Système endocrinien

Un virus injecté dans une zone précise du cerveau et une canule reliée à une pompe osmotique implantée sous anesthésie, en trente minutes d'opération, puis dix-huit semaines de tests métaboliques avec injections dans l'abdomen et prises de sang sur animal vigile. 1 180 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, nourries dès cinq semaines d'un régime enrichi en graisses et isolées en cage individuelle quand la prise alimentaire doit être mesurée. Le porteur annonce des variations du comportement alimentaire "sans entraîner de souffrance" et des effets indésirables "modérés et transitoires", tout en décrivant des jeûnes, une perte de poids et une mobilité réduite après l'opération. Toutes finissent par une chirurgie terminale sans réveil, pour que leur cerveau soit prélevé.

Objectifs

Nous étudions comment le cerveau contrôle la faim et le poids. Certaines cellules du cerveau aident le corps à savoir quand manger. Dans ces cellules, une protéine appelée CaMK1D joue un rôle clé pour réguler l’appétit. Si cette protéine est trop active, elle peut favoriser l’obésité et le diabète. Nous avons identifié un autre acteur important dans cette même voie, appelé CALHM6, qui agit agir comme un frein naturel : lorsqu’il est très présent, il envoie des signaux chimiques qui ralentissent l’activité des cellules qui stimulent la faim, ce qui aide à réduire l’appétit. L’objectif de notre projet est de mieux comprendre ce mécanisme pour savoir comment il régule la prise alimentaire et l’équilibre énergétique : Observer ce qui se passe quand CALHM6 est absent : nous voulons voir si les souris mangent plus ou moins et comment leur métabolisme est affecté. Comprendre comment CALHM6 agit : en modifiant l’activité de cette molécule, nous voulons savoir comment elle influence la faim et le comportement alimentaire des souris. En résumé, ce projet vise à découvrir les signaux qui contrôlent la faim, ce qui pourrait aider à mieux comprendre l’obésité et les troubles liés au métabolisme.

Bénéfices attendus

Ce projet cherche à comprendre comment le cerveau contrôle la faim et l’équilibre énergétique. Nous étudions une molécule appelée CALHM6 et son lien avec une protéine appelée CaMK1D, ainsi que les signaux chimiques qu’elles envoient pour réguler l’appétit. À court terme, nous voulons savoir quel est le rôle de CALHM6 dans différentes zones du cerveau impliquées dans la faim, et comment sa modification influence la quantité de nourriture consommée et le métabolisme des souris. À long terme, ces recherches pourraient aider à trouver de nouvelles pistes pour traiter l’obésité et d’autres troubles liés au métabolisme, en particulier ceux causés par un dérèglement du contrôle de l’appétit par le cerveau. Enfin, ce projet pourrait améliorer notre compréhension des liens entre cerveau, alimentation et maladies chroniques, avec des retombées positives pour la santé publique.

Procédures

Les animaux subiront, sous anesthésie générale, des interventions chirurgicales afin d’injecter des virus expérimentaux dans une zone spécifique du cerveau et d’implanter des canules reliées à une pompe osmotique. La durée totale de la chirurgie, de l’induction de l’anesthésie au réveil, est d’environ 30 minutes. Avant et après ces interventions, les animaux seront soumis à des tests métaboliques réguliers pour suivre leur alimentation et leur métabolisme pendant 18 semaines. Pour chaque test, plusieurs injections intrapéritonéales seront réalisées rapidement (durée = 10 secondes). Par ailleurs, des prélèvements sanguins seront effectués sur les animaux vigiles avant la chirurgie et à un mois de suivi afin d’évaluer différents paramètres biologiques. Certains animaux seront soumis à un régime enrichi en graisses pour observer l’impact sur la prise de poids et le métabolisme. Toutes les manipulations seront réalisées par du personnel qualifié, sous anesthésie, et conformément aux règles de bien-être animal afin de limiter toute souffrance ou stress inutile.

Impact sur les animaux

Les effets attendus sur les animaux utilisés dans ce projet sont principalement liés aux manipulations expérimentales et au modèle métabolique étudié. Les souris pourront présenter une perte de poids transitoire lors de périodes de jeûne ou à la suite d’injections expérimentales visant à moduler l’appétit. Des variations du comportement alimentaire sont attendues selon les modèles utilisés, sans entraîner de souffrance. L’implantation de canules ou de pompes osmotiques peut engendrer un stress modéré ou une réduction temporaire de la mobilité pendant la période post-opératoire, mais une surveillance rapprochée et des soins adaptés seront assurés. Les tests de tolérance au glucose et à l’insuline peuvent provoquer un stress ponctuel lié aux manipulations et aux prélèvements sanguins, mais leur fréquence et leur durée seront limitées. Globalement, les effets indésirables attendus sont modérés et transitoires, et feront l’objet d’un suivi clinique rigoureux pour assurer le bien-être des animaux tout au long du protocole. Pour les expériences nécessitant la mesure de la prise alimentaire, les souris seront individualisées dans les cages afin de garantir des mesures précises. Les procédures expérimentales se termineront avec une chrirugie terminale sans réveil pour prélever les organes.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études histologiques

Remplacement

Ce projet cherche à comprendre comment certaines cellules du cerveau contrôlent la faim et l’équilibre énergétique. Les expériences faites uniquement sur des cellules ou par ordinateur ne permettent pas de reproduire la complexité d’un organisme entier, où interagissent le cerveau, les hormones, le métabolisme et le comportement alimentaire. Pour cela, il est nécessaire d’utiliser des souris génétiquement modifiées, afin d’observer comment la modification d’un gène précis influence la faim, le poids et le métabolisme. Ces modèles permettent de relier directement des changements dans le cerveau à leurs conséquences sur l’organisme. Comme il n’existe pas d’alternative équivalente, l’expérimentation animale est indispensable, mais elle sera réalisée dans le respect du principe des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner).

Réduction

Nous prévoyons d’utiliser un total de 1 180 souris. Ce nombre a été déterminé pour s’assurer que les observations réalisées soient fiables et comparables entre différents groupes expérimentaux, tout en respectant strictement le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés. Lorsque cela est possible, plusieurs manipulations expérimentales seront réalisées sur les mêmes groupes de souris, avec un temps de récupération approprié pour chaque animal. Certaines interventions chirurgicales permettent d’introduire des substances dans des zones spécifiques du cerveau afin d’étudier leur rôle dans la régulation de la faim et du métabolisme. Toutes les données seront ensuite analysées pour comprendre comment ces interventions influencent le poids, la consommation alimentaire et d’autres aspects du métabolisme des souris, dans le respect du bien-être animal.

Raffinement

Les animaux sont logés dans des cages enrichies systématiquement fournies en matériau de nidification et en éléments manipulables en carton afin de favoriser les comportements naturels et réduire le stress La litière est renouvelée hebdomadairement ou plus fréquemment si nécessaire pour maintenir une hygiène optimale Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie multimodale préventive et postopératoire selon des protocoles validés par le vétérinaire responsable Les interventions stéréotaxiques se déroulent en conditions strictement aseptiques avec matériel stérile et opérateurs formés spécifiquement à cette technique Pendant la phase de réveil les animaux sont placés sur des dispositifs de maintien thermique et surveillés en continu jusqu’à reprise d’une activité normale Un protocole de surveillance clinique standardisé est appliqué après toute manipulation invasive avec des observations rapprochées dans les 24 premières heures puis au minimum une fois par jour ensuite Un score de bien-être comportemental et physiologique est utilisé pour détecter précocement douleur, déshydratation, perte d’appétit ou immobilité et déclencher une prise en charge vétérinaire ou un critère d’euthanasie si nécessaire L’habituation des animaux à la manipulation est systématique plusieurs jours avant les manipulations expérimentales par du personnel qualifié pour réduire la réactivité au contact humain Les manipulations stressantes pouvant nécessiter isolement sont réalisées en minimisant la durée d’isolement et en utilisant des cages transparentes pour maintenir la visibilité des congénères Les soins postopératoires incluent administration d’analgésiques selon un calendrier prescrit, surveillance de la plaie, contrôle du poids et réhydratation si besoin. Les actes invasifs sont limités.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus adaptée pour ce projet en raison de la disponibilité de nombreux modèles permettant d’étudier le rôle de certaines molécules dans le cerveau. Son système de régulation de l’appétit et de l’énergie présente de nombreuses similitudes avec celui de l’humain, ce qui permet de transposer les résultats. Sa petite taille, son cycle de reproduction court et la connaissance approfondie de sa physiologie en font un modèle de référence pour l’étude du métabolisme et du comportement alimentaire. Certaines souris subiront des interventions chirurgicales permettant d’introduire des substances dans des zones spécifiques du cerveau, afin d’étudier leur rôle dans la régulation de la faim et du métabolisme. Ces interventions seront réalisées lorsque les animaux auront atteint un âge où leur cerveau est pleinement développé. Les animaux seront nourris avec une alimentation riche en graisses dès l’âge de 5 semaines afin de favoriser une prise de poids adaptée pour les expériences.

L'effectif demandé suit la croissance annoncée du carnet de commandes de l'établissement. 1 650 souris au foie ou au système immunitaire humanisés vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, 1 600 tuées à l'issue et 50 réorientées vers un projet de formation interne aux gestes techniques. Elles développent obésité, stéatose hépatique et diabète sous régime gras et sucré, ou une cholestase provoquée par une substance qui bouche progressivement leurs voies biliaires, avec des atteintes annoncées allant de l'ictère à l'ascite et à l'encéphalopathie hépatique, avant de subir des jeûnes de six à huit heures, des injections de plasmides et des prélèvements sanguins répétés. Le porteur écrit n'avoir conduit aucune approche statistique pour fixer le nombre total d'animaux, l'estimation venant du nombre d'études des années précédentes et d'une croissance anticipée "en accord avec le plan commercial".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer un modèle murin de syndrome métabolique, c'est-à-dire une association d'anomalies mêlant dans ce cas obésité, stéatose hépatique non alcoolique (NASH) qui est une pathologie caractérisée par un excès de graisses dans le foie qui n'est pas due à une consommation élevée d'alcool et le développement de diabète qui est donc une résistance à l’insuline. Ce syndrôme sera reproduit grâce à des régimes riche en graisse et en sucre mimant les régimes occidentaux et permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires de cette pathologie et de tester de nouveaux candidats médicaments puisqu'aucune thérapie curative n'est approuvée. [MODIFICATION] En plus du modèle métabolique, nous allons développer un modèle chez la souris pour étudier la cholestase, une maladie où la bile ne circule plus correctement dans le foie. Pour cela, nous utiliserons une substance appelée DDC, connue pour bloquer progressivement les voies biliaires et provoquer des dépôts spécifiques dans le foie. Ce modèle reproduit les problèmes observés dans certaines maladies chroniques du foie et des voies biliaires. Grâce à ce second modèle, nous pourrons mieux comprendre les mécanismes qui perturbent le système biliaire, souvent liés ou aggravés par des troubles comme le syndrome métabolique et la NASH (une forme avancée de stéatose hépatique).

Bénéfices attendus

En basant notre modèle sur des souris ayant un système immunitaire et/ou un foie humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs [MODIFICATION] des modèles permettant d'étudier [MODIFICATION] des syndromes métaboliques et maladies hépato-biliaires (diabète, NASH, obésité, [MODIFICATION] cholestase hépatique) et des potentiels traitements avec davantage de spécificité pour l’espèce cible de ces recherches : l’Homme.

Procédures

Test de résistance à l’insuline et test de résistance au glucose comprenant une mise à jeun. Durée totale du test entre 6h30 et 8h30. L’administration de traitements ou de cellules pourra être réalisée selon différentes voies. Une anesthésie gazeuse sera appliquée en fonction de la voie choisie. Les volumes administrés seront proportionnels au poids de l’animal avec un maximum défini. La durée sera généralement de 10-15 secondes. Le nombre est défini selon le protocole d’étude et dépendra de la fréquence. Ceci sera évalué par le vétérinaire. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris avec ou sans anesthésie en fonction de la voie choisie. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal avec une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlée par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal, sans réveil de l’animal, sous anesthésie gazeuse sera réalisé. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, pour favoriser le développement de populations immunitaires humaines d’intérêt, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les injections pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. À l’issue des études, les animaux devant être euthanasiés le seront selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux. Un jeûne de nourriture pourra être effectué sans dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages.

Impact sur les animaux

Pour le développement de [MODIFICATION] ces modèles pathologiques, divers signes cliniques pouvant entraîner un inconfort pourront être observés: en lien avec le développement d’un diabète de type II : polyphagie (besoin excessif de manger), polyurie (trouble urinaire) , polydipsie (sensation de soif exagérée), troubles de la vision, asthénie, pathologie cardio-vasculaires (accident vasculaire cérébral, crise cardiaques), néphropathie, neuropathie, rétinopathie; en lien avec l’obésité: accumulation de graisse viscérale et augmentation du poids pouvant entraîner une difficulté à se mouvoir, pathologie cardio-vasculaire; en lien avec une insuffisance hépatique : état général dégradé, encéphalopathie hépatique, ictère, asthénie, anorexie, ascite, troubles de la coagulation, vomissement (hématémèse), diarrhée (méléna ou hématochésie). -Injection(s) de solution saline isotonique contenant des plasmides (pour favoriser le développement de populations immunitaires humaines d’intérêt) : hématome, troubles cardio-respiratoires, altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. -Administration de traitements ou de composés : effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées). -Prélèvements sanguins : hématome, anémie, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). -Rasage et crème dépilatoire : microlésions, irritations cutanées, gêne (sensation de brûlure de la crème), inflammation transitoire. -Anesthésie : risque d’hypothermie et de sécheresse oculaire. Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû aux contentions. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Les animaux ayant atteints les point limites ou sur demande du vétérinaire seront euthanasiés. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. Des souris issues de cette procédure pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris » sur décision vétérinaire. Ceci ne pourra être envisagé que dans les cas ou des animaux ont subi seulement une partie de la procédure (ex : animaux du groupe contrôle négatif) et ne présentant pas d’altérations résiduelles de leur état de santé.

Remplacement

Il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement qui mimerait le développement d'un syndrome métabolique (diabète, obésité, NASH, [MODIFICATION] cholestase hépatique) tout en objectivant l’efficacité de molécules agissant, entre autres, sur l’activité du système immunitaire, la mort cellulaire, le stress oxydatif ou les taux d’insuline et de lipides dans le sang. Les modèles murins en général, et plus particulièrement la souris avec un foie et/ou un système immunitaire humanisé(s), constituent donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre cette maladie.

Réduction

Un total de [MODIFICATION] 1650 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet sur une durée de 4 ans, permettant de réaliser [MODIFICATION] 55 études de 4 groupes (contrôle négatif, contrôle positif, plusieurs doses ou traitements à comparer) avec 5 à 10 animaux par groupe. Aucune approche statistique n'a été réalisée pour le nombre total d’études ou pour le nombre total d’animaux dans le projet. L’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum par des analyses rétrospectives systématiques.

Raffinement

En début d'étude, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Des traitements antalgiques préventifs et curatifs seront mis en œuvre dès que nécessaire, sous avis vétérinaire. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini pour un prélèvement unique, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sans réveil sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Les points limites déclenchant l’euthanasie incluent : atteinte sévère de l’état général, douleur non contrôlée ou tout score clinique dépassant les seuils définis, perte de poids dépassant les seuils définis.

Choix des espèces

L'utilisation de modèles murins dans les syndromes métaboliques a déjà été démontré dans la littérature scientifique. Par ailleurs, nous maitrisons l'humanisation du système immunitaire et du foie chez des lignées de souris spécifiques. En se basant sur cette expertise, il est essentiel de poursuivre sur cette espèce. Pour les souris non humanisées et humanisées avec des cellules sanguines provenant du sang périphérique, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines. Pour les souris humanisées avec des cellules souches issues de cordons ombilicaux humains, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules humaines dans le sang. Pour les souris humanisées au niveau du foie ou double-humanisées (foie + système immunitaire), les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 13 semaines correspondant au délai nécessaire pour obtenir une prise de greffe hépatique suffisante dans la majorité des souris.

Pour comparer des molécules biosourcées à un traitement de référence contre l'obésité, 200 souris mâles sont rendues obèses par un régime gras pendant dix à quinze semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes tuées à l'issue. Chacune subit treize prélèvements de sang obtenus en coupant un millimètre du bout de sa queue, neuf à quinze injections sous la peau, et des gavages de solution sucrée qui peuvent irriter la gorge. S'y ajoutent six privations d'eau de six heures, trente-six heures au total, et des isolements de quatre heures deux fois par semaine pour mesurer leurs préférences alimentaires. L'enjeu déclaré est de retenir l'une des deux molécules candidates pour la production pharmaceutique et le passage aux essais cliniques.

Objectifs

Des études montrent que l’obésité modifie le goût et augmente la préférence pour les graisses alimentaires. Pour y remédier, des composés d’origine naturelle ont été synthétisés pour diminuer la consommation des graisses alimentaires et augmenter la satiété. L’objectif de cette étude est de comparer l’effet des composés synthétisés à partir d’un ingrédient d’origine naturelle à un traitement de référence contre l’obésité sur la gestion de l’alimentation et du poids. Elle vise également à fournir des données comparatives entre différents molécules biosourcées. Les principaux buts de l’étude sont : 1. Évaluer l’impact des molécules biosourcées sur les préférences alimentaires chez des souris. 2. Comparer l’effet des molécules biosourcées à celui du traitement de référence et voir si leur combinaison aide à maintenir une perte de poids durable chez des souris obèses. 3. Vérifier si les molécules biosourcées peuvent prévenir la reprise de poids après l’arrêt d’un traitement contre l’obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comparer des molécules biosourcées par rapport à un traitement existant et de les évaluer en tant que traitement adjuvant ou d’entretien dans la gestion du poids. Nous évaluerons également des molécules biosourcées B et C et validerons l’un d’eux (B ou C) pour la production pharmaceutique et la réalisation des études cliniques.

Procédures

Les souris sous régime (obésogène ou standard), seront pesées hebdomadairement et subiront : - une mesure de glycémie toutes les deux semaines pendant 10-15 semaines (prélèvement d’une goutte de sang environ : technique de mesure peu invasive nécessitant une simple contention pendant 1 minute), - un isolement ainsi qu’une privation d’eau pendant 6 heures avant chaque test de préférence entre deux choix, à raison de 3 tests par semaine pendant 2 semaines (soit 6 périodes de restriction hydrique, totalisant 36 heures). Une privation d’eau de 6 heures sera également appliquée avant la réalisation du test pour mesurer leur réaction au sucre (test de tolérance au glucose). Pour la mesure du taux de sucre dans le sang, chaque souris subira 5 à 8 prélèvements. Les souris seront soumises à un test de tolérance au sucre impliquant une brève contention pour l’administration du sucre par gavage, suivie de cinq prélèvements sanguins de faible volume réalisés au niveau de la queue sous anesthésie locale. Un prélèvement sanguin d’un volume important sera réalisé sous anesthésie générale juste avant la mise à mort (elle aussi réalisée sous anesthésie générale). Après le décès de l’animal, certains de ses organes seront prélevés.

Impact sur les animaux

- Les souris recevront une alimentation pouvant les rendre obèse (grosse) et provoquer un certain inconfort. Mais cette période ne durera que le temps nécessaire pour voir si les substances testées fonctionnent, soit entre 10 et 15 semaines (incluant 2 semaines sans subir aucun protocole pour s’habituer à leur nouvel environnement et entre 8 et 13 semaines de test). Cela permet de limiter au maximum les effets désagréables pour les souris. - Les souris peuvent ressentir un peu de stress à cause de certaines manipulations. Par exemple, elles peuvent recevoir entre 9 et 15 petites piqûres sous la peau, ou plusieurs petites prises de sang au niveau de la queue : entre 5 et 8 pour mesurer le sucre dans le sang, et 5 autres pendant un test de tolérance au sucre (pour voir comment leur corps réagit au sucre) qui dure 2 heures. Elles peuvent aussi être mises seules dans une cage pendant 4 heures, deux fois par semaine, pendant 2 semaines, pour un test sur leurs préférences alimentaires. - Pour faire les tests, on doit prélever un peu de sang aux souris, environ la taille d’une petite goutte. Pour cela, on coupe un petit bout du bout de leur queue, à peine un millimètre, ce qui peut leur faire un peu mal et parfois provoquer une petite infection, mais c’est surveillé de près. Au total, chaque souris aura 13 prises de sang : 8 pour suivre l'apparition du diabète, faites toutes les deux semaines, et 5 autres pendant un test pour voir comment leur corps réagit au sucre. - Les administrations par la bouche de solution sucrée induisent un stress chez les animaux et sont susceptibles de provoquer une irritation au niveau de la gorge.

Devenir

À la fin de l’expérience, les animaux seront mis à mort pour pouvoir prélever des tissus et des organes nécessaires aux analyses scientifiques. Ces examens, notamment ceux qui regardent les cellules et les organes au microscope, ne peuvent pas se faire sur un animal vivant. La mise à mort est faite sous anesthésie générale pour que les animaux ne ressentent ni douleur ni stress.

Remplacement

L’obésité est une maladie qui touche plusieurs parties du corps en même temps et qui modifie la façon dont l’organisme utilise les graisses, les sucres et contrôle l’appétit. Pour comprendre tous ces changements, il faut les étudier dans un corps vivant, car ils dépendent de la communication entre les organes. Ainsi, les modèles cellulaires ne peuvent pas entièrement remplacer l’utilisation d’animaux vivants pour cette étude. En effet, bien que des résultats aient été obtenus sur des cellules en laboratoire, cela ne suffit pas pour comprendre les réactions complexes du corps, comme la manière dont il perçoit les saveurs et réagit à ce qu’il mange. C’est pourquoi on a besoin d’étudier ces effets chez des animaux vivants.

Réduction

En utilisant des cellules en laboratoire (in vitro), on a pu faire une partie des tests sans animaux. Cela nous permettra d’en utiliser moins pour comprendre comment les substances agissent dans le corps. 3. Le nombre d’animaux utilisé dans cette étude a été réduit au minimum tout en permettant d’obtenir des résultats scientifiques fiables. Après estimation, 8 souris par groupe sont nécessaires. Pour tenir compte de possibles effets du transport sur leur comportement, 2 souris supplémentaires sont ajoutées, soit un total de 10 animaux par groupe.

Raffinement

• Prise en charge et environnement : • Les souris seront hébergées en groupes dans des conditions habituelles de l’animalerie. Le calme sera maintenu dans la pièce, et les animaux seront surveillés lors des pesées (2 fois par semaine) ; • Du matériel d’enrichissement (pour la construction de nids) sera fourni en continu, avec un accès permanent à la nourriture et à l’eau ; • Pour réduire le stress lié aux manipulations, les souris seront habituées à la contention (par tunnel ou dans le creux des mains) quelques jours avant les expérimentations. • Gestion de la douleur : Pour limiter toute douleur ou souffrance, Les souris seront surveillées de près par l’équipe de recherche. Cela permettra d'intervenir rapidement en cas de problème et de garantir le bien-être des souris. Lors des tests pour mesurer le sucre dans le sang, une crème anesthésiante sera appliquée sur la queue des souris quelques minutes avant la petite coupure nécessaire pour prélever le sang. La zone sera aussi nettoyée avant et après avec un produit désinfectant. Le matériel utilisé sera désinfecté à chaque fois. Pour réduire l’inconfort et le stress lors de l’administration des substances par la bouche, des sondes souples et adaptées à la taille des souris seront utilisées. L’animal sera maintenu seulement quelques secondes, et l’expérimentateur est formé pour faire cette manipulation de façon douce et rapide. Pour assurer une hygiène optimale lors des interventions : • Le personnel portera une blouse jetable propre et des gants désinfectés à l’alcool 70 % ; • Les surfaces de travail seront nettoyées, un champ stérile sera utilisé, et les instruments seront stérilisés ; • La zone d’incision sera tondue et la peau désinfectée avant toute intervention. Des points limites adaptés seront également mis en place .

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de l’obésité car c’est un modèle qui est assez documenté, conduisant à l’apparition de syndrome métabolique comme chez l’homme. De même, la durée d’induction de l’obésité à partir de 8 semaines chez la souris est relativement courte, ce qui permet la création des groupes expérimentaux dans des délais raisonnables. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils (Anticorps, kits de dosage etc …) contribue au choix de modèle de souris. Des souris mâles adultes âgées de 22 semaines seront utilisées dans cette étude. Certaines auront été rendues obèses en recevant une alimentation très grasse pendant plusieurs semaines. Pour évaluer leur état corporel, on utilise une méthode appelée Body Condition Score (BCS), qui donne une note de 1 à 5 (maigre à obèse) selon la quantité de graisse et de muscle. Cette estimation est faite en touchant doucement leur dos et leurs côtes. On utilise aussi un appareil de mesure spécialisé (appelé EchoMRI) pour avoir une estimation précise de la masse graisseuse. À la fin de l’étude, les animaux auront environ 37 semaines, un âge permettant d’observer les effets d’un régime riche en graisses sur le fonctionnement du corps à un stade avancé de leur développement.

309 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune passant par cinq séances de suivi glycémique. Une séance, c'est six heures de jeûne puis une incision au bout de la queue et un prélèvement de sang toutes les quinze minutes pendant deux heures. La moitié des souris reçoit dès dix semaines un régime riche en graisses qui les rend obèses et diabétiques jusqu'à la fin des expériences, avec une dégradation dentaire attendue, et le suivi métabolique impose l'isolement de chaque souris en cage individuelle. Le porteur fonde tout le projet sur le constat que l'hébergement réglementaire à 22 °C soumet les souris à un stress thermique chronique, et présente l'hébergement à 28-30 °C comme un raffinement pour des animaux qu'il rend par ailleurs malades.

Objectifs

Le changement climatique représente une menace croissante pour la santé humaine. Parmi ses conséquences les plus dangereuses figure la chaleur extrême, qui affecte particulièrement les patients atteints de maladies chroniques comme le diabète. Plusieurs études associent les vagues de chaleur à une augmentation des hospitalisations et de la mortalité chez les patients avec un diabète. Il reste néanmoins à déterminer si ces effets sont directement liés à la température et à mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués. Pour cela, nous souhaitons développer un modèle pertinent qui permettra d'étudier l’impact de la chaleur sur la régulation de la glycémie. Chez la souris, mammifère endotherme, la zone de thermoneutralité se situe autour de 28-30°C. Or, en laboratoire, les souris sont hébergées à 22 ± 2°C, ce qui induit un stress thermique chronique pouvant modifier leur métabolisme. Cette situation soulève des questions quant à la validité des modèles expérimentaux et leur transposabilité à l’homme. La régulation de l'équilibre glycémique étant sensible au stress, il est contre-intuitif de l’étudier chez des animaux en stress thermique. Or, peu d'études ont évalué l'effet de la température ambiante sur la glycémie, et leurs résultats sont souvent contradictoires. De plus, la notion de thermoneutralité est rarement prise en compte, et les études se concentrent généralement sur les régulations périphériques, négligeant les mécanismes cérébraux. Notre projet vise à étudier l’impact de la thermoneutralité sur la régulation de la glycémie et à identifier les mécanismes impliqués, en particulier ceux d’origine cérébrale. Dans ce contexte, une région du cerveau, l’hypothalamus, est un important organe régulateur des fonctions corporelles, notamment de la température corporelle, du sommeil et de l’appétit. Il semble donc représenter un acteur crucial reliant la température et l'équilibre glycémique, qui est important à étudier.

Bénéfices attendus

Les études réalisées sur la régulation cérébrale de l’équilibre glycémique, en contextes sain et pathologique, sont souvent menées à des températures d’hébergement qui induisent un stress thermique chez les souris, ce qui peut affecter leur physiologie et, par conséquent, la fiabilité des résultats et leur impact translationnel. Le nombre d’études conduites sur les souris à thermoneutralité est très limité. Ainsi, la caractérisation de l’homéostasie du glucose ainsi que des circuits neuroanatomiques dans un contexte de thermoneutralité est nécessaire. Cette étude va donc nous permettre de déterminer l’impact de la thermoneutralité et l’enjeu de la thermorégulation sur l’homéostasie glucidique. En outre, le présent projet propose d’étudier, à différentes échelles, l’impact d'un hébergement à thermoneutralité sur les mécanismes impliqués dans la physio-pathologie d’obésité/diabète, chez le modèle murin. Ces recherches apparaissent cruciales dans la lutte contre la pandémie croissante de diabète que nous connaissons à l’heure actuelle. Notre compréhension des enjeux sanitaires prenant en compte les facteurs environnementaux tels que la température, ouvrira la voie à des solutions innovantes dans l’adaptation à notre environnement et le traitement de ces maladies.

Procédures

Les animaux seront soumis à divers types d'expérimentations et de prélèvements soit en condition vigile, soit sous anesthésie. - Afin d’évaluer la régulation de la glycémie chez des animaux soumis à une température environnementale correspondant à leur thermoneutralité, les souris seront placées en armoire ventilée et soumises à des cycles de température inclus dans la zone de thermoneutralité (27 à 31°C) et comparées aux animaux hébergés à la température règlementaire durant la période d’expérimentation. - Afin de comparer l'effet de la température environnementale chez des animaux sains et obèses diabétiques, les souris seront divisées en 2 lots, l’un soumis à un régime alimentaire standard et le second soumis à un régime riche en graisse (High Fat Diet) dès l’âge de 10 semaines jusqu’à la fin des expériences. -Afin de suivre la glycémie, les animaux seront mis à jeun pendant 6 heures de leur phase inactive, pour subir ensuite des prélèvements sanguins de 4μL à l'extrémité de la queue toutes les 15 minutes pendant 2 heures, soit un volume total de l'ordre de 40 μL par expérience ; Les expérimentations sont répétées 5 fois en respectant une semaine de repos minimum entre chacune d'entre elles. - Afin d'évaluer l'impact de la température d'hébergement sur le comportement anxieux chez la souris vigile, les animaux soumis aux différentes conditions d'hébergement, subiront un test permettant d'évaluer leur comportement exploratoire dans un environnement inconnu. Le test consiste à une heure d’habituation dans la pièce d’expérimentation et 5 minutes d’observation du comportement de la souris libre à explorer le nouvel environnement – chaque souris subira ce test une seule fois. - Afin de prélever des tissus à l'issue des tests physiologiques, les animaux seront profondément anesthésiés afin de réaliser une chirurgie sans réveil d'une durée de 15 minutes.

Impact sur les animaux

- Le protocole de nutrition qui sera utilisé entraine un surpoids et une hyperglycémie chronique chez la souris constituant un modèle d'obésité et de diabète de type 2 chez l'animal. Ce régime riche en lipides, à température ambiante et à thermoneutralité peut entrainer une détérioration de la santé dentaire des souris, sévérité modérée. - La mise à jeun de 6 heures avant chaque test physiologique peut entrainer une perte de poids, sévérité légère. - Le prélèvement sanguin pour le suivi de la glycémie, par incision de l’extrémité de la queue peut entrainer une douleur légère et de courte durée à l’incision, ainsi qu'une légère perte de sang, sévérité légère. - Le suivi métabolique implique l’hébergement individuel des animaux à 1 animal/cage inhérent à ce suivi, sévérité modérée. - L’injection intra-péritonéale de diverses molécules pour la caractérisation du profil glycémique, durant les procédures peut entrainer une douleur légère et de courte durée à l’injection, sévérité légère. - Le test de comportement utilisé pour évaluer le comportement anxiogène chez la souris, peut entrainer un stress, et un risque de chute de la plateforme associé à une blessure, sévérité légère.

Devenir

A l'issue des procédures, les souris seront mises à mort dont la majorité sera utilisée pour des analyses post-mortems. Le prélèvement des organes post-mortem, notamment le cerveau, servira pour la caractérisation de l'anatomie cérébrale ou de pour des études moléculaires, ainsi que les mécanismes cellulaires d'intérêt.

Remplacement

Afin de mieux comprendre la relation complexe entre la température et le diabète, en particulier dans un contexte où les enjeux climatiques s’exacerbent, il est essentiel d’étudier cette interaction dans un cadre physiologique chez la souris. Cette approche permet d’explorer les mécanismes interconnectés de la thermorégulation et du maintien de l’homéostasie glucidique. Pour mieux élucider ces effets, un réseau de neurones de l’hypothalamus, connu pour réguler à la fois la température corporelle et la glycémie, est particulièrement interessant. La caractérisation des altérations neuroanatomiques et du fonctionnement des réseaux formés par ces neurones en réponse aux variations thermiques environnementales, nécessite l’utilisation d’un modèle in vivo intégré. Il est indispensable d’étudier la communication entre le système nerveux et les systèmes périphériques de l’organisme afin de comprendre l’influence du premier sur le second dans différents scenarii climatiques. La physiologie de la souris étant proche de celle de l’Homme, ce modèle animal constitue une étape clé pour la recherche translationnelle. Les innovations thérapeutiques pourront potentiellement être développées sur la base de ces nouvelles connaissances et applicables à l’Homme à l’avenir. À ce jour, il n’existe aucune alternative non-animale permettant d’étudier ces interactions de manière complète.

Réduction

Dans un objectif de réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet, nous avons entrepris une planification expérimentale en amont et avons réalisé des estimations de puissance statistique, associées à une estimation pour chaque expérience du nombre d’animaux nécessaires par groupe. Ceci permet de réduire au plus le nombre d’animaux utilisés, tout en s’assurant d’avoir la puissance statistique nécessaire à nos tests. En outre, cela permet d’éviter le double emploi et la réplication d’expériences. Les tests statistiques envisagés seront adaptés en fonction du nombre de groupes et du design expérimental ainsi que des conditions de normalité et d’homoscédasticité des données. Le design de nos expérimentations prévoit, quand cela est possible (différents tests physiologiques par exemple), qu’une souris subisse successivement différents tests, réduisant de ce fait de façon significative le nombre de groupe d’animaux nécessaires.

Raffinement

Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. De fait, l’hébergement des souris à une température dans la zone de thermoneutralité est susceptible d’éliminer le stress thermique métabolique qu’elles subissent à température règlementaire. Les animaux seront maintenus à un minimum de trois par cage pour éviter tout isolement social et leur hébergement sera pourvu de matériel pour la nidification et d'un tube de plastique rouge leur fournissant un abri. Pour éviter la dégradation des croquettes riches en lipides par la chaleur à thermoneutralité, les croquettes seront remplacées toutes les 48 heures. Pour éviter d'induire un stress par choc thermique en sortant les animaux de l'armoire chauffante, les souris seront placées dans des cages d'expérimentation chauffées, qui assurent une température stable dans la zone de thermoneutralité pendant les procédures experimentales. De plus, l’état général des animaux sera quotidiennement évalué et les signes de mal-être seront surveillés attentivement, selon les points limites préalablement définis selon les recommandations pour le bien-être animal. Si un signe de mal-être ou une combinaison de signes apparaît, le suivi de l'animal sera renforcé et les soins adéquats seront apportés. Si l'état de l'animal s'aggrave dans les heures qui suivent ou ne s'améliore pas dans les 24-48 heures, il sera considéré qu'un niveau de souffrance intolérable est atteint et la mise à mort sera réalisée par élongation cervicale après anesthésie. L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie/analgésie (locale ou générale). Il sera prévu, pour les animaux devant subir plusieurs tests au cours d'une même procédure, une période de rétablissement minimum d’une semaine entre chaque test, leur permettant une stabilisation de leur poids corporel et la reconstitution initiale de leur volume sanguin après prélèvement. Pour les souris sous régime riche en graisse, le suivi du poids est réalisé toutes les 2 semaines pour la surveillance de leur bien-être et l’intervention en cas d’atteinte d’un point limite.

Choix des espèces

Afin de caractériser les mécanismes de régulation centrale de la glycémie chez la souris à thermoneutralité, il est nécessaire d’adopter une approche intégrative permettant une compréhension globale d’un système physiologique complexe. Seule l’utilisation d’un modèle mammifère in vivo nous permettra d’étudier la physiopathologie de l’obésité et du diabète ainsi que leur interaction avec la thermorégulation et le maintien de la température corporelle. La souris constitue un modèle privilégié en raison de sa physiologie proche de celle de l’Homme, favorisant une recherche translationnelle dont les innovations thérapeutiques pourraient être appliquées en clinique humaine. La souris présente également de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : notamment taille et coût d’entretien réduits. Il s’agit d’un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques permettant une comparaison aisée de nos données avec celles d’autres équipes. De plus, la souris offre des possibilités uniques d’approches génétiques et phénotypiques complexes n’existant pas chez d’autres modèles mammifères. Au cours de cette étude, la physiologie chez l’adulte sera étudiée. Les souris seront donc âgées d’au moins 8 semaines lors des expérimentations.

Nourris pendant soixante semaines au plus avec un aliment riche en graisses et en sucres, 1 000 souris et 1 000 rats subissent jusqu'à 240 prélèvements sanguins pour mesurer leur glycémie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils développent obésité, diabète, dyslipidémie, insulinorésistance et stéatose hépatique pouvant aller jusqu'à la fibrose, la cirrhose ou un cancer du foie, et sont tous tués à l'issue sans pouvoir être réutilisés. Le protocole vise à vérifier qu'un aliment gras et sucré stérilisé par irradiation induit toujours le même état pathologique et que le modèle reste valide. Sur le dimensionnement de l'effectif, le porteur indique s'appuyer sur son savoir-faire et ses données historiques, et écrit qu'aucune approche statistique n'a été réalisée.

Objectifs

A l’échelle mondiale, les maladies liées au surpoids représentent une part non négligeable des décès estimés à plus de 1,2 million par an. En 2016, 650 millions d’adultes étaient obèses, soit 3 fois plus qu’en 1975. En 2021, le diabète affecte plus de 537 millions de personnes. La dyslipidémie et la stéatose hépatique non- alcoolique sont provoquées par le diabète et l’obésité. La dyslipidémie touche quelques milliers de patients chaque année en France et la société nationale française de gastro-entérologie considère qu’un quart de la population française est touché par la stéatose hépatique non- alcoolique. Par l'alimentation de rongeurs avec un régime riche en lipides et glucides, il est possible d'induire ces phénotypes spécifiques : obésité, dyslipidémie, diabète. Ce protocole a pour objectif de tester un aliment riche en lipides et/ou en glucides stérilisé par irradiation à différentes doses. L’étude permettra d’évaluer si le taux d’irradiation a un impact sur le modèle, en suivant notamment la prise de poids, le maintien du phénotype attendu et l’état général des animaux. Les observations recueillies permettront ainsi de vérifier si le modèle reste valide.

Bénéfices attendus

Ce projet aura des bénéfices pour l’homme. Ce projet pourra amener à long terme des solutions thérapeutiques pour traiter les syndromes métaboliques du surpoids et du diabète. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour l’espèce utilisée grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Les animaux auront à disposition un aliment standard et/ou un aliment riche en gras et/ou en sucre et une eau standard et/ou une eau additionnée de sucre, pendant 60 semaines maximum. Des prélèvements sanguins pour mesure de glycémie pourront être faits avec ou sans mise à jeun (mise à jeun de 4 à 6 heures maximum) sur les animaux en aigue (maximum 2 mesures par jour par animal, avec 3 jours de récupération entre 2 séries de mesures, ce qui fait 240 prélèvements maximum sur toute la durée du protocole) ou en chronique (une mesure par animal par semaine, ce qui fait 60 prélèvements maximum sur toute la durée du protocole). Une goutte de sang sera prélevée pour mesure de la glycémie sur une bandelette de glucose. La durée de prélèvement sera d’1 minute maximum.

Impact sur les animaux

Au fil de la prise alimentaire riche en gras et/ou sucre et d’un abreuvement standard ou riche en sucre, les animaux pourront exprimés des signes cliniques plus ou moins modérés. Les animaux vont développer une obésité et des syndromes métaboliques tels diabète, dyslipidémie, insulino-résistance, NASH pouvant aller jusqu’à une fibrose, une cirrhose ou un cancer du foie à long terme (après la phase préparatoire). Le prélèvement sanguin peut induire un léger stress transitoire et une légère douleur.

Devenir

En fin de protocole, les animaux ne pourront pas être réutilisés dans un autre projet et seront donc mis à mort selon les procédures en vigueur.

Remplacement

L’induction de modification métabolique chez l’animal fait intervenir plusieurs types cellulaires produisant des facteurs tendant à moduler ou amplifier la réponse. Toute cette cascade d’événement faisant intervenir des facteurs autocrines, paracrines ou exocrines aussi variés que complexes ne permet pas une étude significative et déterminante in vitro. Par ailleurs, l'objet de cette étude est d'évaluer l'impact sur une fonction vitale de l'organisme, ce qui ne peut être fait que sur un organisme vivant.

Réduction

Nous réalisons ce protocole alimentaire pour proposer un modèle animal pertinent avec un nombre minimal et suffisant d’animaux pour atteindre l'objectif scientifique. Notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.

Raffinement

Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long de cette phase préparatoire. En cas d'anomalie clinique observée sur un animal, une grille de scoring général sera utilisée afin de déterminer l'atteinte de points limites et de décider du devenir de l'animal. Enfin, les contentions et prélèvements seront réalisés par un personnel formé et expérimenté.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit sur les maladies métaboliques liés au surpoids car elles développent naturellement ce type de pathologie ayant une affinité à la nourriture grasse et sucrée similaire à l’Homme. Les animaux pourront commencer le régime alimentaire à partir de l’âge de 4 semaines (âge minimum). À cet âge, le métabolisme est encore en développement, ce qui permet une meilleure induction de l’obésité par le régime enrichi en graisses et/ou en sucre. De plus, une mise en place précoce du régime permet une meilleure standardisation entre les individus et augmente la robustesse du modèle DIO.