Oncologie

3 570 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des greffes de cellules tumorales dans la glande mammaire ou le poumon, puis des injections d'hormonothérapie, de facteurs de croissance ou de lymphocytes, pour étudier des cellules immunitaires qui favorisent les cancers. La croissance tumorale provoque une asthénie et les souris sont tuées par dislocation cervicale avant d'atteindre les points limites, pour prélever rate, tumeur, foie et poumons. Le porteur affirme que le modèle murin est "indispensable" et qu'aucun système in vitro ni non-vertébré ne peut mimer ces interactions immunitaires.

Objectifs

Le système immunitaire protège généralement contre l'apparition des cancers. Cependant, dans certains cas, les cancers peuvent échapper à protection par le système immunitaire. Des cellules immunitaires particulières, appelées « cellules myéloïdes suppressives (CMS) » contribuent à cet échappement. Ces cellules sont en partie responsables du manque d’efficacité des immunothérapies chez de nombreux patients. De nombreux sous-types de CMS ont été décrites, ce qui rend leur identification problématique. En dehors de leur capacité à bloquer le système immunitaire, les CMS participent à la mise en place de vaisseaux sanguins dans les tumeurs ou au processus métastatique. La notion que ces cellules pourraient s’associer avec les cellules tumorales circulantes (cellules tumorales présentes dans le sang, migrant depuis la tumeur primaire vers des sites distants métastatiques) est un concept récent sur lequel notre laboratoire travaille activement. Ce projet a pour objectifs de caractériser l’influence des CMS sur l’immunité anti-tumorale, la préparation des sites pré-métastatiques et la réponse aux thérapies en utilisant des modèles de cancer murins établis, représentatifs de cancers humains et avec lesquels notre équipe a précédemment publié. Les objectifs principaux sont les suivants : 1) Déterminer la cinétique d’apparition de différentes sous-types de CMS dans différents organes au cours du développement tumoral. En parallèle, une caractérisation précise d’amas cellulaires associant cellules tumorales et cellules immunitaires (dont ces CMS) dans le sang sera réalisée. 2) Déterminer l’influence de sous-types distincts de CMS sur l’apparition de micro-métastases dans des organes distaux ; 3) Evaluer si l’hormonothérapie, des facteurs de croissance ou des chimiothérapies utilisées dans le traitement de nombreux cancers modifient le nombre et les fonctions de ces cellules dans un modèle de cancer mammaire et pulmonaire ; 4) Evaluer le rôle de ces cellules dans la réponse aux immunothérapies.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait apporter des informations nouvelles concernant les multiples rôles des cellules myéloides suppressives dans les cancers. 1) Les données obtenues devraient d'abord permettre de mieux définir les fonctions protumorales de sous-populations différentes de cellules myéloides suppressives. 2) de nouveaux résultats devraient être générés concernant la capacité de ces cellules à préparer les organes situés à distance de la tumeur primaire à l'arrivée de cellules tumorales migrantes (métastatiques). 3) Enfin, ces travaux apporteront des informations essentielles sur l’impact de l’hormonothérapie et de facteurs de croissance (utilisés cliniquement pour prévenir les risques d'infection) sur les différentes sous-populations myéloïdes et le développement tumoral.

Procédures

Model de souris de cancer du sein : injection dans la glande mammaire de cellules tumorales (~10 secondes). Model de cancer du poumon : injection intrapulmonaires de cellules tumorales (~2min). Des injections intrahépatiques, intraspléniques et intrapulmonaires de cellules myéloïdes seront effectuées (

Impact sur les animaux

Les nuisances, stress et douleurs anticipés seront liés à la préhension et contention des animaux, aux injections (cellules tumorales ou thérapies) ainsi qu’à la croissance tumorale. La croissance tumorale s'accompagne d'une asthénie générales. Un handicap physique lié à la tumeur primaire n'est pas anticipé puis les souris seront euthanasiées avant qu'elles atteignent ce stade basé sur des points limites définis. Basé sur nos travaux précédents, les immunothérapies proposées sont bien tolérées et aboutissent dans certain cas à la régression des tumeurs et à la guérison des animaux.

Devenir

A l'issu de toutes les procédures, les animaux sont euthanasiés pour collecter les différents organes d'intérêt permettant une analyse du nombre, du phénotype et des fonctions de différentes populations de cellules immunitaires

Remplacement

L'utilisation de modèles de souris de cancers est indispensable à ces études et ne peut être remplacée par des approches alternatives: en effet, la simplicité des systèmes de culture in vitro n'est pas adaptée et ne permet pas la génération de résultats interprétables puisque ne prenant pas en compte les multiples interactions cellulaires et facteurs solubles jouant un rôle à distance dans l'organisme impliqués dans la régulation du système immunitaire. Il n'est pas possible de mimer in vitro les influences réciproque entre les très nombreuses populations de cellules présentes in vivo. De plus, ces systèmes in vitro ne permettent pas l'évaluation de l'influence du microenvironnement propre à chaque organe sur les cellules myéloïdes suppressives in vivo. Nous avons envisagé la possibilité d'utiliser des modèles d'insectes ou des systèmes non-vertébrés, mais ces organismes ne possèdent pas les cellules immunitaires retrouvées chez les mammifères, rendant impossible une extension des résultats à l'Homme.

Réduction

Le nombre d’animaux sera restreint au minimum permettant de dresser des conclusions scientifiques basées sur une approche statistique. Par ailleurs lorsque possible les groupes contrôles seront communs à différentes expériences. Les animaux sont hébergés e à raison de 5 souris par cage. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu.

Raffinement

La procédure majeure commune à toutes les expériences proposése consiste en l’implantation orthotopique de cellules tumorales syngénéiques. Cette procédure est largement reconnue et adaptée à l’étude des cancers in vivo. Elle présente les avantages suivants : • une mise en œuvre aisée ne nécessitant pas d’acte chirurgical. • un suivi longitudinal simple donc sans manipulation engendrant une douleur ou un stress important de l’animal D’un point de vue éthique cette méthode permet de : • restreindre le nombre d’animaux grâce au suivi longitudinal. En effet il n'y aura pas besoin de mettre à mort des animaux pour obtenir le suivi de points intermédiaires dans l'évolution tumorale, tout sera fait sur les mêmes animaux qui iront jusqu'au point final avant d'être mis à mort. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu. Les animaux seront anesthésiés comme indiqué lorsque requis, lors de procédures spécifiques.

Choix des espèces

Il n´existe pas de méthode alternative pour ce projet. Le suivi de la réponse immunitaire chez les patients ne donne qu'une réponse partielle (limité a des endpoints partiels, au niveau du compartiment sanguin). L'impact du microenvironnement tumoral sur le système immunitaire, et les modifications dynamiques de la fonction et du phénotype des cellules immunitaires étudiées sont impossibles éthiquement et techniquement à mettre en évidence chez l'homme. L'étude chez la souris (6-8 semaines) est la seule approche permettant une analyse spatio-temporelle de la régulation des réponses immunitaires antitumorales. Les conclusions recherchées ne peuvent en aucun cas être obtenues par des modèles alternatifs in vitro (absence des complexes réseaux d'interraction cellulaire et cytokinique régulant l'immunité antitumorale) et sans l'utilisation de souris immunodéficientes. Des systèmes non-vertébrés ne sont en outre pas adaptés puisque ne possèdant pas de système immunitaire équivalent à celui des mammifères. La souris comme animal modèle est Sources: PubMed, CEVMA.

120 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur greffe des cellules tumorales dans le tronc cérébral au deuxième jour après la naissance, puis suit la croissance de la tumeur sous anesthésie trois fois par semaine et administre des agents anticancéreux, pour un cancer pédiatrique incurable. Les souris sont euthanasiées pour prélever et analyser les tumeurs cérébrales. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative" et que les modèles in vitro ne reconstituent pas la complexité de la tumeur in vivo.

Objectifs

Ces travaux de recherche vise à étudier le gliome du tronc cérébral (DIPG), un cancer pédiatrique toujours incurable. Aucun des traitements actuels ne prolonge la vie des enfants atteint de DIPG. Dans ce contexte, il est nécessaire de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques mais aussi d’optimiser celles développées récemment afin que le traitement soit le plus efficace possible. Nos études récentes ont mis en évidence une nouvelle combinaison de deux composés chimiques validée chez la souris, mais nos données sur les lignées cellulaires montrent que certaines cellules tumorales résistent à ce traitement en se transformant en cellules souches tumorales. Le projet vise à mieux comprendre ce phénomène afin d’optimiser l’efficacité de notre combinaison médicamenteuse. Des analyses moléculaires et histologiques seront réalisées sur les tumeurs après prélèvement afin d’apprécier l’action de chacune des deux drogues et de la combinaison sur la pourcentage de cellules souches cancéreuses et sur certains gènes dans un contexte in vivo.

Bénéfices attendus

Démontrer que l’association de deux nouveaux médicaments bloque la formation de tumeur chez la souris. Etudier l’effet des deux composés, seules ou en association, sur la proportion de cellules souches tumorales aau sein des tumeurs. Mieux comprendre pourquoi certaines tumeurs continuent de se développer en présence de ces composés, même si elles se développent moins vite que les tumeurs chez les souris contrôles.

Procédures

Injection sous anesthésie de cellules dans le tronc cérébral (une fois, 5 minutes ). Suivi du poids et du développement tumoral sous anesthésie (3 fois par semaine, 20 minutes)

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales utilisées dans ce projet sont de classe modérée avec la greffe de cellules tumorales dans le tronc cérébral et la formation de tumeur dans le cerveau. Dans certaines conditions du projet, des agents anticancéreux seront administrés aux animaux afin d’évaluer la sensibilité des cellules tumorales à cette nouvelle thérapie. Les nuisances attendues sont la manipulation des cages et des souris lors des expériences, un léger stress termique dû à l'anesthésie qui est pris en charge par l'utilisation d’un tapis chauffant et une douleur due à l’injection de cellules et de solutions chimiques avec une aiguille. Comme les souris sont manipulées sous anesthésie générale, toutes ces nuisances ont un effet limité sur les animaux.

Devenir

Les 120 souris de ce projet seront euthanasiées afin de procéder au prélèvement des tumeurs et leur analyse pas des approches cellulaires, moléculaires et histologiques.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris (souris ayant un système immunitaire à capacité limitée). Sources bibliographiques consultées (PubMed, CEVMA). Les conclusions recherchées ne peuvent être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiment stromales et tumorales en action in vivo chez la souris.

Réduction

Nos effectifs seront déterminés de façon adéquate et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse infligées aux animaux. Les souris seront hébergées en animalerie, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques par du personnel qualifié. Ces animaux sont hébergés en cages à raison de 5 souris par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids de Woodwoll. En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Si pour une raison quelconque, un animal est considéré comme en souffrance, il sera euthanasié sans attendre.

Choix des espèces

1. La souche de souris choisie est largement utilisée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression. 2. L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. Pour le modèle intracrânien de gliome, l’injection de cellules dans les souris sera réalisée au deuxième jour après la naissance. À cet âge, une injection intracérébrale est faisable sans procédures chirurgicales, ce qui réduit considérablement la souffrance animale. Il est aussi important que le cerveau soit à un stade de développement précoce pour être proche du microenvironnement présent chez les enfants atteints de gliomes du tronc cérébral.

480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 384 d'entre elles étant ensuite replacées en élevage et les autres tuées. Elles subissent un jeûne pouvant durer 24 heures, un hébergement isolé lors des tests de comportement alimentaire et des prélèvements de sang à la queue et à la joue, pour étudier le rôle de l'hormone hépatique FGF21 dans l'appétence au sucre et à l'alcool. Le porteur indique que le jeûne peut abaisser la glycémie et la température corporelle et que l'isolement peut stresser les animaux. Il affirme que ces mécanismes, faisant intervenir plusieurs organes, ne peuvent être reproduits par des méthodes alternatives.

Objectifs

Le foie est un régulateur central du métabolisme et du dialogue avec les autres organes, notamment avec le cerveau pour assurer le contrôle de différents types de comportements alimentaires. Dans ce dialogue entre le foie et le cerveau, la protéine FGF21 (pour Fibroblast Growth Factor 21), une hormone produite de manière prédominante par le foie (hepatokine), exerce divers effets métaboliques parmi lesquels le contrôle de l’appétence pour le sucre et l’alcool. FGF21 est aussi une hormone dont l’expression est fortement induite lors du jeûne. La majorité des recherches sur cette hormone a été réalisée grâce à l’utilisation de souris déficientes pour FGF21 dans tout l’organisme et avec des souris transgéniques surexprimant FGF21. Dans ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’implication de FGF21 spécifiquement du foie lors du jeûne et dans le comportement alimentaire.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettront de valider notre modèle de délétion spécifiquement hépatique de FGF21. De plus, ce projet permettra de démontrer ou réfuter que FGF21 d’origine hépatique contrôle la préférence au sucre et à l’alcool. En effet, les résultats décrits jusqu’alors dans la littérature ont été obtenus à partir de souris délétées pour FGF21 dans tout l’organisme ou surexprimant FGF21 dans tout l’organisme. Ces modèles sont peu physiologiques et ne permettent pas de définir l’origine tissulaire de FGF21 dans ces effets.

Procédures

Dans la procédure 1, les animaux seront mis à jeun pendant 24h maximum. Pour la mesure de la glycémie, un prélèvement d’une seule goutte de sang (

Impact sur les animaux

Le jeûne peut induire une baisse du taux de glucose circulant et une baisse de la température corporelle. La consommation d’eau sucrée et d’alcool peut entraîner une augmentation de la glycémie. L’hébergement isolé (1 animal/cage) lors des tests de comportement alimentaire et des récoltes d’urine en cages métaboliques peut entraîner un stress de l’animal. La piqûre pour mesure la glycémie ainsi que le prélèvement de sang peuvent entraîner une douleur.

Devenir

A la fin de la procédure 1 de jeûne, les animaux seront euthanasiés. A la fin de la procédure 2, les animaux seront replacés en élevage après examination par la vétérinaire référente.

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux de laboratoire car les phénomènes biologiques étudiés (jeûne et comportement alimentaire) sont complexes et font intervenir différents tissus agissant en synergie (foie, tissus adipeux, intestin, cerveau, muscle). Il est impossible de mimer ceci par l’utilisation de méthodes alternatives. L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car il est possible d’étudier la protéine d’intérêt (FGF21) grâce à l’utilisation de souris génétiquement modifiées.

Réduction

Le nombre d’animaux pour ce projet est défini pour permettre d’une part de répondre aux questions scientifiques et d’autre part de respecter la réduction du nombre d’animaux au maximum. Ainsi, nous utiliserons le plus petit nombre d’animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux a été déterminé par un calcul de puissance et est basé sur des données provenant d’expériences antérieures du laboratoire. Ce nombre d’animaux est le nombre minimum nécessaire mais suffisant afin d’obtenir des résultats exploitables.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement. Tous les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé (température, hygrométrie). Des enrichissements du milieu de vie (cabanes en inox et ouate de coton ou de cellulose) seront disposés dans la cage afin de pouvoir se distraire, se cacher et fabriquer des nids. Pour un meilleur raffinement et limiter le stress, les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons leur consommation alimentaire et hydrique afin de vérifier la bonne tolérance des différentes expérimentations. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres (indice 0 = normal ou léger, indice 3 = changements importants par rapport à la normale). Si un animal présente un signe quelconque de souffrance (inactivité, somnolence, respiration lente, déshydratation) avec un score de 3 après évaluation de ces paramètres, le critère d’arrêt sera atteint. L’animal sera aussitôt retiré de l’étude et replacé dans des conditions d’hébergement standard (hébergement collectif, régime standard et aucune procédure réalisée).

Choix des espèces

L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car le développement des organes métaboliques est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont greffées dans le tronc cérébral sous anesthésie, puis un traitement anticancéreux est injecté par voie intrapéritonéale ou intracrânienne, avant prélèvement des tumeurs. Le projet compare deux voies d'administration d'une combinaison de médicaments contre le gliome du tronc cérébral, un cancer pédiatrique incurable. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit la complexité de la tumeur in vivo.

Objectifs

Ces travaux de recherche vise à étudier le gliome du tronc cérébral (DIPG), un cancer pédiatrique toujours incurable. Aucun des traitements actuels ne prolonge la vie des enfants atteint de DIPG. Dans ce contexte, il est nécessaire de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques mais aussi d’optimiser celles développées récemment afin que le traitement soit le plus efficace possible. Ici, le projet vise à comparer deux voies d’administration afin de déterminer si la voie d’administration intracrânienne de notre thérapie est la plus adaptée pour un usage chez les patients. La combinaison de drogues utilisée sera celle validée il y a deux ans dans ce même modèle murin. Elle sera injectée soit par voie intrapéritonéale, soit par voie intracrânienne. Des analyses moléculaires et histologiques seront réalisées sur les tumeurs après prélèvement afin d’apprécier l’action de chacune des drogues et de chaque voie d’injection sur les cellules cancéreuses et l’expression de leurs gènes dans un contexte in vivo.

Bénéfices attendus

Démontrer que la combinaison bloque la formation de la tumeur chez la souris qu’elle soit injectée par voie intrapéritonéale ou par voie intracrânienne. Ces données serviront de base à l’élaboration de stratégie thérapeutique chez les enfants atteints d’un gliome pédiatrique. Elles permettront aussi d’envisager l’utilisation de ce modèle pour tester de nouvelles combinaisons de drogue par voie intracrânienne, si cette dernière donne satisfaction.

Procédures

Injection sous anesthésie de cellules dans le tronc cérébral (une fois, 5 minutes ). Suivi du poids et du développement tumoral sous anesthésie (3 fois par semaine pendant 3 semaines, 20 minutes). Injection intrapéritonéale ou intracrânienne sous anesthésie d’une solution chimique (2 fois par semaine pendant 3 semaines, 5 minutes ).

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales utilisées dans ce projet sont de classe modérée avec la greffe de cellules tumorales dans le tronc cérébral et la formation de tumeur dans le cerveau. Dans certains groupes de souris, des agents anticancéreux seront administrés aux animaux par voie intrapéritonéal et intracrânienne afin d’évaluer la sensibilité des cellules tumorales à la combinaison et selon le mode d’administration. La plupart des manipulations sur les animaux seront réalisés sous anesthésie générale. Les nuisances sont la manipulation des cages et des souris, l’injection de cellules et de solutions chimiques avec une aiguille, un stress lors de manipulations répétées, une légère douleur au point de piqure. Cependant, comme les souris sont manipulées sous anesthésie, une large partie de ces nuisances ont un effet limité sur les animaux.

Devenir

Les 90 souris de ce projet seront euthanasiées afin de procéder au prélèvement des tumeurs et leur analyse pas des approches cellulaires, moléculaires et histologiques.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris. Les conclusions recherchées ne peuvent être obtenues par des modèles alternatifs d'étude en boite de culture, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiments stromaux et tumoraux en action in vivo chez la souris.

Réduction

En termes de test statistique et d’après la littérature scientifique, le nombre d’animaux nécessaire par lot pour détecter 50 pourcent de différence inter-lots avec 50 pourcent d’écart type intra-lots est de 15.

Raffinement

Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse infligées aux animaux. Les souris seront hébergées en animalerie, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques par du personnel qualifié. Ces animaux sont hébergés en cages à raison de 5 souris par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids de Woodwoll. En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Si pour une raison quelconque, un animal est considéré comme en souffrance, il sera euthanasié sans attendre.

Choix des espèces

1. La souche de souris choisie est largement utilisée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression. 2. L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. Pour le modèle intracrânien de gliome, l’injection de cellules dans les souris sera réalisée au deuxième jour après la naissance. À cet âge, une injection intracérébrale est faisable sans procédures chirurgicales, ce qui réduit considérablement la souffrance animale. Il est aussi important que le cerveau soit à un stade de développement précoce pour être proche du microenvironnement présent chez les enfants atteints de gliomes du tronc cérébral.

100 souris et 12 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris reçoivent des injections, portent une capsule fixée sur le dos et sont infestées par des tiques, les lapins étant utilisés pour produire du sérum, avant mise à mort pour prélever le sang et les organes. Le porteur indique que l'alimentation des tiques provoque un inconfort modéré et que la pose des capsules a été optimisée pour le limiter. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la réponse immunitaire de la souris à une vaccination anti-microbiote de tique.

Objectifs

L'implication du microbiote (bactéries symbiotique de la tique) de la tique dans la survie des tiques et dans la transmission des agents pathogènes transmis par ces dernières a déjà été signalée pour différentes espèces de tiques. Ces preuves renforcent le fort potentiel du microbiote des tiques en tant que cible pour le développement de stratégies de contrôle. Il est prouvé que la présence de certaines espèces de ces bactéries (symbiotes) favorise l'établissement d’agents pathogènes chez les tiques, alors que la présence d'autres espèces de bactéries a été associée à l'absence d’agents pathogènes chez la tique. Dans ce contexte, l'objectif principal de ce projet de recherche est de cibler deux types de bactéries symbiotiques pour évaluer les effets de la vaccination de souris par ces bactéries sur la composition du microbiote de la tique, sur l'limentation et la survie de tique et enfin sur l'acquisition d'un agent pathogène par la tique.

Bénéfices attendus

Les tiques transmettent des maladies graves à l'homme et aux animaux. Cependant, la lutte contre les tiques repose uniquement sur les acaricides, qui peuvent contaminer l'environnement et les produits d'origine animale (par exemple, le lait et la viande) consommés par l'homme. En outre, les acaricides peuvent sélectionner des populations de tiques résistantes. Malgré la gravité des maladies transmises par les tiques, la prévention repose uniquement sur l'évitement des piqûres de tiques. Les tiques abritent une communauté de microbes (microbiote) comme les autres animaux. Chez les tiques, le microbiote joue un rôle dans la survie et le développement des tiques ainsi que dans leur capacité à transmettre des agents pathogènes. Ce projet vise à développer une stratégie plus sûre de lutte contre les tiques, basée sur des vaccins anti-microbiote de tique utilisés chez la souris.

Procédures

Souris animaux vigiles : 2 injections et 3 prélèvements. Pose de capsule sur le dos des souris. Infestation avec tiques Lapins = Animaux vigiles : 2 injections et 2 prélèvements.

Impact sur les animaux

Chez les souris, l’alimentation des tiques induit un inconfort modéré. De plus, les souris peuvent simplement se sentir mal à l'aise lorsque la capsule est placée sur leur dos. Cependant, le placement des capsules sur le dos de l'animal a été optimisé pour minimiser l'inconfort chez l'animal et maximiser les résultats expérimentaux. Pas de symptômes attendus suite à l'inoculation des agents pathogènes mais surveillance quotidienne des animaux (souris et lapins).

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupération du sang total et des organes.

Remplacement

Ce projet vise à nourrir des tiques sur des souris préalablement immunisées avec des bactéries non pathogènes afin d'évaluer les effets sur la composition du microbiote de la tique, l'alimentation/survie de la tique et l'acquisition d'une bactérie pathogène (Rickettsia) par la tique. Il n'existe pas de modèle in vitro pour remplacer la réponse immunitaire des souris à une infection bactérienne afin d'analyser les effets sur le microbiote des tiques et la colonisation des pathogènes. Afin de disposer d'un plus grand volume de sérums pour des études supplémentaires in vitro, nous immuniserons également des lapins, évitant ainsi l'utilisation de souris supplémentaires. Dans le cadre de ce projet nous ne cherchons pas à simplement infecter des tiques par des bactéries, nous avons besoin d’évaluer l’efficacité d’une vaccination chez la souris avec deux bactéries sur le gorgement/survie et capacité à s’infecter des tiques. Il existe des systèmes de gorgement et d’infection artificielle des tiques mais ces systèmes ne permettent pas d’évaluer la réponse immunitaire des souris suite à une vaccination. La production/cultures des bactéries est par ailleurs réalisée par culture cellulaire in vitro.

Réduction

Chaque souris peut nourrir au maximum 30 tiques. Mais par souris entre 20-25 tiques vont se détacher sans faire un repas complet ou mourir donc nous obtiendrons 5-10 tiques gorgées par souris donc il faut prévoir 5 souris pour groupe pour obtenir 25-50 tiques gorgées par groupe au total, nombre nécessaire à nos analyses. Le nombre d'animaux a été comptabilisé pour être le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir le nombre de tiques gorgées nécessaires à nos analyses. Nous avons comptabilisé le nombre minimal de lapin nécessaire à l’obtention du volume necessaire de serum pour nos futures experimentations in vitro. Pour nos expérimentations futures in vitro, nous avons besoin durant les 5 années du projet d’un volume total de 60ml de sérums de lapins immunisé pour chaque bactérie (deux bactéries) et le même volume pour chaque lapin contrôle (deux contrôles). Nous avons donc estimé avoir besoin de 3 lapins par groupe (environ 20ml de sérum pouvant être récupéré par Lapin) soit un total de 12 lapins sur les 5 ans du projet.

Raffinement

Les souris seront hébergées par lot de 3 dans leurs conditions classiques avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (carré de coton, maison en plastique pour les souris). Il n’y a aucune souffrance attendue suite à l’infection par les bactéries lors des immunisations, les infections sont asymptomatiques chez les souris et les lapins. Pas de points limites dans ces conditions. Cependant, après inoculation des agents pathogènes, l’état clinique des animaux (état général) sera contrôlé chaque jour, pour arrêter l'expérience si nécessaire par mise à mort des animaux. Les animaux seront mis à mort en cas de déshydratation ou signes neurologiques (début de paralysie notamment). Nous n'attendons donc pas de symptômes importants tels que des paralysies chez les souris, mais nous suivrons les animaux tous les jours afin de contrôler l'apparition de symptômes éventuels. Lorsque les souris auront des capsules sur le dos avec des tiques, elles devront être hébergées en cage individuelle, en effet les souris sont capables d'enlever les capsules du dos des autres souris et de manger les tiques. Mais ces souris seront hébergées dans les conditions classiques avec l'enrichissement nécessaire à leur bien être en augmentant le nombre de carré de coton et même si elles sont seules elles pourront voir les autres souris des cages d'à côté. Pour les lapins, à leur arrivée, les animaux seront hébergés dans des cages munies d’une plateforme de repos avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (balles, branches en bois pour les dents et branches végétales). Les lapins seront observés quotidiennement pendant toute l'expérimentation. Comme les lapins sont des animaux très sensibles à la manipulation, ils seront quotidiennement contrôlés et manipulés par les animaliers et l’expérimentateur pour les habituer à leur présence et aux manipulations.

Choix des espèces

Les 3 lignées de souris ont été sélectionnées car elles sont les plus sensibles aux agents pathogènes (bactéries notamment) transmis par les tiques. Lapin blanc de Nouvelle-Zélande car ce sont les animaux les plus appropriés pour obtenir un grand volume de sérum vacciné en une seule expérience et permettra d'obtenir suffisamment d'anticorps spécifiques contre les bacteries à l'étude. De plus ils ne peuvent pas être utilisés pour infecter des souris car ils ne développement pas de bactériemie suffisante. Souris 7-8 semaines. Lapins = 4-5 semaines. Adaptation des animaux durant une semaine avant l'expérimentation. Souris gardées au plus 39 jours (entre 20 et 39 jours selon procédure). Lapins seront gardés au maximum 30 jours. Mise à mort de tous les animaux au maximum à J39.

320 chevesnes sauvages vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Capturés par pêche électrique et maintenus jusqu'à dix mois, ils subissent des endoscopies, une infestation contrôlée par des parasites intestinaux et une exposition à des polluants par ingestion, avant dissection. Le porteur reconnaît un stress de captivité, des lésions du tube digestif et des pathologies liées aux polluants. Il affirme que l'étude des interactions hôte-parasite ne peut se faire in vitro ou in silico.

Objectifs

La pollution des cours d'eau affecte les organismes et peut se répercuter sur les interactions biotiques. Certains parasites sont connus pour accumuler des polluants depuis leur hôte, ce qui pourrait aboutir à une atténuation de certains effets écotoxicologiques, comme cela a été montré chez un poisson d'eau douce, le chevesne Squalus cephalus infestés par des acanthocéphales. Ce projet vise à tester les effets de l'exposition aux polluants à des niveaux réalistes d'un point de vue environnemental, sur les relations hôtes-parasites. Tout d'abord il s'agira de tester les méthodes d'endoscopie pour surveiller la présence de parasites intestinaux dans le tractus digestif des poissons. Des manipulations expérimentales de la charge parasitaire et de l'exposition aux polluants seront menéeschez des chevesnes issus de populations sauvages, hébergés en conditions semi-naturelles, afin d'évaluer les réponses écophysiologiques. La règle des 3R a été prise en compte de la manière suivante : 1. remplacement : les questions de recherche portent sur les interactions biotiques, entre un poisson hôte et les parasites intestinaux en réponse à la pollution environnementale, il n'est pas possible de conduire des études in vitro, ex vivo, in silico pour y répondre. 2. réduction : les effectifs ont été réduits à 20 individus par groupe, effectif minimum suffisant pour tester avec robustesse les hypothèses, 3. raffinement : les conditions d'hébergement en mésocosmes ont été optimisées, plusieurs points limites ont été retenus, et les manipulations expérimentales se font dans la gamme de variation communément observée en milieu naturel, que ce soit pour la prévalence en parasites, ou pour l'exposition aux polluants.

Bénéfices attendus

Le projet développera une méthode pour un examen interne des parasites intestinaux. L’endoscopie est une technique maitrisée et courante en médecine humaine et vétérinaire, mais très peu utilisée en écologie. Le développement de la micro-endoscopie permettra d’améliorer les connaissances sur l’état de santé des animaux sauvages, à l’échelle des individus et des populations, sans recourir à des euthanasies. Cette technique permet d’acquérir de multiples donnéeset le suivi à moyen et long terme l’évolution de l’infestation et du développement des parasites. L'étude expérimentale répond également à des questions de recherche fondamentale en écotoxicologie à l'échelle des interactions biotiques, qui sont encore très peu étudiées, les effets étant principalement étudiés à l'échelle des organismes ou des populations.

Procédures

Les individus seront capturés en milieu naturel par pêche électrique, hébergés pour une durée de 10 mois maximum, dans des très grands mésocosmes avec enrichissement du milieu (radeaux flottants végétalisés). Chaque acte durera moins de 5 minutes, sur des poissons anesthésiés. Les interventions consisteront à 1) réaliser un examen par endoscopie (2 examens par individu), 2) manipuler expérimentalement la charge en parasites, via l'utilisation d'un anthelminthique suivie d'une infestation expérimentale par ingestion de cystacanthes (stade juvénile des acanthocéphales à raison de 0, 5 ou 10 parasites par individu, qui seront déposés dans le tractus digestif des chevesnes anesthésiés). Le développement des acanthocéphales nécessite 5 mois d'attente, les chevesnes ne seront pas manipulés pendant ce temps. 3) manipuler expérimentalement l'exposition à des polluants à des doses réalistes d’un point de vue environnemental afin de déterminer les conséquences sur les conditions hôtes-parasites. L'exposition aux polluants se fera par ingestion, à raison d'une fois par semaine pendant 4 semaines. Une prise de sang (sera réalisée sous anesthésie par ponction de la veine caudale afin d’évaluer les conséquences physiologiques, puis les poissons seront immédiatement euthanasiés et disséqués pour quantifier les niveaux de polluants dans les tissus, étudier les effets écophysiologiques et évaluer les conséquences de l’exposition pour les parasites.

Impact sur les animaux

Les nuisances sont : le stress de captivité, stress thermique (les mésocosmes sont à l’extérieur et sont influencés par les températures atmosphériques). L'endoscopie peut provoquer des lésions et irritation du tractus digestif après la phase de réveil post-anesthésie. L'anesthésie et la manipulation hors de l’eau peut engendrer de l'hypoxie, déshydratation, hyperthermie. Lors de l'infestation expérimentale, la fixation des parasites peut provoquer des irritations et lésions de la muqueuse du tractus digestif et limiter les apports nutritifs. L'exposition expérimentale aux polluants peut engendrer des pathologies.

Devenir

L'euthanasie se justifie par la nécessité de comparer le nombre réel de parasites intestinaux par dissection, par rapport au nombre estimé par endoscopie afin de valider la méthode et par le fait que les analyses écotoxicologiques doivent être réalisées sur certains tissus (foie, muscles, rein, tractus digestif) et sur les parasites intestinaux qui ne peuvent être prélevés que post-mortem.

Remplacement

Le projet consiste à tester les effets de l'exposition aux polluants à des niveaux réalistes d'un point de vue environnemental, sur les interactions biotiques, plus particulièrement sur les relations entre les chevesnes et les parasites acanthocéphales. Les acanthocéphales sont des parasites intestinaux présentant la remarquable capacité d'accumuler des polluants depuis leur hôte définitif, les chevesnes, pouvant aboutir à une atténuation de certains effets écotoxicologiques. Pour comprendre les effets à cette échelle biologique (relation entre deux organismes vivants), il est nécessaire d’étudier les effets sur ces organismes. Il n’est donc pas possible de le remplacer par des modèles in silico, in vitro ou ex vivo.

Réduction

320 animaux seront utilisés, soit 20 animaux par lot pour 16 lots au total. Cet effectif correspond au nombre minimum d'animaux calculé à partir de calcul de puissance en supposant une taille d’effet similaire à ce qui a été obtenu lors d’études précédentes. Les données obtenues feront l'objet de traitement statistique des données a posteriori

Raffinement

Les conditions d’hébergement ont été raffinées avec les mésocosmes extérieurs, de grande taille, équipés de radeaux végétalisés flottants permettant de diversifier l’habitat, d’offrir des caches, abris, ombrage et nourriture diversifiées et de contribuer à l’épuration de l’eau. Avant chaque manipulation, les poissons seront anesthésiés. Chaque acte durera moins de cinq minutes. Il seront ensuite surveillés pendant la phase de réveil. Un suivi journalier des poissons et des mésocosmes sera effectué. Lorsque les poissons seront manipulés, des points limites ont été établis afin de réagir rapidement à l’apparition de symptômes attestant d’une souffrance. Le franchissement d’un point limite (anomalie du comportement, altération du rythme operculaire, hypersécrétion de mucus, lésions, pathogènes) engendrera le retrait immédiat de l’individu du mésocosme et sa mise en surveillance. Un avis auprès du vétérinaire référent sera sollicité, un traitement adéquat sera administré ainsi qu’un soulagement de la douleur si nécessaire. Une détérioration plus sévère ou durable de l’état sanitaire conduira à envisager l’euthanasie, qui sera réalisée à l’écart, après anesthésie.

Choix des espèces

L'espèce a été choisie car 1. plusieurs études ont montré l'accumulation de divers polluants dans leurs parasites acanthocéphales, au point que les chevesnes sont devenus une espèce modèle, 2. cette espèce est ubiquiste et abondante dans les cours d'eau français, 3. de précédentes études (en parasitologie et en écotoxicologie) ont été menées avec succès sur des chevesnes en captivité. Les chevesnes seront adultes, d'une taille moyenne de 15 cm. Cette taille est nécessaire pour l'utilisation de l'endoscope.