Oncologie
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Rôle du récepteur nucléaire FXR dans l’homéostasie énergétique (glucidique, lipidique et des acides biliaires)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
6 908 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, une partie dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil, les autres dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des gavages, des injections virales par voies intracrânienne, intranasale et intra-orbitaire, un régime obésogène et des tests de tolérance au glucose, pour étudier un récepteur nucléaire du métabolisme énergétique. Le porteur précise qu'aucun animal n'est réutilisé ni adopté. Il justifie ce volume par l'activité de tout un laboratoire sur cinq ans et affirme le caractère de "stricte nécessité" du recours à l'animal vivant.
Objectifs
L'étude du rôle du récepteur nucléaire FXR dans l'homéostasie énergétique implique l'étude ce récepteur nucléaire au sein de différents organes clé, impliqués dans la régulation de la balance énergétique (système nerveux central, foie, tissu adipeux banc et brun, pancréas et intestin). Ce projet concerne 5 chercheurs. Cette étude sera réalisées grâce à des approches in vivo (modèles murins d'invalidation tissu spécifique de FXR ou activation pharmacologique) et des approches in vitro (culture primaire de neurones, d'astrocytes, d’hépatocytes, de cellules non-parenchymales primaires, de pré-adipocytes ou de fibroblastes embryonnaires).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet cont une meilleure compréhensuin du rôles des recepteurs nuclaires aux acides biliares dans l'homéostasie énergétique mais également dans le contrôle central de cet dernière, avec l'utilisation de modèles intégrés et le souhait d'évaluer la communication interorganes.
Procédures
administration par gavage : 1-3x, moins de 5 minutes injection intracrâniale de virus : 1-2x, moins de 5min, procédure entière moins de 60 min administration intranasale de virus : 4 administrations/narine sur une session, moins de10 min) injection intraveineuse : 1-5x, moins de1 minute injection intrapéritonéale pour anesthésie : 1, moins de1 min injection intrapéritonéale de virus 1-6x, moins de 1 min injection en intra-orbital de virus: 1-2x, moins de 1 minute injection intrapéritonéale des animaux soumis à un régime obésogène (moins de20 semaines): 1-6x, moins de 1 min (glycémie : 1x/mois au maximal ; tolérance au glucose et a l’insuline : moins de 2 minutes ; 8x/session) des prélèvements de sang des animaux soumis à un régime obésogène : au maximum 4 fois, espaces d’au moins 3 semaines.Biopsie de queue: 1x , moins de 5 minutes
Impact sur les animaux
Les nuisances des procédures chirurgicales de classe modérée (procédure 2 et 15 - stéréotaxie) peuvent concerner 1/ la douleur lors du placement de l’animal dans la cadre stéréotaxique ; 2/ l’incision de la peau ; 3/ le conditions de réveil de l’animal. les nuisances énumérées seront minimisées par l’ anesthésie et l’analgésie et le suivi post-opératoire réalisé par du personnel forme au bien-être animal.
Devenir
Nn dehors de la procedure de generation et de genotypage, l'ensemble des animaux sera mis a mort en fonction des objectifs annonces. Aucun animal ne sera réutilisé ni adopté.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer différents aspects de la physiopathologie de désordres métaboliques en ciblant les réaux acides bilaires, mettant en jeu une communication inter-organes. L'utilisation d'animaux vivants revêt donc un caractère de stricte nécessité avec le développement d’approches neurobiologiques et intégrées. Ces évaluations ne peuvent pas être réalisées en utilisant des alternatives aux modèles animaux. Le laboratoire est néanmoins conscient de l’aspect nécessaire de recourir à des méthodes alternatives quand cela est possible, ce qui est effectivement fait pour un certain nombre d’études cellulaires et moléculaires ne nécessitant pas de modèles animaux
Réduction
Le nombre total d’animaux concernant les procédures de l’ensemble des protocoles de notre laboratoire (16 chercheurs, 8 ITA statutaires, 4 post-docs, 10 étudiants) sur les 5 ans à venir est estimé à 6888. Cette utilisation maximise les données obtenues de chaque animal, ce qui peut limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Pour chacun des groupes constitués, le nombre d'animaux a été réduit au maximum tout en permettant l'obtention de résultats satisfaisant (différences statistiquement observables). Pour limiter le nombre d’animaux, lorsque cela sera possible une réutilisation des animaux des animaleries employés pour la formation sera réalisée. Un calcul du nombre d’animaux total nécessaire par groupe a été effectué pour respecter le principe des 3R à l’aide du site https://eda.nc3rs.org.uk/experimental-design-group.
Raffinement
Les animaux seront observés tous les jours, pesés régulièrement, par du personnel spécialement formé. Durant les différents protocoles, tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis. Les animaux seront hébergés en groupe, et des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition, par exemple coton pour la confection de nids... Les animaux seront suivis précisément pour chaque protocole, pour lesquels des points limites adaptés ont été définis. Toute souffrance, angoisse ou comportement inhabituel sera pris en charge par des approches appropriées. Les procédures expérimentales de chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale par une combinaison de kétamine et de xylazine par voie intrapéritonéale. En cas de douleur, un analgésique sera administré. Les animaux présentant un des points limites spécifiés pour chaque approche expérimentale seront sacrifiés dans une salle dédiée; le tout en lien avec le responsable du bien être animal.
Choix des espèces
Cette espèce est utilisée parce que les souris peuvent être évaluées par méthodes comportementales et être génétiquement modifiées par injections virales ou transgénèse. La lignée présentant une séquence floxée pour le récepteur nucléaire FXR permet son invalidation conditionnelle. La délétion dans une structure cérébrale précise sera obtenue par injection stéréotaxique ou intra-nasale d'AAV2/9-Cre, la délétion hépatique, intestinale sera obtenue par le croissement des souris FXR-flox avec des souris albumine-cre, des souris dont l'expression de la Cre sera dépendante d'un promoteur spécifique des cellules entéro-endocrines, respectivement. Si un phénotype dommageable apparait au cours des expérimentations, les études seront interrompues. Dans la plupart des expérimentations, les souris seront utilisées à l’âge adulte : de 2 mois à 12 mois. Etant donné que l'ensemble des procédures réalisées concerne le métabolisme, il est nécessaire d'utiliser des souris adultes (càd 2 mois minimum et en dehors de la courbe de croissance). Par ailleurs, les protocoles ont été validés (publications) au sein du laboratoire sur des souris adultes (de 2 à 12 mois) et ce, en accord avec les 3R.
Evaluation d’une nouvelle stratégie thérapeutique couplant l’utilisation d’ultrasons à des thérapies ciblées innovantes dans un modèle de gliome chez des souris et rats.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 298
810 souris et 298 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Des cellules de gliome sont implantées dans le cerveau par chirurgie, puis les animaux reçoivent des injections thérapeutiques répétées et des ultrasons pour ouvrir la barrière hémato-encéphalique, avec des sessions d'imagerie sous anesthésie, le porteur reconnaissant une toxicité possible sur les organes sains. Les organes sont prélevés après la mise à mort. Le porteur affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas le flux sanguin ni l'infiltration immunitaire et revendique un fort potentiel de transfert clinique.
Objectifs
De nouvelles innovations thérapeutiques à base d’anticorps et de peptides spécifiques pourraient améliorer significativement les conséquences des cancers du cerveau les plus graves : les gliomes. Ces thérapies ciblent spécifiquement des molécules exprimées principalement par les gliomes et diminuent considérablement les effets secondaires tout en augmentant l’efficacité thérapeutique. Malheureusement l’efficacité de ces traitements est freinée une barrière naturelle, appelée « barrière hémato-encéphalique » (BHE), qui limite la diffusion dans le cerveau des médicaments qui pourraient être efficaces contre ces tumeurs. Les gliomes, qui sont des tumeurs cérébrales très agressives, restent essentiellement incurables même si la BHE est partiellement compromise par la présence de cette tumeur. L’objectif du projet est d’évaluer une stratégie thérapeutique qui vise à surmonter la limitation de la diffusion des médicaments dans la tumeur, en combinant des ultrasons focalisés à des médicaments innovants, associés ou non avec des isotopes thérapeutiques. Les isotopes directement injectés dans la circulation sanguine, agissent comme une radiothérapie interne. Ils ont aussi été montrés stimuler le système immunitaire en plus de leur effet thérapeutique sur les cellules tumorales. Les ultrasons focalisés ont prouvé leur capacité à faciliter la diffusion de divers médicaments dans le cerveau grâce à une ouverture transitoire et sécurisée de cette barrière sans causer de lésions cérébrales. Nous exploiterons cette perturbation de la BHE pour adresser les médicaments directement dans la tumeur, tout en y associant une radiothérapie interne. Cette stratégie sera évaluée sur des modèles de rongeurs (souris et rats) présentant soit un statut immunitaire normal soit une immunorésistance, pour évaluer toutes les conditions pouvant se présenter en clinique humaine. . Ce projet sera réparti entre deux établissements pour réaliser d’un côté la thérapie et de l’autre le suivi par imagerie.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à valider de nouvelles stratégies thérapeutiques en utilisant des traitements innovants et des ultrasons focalisés. Ces approches thérapeutiques présentent un fort potentiel de transfert chez les patients. Dans le cadre de ce projet, une évaluation des thérapies par imagerie TEP est également envisagée. Cette méthodologie, associée à l'utilisation de radioligands, pourrait bénéficier aux patients de deux manières : en améliorant la sélection des patients pouvant bénéficier des traitements innovants et en optimisant la dose médicamenteuse afin de réduire les effets toxiques potentiels.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : o La mise en place du modèle tumoral (45 minutes d’intervention chirurgicale, une seule injection par animaux) : des cellules tumorales seront injectées sous anesthésie générale dans une sous-structure du cerveau : le striatum pour la formation de tumeurs o L’injection de molécules permettant l’imagerie chez l’animal sous anesthésie générale pour le ciblage de biomarqueurs d’intérêt et pour le suivi du volume tumoral, réalisée via une injection systémique (temps d’injection 5 minutes, nombre total d’injections par souris/rats : maximum 3). o L’injection des agents thérapeutiques qui aura lieu tous les deux à trois jours pendant deux semaines environ (temps d’injection de la thérapie 5 minutes, nombre total d’injections par souris/rats : maximum 6). o Une anesthésie lors des différentes sessions imageries (temps d’anesthésie durant l’imagerie entre 15 minutes et 70 minutes, en comptant un maximum de 6 sessions d’imagerie. o Un prélèvement sanguin sur animaux sous anesthésie (maximum 5 minutes, 5 maximum au total ). Le diagnostic et la thérapie seront réalisés dans un premier établissement utilisateur alors que le suivi par imagerie sera réalisé dans un autre établissement utilisateur.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux : • L’injection des radioligands en intra veineux peut induire une courte douleur (moins de 5min). • Les souris seront endormies lors des sessions d’imagerie (70 minutes maximum) par voie gazeuse. Lors du réveil les souris peuvent être désorientées et stressées. • Le geste chirurgical lors de la mise en place du modèle tumoral induira une douleur au niveau de la boite crânienne. L’acte chirurgical durera 30 min. Les traitements peuvent avoir une toxicité non spécifique au niveau des organes sains. La durée des traitements ne dépassera pas plus de 3 semaines. Cette toxicité sera limitée par l’utilisation de dose thérapeutique décrite et validée dans la littérature.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour des analyses ex vivo de biomarqueurs d’intérêt tumoraux et au niveau du système immunitaire.
Remplacement
Dans une première approche, toutes les stratégies thérapeutiques sont évaluées sur des cultures cellulaires et des tumoroides pour déterminer leur pertinence, ainsi que pour identifier une éventuelle surexpression de biomarqueurs au niveau des tumeurs. Un travail impliquant plusieurs équipes spécialistes des gliomes et de la BHE porte notamment sur l’élaboration de modèles tumoroides couplant gliomes et microenvironnement tumoral pour évaluer in vitro les différentes stratégies thérapeutiques. Les tests in vitro préliminaires sont mis en place afin de définir la stratégie qui sera appliquée in vivo, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux utilisés pour l'évaluation sur un modèle murin. Cependant, nos modèles in vitro sont limités quant à l’interaction entre les cellules tumorales et le microenvironnement tel que les différentes populations du système immunitaire.Afin de valider les thérapies et la stratégie associée par imagerie, il est nécessaire d'implanter les tumeurs dans l'organe cible, en l'occurrence le cerveau. L’ouverture de la BHE par l’utilisation d’ultrasons thérapeutiques ne peut être que testée dans un environnement complexe récapitulant le flux sanguin, les jonctions de la barrière cérébrales, l’infiltration immunitaire et les flux lymphatiques cérébraux uniquement observable in vivo. Cette approche permet de mieux simuler le contexte physiologique et de fournir des données plus pertinentes pour le transfert clinique de ces stratégies.
Réduction
L’imagerie TEP permettra de réduire drastiquement le nombre d’animaux étant donné que l’impact des traitements sera suivi de manière longitudinale sans avoir recours à des euthanasies à différents temps d’imagerie. Cette évaluation nécessitera d’avoir recours à un traitement des images et l’utilisation de modèles mathématiques pour extraire un maximum de données directement transférables en clinique. En tenant en compte les différentes données préliminaires et les données bibliographiques, le nombre d’animaux par groupe a été déterminé entre 10 et 12 afin d’être statistiquement significatif. Les données quantitatives issues de l’imagerie seront exprimées en moyenne avec un écart-type associés.
Raffinement
Toutes les interventions invasives à savoir les injections de radioligands, les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale par voie gazeuse complétée par une anesthésie locale et des soins post-opératoires adaptés afin de minimiser le stress de l’animal et les douleurs liés aux interventions. Un suivi régulier permettra d’éviter toute souffrance animale. Les animaux seront entrainés à la manipulation pour éviter tout stress. Les souris seront hébergées par 4 ou 5 en milieu enrichi. Des points limites sont définis pour éviter toute souffrance animale. Si une souffrance est observée, un antalgique pourra être administré en accord avec le/la vétérinaire référent-e. sera administrée. Les rongeurs seront transportés dans des cages adaptées aux transports comportant de la litière et de la nourriture gélifiée. Le transport sera réalisé dans un véhicule dédié aux transports des animaux avec une climatisation. Le parcours entre les deux sites est de 20 minutes maximum.
Choix des espèces
Ce projet a comme objectif d’évaluer de nouveaux axes thérapeutiques qui peuvent être directement transférables à l’humain. En fonction de la lignée cellulaire tumorale utilisée, la souris ou le rat sont des animaux de choix pour la mise en place de modèle tumoraux. Ayant une taille adaptée pour la manipulation et l’imagerie corps entiers. Les modèles permettant une implantation de la tumeur dans son environnement d’origine sont largement utilisés pour examiner le microenvironnement tumoral essentiel pour valider les stratégies thérapeutiques et les biomarqueurs prédictifs. Les souris et les rats utilisés dans ce projet auront atteint un stade jeune adulte (5 semaines) à adulte (8 semaines). Cette tranche d’âge permet d’être représentative des cancers cérébraux chez les patients majoritairement à l’âge adulte.
Transplantation d’organoïdes dans la capsule rénale
- Recherche fondamentale
- Oncologie
128 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une chirurgie transplantant des organoïdes sous la capsule du rein gauche, que leur croissance rend non fonctionnel, le porteur reconnaissant que ce développement peut provoquer une douleur. Les organes sont prélevés après la mise à mort. Ce projet vise à mettre au point la technique chirurgicale en vue d'un projet ultérieur de plus grande ampleur sur le cancer de l'estomac.
Objectifs
Le tractus gastro-intestinal supérieur comprend l’œsophage et l’estomac reliés par une zone de transition (ZT). Il y a deux types de cancer de l’estomac chez l’homme : distal (partie basse) et proximal (ZT). L'incidence du cancer de l'estomac distal a diminué, tandis que celle des cancers de la ZT a connu une augmentation rapide. Dans le laboratoire nous avons mis en place la culture de ‘’mini-organe’’ ou organoïdes de ces zones de transition gastrique à partir de tissus de souris. Ces organoïdes en culture ont une taille ne dépassant pas 1-2mm. L'objectif du projet est de mettre au point une technique chirurgicale de transplantation de ces organoïdes sous la capsule rénale de souris immunodéficientes afin de permettre à ces structures tridimensionnelles de se développer de façon plus importante (>10 mm) et de se différencier. La capsule rénale a été choisie comme site de transplantation pour sa localisation proche de la surface au niveau dorsal, ce qui rend son accès facile et la récupération de l’animal plus rapide, ainsi que pour son innervation importante et le rôle de son microenvironnement dans la croissance et maturation des organoïdes. En effet, la transplantation d’organoïdes intestinaux dans la capsule rénale montre une maturation complète au bout de 6 semaines dans la littérature. L’objectif est de reproduire cette maturation avec nos organoïdes de zone de transition gastrique. Des études préliminaires de différenciation in vitro ont été effectuées et la différenciation obtenue est partielle. En effet, à la zone de transition gastrique se trouve une glande protectrice qui sécrète du mucus in vivo. Les organoïdes dérivés de ces zones de transition conservent cette glande, cependant le milieu de différenciation ne permet pas la production de mucus d’où la nécessité de différencier les structures in vivo, grâce au microenvironnement présent. L'objectif est de mettre au point les conditions expérimentales qui seront utilisées, après autorisation, dans un futur projet de plus grande ampleur de l’équipe.
Bénéfices attendus
Le tractus gastro-intestinal supérieur comprend l’œsophage et l’estomac reliés par une zone de transition (ZT). L'incidence des cancers de la ZT a connu une augmentation rapide. Dans le laboratoire nous avons mis en place la culture de ‘’mini-organe’’ ou organoïdes de ces zones de transition gastrique à partir de tissus de souris. Ces organoïdes en culture ont une taille ne dépassant pas 1-2mm. L'objectif du projet est de mettre au point une technique chirurgicale de transplantation de ces organoïdes sous la capsule rénale de souris immunodéficientes afin de permettre à ces structures tridimensionnelles de se développer de façon plus importante (>10 mm) et de se différencier. Notre modèle d’organoïdes nous permettra de comprendre les mécanismes de transformation à l’origine des cancers de la ZT et donc dans le futur développer des traitements ciblés. De plus, l’utilisation d’organoïdes permet de réduire de façon notable l’utilisation de modèles animaux.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale visant à transplanter des organoïdes (mini-organes) dans le rein. La procédure chirurgicale dure environ une heure en prenant en compte le temps nécessaire pour que l'analgésique soit effectif, le temps nécessaire pour anesthésier l'animal, la durée de la procédure (30 minutes au maximum) et le temps de réveil. Chaque animal sera soumis à la procédure une seule fois. Les animaux seront également pesés et évalués selon une grille de score (durée de la manipulation entre 5 et 10 minutes par animal) le jour de la chirurgie, 24h et 48h après ainsi que deux fois par semaine pendant 4, 5, 6 ou 8 semaines après la chirurgie, ce qui peut générer un stress.
Impact sur les animaux
La greffe se fera dans la capsule rénale du rein gauche, ce qui, après croissance et différenciation des organoïdes, rendra le rein non fonctionnel. La chirurgie implique une anesthésie qui présente un risque d’hypothermie ainsi qu’une incision entrainant la réalisation de points de suture au niveau dorsal, ce qui peut créer une gêne ou une douleur chez l'animal. Les animaux seront manipulés pour pesées et évaluations du bien-être le jour de la chirurgie, 24h et 48h après, ainsi que deux fois par semaine pendant 4, 5, 6 ou 8 semaines après la chirurgie, manipulation susceptible de générer un stress. La chirurgie dure environ 30 minutes, et l’animal sera anesthésié pendant environ 45 minutes. La pesée et l’évaluation du bien-être dure environ 5 à 10 minutes par animal. La croissance des organoïdes dans le rein peut également induire une douleur chez l’animal.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort afin d'effectuer les prélèvements d'organes nécessaires à nos analyses.
Remplacement
Le tractus gastro-intestinal supérieur comprend l’œsophage et l’estomac reliés par une zone de transition (ZT). A la ZT gastrique se trouve une glande protectrice qui sécrète du mucus in vivo. Les organoïdes dérivés de ces zones de transition conservent cette glande. Des études préliminaires de différenciation in vitro ont été effectuées et la différenciation obtenue est partielle, en effet, la production de mucus n’est pas conservée in vitro, d’où la nécessité de différencier les structures in vivo grâce au microenvironnement présent. Il est également nécessaire à la croissance des organoïdes jusqu'à la taille requise, la taille maximum étant limitée in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux sera limité au maximum pour ce protocole. Tout d’abord, nous n’utiliserons que 4 souris par condition, nombre minimum nécessaire afin de confirmer la reproductibilité des résultats. Ensuite, les organoïdes utilisés pour la transplantation ne seront pas produits avec de nouvelles souris mais proviendront de stock congelés. Afin de déterminer la quantité d'organoïdes la plus efficace pour la transplantation, et de connaître la durée de croissance pour établir les temps d'analyses les plus intéressants pour notre projet futur, nous allons tester plusieurs combinaisons. Nous testerons 4 quantités d'organoïdes (en se basant sur la littérature) ainsi que 4 temps d'analyse différents pour ces 4 quantités. Pour ces temps d’analyse, nous nous basons sur le fait que la transplantation d’organoïdes intestinaux dans la capsule rénale montre une maturation complète au bout de 6 semaines dans la littérature. Le type d’organoïdes transplanté dans notre protocole étant différent, le temps nécessaire à la différenciation peut varier.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvellement d’air : 15 volumes/ heure ; éclairage artificiel : 12h jour/12h nuit). Les normes les plus strictes en matière de soin et de surveillance des animaux seront appliquées. Toutes les manipulations sont réalisées dans un environnement stérile afin de maintenir le statut sanitaire exigeant (particulièrement pour des animaux immunodéficients) et tout le matériel utilisé est stérile. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l’administration d’un analgésique) en fonction d’une grille de score de bien-être adaptée à notre modèle, comprenant des points limites entraînant l'arrêt de la procédure pour les animaux concernés. Les animaux seront hébergés en groupe pour un enrichissement social et afin de respecter l'instinct grégaire de cette espèce. La nourriture et l'eau sont fournies ad libitum. Du matériel de nidification (dôme, coton, copeaux compressés) est mis à disposition des animaux. Les locaux d'hébergement sont séparés des locaux d'expérimentation. Les animaux destinés aux procédures expérimentales feront l’objet d’une phase d’acclimatation dans les locaux dédiés au suivi de l’expérimentation. Cette phase sera de 7jours pour les animaux produits sur site. Les animaux seront pesés et évalués à l’aide d’une fiche de score le jour de la chirurgie, 24h et 48h après ainsi que deux fois par semaine pendant 4, 5, 6 ou 8 semaines après la chirurgie. Si nous observons une déshydratation nous administrerons une solution saline. Nous utiliserons des analgésiques pour réduire la douleur due à la chirurgie. L’analgésie sera effectuée à 24H et 48H après la procédure chirurgicale. L’administration se fera par voie sous cutanée pour une diffusion plus longue. Une analgésie préopératoire sera effectuée en voie sous cutanée 30 minutes minimum avant l'intervention. La transplantation des organoïdes dans la capsule rénale est préférable qu’une transplantation au niveau gastrique car cela permet d’effectuer une chirurgie moins invasive et donc d’avoir une récupération plus rapide des animaux.
Choix des espèces
La réalisation de greffe demande l'utilisation de modèle immunodéficient, et ce modèle est disponible chez la souris. De plus, les organoïdes transplantés proviennent de tissus murins, l'espèce doit donc rester consistante. Des animaux adultes (6-12 semaines) seront analysés à 4, 5, 6 ou 8 semaines après la procédure chirurgicale pour suivre le développement et la différenciation des organoïdes. L’âge a été déterminé pour avoir un poids équivalent entre les animaux et pour s’assurer de la maturité. C’est également l’âge qui sera utilisé dans le projet futur dans lequel s’inscrit cette mise au point de protocole.
Mémoire Innée et PDAC
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une irradiation, une greffe de moelle osseuse par injection rétro-orbitale sous anesthésie et une greffe de tumeur du pancréas, développant une pathologie que le porteur qualifie de "potentiellement grave". Le projet étudie la mémoire du système immunitaire face au cancer du pancréas. Le porteur affirme qu'aucune alternative non animale n'est disponible, tout en décrivant des travaux in vitro déjà menés en co-culture.
Objectifs
L'adénocarcinome pancréatique (PDAC) est un problème majeur de santé publique, avec une survie à 5 ans, tous stades confondus, estimée à 11% en France. Malgré les efforts pour mieux comprendre les mécanismes de résistance aux traitements, pour développer de nouvelles stratégies de prise en charge et pour rechercher de nouvelles cibles thérapeutiques, de nouvelles connaissances et des approches originales pour relever ce défi sont nécessaires. Le PDAC se caractérise par un remodelage profond du paysage immunitaire afin d'atténuer l’inflammation anti-tumoral. Donc, un défi pour cibler les cellules immunitaires dans le cadre d'un traitement anticancéreux consiste à identifier les facteurs clés qui contrôlent les réponses inflammatoires anti-tumorales et pro-tumorales. Ce projet vise à mieux comprendre comment la système immunitaire s’adapte vis à vis des tumeurs, et notamment le PDAC. Dans cet objectif, nous allons mettre en place un procédure pour pouvoir étudier l’inflammation et les mechanisms moléculaires qui l’accompagne dans les cellules immunitaires avant et après adaptation à un tumeur. Ceci sera fait par bias de greffe de moelles osseuses de souris avec ou sans tumeurs dans des souris seins auxquelles nous allons greffer des tumeurs par la suite. Ces informations auront un impact important sur notre compréhension de la résistance immunitaire et des traitements utilisant des thérapies immunitaires pour le PDAC.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra d'évaluer l'héritabilité et la présence de la mémoire dans le compartiment des cellules souches du système immunitaire. Ces informations auront un impact important sur notre compréhension de la résistance immunitaire et des traitements utilisant des thérapies immunitaires pour le PDAC.
Procédures
Les animaux seront soumisent à 1 procédure chirurgicale (durée 40 minutes), 1 irradiation (durée 12 minutes), 1 injection rétro-orbitaire sur des souris anesthésiées (durée 7 minutes), et 2 prises de sang rétro-orbitaire sur des souris anesthésiées (durée 7 minutes chaque).
Impact sur les animaux
Les animaux seront transplantés avec des cellules tumorales et développeront donc une pathologie potentiellement grave. L'anesthésie constituera une nuisance sur les animaux. Les manipulations, le court jeune avant transplantation ainsi que les pesées peuvent être source d'angoisse. Autres nuissances éventuels pourraient être induit lors de l’irradiation (peur/détresse), le site de l’injection retro-orbital des greffes de moelles faites sous anesthésie, l’injection éventuelles d’analgésésiques post-opératoire, et des piqures retro-orbital pour les prélèvement de sang post-greffe de moelle (douleur lié au lésion de la piqure).
Devenir
Tous les animaux seront mise à mort à l'issue de chaque procédure, ou plus tôt selon les points limites, pour la prélevement et l'analyse des organes.
Remplacement
Des alternatives non animales ne sont pas disponible dans ce domaine pour aborder les questions scientifiques posés. Cependant, l'utilisation de modèles tumoraux orthotopiques murin permet d'étudier l'environnement tumoral et de reproduire l’hétérogénéité tumorale qui ne peut être recréé in vitro (i.e. un seul organe isolé) ou chez une espèce autre que les mammifères. Ce modèle se prête également aux greffes de moelle osseuse qui sont nécessaires pour étudier la transmission de la mémoire immunitaire. De plus, leur utilisation dans de nombreux projets scientifiques a permis des avancées significatives et le transfert vers des essais cliniques. Des modèles in vitro avec des cellules de moelle osseuses murin mise en co-culture avec des organoides de tumeur pancréatique murin, pour étudier les mécanismes moléculaires associé à l’activation des macrophages issue de souris avec PDAC ou sans tumeur et ensuite exposés aux signaux émis des cellules cancéreuse, ont déjà été accomplis.
Réduction
Le nombre d'animaux/groupe expérimental nécessaire pour obtenir une signification statistique a été défini en déterminant : - le test statistique à utiliser : ANOVA et test post-hoc (Tukey) pour comparer les 2 groupes expérimentaux entre eux. - l'effet biologique et la dispersion attendus, cette estimation a été faite en fonction des données bibliographiques et/ou des résultats antérieurs obtenus par le laboratoire.
Raffinement
Les conditions d’hébergement respectent les besoins physiologiques et le bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvellement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). La nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Afin de respecter leur instinct grégaire, l’hébergement des animaux se fait en confinement en cages individuellement ventilées à raison de 5 souris par cage. L’environnement est enrichi à l’aide de coton, de lanières de papier utiles à la nidification, et éventuellement d’un dôme. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. Les contraintes par rapport à la douleur, la souffrance et l’angoisse dans le cadre de l’expérimentation présentées dans le projet seront réduites par une surveillance accrue avec des points limites spécifiques et adaptés. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l'apport d'un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être. Nous utiliserons aussi une lampe chauffante pour maintenir les animaux au chaud lors des chirurgies avec maintien de l’enrichissement, de la socialisation et de l’alimentation. Les chirurgies sont faites sous anesthésie et analgésie.
Choix des espèces
Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. L'espèce choisie est la souris C57BL/6, car elle permet le transfert adoptif de cellules immunitaires et tumorales. Elle est couramment utilisée en oncologie et dans la recherche sur les cellules souches. Les conditions expérimentales de transplantation de nos modèles tumoraux (a) et hématopoiétiques (b) sont clairement exposés dans la littérature scientifique du domaine. Les souris doivent être âgées de 6 à 8 semaines au moment de greffe. Cet âge est nécessaire pour que le système immunitaire soit mature.
Evaluation d’une nouvelle approche radiothérapeutique dans un modèle préclinique du cancer colorectal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
114 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur colorectale leur est greffée sous la peau, puis elles reçoivent un anticorps et une sonde radioactive par voie intraveineuse, suivis de séances d'imagerie sous anesthésie. Le projet teste une radiothérapie interne visant à irradier sélectivement la tumeur. Le porteur fixe des points limites, une perte de poids de plus de 20 % ou une tumeur de plus de 1 500 mm3 déclenchant la mise à mort.
Objectifs
L’objectif de ce projet de recherche est d’évaluer une approche thérapeutique du cancer colorectal. Cette approche repose sur le principe de la radiothérapie interne, visant à sélectivement irradier les tumeurs afin de les détruire. Une stratégie consiste à injecter au patient un anticorps ciblant la tumeur, et sur lequel a été greffé un atome radioactif dont l’énergie du rayonnement est suffisante pour causer des dommages importants aux cellules cancéreuses. Cependant, cette stratégie peut engendrer une toxicité au niveau d’autres tissus de l’organisme, car les anticorps restent longtemps dans la circulation sanguine. Aussi, l’approche thérapeutique que nous souhaitons évaluer ici consiste à séparer l’injection de l’anticorps (ciblage de la tumeur) de celle de la radioactivité (action thérapeutique). Dans ce contexte, l’anticorps est dans un premier temps administré et va se fixer au niveau de la tumeur (préciblage de la tumeur). Dans un second temps, une sonde radioactive est administrée et va spécifiquement reconnaître l’anticorps fixé sur la tumeur et ainsi, délivrer son énergie à cette dernière (action radiothérapeutique). Cela permet d’irradier sélectivement les tumeurs tout en limitant la toxicité périphérique. Malgré les excellents résultats observés au niveau préclinique, il n’existe à ce jour aucun essai clinique de cette approche en raison d’une ingénierie difficile. Pour remédier à ces verrous scientifiques, nous proposons d’évaluer de nouveaux outils (optimisation des temps entre l’injection de l’anticorps et l’injection de la radioactivité et amélioration de la reconnaissance entre l’anticorps et la sonde radioactive grâce à la synthèse de nouvelles molécules) dans un modèle préclinique de cancer colorectal.
Bénéfices attendus
L’ensemble de ces travaux nous permettra d’évaluer l’intérêt de l’optimisation d’une approche par radiothérapie interne dans la prise en charge des cancers colorectaux avec pour objectif à plus long terme d’améliorer la prise en charge clinique de cette pathologie, en augmentant l’eefficacité de la radiothérapie. Par ailleurs, cette approche sera extrapolable à d’autres type de cancer.
Procédures
Les animaux subiront deux types d'intervention: - inoculation de cellules tumorales par voie sous-cutanée, sous anesthésie générale. Chaque souris ne subira cette intervention qu'une fois. La croissance tumorale sera alors suivie, avec une mesure du volume tumoral 2 fois par semaines pendant 3 semaines, toujours sous anesthésie générale afin de réduire l'angoisse de la manipulation. - injection intraveineuse sur animal vigile placé dans un système de contention: au maximum, une souris subira cette intervention 2 fois, 1 fois pour l'injection de l'anticorps, 1 seconde pour l'injection de la sonde radioactive. Ces 2 injections seront espacées d'au moins 24 heures. Ces injections seront réalisées par du personnel compétent et ne dureront que quelques minutes. Suite à l'injection de molécules radioactives, les animaux seront placés sous anesthésie générale pour l'évaluation de la distribution de ces molécules par imagerie. L'acquisition des images sous anesthésie durera au maximum 45 minutes et sera répétée au maximum 3 fois, à 24 heures d'intervalle, pour l'évaluation de la pharmacocinétique des anticorps.
Impact sur les animaux
Les nuisances potentielles sont le stress dû aux manipulations et la douleur engendrée par les procédures, principalement les injections (réduites à quelques dizaines de secondes car réalisées par un expérimentateur expert). Aucune nuisance liée à l’imagerie in vivo ou aux anesthésies n’est attendue. Pour les animaux porteurs de tumeur, les nuisances peuvent être relatives à une gêne fonctionnelle liée à la présence de la tumeur ou encore une nécrose précoce de la tumeur. Dans tous les cas, un suivi régulier des animaux permettra de réagir rapidement en cas d’apparition d’une souffrance pour l’animal. L’arbre décisionnel viendra orienter les actions à mener jusqu’à l’atteinte de points limites. Des méthodes de raffinements sont utilisées afin d'augmenter au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet. Pour cela les conditions d'hébergement seront optimales (hébergement en groupe, portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, enrichissement de milieu, surveillance quotidienne).
Devenir
Tous les animaux seront porteurs de tumeurs sous-cutanées et ne pourront être réutilisés. Aussi, tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure
Remplacement
Plusieurs sondes radioactives seront évaluées au cours de ce projet. Ces sondes ont été testées dans un premier temps in vitro afin de sélectionner les plus adaptées. La culture cellulaire ne permet pas de mimer la distribution et le métabolisme des molécules étudiées. A ce stade, le passage sur un modèle préclinique est donc inévitable pour juger de façon optimale l’effet des molécules étudiées.
Réduction
Les molécules évaluées ont dans un premier temps été caractérisées et sélectionnées par des méthodes in vitro afin de réduire le nombre de groupe d’animaux requis pour le projet. Le nombre d’animaux dans chaque groupe a été défini de façon à utiliser le minimum d’animaux tout en étant certain d’obtenir le matériel tumoral suffisant pour réaliser des études de caractérisation du modèle et atteindre une validité statistique. Sur ce plan, nous utiliserons des groupes de 6 souris.
Raffinement
Des méthodes de raffinements sont utilisées afin d'augmenter au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet. Pour cela les conditions d'hébergement seront optimales (hébergement en groupe, portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, densité animale, enrichissement de milieu, surveillance quotidienne). Lors des procédures expérimentales (inoculation des cellules et imagerie), les souris seront placées sous anesthésie générale gazeuse afin d’éliminer toute douleur potentielle et de réduire l’angoisse générée par la manipulation. De plus, des injections d’antalgiques pourront être appliqués si besoin. Une surveillance régulière des animaux consistera à observer et évaluer la présence de certains critères signes d’une dégradation de l’état général : prostration, œil clos, diarrhées, nécrose, infection au niveau de la tumeur…. Le poids sera régulièrement suivi ainsi que le volume tumoral. Une perte de poids supérieure à 20 % du poids maximal ainsi qu’un volume tumoral supérieur à 1500 mm3 sont deux signes cliniques imposant la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
Les rongeurs sont classiquement utilisés en expérimentation animale en imagerie préclinique comme en cancérologie. En ce qui concerne le modèle tumoral, les études préliminaires réalisées ont pu mettre en évidence une croissance plus homogène chez les souris balb/c nude, décrite dans la littérature pour ce modèle. Les animaux utilisés seront des souris adultes de 5 semaines, pesant environ 20 g ayant atteint leur maturité sexuelle afin d'éviter l'influence des variations hormonales liée à la puberté. Le développement des xénogreffes que nous comptons utiliser est relativement rapide (environ 3 semaines), ce qui implique que les animaux seront inclus dans les procédures d’imagerie à l’âge de 7-8 semaines (20-25g).
Etudes structurales et fonctionnelles lors du développement du Xénope
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
6 702 xénopes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la plupart tués et 680 femelles réutilisées. Les femelles reçoivent des injections d'hormone tous les quatre mois pendant toute leur vie pour produire des ovocytes, tandis que les mâles et les larves sont tués pour prélèvement. Un test de réponse à la lumière évalue la vision des larves. Le porteur présente le xénope comme une "méthode alternative de remplacement" des modèles mammifères.
Objectifs
Ce projet englobe les questions scientifiques de notre institut utilisant le modèle Xénope et qui sont développé avec l'objectif de réduire en les mutualisant les expériences. Les objectifs sont l’étude : a) de la division des cellules de l'épiderme embryonnaire par des approches d’imagerie en temps réel dans des larves aux stades neurula. b) de la cataracte dans la larve de xénope. Le développement du cristallin est aisément observable dans l’embryon de xénope et dépend de l’expression de gènes dont la mutation est à l’origine de cataracte humaine. Les études dans la larve de xenope permettent d’analyser la fonction de ces gènes dans le développement de l’œil in vivo. c) au cours du développement (stades 1 à 45) de l’expression d' ARN circulaires pouvant servir de régulateurs de l'expression des gènes. d) du controle du fuseau de division cellulaire par des approches de microscopie electronique. Le fuseau permet la répartition fidèle du matériel génétique entre deux cellules filles. La taille et la structure du fuseau sont essentielles pour sa fonction. Cependant, malgré des décennies d'étude, on ignore comment le fuseau adopte une morphologie optimisée pour sa fonction.
Bénéfices attendus
Les 4 sujets de recherche développés dans cette demande d’autorisation de projets visent à l’avancée des connaissances scientifiques sur des sujets liés à la Biologie/Santé. En particulier le projet a) vise à préciser le rôle des acteurs de la cytokinese des épithéliums. La majorité des cancers provenant de tissus épithéliaux, la connaissance des mécanismes contrôlant ces divisions participent à la lutte anti-cancéreuse. Le projet b) vise à identifier et caractériser des gènes potentiellement impliqués dans le développement des cataractes et ainsi à ouvrir la voie à l’identification de cibles potentielles pour le traitement ou la prévention de la cataracte. Le sujet c) vise à décrire de nouveaux acteurs des régulations des gènes lors du développement embryonnaire et à analyser les mécanisme contrôlant leur production. Le sujet d) vise à la compréhension des mécanismes de contrôle de l’architecture du fuseau mitotique en tirant profit d’une comparaison inter-espèce.
Procédures
Une solution d'hormone (HCG) est injectée afin d'induire la ponte ou la spermatogenese. Cette opération dure une quinzaine de seconde. Pour les males il s'agit d'une injection unique. Dans le cas des femelles cette procédure est répétée environ tous les 4 mois tout au long de leur vie pour obtenir des ovocytes. Les larves issues de fécondation in vitro sont injectés au stade 1 à 8 cellules (environ 30' à 2h30min après fécondation, à un stade larvaire non autonome). Dans le cadre du sujet cristallin, un test comportemental unique de réponse à la lumière permet d'évaluer la fonction visuelle de chaque larve.
Impact sur les animaux
Les procédures décrites dans cette demande impliquent l'administration d'hormones par injection sous cutanée dans l'animal. Les nuisances associées à ces injections sont a) l'isolement temporaire des animaux et le stress induit par la maniupulation et la contention le temps de l'injection. La procédure s'appliquant aux larves de stades supérieurs à 45 est une procédures d'évaluation de la fonction visuelle par des test comportementaux sans nuisances particulières associé à ce test. Les larves expérimentales ont été microinjectés aux stades 2-8 cellules puis se sont développés jusqu'au stade 48. Les phénotypes attendus sur ces animaux devrait etre associés à la fonction visuelle sans préjudice autre a priori.
Devenir
Xenopus laevis ne peut être adopté puisqu'il s'agit d'une espèce invasive. Les animaux femelles sont en utilisation continue pour la production d'ovocytes (680 animaux) tout au long de cette DAP. La durée de vie de ces animaux étant supérieure à 10 ans, et les procédures étant légères, les animaux sont conservés à l'issue du projet et réutilisés dans le cadre des nouveaux projets. Les males et les larves sont sacrifiés pour prélèvement.
Remplacement
Le modèle xénope permet par sa capacité de ponte élevé l’obtention de nombreuses larves dont le développement est externe. Ceci permet donc l’étude des phénomènes complexes impliqués sont le développement embryonnaire. L’utilisation du modèle xénope dans un contexte d’étude du développement embryonnaire en général est donc en soi une méthode alternative de remplacement de modèles mammifères, murins en particulier. L’objectif de ce projet est de déterminer le rôle de gènes d’intérêt dans l’organogenèse (épithélium, cristallin, embryon entier), ces processus complexes ne peuvent être reproduits en leur globalité en culture cellulaire et nécessite donc l’utilisation de ce modèle animal. L’une des forces de ce modèle est de permettre, en intervenant dans le cadre de procédures sur quelques animaux adultes, d’obtenir en quantité de nombreux stades larvaires permettant l’expérimentation et une bonne puissance statistique des analyses. Par ailleurs, l’utilisation du modèle Xénope nous permet d’obtenir les ovocytes servant à la préparation d’extraits cytoplasmiques capables de reproduire in vitro les évènements du cycle cellulaire associé à la formation du fuseau de division et de les observer par microscopie electronique. La génération in vitro de tels fuseaux ne peut être réalisée qu'avec ces extraits d’ovocytes, de plus ce projet repose sur l'étude comparative entre X. laevis et X. tropicalis. C’est pourquoi aucune autre méthode, y compris les extraits de cellules en culture, ne peut être utilisée comme substitut.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés pour les expériences, nous cherchons à mutualiser entre les différents sujets l’utilisation des animaux entrant dans le cadre d’une procédure. 1) Pour cela les larves obtenues lors d’une FIV seront potentiellement utilisées pour tous les sujets. En effet, en microinjectant les larves à différents stades de développement nous pouvons étaler les expériences et ainsi utiliser au mieux les larves produites lors d’une FIV. De ceci découle que le nombre de procédures FIV et le nombre d’utilisations d’animaux adultes sera diminué. 2) Des mâles doivent être mis à mort pour la collecte des testicules nécessaire aux FIV. L’utilisation des testicules issus de ces mâles est mutualisée lors de la réalisation des FIV et les testicules sont conservés au froid pour permettre la réalisation de FIV sur environ 2 semaines. 3) Le travail expérimental utilisant un nombre d’échantillons élevé pour l’analyse statistique est réalisé uniquement sur des stades larvaires. 4) Les femelles Xénopes ont une espérance de vie en captivité de l’ordre de 20 ans. Ces animaux subissant pour toute procédure des injections d’Hormone Chorionique Gonadotrophique (HCG) tous les 4/5 mois sont réutilisés tout au long de leur vie.
Raffinement
Le milieu est enrichi par l'adjonction d'artéfacts permettant aux animaux de se dissimuler, tandis que les aquariums sont partiellement dissimulés par des plaques opaques afin de limiter l’apport de lumière directe dans les aquariums. Les espaces d'élevages sont séparés des espaces de manipulation et à l’écart des bruits et circulations parasites. Les femelles en procédures sont isolées en bacs individuels lors de cette période qui s'étend au maximum sur 48 heures.
Choix des espèces
De par son mode de fécondation externe, il est possible de récupérer les ovocytes de Xénope après une simple stimulation hormonale, sans chirurgie ni mise à mort. Ces ovocytes permettent soit la réalisation d’extraits cytoplasmiques reproduisant le cycle cellulaire, soit, après fécondation in vitro, d’obtenir de nombreuses larves au stade une cellule qui peuvent être microinjecté par des molécules traceurs ou des molécules interférant avec l’expression des gènes afin d’analyser l’impact de certains produits de gènes sur l’expression des gènes, le développement embryonnaire et l’organogenèse, ou la dynamique des divisions cellulaires des épithéliums. Seuls des animaux adultes sexuellement rentrent dans nos procédures expérimentales. Les stades larvaires expérimentaux sont généralement arrêtés avant le stade 45, les larves allant au stade 48 sont utilisés pour un test fonctionnel non invasif. Les larves surnuméraires non expérimentales pourront être utilisées pour générer des animaux adultes.
Effets protecteurs de lipides végétaux en situation d’obésité chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
88 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent un régime riche en graisses et en sucres pendant douze semaines, avec des gavages de sucre et d'huile, des prélèvements de sang répétés et une prise de poids réduisant leur mobilité, avant d'être tuées pour prélever leurs tissus. Le projet cherche à montrer un effet protecteur de lipides végétaux contre l'obésité. Le porteur présente le résultat comme une "preuve de concept" pour de futures études chez l'humain.
Objectifs
La transition nutritionnelle vers des systèmes alimentaires sains et plus durables est en faveur de la végétalisation des régimes alimentaires. Il est devenu important de mieux comprendre le rôle et les mécanismes d’action des nutriments d’origine végétale d’un point de vue de la santé métabolique. Si les protéines végétales ont suscité un vif intérêt ces dernières années, certains lipides spécifiques des végétaux verts restent encore méconnus et peu exploités. Leur absorption et métabolisme in vivo sont jusqu’ici peu décrits. Des travaux préliminaires suggèrent néanmoins des effets anti-inflammatoires, des effets de réduction des lipides sanguins circulants, ainsi qu’une potentielle utilisation par les bactéries intestinales. Les lipides végétaux naturellement présents dans différents aliments végétaux pourraient donc constituer de potentiels prébiotiques (susbtrats pour les bactéries intestinales) avec des bénéfices importants pour la santé, et avoir ainsi un rôle à jouer dans le cadre de stratégies nutritionnelles préventives dans la lutte contre l’obésité. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est de mettre en évidence les potentiels effets protecteurs des lipides végétaux sur la mise en place de l’obésité chez la souris. Pour cela, nous étudierons leurs effets sur : le métabolisme des lipides et des glucides, la santé intestinale (absorption, fonction barrière, bactéries) et l’inflammation.
Bénéfices attendus
Cette étude animale devrait permettre de montrer pour la première fois que la consommation de certains lipides végétaux peut éviter une altération du métabolisme, un déséquilibre des bactéries intestinales et une augmentation de l’inflammation. Les résultats de cette approche pourront alors constituer une preuve de concept pour de futures études cliniques d’intervention nutritionnelle chez l’Homme, notamment chez des personnes souffrant d’obésité.
Procédures
- Alimentation riche en graisses et en sucres pour 3 groupes de 12 souris pendant 12 semaines ; alimentation d’entretien pour 1 groupe contrôle de 8 souris pendant 12 semaines. - Mesure de la composition corporelle sur toutes les souris vigiles, contention dans un tube, moins de 2 minutes par souris, deux fois par souris à 12 semaines d’écart. - Collecte de crottes de toutes les souris vigiles, 30 minutes dans une cage individuelle, deux fois par souris à 12 semaines d’écart. - Mise à jeun (6h ou 12h) des animaux avant les gavages de toutes les souris, deux fois à 1 semaine d’écart. - Un gavage avec du sucre pour tester le métabolisme des glucides sur toutes les souris vigiles : la contention et le gavage durent moins de 1 min par souris (1 gavage de sucre/souris sur les 12 semaines d’étude). - Un gavage avec de l’huile pour tester le métabolisme des lipides sur toutes les souris vigiles : la contention et le gavage durent moins de 1 min par souris (1 gavage d’huile/souris sur les 12 semaines d’étude). - Les deux gavages seront espacés d’une semaine. - Prélèvements de sang à la queue avant (T0) et suite au gavage avec du sucre (15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes) sur toutes les souris vigiles lors de la 10ème semaine d’étude. Ces prélèvements durent chacun quelques secondes par souris. - Prélèvements de sang à la queue avant (T0) et suite au gavage avec de l’huile (1, 2 et 4heures) sur toutes les souris vigiles lors de la 11ème semaine d’étude. Ces prélèvements durent chacun environ 30 secondes par souris. - Une injection dans l’abdomen des anesthésiques (1 seule fois durant les 12 semaines d’étude) ; durée : quelques secondes. - Un prélèvement de sang sous anesthésie profonde sur toutes les souris (1 seule fois durant les 12 semaines d’étude) ; durée : 30 secondes.
Impact sur les animaux
Une prise de poids est attendue chez les souris suivant une alimentation riche en graisses et en sucres. Cette prise de poids pourra entraîner une diminution de la mobilité des animaux concernés. Un isolement court (30 min) sera nécessaire pour la récupération des fécès et pourra induire un léger stress aux animaux. La mise à jeun (12h ou 6h avant gavage d’huile ou sucre) peut également induire un stress chez les animaux. Lors des deux gavages, léger stress dû à la contention de l’animal et gêne/irritation potentielle de l’œsophage liée au passage de la sonde. Les prélèvements sanguins réalisés après les gavages pourront induire un stress chez les animaux. Pour la mesure de composition corporelle, les souris sont introduites dans un tube cylindrique (espace réduit) pendant moins de 2 minutes, ce qui peut induire un léger stress aux animaux. L’injection dans l’abdomen des anesthésiants (avant le prélèvement terminal) peut induire une douleur transitoire.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort à l’issue du dernier prélèvement sanguin afin de collecter les tissus d’intérêt pour répondre aux questions scientifiques.
Remplacement
Le but de ce projet est d’étudier les effets des lipides végétaux sur le métabolisme de différents organes et l’inter-communication entre tous ces organes. Il est à l’heure actuelle impossible de reproduire dans des modèles de culture cellulaire les mécanismes métaboliques et inflammatoires en lien avec la modification des bactéries intestinales, et l’implication de toutes les voies de régulation au centre de la communication entre les différents organes. Par conséquent, le modèle animal ne peut pas être remplacé pour répondre à notre question scientifique. De plus, une étude clinique chez l’Homme ne peut pas être envisagée directement à ce stade car les comités d’évaluation des études cliniques demandent des résultats préliminiares précliniques (à l’échelle d’un organisme entier) pour démarrer une étude chez l’Homme.
Réduction
A notre connaissance, aucune étude sur la souris n’a encore été réalisée pour évaluer les effets de lipides spécifiques des végétaux verts dans un contexte d’obésité induit par une alimentation riche en graisses et en sucres. Nous ne disposons donc pas de données de la littérature pour réaliser un calcul d’effectif. S’agissant d’une étude pilote et exploratoire, une dizaine de souris par groupe semble nécessaire et suffisante (8 souris pour le groupe contrôle et 12 souris pour chacun des groupes avec alimentation riche en graisses et en sucres). De plus, l’étude sera lancée tout d’abord sur des souris mâles, et si les résultats sont significatifs chez les mâles alors la même étude sera réalisée sur des souris femelles (n=44) pour extrapoler ou non les résultats aux deux sexes
Raffinement
Plusieurs mesures seront mises en place pour veiller au bien-être des animaux et réduire au minimum toutes les nuisances potentielles : 1/ Ajout des lipides végétaux à l’alimentation des animaux pour éviter manipulation et contention quotidiennes des souris (contrairement à une supplémentation par gavage quotidien). 2/ Avoir le même expérimentateur (maximum 2) tout au long de l’étude et habituer les animaux à sa/leur présence (odeurs, voix, etc) pour diminuer leur stress face aux humains. 3/ Avoir du personnel expérimenté et formé aux gestes techniques des différentes procédures (tests métaboliques, mise à mort), et à l’observation de comportements « normaux » des animaux. 4/ Surveillance étroite des animaux 2 fois par semaine (apparence physique, comportement, poids, prise alimentaire), 5/concernant les gavages : - l’administration par voie orale est une méthode moins invasive que l’injection par voie intraveineuse ; - pour limiter la potentielle irritation de l’œsophage des animaux lors des gavages une sonde de gavage coudée au bout arrondi sera utilisée par un personnel expérimenté - les volumes de gavage seront réduits au minimum pour éviter tout incomfort aux animaux. - une surveillance étroite du comportement des animaux sera réalisée suite aux gavages, - les gavages seront espacés d’une semaine afin de réduire le stress des animaux, 6/ Les contentions prévues lors des pesées, gavages ou lors de la mesure de la composition corporelle seront toujours effectuées de manière brève par un expérimentateur formé, 7/ En fin d’étude, les animaux seront anesthésiés pour éviter toute douleur au moment du dernier prélèvement sanguin, 8/ Mise en place de points limites précoces permettant, si l’un est atteint, d’éviter toute souffrance des animaux.
Choix des espèces
En raison de la grande similitude de régulation du métabolisme entre la souris et l’Homme, la souris est un modèle de choix pour étudier et caractériser les effets santé des lipides végétaux en situation d’obésité. Les souris débuteront l'étude à 8 semaines de vie après une semaine d’acclimatation. Le passage à une alimentation riche en graisses et en sucres à cet âge est très bien toléré par les animaux, et les perturbations du métabolisme attendues les semaines suivantes sont bien décrites et maîtrisées.
Caractérisation des atteintes consécutives à un traumatisme crânien chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un impact crânien est infligé à des souriceaux de 17 jours, suivi de l'implantation d'un mini-microscope par une fenêtre crânienne, puis de tests comportementaux (exploration, coordination motrice, sensibilité tactile, état anxieux) et d'imagerie du cerveau. Le porteur qualifie le traumatisme de "léger" et affirme qu'aucun signe de douleur n'apparaît au réveil. Toutes les souris sont tuées pour des analyses en immunohistochimie et par IRM.
Objectifs
Chaque année 1,5 millions d'européens sont victimes d'un traumatisme crânien le plus souvent subit lors d'un accident de la route, d'une chute ou au cours de pratiques sportives. 70 000 personnes perdent la vie des suites du traumatisme et environ 100 000 ne présentent pas de récupération totale et demeurent handicapées, notamment chez les enfants et les jeunes adultes qui représentent une population particulièrement vulnérable en regard de ce type de traumatisme. Bien qu'au cours des dernières années un raffinement des procédures de prise en charge par les urgences et les hôpitaux a permis de réduire la mortalité des traumatisés crâniens, il est apparu qu'un grand nombre de patients souffrent par la suite de désordres chroniques invalidants tels que : épilepsie, dépression, démence progressive, etc. À ce jour, aucun traitement ne permet d'empêcher la mise en place de tels désordres à la suite d'un traumatisme crânien. Le projet que nous avons développé vise à étudier les changements qui se mettent en place à la suite d'un traumatisme crânien (TC) au sein du cerveau et qui contribuent aux atteintes comportementales à long terme. Nous allons nous focaliser dans ce projet sur les atteintes des vaisseaux sanguins ainsi que sur les processus inflammatoires qui se mettent en place après un TC. Le caractère unique de ce projet est assuré par l’utilisation d’une technique innovante permettant d’imager les cerveaux de souris se comportant grâce à un mini-microscope qui sera implanté sur leur tête.
Bénéfices attendus
Les mécanismes physiopathologiques découlant d’un traumatisme survenant pendant l’enfance sont encore assez peu connus. Ainsi on ne sait pas pourquoi seule une partie des enfants souffrant d’un traumatisme crânien léger vont développer à plus ou moins long terme des symptômes tels que des maux de tête, pertes d’équilibre, problèmes de concentration ou retards d’apprentissage… De plus il n’existe à ce jour aucun traitement efficace pour prévenir les conséquences d’un traumatisme crânien survenant chez l’enfant. Notre étude permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à ces traumatismes et devrait permettre de mieux cerner les conditions propices au développement de symptômes post-trauma (notamment l’influence du sexe de l’individu).
Procédures
1. trauma crânien léger juvénile (TC): 17 jours après leur naissance, les animaux seront anesthésiés pendant 5 min et subiront un impact léger calibré de 200 µs. Animaux contrôles soumis au même geste, sauf impact. Réalisé une seule fois. 2. Implantation des lentilles de miniscope. Réalisé un mois après TC sous anesthésie générale et analgésie adaptée. Réalisation d’une fenêtre crânienne. Le cas échéant injection stéréotaxique de virus. Insertion et fixation du prisme, scellement de la base d’ancrage. Durée de 1h à 1h30, plus 30 min en cas d’injection virale. Réalisé une seule fois. 3. Tests comportementaux et imagerie calcique sur animal vigile. Tous les 3 mois (2 fois pour la moitié des animaux, 4 fois pour l’autre moitié). A. mise en place du miniscope. Contention à la main et positionnement du miniscope à l’aide d’une plateforme aimantée sur la lentille. B. Chaque série comportementale comprendra 1 test d’exploration, 3 tests de coordination motrice, 2 tests de sensibilité tactile, et 1 test d’évaluation de l’état anxieux. Tests de 5 minutes réalisés à raison d’1 test/jour. C. Injection intrapéritonéale unique (environ 3 secondes) lors de la dernière session comportementale (6 mois post TC pour la moitié des animaux, 12 mois pour l’autre moitié), une demi-heure avant le test d’évaluation de l’état anxieux.
Impact sur les animaux
Ce projet repose sur l’utilisation d’un modèle léger de traumatisme crânien chez l’animal juvénile anesthésié. Une fois réveillé l’animal ne montre aucun signe de douleur et reprend immédiatement un comportement normal. Les conséquences incluent des altérations d’apprentissage et une légère altération de la coordination motrice, sans altération de mobilité, d’anxiété ou de douleur. Il n’y a pas de phénotype dommageable. Nous utiliserons des modèles de souris permettant une exploration longitudinale par imagerie calcique parfaitement décrits qui sont très utilisés dans le domaine et très bien décrits dans la littérature. Aucun phénotype dommageable n’a été décrit. La chirurgie envisagée peut entraîner à faible niveau hypothermie, déshydratation, douleur postopératoire et stress. La pose d’un implant tel que la lentille de miniscope s’accompagne de la possibilité de perte de l’implant. Lors de l’imagerie calcique sur animal vigile couplée au comportement, la pose du miniscope sur la lentille entrainera une contention très courte d’environ 20s. Le poids (< 2g) et le câble reliant le miniscope peuvent occasioner une gêne. Chaque série comportementale peut représenter une source de stress pour les animaux. L’injection IP du composé peut entraîner une douleur ou une gêne locales.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de la procédure, soit 224 animaux. Ceci est nécessaire pour les analyses en immunohistochimie et par imagerie IRM qui complèteront et seront essentielles à cette étude.
Remplacement
Le projet vise à caractériser les atteintes du tissu cérébral suite à un TC ainsi qu’à évaluer l’intérêt d’une cible thérapeutique sur la récupération post TC. À ce jour, aucun modèle in vitro ou informatique ne permet de simuler la complexité des interactions cellulaires mise en jeu, tant nos connaissances demeurent encore superficielles en la matière. Notre recherche sur des bases de données scientifiques permet d’affirmer qu’à notre connaissance, il n’existe pas d’autre modèle expérimental que l’animal afin d’étudier ces réactions tissulaires dans leur ensemble. Par conséquent, notre projet ne peut pas se passer de l’expérimentation animale.
Réduction
Les procédures expérimentales ont été spécialement conçues pour réduire le nombre d’animaux utilisés par l’obtention d’un suivi longitudinal non invasif. En effet, l’utilisation de l’imagerie in vivo permet d’enregistrer sur un même animal l’évolution de l’unité neurovasculaire au cours du temps, limitant significativement le nombre d’individus nécessaires à cette étude (par exemple, pour 4 temps d’intérêt un seul groupe d’animaux ne sera nécessaire contre 4 groupes avec des techniques classiques). De même cette technique permet de diviser par 2 le nombre d’individus nécessaires pour une approche pharmacologique, les animaux représentant leurs propres contrôles, et augmentant de fait la significativité des résultats. Pour permettre la réalisation des enregistrements d’imagerie, l’utilisation d’animaux transgéniques à phénotype non-dommageable sera privilégié dans la mesure du possible à l’utilisation d’injection virale. Ceci permettra d’augmenter l’efficacité des techniques d’imagerie et donc réduire le nombre d’animaux utilisés. De plus, pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en conservant une puissance statitistique satisfaisante, nous avons réalisé une étude de la robustesse de notre nombre d’animaux pour déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser.
Raffinement
Le projet permet de raffiner l'expérimentation animale en utilisant un modèle pertinent par rapport à la situation chez l'homme. Il s’appuie sur la mise en place des méthodes d'imagerie les plus sensibles disponibles actuellement. Pour permettre la réalisation des enregistrements d’imagerie, l’utilisation d’animaux transgéniques à phénotype non-dommageable sera privilégié dans la mesure du possible à l’utilisation d’injection virale. Ceci permettra de réduire le temps de chirugie d’environ 30 min et donc favoriser la récupération post-opératoire des animaux. Le projet sera mis en oeuvre par des personnes qualifiées en expérimentation animale. Le bien-être des animaux sera assuré par des protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptés. Le stress des animaux sera limité à son maximum, avec un sevrage mis en place à 25 jours post-natal, et des conditions d'hébergement enrichies (matériels de nidification) et permettant les interactions sociales. La réalisation du projet repose sur l'établissement de points-limites et de pratiques permettant de minimiser au maximum le stress, la détresse et la souffrance des animaux. Une fiche de suivi post-opératoire sera mise en place.
Choix des espèces
Le système nerveux central de la souris est parmi les mieux connus et les plus étudiés. Son organisation est aussi très proche de celle du cerveau humain. Les résultats obtenus permettent ainsi de proposer des hypothèses de dysfonctionnement du cerveau humain suite à un traumatisme crânien et de proposer des pistes thérapeutiques pour leur traitement. De plus, le modèle murin permet l’utilisation de souches génétiquement modifiées. Dans ce projet, les traumatismes crâniens seront réalisés sur des souris juvéniles à 17 jours post natal, ce qui nous permet de modéliser les effets d’un traumatisme crânien en pédiatrie chez des enfants de 4 à 6 ans. Nous conserverons les animaux jusqu’à 12 mois après le traumatisme crânien afin d’évaluer les conséquences à long-terme.
Rôle de FAT10/UBD dans la fonction hépatocytaire et la progression de la NASH
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
2 392 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance sans réveil, légers et modérés. Elles subissent une biopsie de la queue, des gavages et des injections, ainsi qu'un régime gras destiné à provoquer une stéato-hépatite, qui peut faire apparaître des nodules du foie évoluant vers un cancer, avant que le foie soit perfusé et prélevé sous anesthésie. L'objectif est d'étudier le rôle de la protéine FAT10 dans cette maladie du foie liée à l'obésité. Le porteur conclut que FAT10 pourrait être une cible thérapeutique, bénéfice renvoyé au conditionnel.
Objectifs
La stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) est la maladie hépatique la plus courante qui affecte 80% de la population obèse. Initiée par une accumulation de graisse dans le foie (stéatose), la NAFLD évolue vers la stéato-hépatite non alcoolique (NASH), facteur de risque de comorbidités mortelles. Actuellement, aucun traitement médicamenteux n’est disponible. Ainsi, il est important de bien caractériser les mécanismes cellulaires impliqués dans cette pathologie afin d'apporter des solutions thérapeutiques. Les résultats préliminaires du laboratoire révèlent une implication de FAT10 dans la progression de la NASH avec une surexpression dans le foie de patients NASH, corrélé à une diminution de l'expression de PPARα, récepteur nucléaire contrôlant le métabolisme lipidique et l'inflammation. De plus, il a été constaté dans le foie de patients atteints de NASH, que l’expression de FAT10 corrèle également positivement avec l’expression des gènes de la sénescence. L'objectif de ce projet est d’étudier si la modulation de l'expression de FAT10 influence la sénescence prématurée et l’activation de PPAR-alpha dans les hépatocytes au cours du développement de la NASH grâce à l’utilisation de modèles murins.
Bénéfices attendus
Ce projet cherche à mettre en évidence le rôle de FAT10 dans le développement des maladies du foie gras non alcoolique et son lien avec l’induction de la senescence de l’hépatocyte et l’activation de PPARa. La compréhension de ces nouveaux mécanismes pourrait permettre demontrer que FAT10 pourrait être une cible thérapeutique intéressante dans l’objectif de soigner la NASH.
Procédures
Les souris seront baguées à l’oreille afin d’être identifiées par la suite et une biopsie de queue (
Impact sur les animaux
La lignée C57BL6/J utilisée dans nos différentes procédures ne présente aucun probléme physique ou physiologique. Ainsi, peu de nuisances ou d’effets indésirables sont attendus dans les procédures qui seront mises en œuvre pour la réalisation de ce projet de recherche. Cependant, l’injection d’Adénovirus ou d’AAV par intra-veineuse permettant la surexpression ou la diminution d’expression de FAT10 sera réalisée et peut conduire à l’apparition d’un stress aigu sur l’animal qui peut se représenter par une douleur d’ordre légere pour l’animal. De plus, la mise en place de ce protocole entraine l’utilisation d’une cage chauffante à 37°C (permettant la dilation des veines pour l’injection en intra-veineuse) provoquant un stress thermique à l’animal. L’utilisation de régime induisant la NASH chez l’animal peut conduire à l’apparition de nodules hépatiques pouvant évoluer vers un carcinome hépatique pouvant causer des douleurs à l’animal au cours du protocole. La mise en place de régimes obésogènes dans un modèle murin peut également entrainer des problèmes de prise alimentaire et donc le développement de faim et de malnutrition de l’animal. L’ensemble des procédures vont également nécessiter la prise des animaux en contention, pouvant provoquer un stress léger à l’animal.
Devenir
A l’issus des différentes procédures mise en place dans ce projet de recherche, l’ensemble des animaux seront mis à mort pour analyses.
Remplacement
Ce projet de recherche est mis en place à partir d’études préliminaires réalisée sur des lignées cellulaires. Ces études ont montré un rôle important de la protéine FAT10 dans les cellules du foie. Cependant, les maladies du foie gras non alcoolique sont des pathologies complexes impliquant de nombreux organes autres que le foie. Ainsi, l’utilisation d’un modèle animal (modèle murin) nous permettra de reproduire au mieux la maladie du foie gras non alcoolique et de mieux comprendre le rôle clé joué par la protéine FAT10 dans le développement et la progression de la maladie.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum, sans toutefois compromettre l’analyse statistique des résultats. De plus, une analyse appronfondie de la littérature permet également d’éviter des répétitions d’expériences inutiles (exemple dose des agonistes de Ppar-alpha à utiliser).
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de maisons. La définition précise des points limites précoces, ainsi qu’une surveillance pendant tout le protocole permet de limiter l’apparition d’une souffrance ou d’une atteinte de l’état général de la souris. En cas d’atteinte de ces points limites, les animaux seront sortis de l’étude et mis à mort.
Choix des espèces
Cette espéce est utilisée car les souris (mus musculus) peuvent être génétiquement modifiées soit par injections virales ou par transgénèse. De plus, de nombreuses données bibliographiques sont disponibles sur cette espèce dans la cadre des études sur les NAFLDs permettant d’affiner au mieux les conditions expérimentales mises en jeu dans le projet. De plus, elle présente de nombreux avantages : facilité d’élevage, possibilités d’utiliser des modéles favorisant la susceptibilité aux régimes spéciaux prédisposant au développement des NAFLDs. Les souris seront utilisées à l’âge adulte de 12 semaines. L’étude de l’implication de FAT10 dans la senescence des hépatocytes lors de la NASH nécessite que certaines expériences soient réalisées comparativement à des souris âgées (60 semaines).
Caracterisation pharmacocinetique d’une molecule innovante administree par les voies intraveineuse, intraperitoneale et orale chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
160 souris vont être utilisées, toutes tuées sans réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit le composé étudié puis un mélange anesthésiant avant la mise à mort et le prélèvement d'urine, de sang et d'organes, pour décrire le devenir d'un candidat médicament contre le glioblastome dans l'organisme. Le porteur indique un stress et une douleur légère de courte durée lors des administrations. L'étude sert à déterminer la meilleure voie d'administration, l'efficacité antitumorale ayant déjà été testée dans des greffes antérieures.
Objectifs
Depuis plusieurs années, nous développons une molécule innovante pour le traitement d'une forme très agressive et incurable de cancer du cerveau, le glioblastome. Son efficacité anti tumorale a été mise en évidence dans des souris chez lesquelles nous avions greffé des cellules cancéreuses provenant de patients. La demande actuelle a pour objectif d'identifier les caractéristiques pharmacocinétiques de ce candidat médicament dans le modèle murin selon différents modes d'administration.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer la manière dont le candidat médicament se distribue dans l'organisme, la vitesse à laquelle il est éliminé ainsi que le mode d'administration le mieux adapté. Ces caractéristiques sont importantes pour optimiser le traitement contre un type de tumeur cérébrale chez l'humain.
Procédures
Chaque animal subira deux gestes techniques qui conduiront à l'administration du composé étudié puis d'un mélage analgésique et anesthésiant. Ces gestes ne dureront pas plus de quelques dizaine de secondes. La mise à mort sera donnée sans réveil préalable.
Impact sur les animaux
La molécule innovante a fait l'objet d'études préalables de toxicité aïgue et chronique. A la dose utilisée, aucun effet indésirable n'a été observé. Chaque animal aura toutefois à subir un stress et une douleur légère de courte durée lors de l'administration du composé à l'étude et du mélange analgésique et anesthésiant. La mise à mort sera donnée sans réveil préalable.
Devenir
La procédure comporte le prélèvement de l'urine, du sang et des organes. Les animaux seront donc mis à mort.
Remplacement
Au cours du développement du projet, nous avons utilisé des modèles cellulaires in vitro 2D et 3D pour optimiser la concentration efficace et déterminer la gamme de toxicité du principe actif.
Réduction
Le design expérimental en pharmacocinétique est variable. Nous avons choisi de limiter le nombre d'animaux nécessaires à l'étude en adoptant comme comparateur un groupe unique de souris traitées par du sérum physiologique et identifié t=0. Cela a permis de réduire de moitié le nombre d'individus. Les réplicats biologiques pour chaque temps de la cinétique ont été limités à trois individus. Un test de student sera utilisé pour vérifier la réalité statistique dans et entre chaques groupes expérimentaux.
Raffinement
Pendant le temps de la procédure expérimentale, les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnent enrichi, sans isolement et en accord avec la réglementation en vigueur. Nous apporterons un soin particulier lors de l'acclimentation à habituer les animaux à la présence de l'expérimenteur et à être manipulés (contention). Ainsi le niveau de stress sera diminué lors de la procédure. De plus, la prise en compte de point limite et l'utilisation d'analgésique permettra de prévenir l'appartition de toute souffrance chez les animaux.
Choix des espèces
A ce stade du développement pré-clinique du médicament, la souris est le modèle de référence le plus proche de l'humain pour obtenir les résultats nécessaires. La pathologie visée affecte les adultes. Aussi nous utiliserons des souris adultes (2 mois)
Evaluation de l’efficacité de l’inhibition d’un gène pour le traitement du mélanome
- Recherche fondamentale
- Oncologie
156 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules de mélanome sous la peau, jusqu'à dix gavages et six injections dans l'abdomen, pour tester une molécule censée resensibiliser les tumeurs aux traitements. Le porteur indique que la tumeur au flanc peut gêner les déplacements et que le gavage peut irriter la trachée. Les retombées pour les patients atteints de mélanome résistant restent formulées comme une perspective, l'objectif immédiat étant de démontrer l'effet de la molécule chez la souris.
Objectifs
Le mélanome malin cutané est la forme la plus agressive des cancers de la peau. Aujourd'hui, le seul traitement efficace reste la chirurgie pratiquée à un stade précoce car une fois disséminées, les cellules de mélanome deviennent résistantes aux chimiothérapies conventionnelles. Les espoirs apportés par l'essor des thérapies ciblées et de l’immunothérapies ont été fortement nuancés par des cas de non-réponse ou rechutes rapides. Nous avons identifié, à travers l’étude de cellules de patient, un gène fréquemment altéré et impliqué dans la résistance aux traitements. Nous avons identifié une molécule capable d'inhiber l'action de ce gène et de resensibiliser les cellules tumorales de patients, initialement résistantes, aux traitements conventionnels. Ce projet a pour but de démontrer chez la souris l’efficacité de cette molécule sur la sensibilité des cellules de mélanome, dans un organisme vivant complexe.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra potentiellement de mettre en évidence l’effet thérapeutique de notre molécule sur le mélanome et pourra ouvrir une nouvelle perspective de traitement pour les patients atteint de cette maladie. En effet, malgré l’essor récent des thérapies ciblées et de l’immunothérapie, la plupart des patients rechutent avec un mélanome résistant.
Procédures
Tous les animaux subiront une injection sous-cutanée de cellules tumorales, un gavage par jour ou tous les deux jours pendant deux semaines soit 6 ou 10 gavages et pour certains animaux. Certains subiront aussi 6 injections de traitement dans l'abdomen. Tous les animaux seront soumis à de la contention, qui durera moins d'1 minute.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont l'apparition de tumeur localisée sur le flanc droit qui pourra potentiellement les gèner dans leur déplacement. Le gavage peut provoquer une irritation de la trachée, entrainant des difficultés pour l'alimentation. La contention va également leur générer du stress. Aussi, les injections peuvent induire des plaies.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car les souris ne rentreront pas dans un nouveau protocole, au maximum 1 mois après injection, si aucun point limite n'est atteint avant cette date. Les tumeurs seront récupérées pour être analysées.
Remplacement
Des études préliminaires sur des modèles cellulaires ont été réalisées et ont permis de démontrer l'efficacité de notre molécule. En parallèle, des analyses complémentaires ont été et seront réalisées sur des prélèvements de patients, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Cependant, ces modèles ont des limites et ne permettent pas l'étude du système immunitaire. C’est pourquoi le recours aux animaux est nécessaire dans notre projet.
Réduction
Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet a été calculé grâce à des outils statistiques. De plus, un animal permettra d’obtenir des résultats dans plusieurs expériences (pousse tumorale, analyse histologique et moléculaire de la tumeur).
Raffinement
Des points limites précis ont été définis pour identifier le plus précocément possible toute souffrance de l'animal. Nous évaluerons l'état de bien-être ou de souffrance des animaux au minimum 2x/semaine, et tous les jours lorsque le traitement par gavage débutera. Après traitement, les souris seront suivies 3fois par semaine jusqu'à leur mise à mort. Pour le gavage, nous utiliserons l’excipient CornOil, le moins irritant et le mieux toléré pour la souris. Nous avons également choisi des lignées non métastatiques car nous n'évaluerons pas cette donnée dans nos procédure. Aussi, le phénotype dommageable des souris ne s'exprime pas dans les conditions ventilées de l'animalerie dans laquelle elles sont hébergées.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour les études du mélanome car c'est un modèle proche de la pathologie humaine reproduisant les caractéristiques histologiques. Nous disposons également d'outils, d'expériences et de compétences solides pour réaliser cette étude dans les meilleures conditions chez la souris. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines, âge standard pour l'étude du système immunitaire.
Impact d’un régime gras sur les rythmes circadiens et la mémoire chez la souris jeune
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une puce sous-cutanée, est logé seul pendant deux mois et demi, soumis pour la moitié d'entre eux à un régime gras, puis à des tests comportementaux et à un prélèvement terminal de sang et de cerveau. Le porteur reconnaît que l'isolement crée un stress chez cette espèce grégaire et que les tests peuvent provoquer anxiété et douleur modérée. L'étude cherche à relier chez le mâle et la femelle les effets d'un régime gras sur les rythmes de 24 heures, le métabolisme et la mémoire.
Objectifs
Une alimentation riche en graisses et en sucres favorise la prise de masse et l’obésité. Chez les souris mâles, une telle alimentation provoque non seulement un surpoids, mais aussi des altérations des rythmes de 24 h et de la mémoire. Les souris femelles avec un régime gras grossiraient relativement moins que les souris mâles. Notre objectif est de mieux comprendre les mécanismes par lesquels un régime alimentaire riche en gras modifie la santé métabolique et la mémoire chez des souris mâles et femelles. Notre hypothèse principale est que, chez un même animal, les altérations de la mémoire seront corrélées aux altérations des rythmes de 24 h et du métabolisme. Notre hypothèse secondaire est que les altérations des rythmes de 24 h pourraient être réduites chez les souris femelles, ce qui pourrait se traduire par une résistance métabolique relative au régime gras et à moins de perturbations de la mémoire que chez les souris mâles. AVENANT: Notre hypothèse tertiaire est qu'un accès du régime gras et sucré chronomodulé (c'est-à-dire ici limité à la période habituelle d'alimentation chez la souris) pourrait, comme chez les individus mâles, réduire l'impact nutritionnel sur les fonctions cognitives des souris femelles.
Bénéfices attendus
La nature des facteurs nutritionnels qui modulent les rythmes de 24 h et les liens qui connectent la régulation des rythmes journaliers d'alimentation avec la mémoire sont encore très mal connus. L’identification des mécanismes sous-jacents pourrait permettre d’améliorer la prévention et le traitement des maladies métaboliques, comme le diabète ou l’obésité, ainsi que les altérations de la mémoire par des approches de nutrition prenant en compte les rythmes de 24 h (approches de nutrition chrono-modulée).
Procédures
Les animaux seront hébergés en cages individuelles pendant 2.5 mois. La moitié sera nourrie avec un régime alimentaire riche en gras pendant 5.5 mois. Le premier groupe sera exposé à 3 conditions particulières d'éclairement (d'une durée de 2 semaines) pour étudier les rythmes de 24 h. Chaque étape sera séparée par 2 semaines de récupération. Le second groupe sera placé en cage métabolique (5 jours) et soumis à 2 tests comportementaux (l’un de 2 jours et l’autre de 3 jours)), séparés par 2 semaines de récupération. Un prélèvement terminal de sang sera effectué sur tous les animaux, suite à une chirurgie d'environ 1 minute.
Impact sur les animaux
Les souris recevront une puce électronique sous-cutanée, ce qui pourrait provoquer une légère inflammation au site d'injection. Les souris seront gardées en cages individuelles pour enregistrer des variables rythmiques individuelles, ce qui pourra créer un stress d'isolement. Les tests comportementaux pourront induire de l'anxiété et une douleur modérée. Le régime gras devrait entraîner un surpoids progressif des souris, ce qui est l'objet même du modèle expérimental. AVENANT: Le régime chonomodulé devrait limité le surpoids des animaux.
Devenir
L’étude de la rythmicité de 24 h de l’expression des protéines dans différentes structures ainsi que celle des rythmes de 24 h des hormones et des métabolites plasmatiques impliquent la mise à mort des animaux pour prélever en même temps leur cerveau et leur sang.
Remplacement
La régulation des cycles journaliers de la prise alimentaire et du métabolisme impliquant plusieurs organes à la fois (notamment, cerveau, foie, pancréas, surrénales, muscles), l’investigation des interactions entre rythmes de 24 h et nutrition nécessite l’utilisation de modèles animaux. Ainsi est-il impossible de réaliser ces études sur des organes isolés ou des cultures cellulaires in vitro.
Réduction
Notre suivi longitudinal des animaux exposés à des tests physiolgoiques et comprtementaux succcessifs réduit le nombre d’individus utilisés. Le nombre d’animaux proposés (n=6 par point-horaire pour 4 temps par 24h) est basé sur une évaluation de la puissance statistique qui prend en compte les moyennes et la dispersion des données comportementales des études antérieures. La rythmicité à l'échelle de 24 h sera validée par une analyse statistique adaptée. L'effet d'un régime favorisant le surpoids sera évalué sur les rythmes de 24 h, le métabolisme et sur des tests de mémoire chez la souris mâle et la souris femelle par des analyses statistiques adaptées.
Raffinement
Les souris seront maintenues en cages individuelles pour enregistrer des variables rythmiques individuelles. Pour limiter ce stress d'isolement chez la souris qui est un animal grégaire, les cages seront ouvertes, de sorte que les animaux garderont des contacts olfactifs et auditifs avec leurs congénères de la même pièce. Un morceau de bois à ronger, du matériel de coton pour faire un nid constitueront un environnement enrichi pour la souris et devrait limiter le stress d’isolement. Avant les tests comportementaux, les animaux seront manipulés régulièrement afin de minimiser leur état relatif de stress. De plus, toutes les souris seront manipulées quotidiennement pendant la semaine précédant les tests comportementaux afin de les habituer à la manipulation et réduire ainsi le stress qui peut y être associé. De même, une attention particulière sera apportée lors des tests comportementaux pour qu’ils se déroulent dans les conditions les plus calmes possibles afin de ne pas perturber les souris, ce qui risquerait d’altérer leurs réponses comportementales. Entre chaque test, un délai de deux semaines sera respecté pour permettre aux animaux de récupérer. Tout au long de la procédure nous ferons un suivi de l'état général de l'animal à l'aide d'une grille de score et nous avons établi des points limites permettant de soustraire l'animal à la souffrance.
Choix des espèces
La souris est devenue un modèle animal classique en nutrition et en chronobiologie par l’existence de nombreuses lignées génétiquement modifiées. Une fois ce projet achevé qui permettra d'établir un modèle expérimental, nous pourrons chercher comprendre les mécanismes moléculaires mis en jeu, en étudiant des souris génétiquement modifiées exposées aux mêmes procédures expérimentales. Les souris traitées seront nourries dès le sevrage avec une alimentation riche en gras. Puis les souris seront phénotypées 3 mois plus tard au stade jeune adulte. Ce protocole a été validé chez la souris mâle pour ses effets sur le métabolisme et la mémoire. L'originalité du projet présent est de relier ces fonctions aux rythmes de 24 h et à leurs perturbations, à la fois chez les mâles et les femelles.