vaccinale, associée à un système de prévention et de diagnostic non optimal.
Procédures
Dans ces procédures, les vaccins sont injectés à des moments précis selon la procédure impliquée. Ces injections ne durent que quelques secondes, sur des animaux sous anesthésies, et selon un volume en adéquation avec les limites autorisées ne dépassant pas 50µl. Des prélèvements périodiques de sang sont pratiqués sur les souris au cours des procédures. Il s'agit d'un prélèvement submandibulaire à Jour 0, 8, 15, 21, 28 et 35. (Dans le cadre des expérimentations sur 90 jours, deux autres points de prélèvement sont effectués, à jour 60 et 90). Ces prélèvements ne durent que quelques secondes également, et sont pratiqués avec une fine aiguille sur animaux vigiles. Sur les procédures de croissance tumorale, une greffe de cellules tumorales est effectuée. Les cellules tumorales sont injectées par une seringue avec une fine aiguille. La greffe se fait en sous cutanée, le geste durant 10 à 20 secondes sur animaux vigiles. Enfin la mesure des tumeurs se fait de manière périodique (2-3 jours) par l’intermédiaire d’un pied à coulisse. La mesure dure 30 secondes sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Les souris impliquées seulement dans la procédure de vaccination ne subissent pas de nuisances ou d’effets indésirables lourds, outre les injections répétées du vaccin. La réponse immunitaire générée est sans conséquence sur l’animal tout le long de la cinétique expérimentale. En revanche, les animaux impliqués dans les procédures de croissance tumorale sont greffés avec des cellules tumorales via une injection sous-cutanée. Cette greffe produit des lésions cutanées tumorales, puis le développement d’une tumeur. La croissance tumorale est cependant contrôlée à la fois par la quantité de cellules injectées et par la cinétique expérimentale associée à cette dose. La dose de cellules tumorales injectée est de 20 000 cellules, elle a été définie au sein d’un laboratoire partenaire et a fait l’objet d’une publication. La tumeur se développe sous la peau, les organes internes de l’animal ne sont pas touchés. Le mal-être de l’animal issu d’une défaillance d’organes ne peut donc pas être atteint, excepté en cas d’échappement métastatique. Dans ce cas des métastases se forment dans les organes internes de l’animal provoquant des changements physiologiques comme « perte d’appétit » (sans aucun autre signe clinique) et « amaigrissement », puis des changements comportementaux comme « agressivité » et « isolement ». Des nuisances ou effets indésirables apparaissent en fin de cinétique au niveau de la tumeur avec notamment l’apparition de parties nécrosées au sein de la tumeur et sa taille pouvant gêner la mobilité de l’animal. Ces deux points sont alors des points limites expérimentaux.
Devenir
L'ensemble des animaux est mis à mort afin de déterminer l'évolution de la réponse immunitaire sur la totalité de la cinétique expérimentale.
Remplacement
Sur la question du « Remplacement », les expérimentations in vitro ne rendent pas compte de toute la complexité rencontrée dans la mise en place de la réponse immunitaire (multi-cellulaires et multi-organes), et de la relation entre le système immunitaire et la tumeur, notamment à cause des différents organes et types cellulaires impliqués. A l’heure actuelle il n’existe pas de modèles expérimentaux in vitro ou ex vivo qui permettent de suivre la réponse anti-tumorale. L’expérimentation animale reste dans ce cas la solution de référence pour étudier l’effet du vaccin anti-CD40.E6-E7.
Réduction
Dans le cadre de la « Réduction », nous avons calculé le nombre minimal de souris nécessaires pour que les résultats soient significatifs. Ce nombre, impliquant tous les groupes des trois procédures, est estimé à 695 souris et est calculé sur la base d’une formule statistique validée et couramment utilisée dans ce cadre.
Raffinement
Pour les stratégies de « Raffinement », nous allons donner tous les produits nécessaires au bien-être animal, réduisant au maximum la souffrance animale, qu’elle soit physique ou psychique. Au niveau de l’hébergement au cours de l’expérimentation, des produits d’enrichissement sont utilisés comme différents types de neslets, des tubes de carton et des dômes de carton. Au cas où la souffrance animale apparait après échappement métastatique sans que nous puissions la résoudre, nous avons créé une grille regroupant les symptômes caractéristiques. Cette grille nous permet d’évaluer la souffrance de l’animal, et ainsi de définir des points limites. Si ces points limites sont atteints, nous sacrifions l’animal. L’animal sera surveillé sur la base de cette grille à partir du vingtième jour après la greffe tumorale sachant que les symptômes décrits dans la grille ne doivent pas apparaitre sur l’ensemble de la cinétique expérimentale. La surveillance se fera tous les 2-3 jours, jusqu’à la mise à mort.
Choix des espèces
La souris est l’espèce majoritairement utilisée pour les modèles du cancer, et ces modèles se prêtent généralement aisément à un transfert de technologie chez l’Homme. De plus, les modèles murins ont cet avantage d’avoir un catalogue de modifications génétiques et de lignées cellulaires importantes qui permettent un meilleur décryptage des voies de signalisation et mécanismes impliqués dans les effets observés. Ainsi les souris sélectionnées pour cette étude qui sont immunocompétentes et qui présentent donc une réponse immunitaire complète, pourront être comparées dans leurs réponses immunitaires aux souris ayant des modifications génétiques. Les souris sont âgées de 6-12 semaines, afin de limiter la variabilité liée à l’âge qui nécessiterait d’utiliser plus d’animaux.
Mise en évidence de l’effet anti-cancéreux d’un vaccin immunothérapeutique dans les tumeurs sous-cutanées de souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une injection de cellules tumorales sous anesthésie, puis quatre injections de vaccin, chacune sous anesthésie : 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs tumeurs. Le porteur décrit une douleur possible au point d'injection, puis des douleurs liées au développement de la tumeur et une dégradation visible de l'état des animaux, absence de toilettage, prostration, lenteur des mouvements. Il attend du vaccin les mêmes effets que chez l'humain, inflammation, fièvre et douleurs musculaires. Il affirme par ailleurs connaître assez bien le modèle pour arrêter chaque expérience "bien avant d'atteindre les points limites", alors que la dégradation qu'il décrit constitue un critère classique de point limite.
Objectifs
Les traitements par l’immunothérapie anti-cancéreuse ont révolutionné le traitement de certains cancers. Cependant de nombreux patients restent non-répondeurs à ces traitements. Les vaisseaux à endothélium épais associés aux tumeurs (TA-HEV) sont des vaisseaux sanguins particuliers qui servent de portes d’entrées majeures à des lymphocytes tueurs. Ces lymphocytes sont des cellules du système immunitaire capable de tuer les cellules cancéreuses. L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet antitumoral d’un vaccin immunothérapeutique qui permettra d'augmenter les vaisseaux TA-HEV, donc d'augmenter les portes d'entrées au sein de la tumeur pour permettre un meilleur recrutement des lymphocytes tueurs.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mettre en évidence un effet anti-tumoral puissant médié par les lymphocytes T et les TA-HEV. Cela permettra donc à court terme d’établir la preuve de concept de l’effet antitumoral du vaccin. Et à plus long terme de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique permettant de traiter des patients non répondeurs aux thérapies anti-cancéreuses actuellement disponibles.
Procédures
Les souris subiront une injection de cellules sous anesthésie (2-3 minutes) et subiront 4 injections de vaccins sous anesthésie (10 secondes à 1 minute)
Impact sur les animaux
L’injection des cellules tumorales peut induire du stress et une douleur légère au site d'injection. Le développement tumoral peut aussi causer des douleurs et une dégradation visible de l’état des animaux (absence de toilettage, prostration, lenteur dans les mouvements…). Les vaccins peuvent avoir des effets indésirables identiques à ceux observés chez l'homme : inflammation, fièvre et douleurs musculaires.
Devenir
L’ensemble des animaux est mis à mort à l'issue de la procédure pour des prélèvements de tumeurs
Remplacement
La procédure réalisée sur l’animal dans le contexte de ce projet ne peut pas être remplacée par des méthodes expérimentales alternatives. En effet, il n’est pas possible à l’heure actuelle de disposer de modèles in vitro permettant d'intégrer à la fois le système immunitaire, le développement d'une tumeur et le système vasculaire sanguin. De plus les vaisseaux auxquels nous nous intéressons dans ce projet ne conservent pas leur caractéristiques en dehors d'un organisme vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque expérience a été déterminé à partir de nos études antérieures et de la littérature scientifique. Il est de 20 animaux pour chaque groupe afin d’avoir un nombre suffisant d’animaux pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives.
Raffinement
La stratégie de raffinement se base premièrement sur une connaissance approfondie du développement tumoral des modèles : les résultats d’expériences précédemment établies et publiés nous permettent de connaître précisément le moment où la réponse immunitaire anti-tumorale est maximale et nous ont permis d'établir le point final de chaque expérience qui se situe bien avant d'atteindre les points limites. Le suivi des animaux sera réalisé quotidiennement par les expérimentateurs et des soigneurs en suivant une grille de scoring conçue spécifiquement pour ce projet. Les injections de vaccins seront réalisées sous anesthésie générale afin de réduire au maximum la douleur et le stress des animaux.
Choix des espèces
La souris est un organisme modèle génétiquement proche de l’être humain, ce qui en fait un modèle préclinique de choix très utilisé dans les domaines de la cancérologie et de l’immunologie. L'étude présentée ici nécessite aussi l'utilisation d'un modèle mammifère car les ganglions lymphatiques sont apparus tardivement au cours de l'évolution. Des souris âgées de 6 à 10 semaines seront utilisées car à ce stade, ces animaux ont un système immunitaire mature.