Oncologie

640 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules de mélanome, six injections d'immunothérapie et un prélèvement de sang par voie rétro-orbitaire, la tumeur pouvant "gêner le déplacement de l'animal". Les tumeurs sont récupérées après mise à mort. Les retombées annoncées pour les patients, améliorer la prise en charge du mélanome métastatique, restent renvoyées au conditionnel et au long terme, le porteur affirmant que seul un modèle in vivo permet d'étudier la résistance aux traitements et le système immunitaire.

Objectifs

Le mélanome est la forme la plus agressive des cancers de la peau. Malgré les progrès majeurs apportés par l'essor des immunothérapies, près d’un patient sur deux résiste encore aux traitements. Il demeure donc crucial de comprendre les mécanismes de résistance mis en place par les cellules cancéreuses et de proposer de nouvelles combinaisons thérapeutiques. L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet d’une combinaison de traitement par immunothérapie sur 2 modèles murins de mélanome, et d’appréhender les mécanismes d’action de ces anticorps sur le système immunitaire et les cellules tumorales.

Bénéfices attendus

Le mélanome métastatique est le cancer de la peau le plus agressif. Malgré l’essor récent des immunothérapie dans le traitement du mélanome, des problèmes de résistance sont observés. Tester de nouvelles pistes de combinaisons thérapeutiques avec l’immunothérapie permettrait à terme d’améliorer la prise en charge des patients.

Procédures

Dans ce projet, les animaux seront soumis à 1 injection sous-cutané de cellules de mélanome, qui se fera à 2 manipulateurs et durera moins d'une minute. Ils subiront également 6 injections d’immunothérapie, réalisées en intra-péritonéal, à raison de 2 injections tous les 2 jours. L'injection durera environ une dizaine de seconde. Les animaux subiront aussi un prélèvement sanguin par voie rétro-orbitaire. Le prélèvement se fera sous anesthésie et durera moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Le traitement par immunothérapie, déjà utilisé dans des précédents protocoles pour d’autres types tumoraux, n'induit pas d'effet secondaire entrainant une dégradation de l'état général de l'animal. Les nuisances attendues sont l'apparition de tumeur localisée sur le flanc droit qui pourra possiblement gêner le déplacement de l'animal. Le prélèvement rétro-orbitaire pourra aussi provoquer une irritation de l'oeil.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les tumeurs pour des analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Seul un modèle in vivo chez l’animal peut permettre d’étudier la capacité tumorigénique et la résistance aux traitements dans une tumeur. En parallèle, des analyses complémentaires seront réalisées in vitro dans des lignées de mélanome, et sur des prélèvements tumoraux de patients, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Cependant, ces modèles ont des limites et ne permettent pas l'étude du système immunitaire. C’est pourquoi le recours aux animaux est nécessaire dans notre projet.

Réduction

Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet a été calculé au minimum pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et reproductibles. Notre projet sera réalisé dans un premier temps sur la moitié de l'effectif prévu, et si les résultats sont satisfaisants, nous poursuivrons sur le reste de l'effectif.

Raffinement

La bonne connaissance des modèles expérimentaux, le suivi adapté des points limites précoces et clairement définis, et la manipulation des animaux par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum toute douleur ou souffrance des souris. Nous évaluerons l'état de bien-être ou de souffrance des animaux au minimum 2x/semaine. Une anesthésie sera réalisée avant le prélèvement rétro-orbitaire afin de diminuer le stress généré, et des gouttes de Collyr seront appliquées afin de prévenir une irritation de l'oeil.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour l’étude du mélanome. Bien qu'il existe certaines différences entre l'immunologie murine et humaine, d'innombrables découvertes chez la souris sont transposables chez l'homme. Le modèle murin de mélanome que nous utilisons miment bien la pathologie chez l'homme. D'autre part, la richesse des réactifs disponibles (notamment immunothérapie) permet une compréhension très approfondie des phénomènes mis en jeu du niveau moléculaire au niveau de l'organisme, un atout déterminant dans notre projet. Des souris adultes de 6 semaines (âge standard pour ce genre d'étude) seront utilisées.

54 miniporcs vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de la paroi abdominale sous anesthésie générale d'environ 1h30 avec implantation de deux prothèses, un suivi par IRM et des prélèvements de sang à huit reprises sur dix-huit mois. Les prothèses sont explantées après mise à mort pour analyse. Le porteur justifie le cochon par la transposition des techniques chirurgicales à l'Homme et invoque une directive européenne incitant à produire des "preuves in vivo" pour les dispositifs implantables.

Objectifs

Les hernies et des éventrations sont des pathologies les plus fréquentes de la paroi abdominale (PA). La surpression naturelle de la cavité abdominale pousse le péritoine à travers une zone de faiblesse acquise ou congénitale de la PA vers les tissus sous-cutanées pour créer un sac dans lequel une partie des viscères viennent se loger. Le traitement est chirurgical. L'utilisation de prothèse textile de renfort de paroi est largement adoptée dans le monde. Leur utilisation a permis de réduire de 20% le taux de récidives comparé à la technique de réparation par suture direct. Malgré cela, le taux de récidive demeure élévé (10 à 15%) et de nombreuses complications sont encore signalées (douleur chronique, infection, sérôme). La discordance à l'interface biomatériau-tissu hôte est la principale cause de récidives et de complications postopératoires. Parmi les facteurs affectant l'intégration à l'interface de l'implant et le tissu biologique, il y a la réponse inflammatoire exagérée, la mauvaise recolonisation de l'implant par le tissu biologique ou l'absence de ferméture de la couche myofasciale antérieure. La nature de la réaction immunitaire générée par les macrophages par la présence de l'implant (réponse au corps étranger) semble jouer un rôle déterminant, qui régule l’homéostasie du tissu conjonctif pariétal (TCP) et la fonction des cellules musculaires. Lorsque celle-ci est pro-inflammatoire, il y a formation de fibrose persistante autours de l'implant générant un tissu cicatriciel inflammatoire. En revanche, une réaction anti-inflammatoire est pro-régénératrice conduit à un remodelage des tissus et la néo-formation d'un tissu conjonctif sain autours de l'implant. De façon intéressante, il apparait que l'utilisation de prothèses de renfort de paroi à base de matériaux biosynthétiques résorbables présentent une meileure tolérence clinique. Nos données in vitro indiquent que les prothèses résorbables et partiellement résorbables à base du biopolymère résorbable en acide lactique, le PLLA (Poly-L-Lactic Acid) favorisent la réponse anti-inflmmatoire des macrophages. Selon la littérature, le lactate (produit lors de la résorption du PLLA) oriente les macrophages vers un état anti-inflammatoire. Par cette étude préclinique; chez le miniporc, nous souhaitons évaluer les réponse biologiques et biomécaniques ces prothèses en PLLA in vivo implantées dans la région ventro-caudale et notemment de la nature de la réponse inflammatoire du tissu pariétal de l'hôte.

Bénéfices attendus

Les hernies et les éventrations demeurent un problème de santé majeur dans le monde, accentuée par le vieillissement de la population et l'augmentation des facteurs de co-morbidités (diabète, obésité, tagagisme...) qui complique la prise en charge chirurgicale de cette pathologie de la PA. En France, on dénombre plus de 45000 cures de hernies réalisées en 2017, et ce nombre a augmenté de 33% au cours des 5 dernières années. Cette étude préclinique permet d'apporter un regard scientifique sur les différentes prothèses de renfort de paroi afin d'améliorer leur indications en clinique. De plus, par cette approche fondamentale, cette étude permettra d'apporter des élements de preuve in vivo de leur effets sur le plan de la reconstition du tissu biologique pariétal en favorisant la réponse anti-inflammatoire pro-régénératrice. A cela se rajoute l'étude de leur comportement biomécanique permettant de mieux comprendre le fonctionnement de la prothèse textile une fois implantée dans le PA. De plus, l’impact du facteur mécanique dans l’intégration à l’interface est très peu évalué. En effet, il y a un manque de données sur comportement de la prothèse une fois implantée et sur son adéquation avec le comportement biomécanique de la paroi abdominale. Ce qui suggère qu’il est nécessaire de connaître précisément les propriétés de la PA lésées ou après agression chirurgicale (propriétés mécaniques, orientations, hétérogénéités de la zone considérée) en présence de nos prothèses en PLLA. Ces données précliniques vont ainsi alimenter les besoins cliniques dans la cure des hernies abdominales primaires et incisionnelles, en apportant au chirurgien un choix éclairé par des critères rationnels afin de limiter les risques de complications, douleurs chroniques et récidives.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une chirurgie de la paroi abdominale sous anesthésie générale par laparotomie avec l'implantation de prothèses de renfort et de réfection de paroi en position extra-péritonéale (sans rentré dans l'abdomen). La durée moyenne de la chirurgie est estimée à 1h30, de la prémédication et l’anesthésie de l’animal à la fin de la procédure d’implantation. La durée de l’examen d’imagerie médicale IRM est 20 minutes environ. Un seul tube de sang (volume de 5 ml) sera prélevé au niveau de la veine de l’oreille sur tous les animaux à 8 temps différents : 1. lors de l’intervention chirurgicale (préopératoire) 2. 7 jours post-opératoire 3. 15 jours post-opératoire 4. 1 mois post-opératoire - 3 mois post-opératoire -. 6 mois post-opératoire - 12 mois post-opératoire -18 mis post-opératoire. La procédure de prélèvement est la suivante. Après avoir nettoyer le site de prélèvement avec de l'alcool, un garrot à la base de l'oreille est réalisé pour visualiser la veine, en commençant le plus possible au bout de l'oreille. Au total, la réalisation de cette recherche nécessite l'utilisation de 54 miniporcs adultes (50 - 60 kg) sur une durée maximale de 5 ans

Impact sur les animaux

1) Les effets indésirables attendus liés à la chirurgie peuvent être : - douleur postopératoire, - appation d'hématome, - infection du site opératoire - mauvaise cicatrisation de la plaie chirurgicale. - occlusion intestinale avec un risque élevé de péritonite avec un risque faible du fait que les prothèses sont implantées en position extra-péritonéale. 2) Les effets indésirables attendus liés à l'examen d'IRM : des réactions imprévisibles au produit de contraste ne sont pas exclues. Elles sont habituellement passagères et bénignes : - sensation de chaleur dans tout le corps - goût étrange dans la bouche, pendant moins d’une minute ; - nausées durant quelques secondes (voire, plus rarement, vomissements) ; - apparition d’un petit hématome cutané lié à la piqûre (sans gravité, il se résorbe de lui-même en quelques jours) ; - fuite sous-cutanée du produit de contraste, au niveau de la veine, due à la pression durant l’injection.

Devenir

A la fin de chaque protocole, tous les animaux seront euthanasiés pour l'explantation des prothèses afin de réaliser d'une part une analyse moléculaire et histologique des tissus de la paroi abdominale autours de la prothèse (tissu prothétique) et d’autre part, analyse biomécanique de chaque prothèse explantée. En cas de point limite portant atteinte au bien-être de l’animal, celui sera également euthanasié.

Remplacement

La nouvelle directive 93/42/EEC incite les fabricants de dispositifs implantables de plus de 30 jours à collecter des preuves in vivo permettant de démontrer non seulement la sécurité du produit mais aussi son efficacité. Tels sont les objectifs de notre recherche préclinique sur le miniporc, démontrant : 1) l'implantation du prototype (nouveau produit) de prothèse de renfort de paroi 100% résorbable en PLLA présente une sécurité et l'innocuité à long terme sur un modèle animal relevant et proche de l'Homme. 2) les bénéfices sur le plan biologique de l'utilisation de biomatériau résorbable PLLA dans la confection des prothèses partiellement ou totalement résorbables avec à l'appui les mécanismes biochimiques et moléculaires sous-jacents dans un système biologique intégré du tissu pariétal vivant. Ces effets biologiques porteront sur la régulation positive de l'inflammation permettant un remodelage tissulaire des tissus lésés de la PA antérieure pathologique (hernie) en rapport avec la cinétique de résorption du PLLA dans les conditions physiologiques transposables en clinique. 3) le comportement biomécanique des prothèses une fois implantées et incarcérées dans le tissu pariétal.

Réduction

La réalisation des procédures par un chirurgien clinicien rompu à ces manipulations garantit une bonne reproductibilité et permet de limiter le nombre d’animaux à engager dans les protocoles. Par ailleurs, afin de limiter le nombre d’animaux nécessaire, nous envisageons dans cette recherche à implanter deux différentes prothèses dans la paroi abdominale sur un même animal. De plus, la procédure expérimentale est parfaitement maîtrisée permettant une évaluation efficace de l’innocuité d’un candidat-implant et ses fonctions attendues.

Raffinement

La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance de l’animal. Les miniporcs seront hébergés dans un environnement en accord avec la norme européenne 2010/63/UE et donc répondant à leur besoins physiologiques (Température entre 10-21°C, avec un cycle lumière 12h:12h) et éthologiques (taille des boxes, enrichissements...). Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de l’étude, avec un suivi journalier des miniporcs sur leur hydratation, la prise alimentaire ainsi que leur état générale (agressivité, prostration…). Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale avec l’usage d’analgésie afin de limiter la douleur post-opératoire. Celle-ci est ponctuelle et est réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Les animaux seront particulièrement surveillés après l'implantation des différentes prothèses de renforts pour visualiser tout signe d’intolérance ou de complications post-opératoire imprévues qui nécessiteraient la mise à mort de l’animal. Les équipes impliquées dans le projet sont constituées de spécialistes des approches in vivo, ce qui assure des pratiques expérimentales maitrisées, ainsi qu'un soin et un hébergement des animaux dans des conditions optimales. Médecins chirurgiens, vétérinaires et animaliers spécialisés associeront leurs compétences pour assurer la meilleure prise en charge des animaux après chaque procédure. L’examen rapproché des animaux opérés est réalisé quotidiennement notemment au niveau du site de l’implantation des prothèses, qui permettra de déceler rapidement une complication post-opératoire en lien avec le matériel prothétique.

Choix des espèces

Le modèle animal est souvent utilisé dans les études précliniques des hernies ventrales ou inguinales avec l’utilisation de nouvelles prothèses de renfort de paroi. Les procédures d’implantation sont toutes effectuées en une seule opération. L’espèce animale utilisée pour cette recherche est le miniporc. Celui-ci permet une transposition des techniques chirurgicales utilisées en pratique clinique courante chez l'Homme et de démontrer l’efficacité fonctionnelle de la candidat-prothèse de renfort à traiter la hernie abdominale. En général, des animaux mâles et femelles seront utilisés indifféremment dans ce projet, en adéquation avec l’hétérogénéité de la clinique. De façon exceptionnelle, des femelles seront fortement privilégiées dans les études sur les hernies ombilicales afin de réduire le risque de l'infection de la cicatrice abdominale liée à la chirurgie. Celle-ci est à proximité de l'appareil génitale chez le mâle, qui risque d'être sous les jets d'urine lors de la miction.

48 souris vont être utilisé·es, gardées en vie et conservées comme reproductrices dans l'élevage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une douzaine de semaines d'apprentissage par renforcement positif, elles passent des tests comportementaux décrits comme "potentiellement modérément anxiogènes" pour évaluer une méthode de capture moins stressante. Le porteur indique que les animaux sont placés dans des situations qu'ils "éviteraient probablement en conditions naturelles" et que leur "liberté comportementale est donc affectée". Il affirme que le projet reste utile "tant que l'élevage et l'expérimentation sur des rongeurs" existent.

Objectifs

Dans un cadre expérimental, les souris sont généralement attrapées à la main par la queue ou en les incitant à entrer dans un tube de transport. Bien qu'il ait été démontré que ce dernier type de manipulation soit moins stressant, il impose l’ouverture de la cage par l’expérimentateur ce qui est susceptible d'induire un certain stress chez la souris capturée et chez celles qui partagent sa cage. En outre, les difficultés rencontrées pour attraper les souris dans des environnements d'hébergement enrichis et complexes, par la queue ou à l’aide d’un tube de transport, peuvent conduire à freiner l'adoption de ces nouveaux types d'hébergement, qui amélioreraient considérablement le bien-être de ces animaux. En entraînant les animaux à venir volontairement dans une boite de transport, en utilisant un apprentissage par renforcement positif, on réduirait l'anxiété due à l’ouverture de la cage et à la capture, et on autoriserait l'utilisation d'environnements plus complexes sans créer de contraintes supplémentaires pour les expérimentateurs. Le premier objectif de ce projet de recherche est de développer un protocole d’apprentissage basé sur le conditionnement opérant, de sorte que chacune des souris, vivant dans un petit groupe social, apprenne à répondre à un signal sonore, différent pour chacune, en venant dans une boite de transport connectée à leur cage d'origine. L'animal pouvant alors être transporté jusqu'au dispositif expérimental. Notre deuxième objectif est de déterminer si cette procédure permet de réduire l'anxiété des animaux comparativement à une manipulation classique dans un tube de transport.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont l’obtention d’animaux moins stressés lors de la manipulation. Les manipulations des animaux sont nécessaires lorsque les animaux sont placés dans les dispositifs expérimentaux, ou changés de cage. Outre l’intérêt éthique d’éviter le stress, ce stress lié à la manipulation peut notamment affecter les mesures effectuées lors de divers tests comportementaux et affecter la qualité des expériences scientifiques utilisant des animaux de laboratoire. La capture d’animaux dans des environnement complexes (diverses parois, et enrichissements) peut s’avérer encore plus délicate et stressante. Cette procédure permettrait, une fois développée et automatisée, la capture plus aisée des animaux dans ces environnements complexes sans créer un stress supplémentaire ni compliquer le travail des expérimentateurs.

Procédures

Durant une première phase s'étalant sur une douzaine de semaine, les animaux connaitront un apprentissage où les animaux seront récompensés en effectuant certaines tâches. Les animaux seront ensuite soumis à des tests comportementaux non invasifs de brève durée (5 minutes chacun). Les deux premiers sont réalisés l'un à la suite de l'autre. Le second le jour suivant. Ces tests sont réalisés à deux reprises, à une semaine d'intervalle.

Impact sur les animaux

Deux nuisances peuvent résulter du projet. D'une part, les animaux seront soumis à des situations anxiogènes lors des procédures de test, Un certain stress pourra donc en résulter. D'autre part les animaux sont placés activement par l'exprimentateur dans des situations qu'il éviterait probablement en conditions naturelles. Sa liberté comportementale est donc affectée. Les tests comportementaux non invasifs effectués sont communément utilisés pour évaluer l’anxiété des animaux et sont donc potentiellement modérément anxiogènes. Ces tests ne durent que 5 minutes chacun, limitant ainsi la durée de l’exposition des animaux à cette situation anxiogène. Les animaux conservent la possibilité de rester en retrait des zones les plus anxiogènes des dispsitifs de test.

Devenir

A l'issue de la procédure expérimentale, les animaux n'ayant pas été, en apparence, particulièrement perturbés par les tests comportementaux (après avis du vétérinaire et de la personne en charge de la structure bien être animal), sont maintenus dans l'élevage afin de servir de reproducteurs pour la génération suivante d'animaux.

Remplacement

Le projet visant à élaborer une méthode moins stressante de manipulation des souris ne peut se passer de l’expérimentation sur l’animal. Il est en effet nécessaire que les animaux puissent exprimer leur comportement pour évaluer l'efficacité de cette nouvelle méthode sur une base comportementale. Ce projet demeure d'intérêt tant que l'élevage et l'expérimentation sur des rongeurs, impliquant systématiquement une manipulation des animaux existe.

Réduction

Un total de 4 groupes de 12 individus est prévu. Deux groupes (24 individus) ayant appris à répondre à un stimulus sonore. La comparaison de ce 2 groupes a pour objectif d'évaluer chez des individus ayant connu un même apprentissage, les niveaux de stress liés à un accès volontaire (à un signal sonore), ou incité par l'expérimentateur dans la boite de transport (méthode classique). Deux autres groupes (24 individus) ne sont pas soumis à l'apprentissage. Ces deux groupes permettent d'évaluer l'effet de la procédure d'apprentissage sur les niveaux de stress des animaux. Ils permettent d’évaluer cet effet lors d'un accès via la boite de transport connectée au dispositif et lorsque les animaux sont manipulés de manière classique. Des comparaisons statistiques pourront alors être effectuées sur ces 4 groupes de 12. Cet effectif tient compte de la variabilité interindividuelle relativement importante pouvant exister chez cette souche sauvage de souris. En outre, ces mêmes individus seront testés une nouvelle fois une semaine plus tard, où les individus des différents groupes seront alors incités à entrer dans la boite de transport de manière différentes à celle qu'ils ont connu la fois précédente. Nous tentons d'assurer avec cette répétition qui accroît la puissance des tests statistiques que malgré le nombre relativement réduit d'individus par groupe, un effet marquant de l’accès volontaire à la boite de transport sur les niveaux d'anxiété des animaux sera mis en évidence.

Raffinement

Toutes les cages utilisées pour l’hébergement des animaux dépassent largement le minimum requis pour l ‘hébergement de deux individus (31 x 20 x 14 cm) et sont enrichies par deux tubes de carton, du matériel de construction pour faire un nid et des bûchette de bois. Un suivi quotidien des animaux utilisés permet de vérifier que les procédures d’apprentissage employées, les moyens utilisés pour le transport des animaux et les tests comportementaux ne conduisent pas les animaux à adopter des comportements pouvant traduire un stress ou mal-être chronique. Des points limites sont définis en amont et des mesures appropriées seront prises en cas de blessures ou de comportements anormaux.

Choix des espèces

Les souris domestiques sont les animaux les plus utilisés en expérimentation animale, cette espèce est donc celle qui est la plus concernée par les questions relatives aux manipulations par les expérimentateurs. Nous n’utilisons pas une souche de souris particulière, mais des animaux d’origine sauvage élevés en laboratoire depuis de 15 générations dans notre laboratoire en tentant de préserver au mieux une forte diversité génétique. Nous espérons de ce fait que résultats obtenus sur ce modèle seront d’autant plus généralisables aux diverses souches de souris de laboratoire. Tous animaux utilisés sont des adultes (70 à 160 jours). Cette tranche d’âge est communément utilisée dans bon nombre d’études chez la souris, permettant le transfert de nos résultats à ces nombreuses études.

84 souris mâles âgées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur pulmonaire par voie veineuse, une immunothérapie anti-PD1, une supplémentation nutritionnelle, et passent des tests de force et d'endurance sur dynamomètre, tapis roulant et rotarod. Le porteur indique que la pousse tumorale peut entraîner difficultés respiratoires, perte de poids, isolement et léthargie. Il affirme que la culture cellulaire ne permet pas d'aborder les relations inter-organes et conclut à la nécessité de l'animal.

Objectifs

L’immunothérapie est une stratégie thérapeutique en plein essor, notamment dans le cancer du poumon, car elle n’induit pas de toxicité secondaire comme les traitements par radiochimiothérapie. Son efficacité reste cependant à améliorer car tous les patients ne répondent pas aux traitements d’où la nécessité de travailler sur des traitements adjuvants. Nous souhaitons combiner 2 approches pour améliorer cette efficacité : - nutritionnelle : supplémentation en acides gras polyinsaturés et en béta-hydroxybutyrate - activité physique : mise en place d’enrichissement dédié à l’augmentation de l’activité physique volontaire.

Bénéfices attendus

Nous attendons à ce que nos traitements améliorent l’efficacité de l’immunothérapie. Pour voir cela, nous suivrons l’évolution du volume tumoral. Des traitements adjuvants tels qu’une supplémentation nutritionnelle ou la mise en place d’une activité physique adaptée est envisageable au cours du traitement par immunothérapie chez les patients. Il y a donc une réelle possiblité de transfert des résultats obtenus dans ce projet en clinique.

Procédures

Les supplémentations nutritionelles se feront ad libitum, par remplacement de l’eau de boisson par le béta-hydroxybutyrate et avec des croquettes pour les acides gras en débitant une semaine vant la tumorigenèse puis pendat les 30 jours du suivi tumoral. L’implantation des tumeurs sera effectuée par injection I.V dans la veine de la queue. Le suivie du volume tumoral par imagerie de biolomuminescence durera 30jours. L’administration de l’immunothérapie sera effectuée tous les 4 jours pendant les 30 jours de tumorigenèse par injection intra-péritonéale d’anicorps anti PD-1. La tumorigenèse sera suivie par imagerie avec calcul du volume tumoral sous anesthésie à l’halothane. La mesure de la synthèse protéique sera effectuée après injection sous cutané d’un traceur (isotope stable). Le test d'agrippement sera réalisé à l'aide d'un dynamomètre munie d'une grille où la souris s'accroche, le manipulateur tire alors la souris par la queue. La mesure de la vitesse maximale de course sera effectuée sur un tapis roulant, le test s'arrête quand la souris est épuisée, elle reste alors sur une grille en bout de tapis. Le test dure en moyenne une quizaine de minutes. Une habituation au tapis de course aura leiru en amont du test. Le test d'équilibre au rotarod se déroule sur un cylindre en rotation, les souris seront habituées à cette procédure en amont. Le test dure en moyenne 2-3 minutesLe passage en echoMRI implique une légère contention des animaux dans un tube placé dans l'appareil. La mesure dure 1 minute environ. Les mesures de performances physiques ainsi que l'echoMRI auront lieu juste avant l'implanttaion (J0) puis à J15 et J30 post-implantation.

Impact sur les animaux

La tumorigenèse peut s'accompager de difficultés respiratoires, d'une perte de poids, de comportements anormaux, tels que l'isolement social, la léthargie, l'agressivité́ accrue ou une altération de la locomotion. Les souris seront surveillées quotidiennement pour suivre leur comportement général.

Devenir

tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole pour prélèvements de sang et de tissus

Remplacement

L’utilisation d’animaux, dans ce projet est absolument nécessaire et ne peut être remplacer par l’utilisation de systèmes de culture cellulaire à 2 voire 3 dimensions. En effet, ces systèmes ne permettent pas d’aborder les relations inter-organes et de mesurer simultanément la digestibilité des acides gras polyinsaturés w3 et du béta-hydroxy-butyrate, l’évolution de la fonctionnalité musculaire, de la performance et de la mobilité, le métabolisme protéique musculaire et le statut inflammatoire circulant et enfin l’évolution du volume tumoral.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans en compromettre les objectifs. Il a été déterminé par un calcul d’échantillonnage. Le nombre de souris nécessaires à l’étude est calculé pour une différence attendue de 25% pour le volume tumoral entre les souris supplémentées en acides gras ou en béta-hydroxybutyrate + activité physique et les souris nourries avec un régime standard. Des études antérieures ont montré que la variabilité du paramètre choisi est de 14%. L’effectif est calculé pour un risque de 1ère espèce alpha de 5% et un risque de 2ème espèce béta de 5%. Ainsi, le nombre de souris nécessaires par groupe est de 8. Toutefois, afin d’anticiper une mortalité éventuelle liée à la tumorigénèse, nous avons choisi de débuter l’étude avec des groupes de 12 souris. Le nombre total de souris nécessaires à la réalisation de ce projet est donc de 84. Pour comparer les résultats des différents paramètres mesurés, nous utiliserons une ANOVA (analyse de la variance) à 2 voies (effet régime, effet activité physique, interaction) suivie d’un test de comparaisons multiples, le test de Tukey si les conditions d’utilisation de l’ANOVA sont remplies (normalité des résidus et égalité des variances). Dans le cas contraire, le test non paramétrique de Kruskal-Wallis suivi d’un test de comparaisons multiples non paramétriques, le test de Dwass-Steel, seront réalisés.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Les souris seront hébergées par 6. Tous les animaux auront un accès illimité à leur régime et à l’eau de boisson. Quotidiennement, l’animalier observera le comportement général de chaque souris, son apparence et contrôlera la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur le cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Une grille d'évaluation définissant des points limites sera mise en place. Elle permettra d'identifier des points limites notables et des points limites graves. Si un animal présente 3 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum.

Choix des espèces

Pour réaliser notre projet d’étude, nous avons choisi la souris C57BL/6 car nous allons leur injecter des cellules tumorales issues de souris C57BL/6. Le modèle de tumorigenèse est donc syngénique et orthotopique. De plus, ces souris sont très actives en environnement enrichi ce qui est crucial pour tester l’effet de l’activité physique volontaire. Nous avons utilisé cette espèce par le passé et validé toutes les procédures détaillées dans ce dossier avec ces souris. Chez l’homme, le cancer du poumon non à petites cellules est diagnotiqué à l’âge moyen de 65 ans. Nous utiliserons par conséquent des souris mâles adultes de 50 semaines.

540 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales pancréatiques humaines et des injections répétées, la tumeur pouvant provoquer gêne, douleur et démangeaisons au-delà d'un certain volume. Le porteur indique que les souris ne peuvent être ni replacées ni réutilisées, aucune technique ne garantissant l'absence de prolifération des cellules greffées. Il affirme qu'il est "primordial" de tester d'abord le composé chez la souris avant les patients.

Objectifs

Le cancer du pancréas est un cancer rare, l'un des plus difficiles à soigner. En effet, étant longtemps asymptomatique, il est souvent détecté à des stades avancés, ce qui rend son traitement difficile. Un composé d'intérêt donne de bons résultats sur des cellules cancéreuses du pancréas en culture. L'objectif de ce travail est donc d'évaluer l'impact thérapeutique de ce composé chimique sur l'évolution du cancer du pancréas, dans un modèle de tumeurs pancréatiques, greffées chez la souris immunodéprimée.

Bénéfices attendus

En validant l'efficacité de cette chimiothérapie sur un modèle de cancer pancréatique chez la souris, ce projet pourrait améliorer à long terme la survie des patients souffrant d'un cancer du pancréas.

Procédures

Tous les animaux subiront les traitements suivants: Injections sous-cutanées, 1 fois par animal, 10s; Greffe cellules tumorales, 1 fois par animal, durée maximale: 2 mois; Injection intrapéritonéale, 5 fois par animal, 10s ; Anesthésie gazeuse, 1 fois par animal, 3 min maximum.

Impact sur les animaux

S’il y a prise de greffe et formation de tumeurs sous-cutanées, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer une gêne et une douleur lorsqu’elles dépassent un certain volume. La tumeur peut induire une tension de la peau, ce qui peut engendrer des démangeaisons et des irritations. Les injections intrapéritonéales répétées peuvent induire aussi une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Une hypothermie peut être observée à l'issue de l'anesthésie gazeuse.

Devenir

Tous les animaux entrant dans la procédure seront mis à mort en fin de procédure. L'injection de cellules tumorales entraîne le développement de tumeurs, développement qui doit être surveillé. Ces souris ne peuvent donc pas être replacées, ni réutilisées, même si la greffe ne semble pas avoir pris: ces cellules peuvent à plus ou long terme induire le développement de tumeurs. Nous n'avons pas de techniques qui permettent d'affirmer qu'aucune des cellules injectées ne prolifère, dans le cas où la greffe ne semble pas avoir pris.

Remplacement

Nous avons démontré en culture l'efficacité du composé chimique sur la survie des cellules tumorales pancréatiques. Pour tester son efficacité chez les patients, il est maintenant primordial de le tester d’abord sur un modèle murin, animal proche de l’homme dans le développement tumoral.

Réduction

Nous avons effectué des hypothèses statistiques pour calculer la taille d'échantillon optimale pour chaque procédure.

Raffinement

Pour s’assurer du bien-être des souris durant la prise de greffe tumorale, elles bénéficieront d'un milieu avec un enricissement adapté. Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l’animalerie et par la personne en charge de la procédure tous les deux à trois jours, afin de détecter tout signe de douleur. Pour limiter la possibilité de souffrance induite par des injections intrapéritonéales répétées, les injections seront réalisées à l’aide d’aiguilles très fines, quasi indolores. Des points limites spécifiques à chacune des procédures ont été définis. Tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques, en particulier grâce à l'utilisation d'animaux génétiquement modifiés et à l'élaboration de nombreux outils d'analyse mis en point pour cet animal. L'expérimentation sur animal est d'autre part indispensable pour tester nos modèles in vitro chez l'animal et ainsi vérifier la faisabilité d'études cliniques. Le modèle de souris utilisé ici est le meilleur modèle animal connu pour éviter tout rejet de greffe de cellules tumorales humaines. En effet, ces souris peuvent supporter une greffe de cellules humaines.

48 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime obésogène pendant douze à vingt-quatre semaines, des injections deux fois par semaine, des mises à jeun et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline nécessitant gavages et prélèvements caudaux répétés. Le porteur indique que le surpoids peut gêner les déplacements et que la contention dans le tube d'échoMRI peut être anxiogène. Il affirme que le recours au modèle animal est "indispensable" pour une approche intégrée de plusieurs organes, et limite l'étude aux mâles.

Objectifs

L'obésité et le diabète de type 2 constituent des défis majeurs pour la santé publique à l'échelle mondiale, engendrant des conséquences graves sur la qualité de vie des individus et imposant un fardeau économique croissant. Ces affections sont souvent associées à un état inflammatoire , communément appelée "inflammation à bas bruit". L'inflammation à bas bruit représente un état caractérisé par des niveaux d'inflammation systémique faibles, mais persistants, qui peuvent ne pas être détectés par les symptômes cliniques traditionnels. Cette inflammation chronique de bas niveau a été étroitement associée à la pathogenèse et à la progression de l'obésité et du diabète de type 2. Cependant cette inflammation à bas bruit est-elle la cause ou la conséquence de ces pathologies est une question qui n’est pas encore tranchée dans la communauté scientifique. Comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent cette relation complexe est impératif pour développer des stratégies de prévention et de traitement efficaces visant à atténuer l'inflammation à bas bruit et, par conséquent, à améliorer la prise en charge des maladies métaboliques. Ce projet de recherche vise à approfondir notre compréhension de cette interaction complexe en examinant en détail les voies biologiques et les facteurs déclencheurs qui contribuent à l'inflammation à bas bruit dans le contexte de l'obésité et du diabète de type 2. En particulier nous allons étudier l’effet d’un composé pharmacologique aux propriétés anti inflammatoire développé par une start-up dans deux situations distinctes : La prévention ou la thérapie de ces maladies métaboliques. En d’autres termes nous espérons apporter des éléments de réponse à la question : Inflammation et maladies métaboliques :cause ou conséquence ?

Bénéfices attendus

Ce travail devrait permettre de répondre aux questions suivantes : Le composé pharmacologique aux propriétés anti-inflammatoires démontrées, est-il en capacité de prévenir l’installation des maladies métaboliques et/ou de traiter ces maladies une fois qu’elles sont installées. Les résultats obtenus devraient nous permettre d’apporter des éléments de réponses quant à l’association des maladies métaboliques à l’inflammation à bas bruit. De plus si ce composé à des effets bénéfiques, alors on peut imaginer que cela puisse un jour être un traitement pour ces maladies.

Procédures

L’ensemble de l’effectif du projet recevra un régime alimentaire obésogène de type HFHS et sera soumis à un suivi de masse corporelle hebdomadaire (12 24 pesées sur 12 ou 24 semaines de régime pour la procédure 1 ou 2 respectivement ). Une mesure de masse grasse et masse maigre par EchoMRI (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 3 minutes) en semaines 12 et 24 sera réalisée. Des prélèvements sanguins au niveau caudal après légère incision du bout de la queue (0,5-1mm) et post anesthésie locale (crème EMLA 30-45 minutes avant le premier prélèvement) seront également réalisés en semaines -S11 (pocédure 1 et 2) et S23 (procédure 2) pour la réalisation des tests métaboliques (OGTT et ITT). Dans chaque procédure il y a aura deux injections par semaines pendant 12 semaines soit 24 injections. Une injection IP (volume 100µl), réalisée par un expérimentateur maitrisant le geste technique ne prends pas plus de 10 secondes, préhension de l’animal incluse. Concernant OGTT et ITT, respectivement 6 et 5 prélèvements caudal seront nécessaire. Un prélèvement réalisé par un expérimentateur maitrisant le geste technique ne dépasse pas 15 secondes, préhension de l’animal incluse

Impact sur les animaux

Les animaux en régime High Fat /High Sucrose peuvent avoir des difficultés à se mouvoir en raison du surpoids. Toutefois, cela n’a jamais observé après 12 semaines de régime. Une attention particulière sera portée aux animaux de la procédure 2 qui eux seront sous régime HF/HS pendant 24 semaines Les préhensions des animaux lors des pesées, des injections intra péritonéales peuvent causer au moins au début du protocole un peu de stress sur les animaux. Pour diminuer au maximum ce stress (et éviter également que ce dernier puisse perturber le protocole), les animaux seront manipulés lors de la deuxième semaine d’acclimatation par le même expérimentateur qui procédera au différentes mesures hebdomadaires. De la même manière, les injections intrapéritonéales seront réalisées par un expérimentateur maitrisant parfaitement ce geste technique Les test de tolérance oral au glucose (OGTT), les test de tolérance à l’insuline (ITT) nécessitent des mises à jeun de 4h. Les mises à jeun de 4h se font sur la matinée en dehors de leur phase de nourriture nocturne et n’a donc que peu d’impact mais permet de s’affranchir des variations interindividuelles du métabolisme glucidique. L’OGTT, nécessite une préhension des animaux afin de les gaver avec la solution de glucose ce qui est invasif pour les souris (maîtrise du geste par un expérimentateur formé). L’ITT nécessite une préhension des souris et une injection intrapéritonéale d’insuline qui peut également être invasive (maîtrise du geste par un expérimentateur formé). OGTT et ITT nécessitent des mesures de glycémie pendant 2h. Ces mesures sont réalisées à l’aide d’un glucomètre par prélèvement d’une micro goutte de sang L’EchoMRI nécessite de faire entrer les souris dans un tube plastique dans lequel elles doivent rester 3 minutes, ce qui peut être anxiogène (maîtrise du geste par un expérimentateur formé).

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés sous anesthésie selon le planning prévu par l’étude afin de réaliser des prélèvements sanguins et tissulaires.

Remplacement

Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu plusieurs organes (intestin, tissu adipeux et foie). Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires et le nombre d’expériences réalisées sur chaque animal, nous avons adopté la stratégie suivante : - Réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à une analyse statistique robuste de cette expérience à l’aide de tests non paramétrique sachant qu’il y a des variations individuelles dans la mise en place de l’obésité. - Cette série d’expérience se fait uniquement sur les mâles. Si des effets sont observés, la necessité impérative de reproduire les données avant publication se fera alors sur les deux sexes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales avec un enrichissement de leur milieu adapté. Ils bénéficieront d’un suivi quotidien de leur état général. Lors des procédures expérimentales, les actes susceptibles d’entrainer une souffrance ou une douleur seront réalisés soit sous anesthésie locale, soit sous anesthésie générale. S’agissant d’un projet nécessitant l’utilisation d’animaux vivants, l’utilisation de techniques non invasives et indolores est privilégiée afin d’acquérir les paramètres physiologiques nécessaires au projet tout en respectant les questions d’éthiques en expérimentation animale et la règle des 3R. De plus, des points limites en adéquation avec ce projet ont été définis. En cas d’atteinte d’un de ces points limites, l’animal concerné sera retiré du projet. Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet.

Choix des espèces

La souris est utilisée car son métabolisme présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme. . Ce modèle est largement documenté dans la bibliographie scientifique dans les études de maladies métaboliques Les animaux seront réceptionnés au centre de zootechnie à l’âge de 8 semaines, stade adulte des souris. Le début du régime HF/HS commencera à partir de 10 semaines et se terminera soit a 22 semaines (S12) (procédure 1) soit à 34 (S24) semaines (procédure 2)

400 têtards de xénope vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit sous anesthésie une transplantation de cellules de drosophile dans le chiasma optique, puis est disséqué pour observer l'enroulement de ces cellules autour des neurones. Le porteur indique qu'une transplantation peut traverser une veine et provoquer une hémorragie, l'animal étant alors tué dans les cinq minutes, et que l'exposition au métronidazole tue environ 10 % des têtards. Il revendique le remplacement de vertébrés comme la lamproie par un invertébré, la drosophile, et justifie le xénope par sa transparence et sa position sur l'arbre évolutif.

Objectifs

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie du système nerveux central qui dans sa forme la plus fréquente évolue par poussées et régressions des symptômes. La régression des symptômes, plus ou moins complète en début de la maladie, devient de moins en moins complète au cours de la progression de la maladie. La SEP associe une atteinte inflammatoire et de dégénérescence des neurones. Depuis les 30 dernières années des progrès considérables ont été réalisés dans la prise en charge du volet inflammatoire de la maladie. En nous attaquant à la compréhension du processus de mise en place des couches (myéline) qui entourent les neurones, pour les protéger et permettre une conduction nerveuse rapide, nous espérons pouvoir identifier des cibles thérapeutiques pour lutter contre la dégénérescence des neurones dans la SEP.

Bénéfices attendus

Dans un premier temps le bénéfice de notre projet est fondamental, conduisant à comprendre les signaux minimums qui permettent la mise en place de la couche de protection autour des neurones (myéline). A plus long terme notre ambition est d’ouvrir des voies thérapeutiques dans les maladies dégénératives dont la plus fréquente est la sclérose en plaques.

Procédures

Dans notre protocole expérimental, les têtards seront soumis à une étape de transplantation des cellules dans le chiasma optique sous anesthésie générale. Du début à la fin de l’anesthésie nous estimons que la durée ne dépassera pas 10min. Le chiasma optique est la structure anatomique dans laquelle les deux nerfs optique (un pour chaque œil) se croise. Réaliser la transplantation dans le chiasma optique, nous permet d’envisager que les cellules transplantées migreront dans les nerfs optiques et seront facilement identifiables et analysables. Cette procédure de transplantation n’a lieu qu’une seule fois par animal, sous anesthésie générale, avec un taux de survie dépassant les 90 pour cent pour les concentrations de cellules injectées. L’exposition au métronidazole (molécule permettant de mettre en place le modèle) entraine une perte d’environ 10 pour cent de têtards. La même technique d’anesthésie est utilisée pour une observation du nerf optique au macroscope, mais le têtard est cette fois ci placé sur une petite boite dans une goutte d’anesthésiant, l’observation ne dépasse pas 5 min, ce qui fait que le têtard est anesthésié au maximum pendant 10 min. Ces observations auront lieu 5 fois pendant toute la durée du protocole. Pour le comportement, les têtards sont amenés dans la pièce agréée dans leur bac, et prélevés délicatement avec une épuisette pour les placer dans une large boite avec leur milieu de nage. Leur nouvel environnement ne semble pas induire de stress car aucun comportement de fuite n’est observé. Cette expérience n’est réalisée que 2 fois et dure moins de 5 minutes par têtard. A la fin de la procédure les têtards seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

L’anesthésie est maintenue durant toute la durée de la procédure pour ne pas engendrer de stress chez le têtard mais peut entrainer des risques cardio-respiratoires, les battements du cœur sont donc fréquemment contrôlés durant l’anesthésie (facilement visible chez les têtards). La capture avec une épuisette peut générer un stress, ainsi que le changement d’environnement lors du test comportemental. L’exposition au métronidazole (molécule permettant de mettre en place le modèle) entraine une perte d’environ 10 pour cent de têtards. Lors de la transplantation, il est possible de traverser une veine, ce qui provoque une hémorragie, dans ce cas-là, à la reprise de la nage à la suite de l’anesthésie, le têtard peut soit nager de travers, soit avoir une poche de sang visible. Le têtard est donc directement euthanasié dans les 5 minutes après la transplantation.

Devenir

Suite aux transplantations, les têtards sont euthanasiés pour observer les cellules gliales de Drosophile qui ont été injectées dans le chiasma optique. Cette euthanasie est nécessaire pour observer l’enroulement possible des cellules gliales de Drosophile autour des neurones de Xénope, et cette observation n’est possible qu’après dissection des têtards.

Remplacement

L’enroulement autour des axones par des cellules gliales (myélinisation), comme la remyélinisation (suite à une ablation de ces cellules gliales, évènement de démyélinisation), ne peut que difficilement s’étudier sur un autre modèle que chez les vertébrés. Une autre possibilité eut été d’utiliser deux espèces de vertébrés : Tous les vertébrés sont myélinisés sauf les plus anciens, dépourvus d’une mâchoire à savoir la lamproie et la mixine. Nous aurions pu ainsi transplanter des cellules gliales de lamproie dans le système nerveux de Xénope. Afin d’éviter l’utilisation de ces vertébrés nous avons préféré les remplacer par la Drosophile, qui est un invertébré, dont les cellules gliales ne s’enroulent par autour des axones (au plus 1 à 2 tours) mais forment des empilements protégeant les axones.

Réduction

La transparence des têtards de Xénope permet de suivre in vivo la progression des expériences et ainsi d’éviter des suivis histologiques nécessitant l’euthanasie des têtards expérimentaux à différents points critiques du protocole. Le chiffre de 400 têtards utilisés pour ce projet a été déterminé de sorte à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en s’assurant de résultats statistiquement robustes. Il est à noter que dans un souci de respecter au plus près la règle des 3R ces expérimentations in vivo ne seront que l’aboutissement d’études préalables, n’entrant pas dans le champ d’une demande Apafis, réalisées sur des co-cultures de cellules de Drosophile et de Xénope.

Raffinement

Les têtards sont placés dans un bain à une température de 23 degrés celsius avec une pompe pour oxygéner l’eau. L’eau (moitié osmosée moitié dure) est renouvelée régulièrement pour maintenir un volume suffisant et réduire l’accumulation des déchets urémiques. L’eau est oxygénée de manière plus importante après anesthésie pour permettre une meilleure récupération du têtard. Les têtards sont observés quotidiennement, et ceux qui présentent des anomalies (déformations, retard de développement, troubles de la nage…) sont euthanasiés, les cadavres liés aux problèmes de développement et les surplus de nourriture sont aussi retirés de l’eau quotidiennement. De plus, des branches de plantes artificielles sont placées dans les bacs des têtards, qui leurs permettent de se cacher dessous. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Pour les manipulations, les têtards sont attrapés par une épuisette, ce qui n’entraine normalement pas de blessures ou de comportements anormaux suite à la capture. Pour le comportement, les têtards sont amenés dans la pièce agréée dans leur bac, et attrapés par une épuisette pour les placer dans une large boite de Pétri (145 x 20mm) avec leur milieu de nage. Leur nouvel environnement ne semble pas induire de stress car aucun comportement de fuite n’est observé. Les têtards sont isolés seulement 5 minutes avant d’être replacés dans leur bac d’origine avec leurs congénères, ce qui n’entraine pas de troubles de comportement visible. Durant l’exposition au métronidazole (molécule permettant de mettre en place le modèle), les têtards sont placés dans un incubateur opaque. Cette absence de cycle jour/nuit n’impacte pas les têtards car nous n’avons pas observé de stress ou d’augmentation de la mortalité durant les 10 jours d’exposition. De plus, les têtards aiment les zones qui sont peu lumineuses, ils se cachent naturellement dans les plantes et dans les tuyaux. Le passage à l’obscurité n’est donc pas une perturbation pour eux.

Choix des espèces

Le choix du Xénope se justifie pour 3 raisons : 1) le Xénope vit à la même température que les Drosophiles, critère indispensable pour créer les transplantations 2) les têtards de Xénope sont transparents, ce qui facilite le suivi in vivo de l’expérimentation (respect du critère réduction) ; 3) contrairement aux poissons (osteichtyens(danio) ou chondrichtyen) les amphibiens (Xénope) sont les premiers vertébrés sur l’arbre évolutif à utiliser un profil protéique myélinique différent dans le système nerveux central et périphérique. Les transplantations seront réalisées à différents stades de développement : au début de la myélinisation (stade 48) et des têtards déjà bien myélinisés juste avant la métamorphose (stade 55-60). Ceci afin de déterminer le stade auxquels les axones sont le plus "aptes" à être myélinisés.

1038 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau, des injections de composés radioactifs et des prélèvements de sang, pour étudier la réponse immunitaire induite par la radiothérapie interne vectorisée. Le porteur affirme que cette radiothérapie n'induit aucune nuisance car utilisée à dose réduite, et fixe le volume tumoral toléré à 1500 mm3. Il conclut qu'il n'existe "pas de méthodes alternatives à ces expériences de preuve de concept in vivo".

Objectifs

Les mécanismes associant la radiothérapie et la réponse immunitaire dirigée contre les tumeurs restent à explorer. La radiothérapie conventionnelle utilisant des rayons X (RTE) est dédiée aux tumeurs localisées, la radiothérapie interne vectorisée (RIV) permet elle d'irradier spécifiquement les tumeurs métastatiques. Nous proposons d’étudier l’immunité induite par la RIV et la RTE. Dans ce projet, 4 approches complémentaires seront utilisées pour évaluer cette réponse immunitaire en fonction de la présence ou de l’absence de gènes d’intérêt dans les souris. Au maximum 1038 souris pourront être utilisées pour ces 4 études sur une durée de 5 ans. Le nombre d’animaux sera réduit au minimum tout en ayant un nombre suffisant pour obtenir un résultat statistiquement significatif. Toutes les expériences sont menées par du personnel formé et compétent. Ces études découlent de premiers résultats in vitro et in vivo réalisés au sein du laboratoire. Les animaux sont surveillés quotidiennement et pesés 2 fois par semaine. Dès qu’un animal présentera l'un des points limites définis dans le cadre de nos expériences, il sera pris en charge immédiatement.

Bénéfices attendus

La radiothérapie interne vectorisée (RIV) peut induire des molécules présentant un fort potentiel thérapeutique. Ces nouveaux agents pourraient constituer une avancée majeure pour la prise en charge des patients atteints de cancer et pour le maintien de leur qualité de vie.

Procédures

- Les greffes sous-cutanées seront effectuées avec un temps de contention réduit au maximum (

Impact sur les animaux

Les nuisances d’un traitement par VECs, administrées par voie intraveineuse ou par voie intratumorale, n’est pas supérieur à celle induite par une greffe de tumeur. Dans ce projet, la RIV n’induit pas de nuisance puisqu’elle est utilisée à la moitié ou au quart de la MTA (maximal tolerated activity). Nous avons démontré dans des études antérieures qu’il n’y a pas de perte de poids, une numération sanguine constante et au-dessus des seuils pendant toute la durée de l’expérience et aucun changement de comportement observable.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés soit parce qu'ils ont atteint un des points limites définis pour chaque procédure, soit pour prélèvements post-mortem à l'issue des expérimentations. En cours d'étude, tout animal démontrant une souffrance irréversible ou inacceptable sera immédiatement euthanasié.

Remplacement

Il s’agit ici d’évaluer l’impact d’une réponse immunitaire associée à la RIV et son impact sur le développement tumoral. Il n’existe pas de méthodes alternatives à ces expériences de preuve de concept in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique et fixé à 8 souris par groupe. Enfin, les expériences intègrent les impératifs éthiques, les modalités d’hébergement, d’enrichissement du milieu, de prévention de toute douleur, détresse, et/ou inconfort chez l’animal. En outre, le principe des 3R est respecté puisque nous utiliserons des mâles et des femelles (pas de tri dans la colonie). Enfin, une technique d’imagerie SPECT/CT sera mise en place pour visualiser et suivre dans le temps la biodistribution des VECs de manière non-invasive (pas d’animaux supplémentaires).

Raffinement

Concernant les greffes, le temps de contention sera réduit au maximum (20g) par méthode submandibulaire pendant la durée de l’expérience (espacé d’au moins 8 jours) par du personnel formé et compétent (procédure

Choix des espèces

La souris immunocompétente constitue un modèle expérimental de référence pour ce type d’expérience sur la réponse immunitaire. L’étude débutera quand les souris auront entre 6 et 8 semaines. En effet, à ce stade le système immunitaire sera mature.