Oncologie

2500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris immunodéprimée reçoit une transplantation de cellules pancréatiques humaines sous la capsule rénale et un prélèvement sanguin hebdomadaire à la queue, pour évaluer la fonction du greffon avant transplantation chez le patient. Le porteur indique n'avoir noté aucune incidence sur le bien-être des souris lors du projet précédent et traiter la douleur chirurgicale, toutes les souris étant tuées pour récupérer le rein porteur du greffon. Il affirme travailler à une technique in vitro de remplacement mais la juge encore trop peu robuste pour fournir des résultats exploitables.

Objectifs

Lors de la transplantation des îlots de Langerhans chez le patient, la fonction primaire du greffon apparait comme le principal facteur pronostic de succés et son amélioration représente l'un des principaux enjeux dans le domaine. Aprés l'isolement de ces cellules, même aprés avoir obtenu une préparation d'îlots quantitativement importante, il est difficile de prédire la fonction après transplantation. L'évaluation pré-greffe (in vitro) consiste en un comptage, une viabilité, la pureté et la capacité à secréter de l'insuline. Malheureusemment, ces techniques ne corrèlent pas avec la fonction greffée chez le patient. Le modèle de souris xénogreffée montre, quant à lui, une bonne corrélation de fonction. L'objectif général du projet est donc, d'étudier les cellules pancréatiques humaines transplantées chez le patient, en transplantant une fraction chez la souris immunodéprimée, afin d'en évaluer la fonction. Cela se fait notamment par dosage spécifique du Peptide-C humain circulant dans le plasma de la souris.

Bénéfices attendus

La transplantation des cellules pancréatiques nous permettra : - D'une part, d'étudier la fonction des cellules pancréatiques humaines provenant de donneurs de phénotype différent (age, taille, poids, habitus...) et - D'autre part, de prédire la fonction du greffon cellulaire transplanté chez le patient recevant les cellules issues du meme donneur.

Procédures

Les animaux subiront un seul acte chirurgical à savoir la transplantation de cellules humaines sous la capsule rénale, traité par les anti-douleur adéquats (durée 15 minutes). Aussi, un prélevement sanguin hebdomadaire au niveau de la queue permettra de doser les hormones plasmatiques.

Impact sur les animaux

Ce projet etant un renouvellement d'un projet précédent, nous n'avons noté aucune incidence néfaste au bien etre des animaux transplantés. Les eventuelles douleurs notamment dues à la chirurgie sont palliées par un traitement anti-douleur adéquat. De la même manière, un traitement anti-douleur local (xylocaine) sera effectuée au niveau de la queue pour la prise de sang hebdomadaire.

Devenir

Nous envisageons la mise a mort de tous les animaux car en fin de protocole, nous récupérons le rein proteur du greffon pour étude immunohistochimique ou étude dynamique ex-vivo.

Remplacement

L'étude de fonction des ilots transplantés ne peut se faire sans faire avoir recours à l'animal car il n'xiste pas de technique in vitro performante qui permet de maintenir les cellules pancréatiques vivantes sur le long terme. Nous travaillons sur la mise en place d'une technique in vitro d'étude des cellules appelée périfusion en vue de remplacer l'animal, mais les données ne sont actuellement pas suffisemment robustes pour obtenir des résultats quantifiables et statistiquement exploitables. De plus, du fait de l'extreme hétérogénéité des donneurs d'organe, il n'existe pas de modèle d'étude ex vivo, organe-sur-puce, ou autre modele biostatistique qui permettent d'obtenir des résultats satisfaisants à l'heure actuelle. Aussi, l'usage de l'animal est necessaire pour 1) reproduire l'acte de la transplantation, 2) étudier les cellules humaines dans un organisme entier, et 3) maintenir les cellules vivantes pendant plusieurs semaines.

Réduction

Nous utiliserons le juste nombre d'animaux (n=5 animaux par pancréas traités) afin d'obtenir des résultats probants et statistiquement satisfaisants.

Raffinement

Les animaux seront hébergés et traités avec soin (nourriture et eau en illimité, visite quotidienne, cycle jour/nuit régulier). Les animaux recevant une chirugie seront surveiller pluriquotidiennement les 3 premiers jours après chirurgie puis quotidiennement. L'acte chirugicale se fera sous anesthésie et traitement de la douleur (pré et post opératoire - buprénorphine 0,05mg/kg) renouvelé selon le besoin. De plus, la chirurgie et les prélèvement sont réalisées par du personnel formé et sensible aux régles d’éthique expérimentale et qui manipule les animaux quotidiennement afin de les faire coopérer.

Choix des espèces

Les outils génétiques permettent de générer des animaux mutants immunodéficients disponibles facilement. De plus, nous disposons de tous les outils (anticorps, kits de dosages, animalerie) pour mener une étude facilité sur cet animal. Les souris Swiss Nude constituent un bon compromis puisque leur déficience d'immunité permet une bonne implantation des cellules humaines. Nous utiliserons des animaux adultes pour un geste chirurgical aisé.

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales puis deux à cinq injections de molécules anticancéreuses, avec un suivi de la croissance des tumeurs sur les flancs, pour étudier la mort cellulaire dite immunogène. Le porteur indique que les tumeurs peuvent gêner les souris et que la chimiothérapie peut entraîner perte d'appétit et de poids, les analyses se faisant sur organes après mise à mort. Il revendique un modèle "complet et fonctionnel" irremplaçable in vitro et présente un algorithme d'intelligence artificielle comme moyen de réduire à terme le nombre d'expériences.

Objectifs

La chimiothérapie est un traitement clé contre de nombreux cancers. Certains médicaments peuvent provoquer un type de mort cellulaire spécifique appelé "mort cellulaire immunogène". Cela déclenche une réponse immunitaire antitumorale tout en protégeant contre la réapparition du cancer. Récemment, des recherches ont montré que bloquer la transcription de l'ARN est crucial pour déclencher cette mort. En utilisant un microscope, nous avons remarqué des changements spécifiques dans le noyau des cellules suite à l'utilisation de médicaments déclenchant la morte cellulaire immunogène. Ces changements sont liés à l'inhibition de la synthèse d'ARN. Nous avons développé un algorithme informatique capable de repérer ces changements dans les cellules sans avoir besoin d'utiliser des colorants. De plus, des études récentes ont montré que les effets secondaires de certains médicaments anticancéreux, comme la toxicité cardiaque ou la stérilité, sont liés aux dommages causés à l'ADN. Cependant, il existe des versions de ces médicaments qui conservent leur efficacité contre le cancer sans provoquer ces effets secondaires. C'est pourquoi nous examinons comment l'arrêt de la transcription de l'ARN et les dommages à l'ADN sont impliqués dans la mort cellulaire immunogène. Ce projet vise à confirmer dans des modèles animaux l'effet stimulant sur le système immunitaire de nouvelles molécules anticancéreuses. Ces molécules ont été sélectionnées soit par des tests sur des cellules évaluant leur impact sur la transcription et l'ADN, soit par des algorithmes informatiques capables de prédire ces effets à partir de leurs caractéristiques chimiques. Nous étudierons également leur effet sur la croissance des tumeurs.

Bénéfices attendus

Les expérimentations précliniques prévues visent à confirmer les effets antitumoraux des nouvelles molécules candidates et à approfondir notre compréhension de la potentielle implication du dommage à l’ADN dans l’immunogénicité. Ces études permettront d’explorer plus en profondeur les mécanismes sous-jacents à ce processus. De plus, nous pourrons évaluer si les molécules issues de l’algorithme d’intelligence artificielle permettant de prédire la capacité des différents composés à induire le dommage à l’ADN et l’inhibition de la synthèse d’ARN, présentent également des propriétés immunogènes. Cette approche constitue un atout en matière de criblage de molécules, offrant la possibilité de réduire considérablement le nombre d’expérimentations nécessaires.

Procédures

Suivant les groupes, les animaux recevront de 2 jusqu’à 5 injections, d’une durée de moins d’une minute chacune, sous anesthésie générale ou locale, dépendamment des injections. Ils seront manipulés brièvement (

Impact sur les animaux

Certains effets indésirables peuvent être observés chez la souris lors des expérimentations, notamment la manipulation et la contention régulière peuvent leur engendrer un stress léger. Les diverses injections pourraient générer des inconforts transitoires et légers. Les traitements chimiothérapeutiques peuvent entraîner des effets modérés comme une perte d’appétit et donc une perte de poids modérée chez la souris. Les tumeurs qui vont se développer sur les animaux pourront croitre et les gêner modérément au niveau des flancs.

Devenir

Chaque procédure requiert l’injection de cellules tumorales, ce qui implique l’impossibilité de garder les souris en vie à la fin de l’expérience. De plus, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez la souris afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro. Ce projet ayant pour objectif de tester si nos composés induisent une réduction de la croissance tumorale et une activation du système immunitaire, il est nécessaire d’utiliser un modèle mimant le plus fidèlement possible l’environnement tumoral et le système immunitaire. Il est actuellement impossible de reconstituer un système immunitaire in vitro/ex vivo du fait de sa complexité. Il est donc absolument nécessaire pour ce projet d’utiliser un modèle in vivo.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes de souris dont le nombre a été déterminé mathématiquement afin permettre une évaluation statistique solide des effets analysés. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail (les procédures sont en ordre séquentiel et non mises en oeuvre si l'hypothèse précédente est invalidé). Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque procédure.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début des expériences puis suivis quotidiennement. Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, et plusieurs fois par semaine lors de l'expérience décroissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux dispo-seront de nids, de tunnels en carton. Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par un système de scoring. Des me-sures seront prises pour limiter le stress : plusieurs souris par cage pour un hébergement en groupes sociaux, animaux hébergés au calme. Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale ou locale selon le geste à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Des points limite ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Le choix d'utiliser la souris dans cette étude repose sur plusieurs raisons importantes. Tout d'abord, la souris est un modèle complet et fonctionnel, offrant des similitudes intéressantes avec le système immunitaire humain, ce qui en fait un modèle utile pour cette recherche. De plus, nous connaissons bien sa génétique, ce qui facilite les études moléculaires et génétiques. Dans notre centre de recherche, la souris est souvent utilisée, ce qui présente des avantages pratiques. Nous disposons d'installations adaptées pour les élever, d’une solide expertise dans les techniques d'expérimentation animale ainsi que dans le suivi vétérinaire et microbiologique. La souris est également largement reconnue dans la communauté scientifique internationale comme un modèle animal standard pour les études précliniques. Son utilisation répandue facilite la comparaison des résultats entre différentes études, renforçant ainsi la validation des observations. Nous utilisons des souris adultes âgées de 8 semaines, car elles possèdent un organisme avec un développement complet et un système immunitaire fonctionnel. Les animaux sont utilisés au stade adulte (8 semaines), afin de disposer d’un organisme dont le processus de développement est achevé et qui possèdent un système immunitaire complet et fonctionnel.

1250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par voie intrapéritonéale des prélèvements biologiques humains ou animaux pour isoler et collectionner des souches de toxoplasme, puis sont tuées pour récupérer les tissus où le parasite s'est enkysté. Le porteur indique surveiller les signes d'infection dans les 72 heures et ne traiter qu'en cas de signes limites, l'infection restant le plus souvent asymptomatique. Sur le remplacement, il affirme que la culture cellulaire n'atteint pas la même sensibilité et conclut qu'il n'y a "pas d'alternative in vitro" à la souris.

Objectifs

La toxoplasmose est une parasitose dont la prévalence chez l’Homme, en France, est d’environ 40% dans la population générale. Il s’agit dans plus de 80% des cas d’une infection asymptomatique et bénigne. Plus rarement, cette infection peut revêtir un caractère de gravité, et un traitement médicamenteux peut être mis en place pour limiter les conséquences de la toxoplasmose. Ainsi, chez la femme enceinte,l’infection par ce parasite peut être responsable d’une toxoplasmose congénitale par atteinte du foetus (transmission transplacentaire). Le diagnostic de toxoplasmose congénitale réalisé à la naissance, repose sur la sérologie et l’analyse du placenta et du sang de cordon/sang de bébé. Seule la présence formelle du parasite dans ces liquides biologiques, par biologie moléculaire, permet de déterminer si les prélèvements sont positifs. Dans ce cas, ces prélèvements (liquide amniotique, placenta ou sang de cordon/bébé) venant de toute la France, sont envoyés pour isolements des souches. Le modèle murin, sensible à l’infection par le toxoplasme est donc le plus approprié et le seul disponible, il n'y a pas d'alternative in vitro. Dans le cadre de la recherche, l’inoculation par voie intrapéritonéale à la souris, d’échantillons biologiques permet aussi l’isolement et la collection des souches de toxoplasmes en vue de leur caractérisation phénotypique et génotypique.

Bénéfices attendus

Cette caractérisation contribue à l’étude de la biodiversité du parasite et permet une recherche fondamentale (identification de marqueurs de virulence, de résistance thérapeutique…).

Procédures

Inoculation intrapéritonéale, 2 fois, 30sec - prélèvement à la queue, 1 fois, 1minute

Impact sur les animaux

Dans de très rares cas, l’infection peut être suspectée sur des signes d’infection précoce (poils hérissés, gonflement de l’abdomen).

Devenir

L’euthanasie des animaux est nécessaire pour la récupération des tissus où se sont enkystés les parasites. La réutilisation ou l'adoption de l’animal n'est pas envisageable du fait du traitement préalable. Toutes les souris sont euthansiées.

Remplacement

Le modèle murin est le plus sensible à l’infection par le toxoplasme et est le seul actuellement disponible. Des essais antérieurs au sein du laboratoire n'a pas permis d'obtenir d'isolement de souches par culture. Cependant, des essais supplémentaires sont continuellement effectués pour améliorer la sensibilité de culture cellulaire permettant l'isolement des souches . A l'heure actuelle, il n'y a donc pas d'alternative in vitro.

Réduction

Suite à une comparaison d’efficacité, nous avons transposé ce protocole de diagnostic clinique pour l’isolement de toxoplasmes à partir d’autres prélèvements (animaux ou humains) puis optimisé le protocole en réduisant le nombre de souris nécessaire pour l’obtention de souches de toxoplasmes : le nombre de 2 ou 4 souris par prélèvement permet une optimisation entre la diminution du nombre de souris et la sensibilité de l’isolement. Il n' y aura pas de tests statistiques d'effectuer. Deux animaux pour les petits de volumes de prélèvements et 4 animaux pour des plus gros volumes.

Raffinement

Une surveillance accrue est effectuée dans les 72 heures après inoculation. En cas de signes cliniques limites (points limites) 72h après l’inoculation, laissant supposer une atteinte toxoplasmique, un traitement traitement anti-toxoplasmique sera institué. Ce traitement permet une amélioration des signes cliniques dans les jours suivants. Dans la majorité des cas, le traitement n'est pas nécessaire car il n'y a pas d'apparition de signes cliniques (asymptomatique). Le traitement anti-toxoplasmiques reste exceptionnel. Des copeaux et rouleaux de carton sont ajoutées dans la cage.

Choix des espèces

L’isolement à partir de prélèvements (animaux ou humains) pour l’obtention de souches de toxoplasmes ne peut être que la souris. La comparaison avec la culture cellulaire n'a pas permis d'avoir une sensibilité comparable que l'inoculation à l'animal. Souris de 8 semaines 20g, à ce stade de développement le système immunitaire est bien en place et fonctionnel.

743 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des tumeurs leur sont implantées dans le flanc ou les poumons, suivies de traitements par virus oncolytique et d'injections intrapéritonéales répétées jusqu'à 36 fois, les tumeurs pulmonaires pouvant gêner la respiration. Fortement immunodéprimées, ces souris humanisées sont plus sensibles aux infections, ce que le porteur décrit comme un phénotype dommageable. Il veut induire des structures lymphoïdes dans les tumeurs pour améliorer le pronostic des patients et affirme qu'aucune alternative, pas même les organoïdes, ne remplace le modèle animal.

Objectifs

Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) représentent une cible nouvelle dont le contrôle de la formation est devenu un enjeu en immunothérapie. En effet, les TLS sont à l’origine du développement de réponses immunitaires adaptatives favorables chez les patients atteints de cancers. Il a, récemment, été montré que certaines molécules pouvaient être à l’origine de leur induction. Notre projet vise à évaluer la capacité de ces molécules, exprimées par un virus capable d’infecter la tumeur (virus dit oncolytique), à induire la formation de TLS dans les tumeurs, dans des modèles de souris présentant un système immunitaire humain afin de se rapprocher au mieux de la physiopathologie humaine.

Bénéfices attendus

Notre projet a pour objectif de manipuler les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) à visée thérapeutique afin de les induire chez des patients atteint d’un cancer présentant peu ou pas de TLS, et d’augmenter ainsi leur pronostic vital. Pour répondre à cette problématique, il nous est impossible d’avoir recours à d’autres alternatives que les modèles animaux. En plus de nous permettre d’établir une nouvelle stratégie thérapeutique des cancers, les résultats issus de ce projet nous permettront d’approfondir nos connaissances sur les mécanismes fondamentaux et les molécules intervenant dans la formation de TLS. Si un effet probant est observé, le projet pourra se poursuivre vers un développement clinique.

Procédures

Des tumeurs seront implantées dans le flanc ou dans les poumons des souris par injection de cellules tumorales en sous-cutané ou intraveineuse, respectivement. L’intervention n’aura lieu qu’une fois, durera moins d’une minute et sera réalisée sur souris vigile. L’administration du traitement par voie intra-tumorale ou par voie intraveineuse sera aussi réalisée sur souris vigile, à une seule reprise, et ne durera pas plus d’une minute. L’administration du traitement par instillation intranasale se fera cette fois-ci sur souris anesthésiées et tenues à la verticale. L’opération durera environ 5 min par souris et sera répétée un jour sur deux pendant six jours. Le suivi de la croissance tumorale sous-cutanée se fera pas mesure du volume tumoral au pied à coulisse, 2 fois par semaine, sur souris vigile, et ne durera que quelques secondes. Les injections intrapéritonéales d’un inhibiteur de point contrôle immunitaire seront réalisées 3 fois par semaines en alternant de côté, sur souris vigiles et ne dureront pas plus d’une minute. Les souris seront systématiquement manipulées sous un poste de sécurité microbiologique (PSM) en raison de leur forte immunodéficience (sensibilité élevée aux infections).

Impact sur les animaux

La douleur potentielle liée aux actes d’injections des cellules tumorales et des virus oncolytiques se limitera à l'introduction de l'aiguille au site d'injection et aura lieu au maximum à 2 reprises par animal et par procédure. Il en est de même pour l’injection intrapéritonéale de l’inhibiteur de point de contrôle immunitaire qui aura lieu au maximum 36 fois par animal. La contention des animaux peut procurer un stress ponctuel (quelques minutes). La croissance des tumeurs sous-cutanées pourra générer une gêne physique et des difficultés à la mobilité. La croissance des tumeurs pulmonaires pourra occasionner une gêne respiratoire. Les tumeurs métastasées sont rarement observées. Cependant, si elles surviennent, elles pourraient entraîner de la douleur, perturber le fonctionnement des organes, causer des complications physiologiques, altérer l'alimentation et la nutrition, ainsi qu'impacter la qualité de vie des animaux concernés. Les anesthésies peuvent être associées à des risques d'hypothermie, d'hypoventilation ou encore d'arrêt cardio-respiratoires. Les souris utilisées ont un phénotype dommageable en raison de leur forte immunodépression, elles sont donc plus sujettes aux infections et peuvent être plus sensibles à certains traitements que des souris immunocompétentes.

Devenir

Toutes les souris de ce projet seront euthanasiées afin de prélever les tumeurs et d’analyser l’infiltrat immunitaire du microenvironnement tumoral après chaque procédure.

Remplacement

Nos travaux portent sur l’induction de structures lymphoïdes tertiaires au sein de tumeurs. Ce mécanisme fait intervenir plusieurs paramètres dynamiques et complexes (système immunitaire, systèmes vasculaire et lymphatique) qui ne peuvent pas être modélisés ailleurs que dans des modèles in vivo, pas même dans des modèles d’organoïdes. De plus, dans ce projet nous souhaitons valider de nouveaux virus oncolytiques candidats. Il est donc primordial d’utiliser des modèles in vivo afin d’appréhender leurs interactions potentielles avec l’organisme hôte.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Différents prélèvements seront faits sur les animaux destinés à être euthanasiés, afin d’évaluer la pharmacologie des virus et des substances anti-tumorales utilisés et de réduire ainsi le nombre d’animaux nécessaire. Du fait de la variabilité de la croissance tumorale entre les animaux, particulièrement élevée dans les modèles de souris humanisées, nous utiliserons 12 souris par groupe traité et nous réduirons le nombre de souris à 10 dans le groupe non traité. Nous répéterons jusqu’à trois fois les expériences car la reproductibilité des résultats est une question centrale dans les bonnes pratiques des laboratoires. Tous les groupes expérimentaux seront réalisés simultanément pour réduire le nombre d’animaux contrôles dans le projet. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Nous utiliserons au maximum 743 animaux dans ce projet.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des portoirs ventilés (6 souris maximum par cage) et ne seront expérimentées qu'après une semaine minimum de stabulation. Notre structure a un programme d'enrichissement (placement de nids végétaux et de tunnels en carton dans les cages) lors d'expérimentations supérieures à 15 jours. La stabulation sera conventionnelle et conforme à la réglementation (litière normale, cages ventilées individuellement, 6 animaux maximum par cage de type-IIL, éclairage alterné jour et nuit 12h-12h de 6h-18h), et celles-ci recevront un régime alimentaire classique (nourriture libitum et eau par abreuvage automatique). Compte tenu de leur caractère immunodéficient, les souris seront maintenues dans un environnement stérile (cages individuellement ventilées, change sous hotte, aliment/litière irradiée, autoclavage, etc.). Les animaux seront surveillés quotidiennement par les expérimentateurs et animaliers pendant la durée de chaque expérience. Les animaux seront pesés deux fois par semaine et leur état de santé sera reporté sur une grille de suivi individuel. La présence de points limite définis permettra de stopper les expériences en cas d’atteinte de ceux-ci. Les actes d’instillation intranasale seront réalisés sous anesthésie.

Choix des espèces

Les souris humanisées représentent le seul modèle d’étude préclinique d’une réponse immunitaire de cellules humaines, in vivo. De plus, les propriétés oncolytiques des virus de la vaccine sont nettement supérieurs dans les cellules cancéreuses humaines que dans les cellules cancéreuses murines. Un tel modèle permet d’apprécier à la fois les propriétés oncolytiques directes des virus oncolytiques sur des tumeurs humaines, la capacité d’un armement avec des molécules humaines à stimuler les défenses immunitaires anti-tumorales humaines et, d’appréhender la pharmacocinétique des virus face à un système immunitaire humain afin de mieux extrapoler les effets thérapeutiques du traitement à l’homme. Les souris humanisées seront reçues à l'âge de 22 semaines, puis mises en stabulation pendant une semaine minimum avant de débuter l'expérimentation. La tranche d’âge des souris a été choisi car à ce stade de développement, les souris sont sevrées, ont atteint une taille adulte. Les expériences, visant en partie à mesurer la survie des animaux en réponse à un traitement, dureront au maximum 3 mois ou jusqu’à l’apparition de signes de souffrance, dans le respect de la règle des 3R.