Système endocrinien

450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit quatre injections d'antigène avec adjuvant, dont l'adjuvant complet de Freund, suivies de prélèvements sanguins et de la mise à mort pour prélever la rate et produire des anticorps monoclonaux. Il indique que ces immunisations peuvent provoquer des ulcérations aux points d'injection. Sur le remplacement, il affirme que l'immunisation animale reste la "méthode de référence" et présente le recours in vivo comme "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.

Objectifs

Le but du projet est d’assurer la production d’AcM pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Pour répondre à ce besoin, il est pertinent de mettre en œuvre la méthode de référence, qui consiste à réaliser une fusion cellulaire entre un lymphocyte B et un myélome de souris.

Bénéfices attendus

Les anticorps monoclonaux (AcM) ont permis le développement de remarquables outils de recherche fondamentale, de diagnostic et plus récemment d’agents thérapeutiques. En recherche fondamentale, les AcM représentent des outils essentiels, en biochimie et en histologie pour la réalisation d’immunomarquages (immunohistochimie/ immunofluorescence) permettant la mise en évidence d’antigènes d’intérêts au sein d’un tissu, en biochimie dans des applications de type ELISA ou immunoprécipitation, et en biologie moléculaire pour la révélation de Western Blot. Dans le cadre du diagnostic, les tests de grossesse reposent classiquement sur la capacité d’AcM à détecter la présence de l’hormone Gonadotrophine Chorionique humaine (hCG), une glycoprotéine produite par le placenta. Les AcM sont également essentiels pour le diagnostic de différentes pathologies oncologiques et infectieuses. Les AcM demeurent aujourd’hui les outils de diagnostic tissulaire les plus performants. En parallèle de leur utilisation diagnostique, les développements menés depuis une quarantaine d’années ont abouti à la production de plus d’une vingtaine d’AcM à visée thérapeutique disposant d’une autorisation de mise sur le marché pour diverses applications, dont le domaine de l’oncologie et des maladies inflammatoires. L’ensemble de ces éléments permettent de justifier la pertinence de pouvoir assurer le développement d’AcM pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées, travaillant sur des approches fondamentales ou appliquées (diagnostic/ thérapeutique).

Procédures

4 injections seront réalisées : J00 (IP ou SC en ACF), J07 (AIF en SC ou IP), J14 (AIF en IM ou IP) et J21 une injection en intraveineuse sans adjuvant. Des prélèvements seront effectuée sur animaux vigiles : un pré-immun (qui sera le témoin négatif), un à J14 (suivi immunitaire) et J24 (jour de sacrifice de la souris). Injection IP/ SC ou IM, 30 sec pour la contention qui change à chaque point d’injection effectué + 30 secondes d’injection par point d’injection + 30 secondes de massage de la zone injectée, avec injections en 1, 2 ou 4 points suivant le type d’injection (IP, IM ou SC). Injection intraveineuse : 2 à 3 minutes de contention pour la dilation des veines caudales et 1 minute pour l’IV (l’injection en tant que telle ne prend que quelques secondes), mais la réalisation du geste technique (mise en place, maintien de la queue à demande de maintenir l’animal calme pendant 1 minute environ) Prélèvements, maintien de la souris et prélèvement 5 minutes

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Il n’y a pas d’opération chirurgicale dans les protocoles. Les prélèvements sont réalisés sur animaux vigiles au niveau de la veine sous-mandibulaire afin de remplacer le prélèvement en rétro-orbitaire.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, les souris ne peuvent pas être réutilisées pour d’autres protocoles, elles sont donc toutes euthanasiées en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcM reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. Toutefois l’isolement de la rate des souris immunisées, afin d’en isoler les plasmocytes sécrétant les anticorps et de les fusionner à des cellules immortalisées, aboutira à l’obtention d’hybridomes permettant la production d’anticorps in vitro sans avoir de nouveau à immuniser un animal.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (3 souris par protéine immunisée) est adapté au plus juste par rapport à la faible quantité d’antigène. Le nombre d’animaux utilisé est réduit au maximum, il s'agit de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire afin d’éviter la variabilité interindividuelle

Raffinement

Raffiner : Les souris sont hébergées dans des cages adaptées, proposant des objets d’enrichissement (abri, coton pour fabrication de nid) permettant de stimuler l’activité des animaux et de maintenir leur sociabilisation. Un contrôle des animaux et des sites d’injection est réalisé chaque jour. Cette observation quotidienne par un personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et permet ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Il s'agit d'un protocole de simple vaccinations avec adjuvants.

Choix des espèces

La souris est l'animal référent pour l'obtention d'AcM. Les cellules de la rate et des ganglions lymphatiques des souris immunisées contiennent des cellules lymphocytaires sécrétant des anticorps contre l'antigène d'intérêt. Ces lymphocytes fusionnés avec des cellules de myélome issues de souris, permettent d'obtenir des AcM dirigés contre l'antigène d'intérêt. Le protocole nécessite des jeunes adultes immunocompétents de 6 à 8 semaines au moment de la première injection, afin d'obtenir une bonne réponse immunitaire. Par conséquent, les souris sont reçues à l’âge de cinq semaines. Elles sont mises pendant une semaine en quarantaine dans une zone d’hébergement dédiée conforme à la règlementation avant le début du protocole

80 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit un régime riche en graisses induisant l'obésité, complété par une supplémentation en poudre de tomate, avec prises de sang par incision de la queue, perçage des oreilles, tests de tolérance au glucose et à l'insuline et isolement pour recueil des fèces. Il indique que l'isolement provoque un stress social et que l'incision et le perçage peuvent être douloureux, avant la mise à mort pour prélever les tissus. Sur le remplacement, il affirme que l'étude d'une supplémentation sur la santé métabolique ne s'envisage qu'in vivo.

Objectifs

La tomate est une des productions agricoles les plus importantes en termes de volume de production et de portée économique. Sa consommation, notamment sous forme de poudre de tomate, est associée à des effets bénéfiques pour la santé métabolique, mais son profil nutritionnel et sa teneur en micronutriments dépend du génotype et des conditions de production. L’objectif du projet est de mieux comprendre l’impact du génotype de tomate et du déficit d’irrigation sur la qualité nutritionnelle des poudres de tomates et les conséquences que cela va engendrer en terme de santé métabolique chez souris. Pour ce faire, 4 génotypes de tomate ayant subit différents niveaux de stress hydrique et présentant des profils contrastés en phytomicronutriments seront lyophilisés (6 poudres différentes en tout) puis administrés à 80 souris C57Bl/6J males (8 groupes de 10 souris) durant 12 semaines, dans le cadre d'un régime riche en graisse. Une prise de sang sera réalisée à 6 semaines, ainsi qu'un test de tolérance à l'insuline à la 9eme semaine et un test de tolérance au glucose à la 10eme semaine. Les fèces seront également récoltés et le microbiote des animaux sera analysé.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux évaluer l’impact du génotype et des conditions de culture de poudres de tomate sur la santé métabolique. Ce projet s’insère dans un projet plus large qui permettra in fine d’améliorer les effets santé de la tomate avec une combinaison innovante du choix de génotypes, de pratiques culturales et de technologie alimentaire.

Procédures

Un prélèvement de sang sur animal vigile sera réalisé au début de l'étude et après 6 semaines (2 au total). Un test de tolérance à l'insuline et un test oral de tolérance au glucose seront pratiqués respectivement en 9ième et 10ième semaine. Lors de la procédure, 3 recueils de fèces nécessitant d’isoler temporairement l’animal seront effectués.

Impact sur les animaux

Stress social lié à l'isolement de l'animal de ses congénères lors d'un test de tolérance à l'insuline, d'un test oral de tolérance au glucose et du recueil de fecès. Douleurs possibles lors de l'incision à la queue pour les prises de sang, du perçage des oreilles pour l'identification des animaux et lors de la distribution des doses de glucose pendant le test oral.

Devenir

Les animaux de cette prcédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'interet quei seront ensuite étudiés (expression génique, histologie, dosages protéiques) et de démontrer les effets métaboliques de la supplémentation en poudre de tomate.

Remplacement

L’étude d’une supplémentation en poudre de tomate sur la santé métabolique ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Les souris C57Bl/6J sont un modèle largement utilisé et reconnu pour les études sur le métabolisme.

Réduction

Le nombre d'animaux (10 par groupes) est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, notamment en ce qui concerne la prise de poids.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage de 3 ou 4, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique et de matériel de nidification (bandelettes de papier kraft). Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Une crème anesthésique sera appliquée localement lors du perçage des oreilles pour identification et avant incision pour les prélèvements de sang à la queue. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Les animaux seront manipulés régulièrement afin de réduire leur stress. Et une phase d'habituation au gavage sera réalisée pendant 3 jours avant le début de l'étude.

Choix des espèces

Le modèle souris est un modèle reconnu pour les études portant sur l’obésité et les pathologies associées. Les mécanismes d’adaptation à une alimentation riche en matière grasse chez la souris sont très proches des mécanismes observés chez l’Homme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles sont soumises seize semaines à un régime gras jusqu'à devenir obèses, avec pesées, mesures de composition corporelle et tests de tolérance au glucose sur animaux vigiles. Un prélèvement sanguin rétro-orbital sous anesthésie précède la mise à mort et le prélèvement d'organes. Le porteur affirme que la dysfonction métabolique de l'obésité ne peut être étudiée que sur des animaux entiers.

Objectifs

Le but est d'evaluer la reponse metabolique des animaux porteurs d'anomalies de l'expression de certaines proteines a un regime obesogene , et d'evaluer l'importance des changements metaboliques par rapport a un groupe controle .Il s'agit de de tester la pertinence des cibles proteiques etudiées du point de vue physiopathologique/et/ou thérapeutique. Il s'agit d'un protocole de suivi metabolique standard, avec de légeres modifications qui ont pour seules consequences d'ameliorer le confort des animaux (elevage en thermoneutralité).

Bénéfices attendus

ce projet s'inscrit dans le contexte de l'etude de modeles de souris comme outil de comprehension des mecanismes physiopathologiques de l'obesité, qui necessite des etudes sur animaux vivants ne pouvant etre subsitues. Il permettra de demontrer l'importance de l'espression des proteines ciblées dans la dysregulation metabolique mise en jeu dans l'obesité, etape necessaire a la poursuite vers des essais therapeutiques.

Procédures

pendant l'etape 1 pendant 16 semaines: Changement de régime alimentaire et mise sous régime enrichi en graisse. Maintient a thermoneutralité (30°C) pendant l'etape 2: Pesée hebdomadaire. Mesure non invasive de la composition corporelle par RMN. Procedure realisée 2 fois a S0 et S15 sur animaux vigiles. Test de tolerance au glucose et a l'insuline comportant la mise a jeun pendant 4h suivie de prelevements de gouttes de sang a la queue (1 goutte x 6 pendant 180 minutes) sur animaux vigiles. Procedure realisée 2 fois a S0 et S15. pendant l'etape 3: (a S16) Anesthesie gazeuse pour prelevement sanguin retroorbital. Euthanasie pour prelevement d'organes post mortem.

Impact sur les animaux

Les animaux de ce protocole seront soumis a un regime alimentaire obesogene (riche en graisse) consommé avec grande appétence, qui conduit au développement d'une obésité expérimentale, ce qui peut etre considéré comme une nuisance a la santé. Egalement nous proposons dans ce protocole de maintenir les animaux a thermoneutralité (30°C) et non pas a temperature ambiante comme c'est generalement le cas dans la plupart des animaleries. Cette procedure peut constituer une nuisance dans le sens ou elle necessite l'utilisation d'une enceinte climatique pour la stabulation des animaux, cependant le confort thermique est amélioré, et plus proche des conditions de vie des humains qui vivent la quasi totalité dans des conditions de thermoneutralité.

Devenir

A la fin du protocole, tous les animaux sont euthanasiés en vue de prelever et d'etudier differents organes (tissu adipeux, foie, muscle etc). Les différents prélèvements sont nécessaires pour des analyses post-mortem et que cela implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux

Remplacement

La dysfonction metabolique induite par l'obésité chronique est une situation impliquant de nombreux acteurs cellulaires, qui ne peuvent être étudiées dans leur intégralité que sur des animaux. L’évaluation de candidats therapeutiques potentiels nécessite l’utilisation des modèles murins génétiquement modifiés. Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet et permet d'explorer les males et les femelles.

Réduction

Pour chaque groupe experimental correpondant a un regime (standard ou enrichi en graisse) et un genotype (ko ou control), 12 animaux (6males et 6 femelles) seront utilisés. Au total par lignée transgenique 48 animaux seront nécessaires, soit 240 au totalpour les 5 lignées a étudier. C'est le nombre minimal pour prendre en compte la variabilité experimentale de la reponse au regime riche en graisse, qui permet d'obtenir des differences statistiquement significatives apres 16 semaines de regime. . La durée du regime (16 semaines) correspond au temps necessaire pour obtenir non seulement une augmentation du poids corporel mais aussi des effets metaboliques associées a l'obesité chronique. De plus il est necessaire d'evaluer a la fois des males et des femelles car il est connu que les risques metaboliques consecutifs a l'obesité sont differents selon le sexe.

Raffinement

Pour l’étape 1 : Le maintien es animaux a thermoneutraliré réduit le stress thermique par rapport a un élevage a température ambiante. Il est réalisé dans une enceinte a climat constant a 30°C avec éclairage led entre 6.00AM et 18.00PM, l'humidité est maintenue constante a 40-70%, les cages standard utilisées pour la stabulation a température ambiante avec l'enrichissement habituel (lanières de papier) ont utilisées avec des biberons pour l'accès a l'eau de boisson. 6 animaux par cage au maximum. Le type d'enrichissement (lanières de papier a disposition dans les cages tapissées de sciure) est identique pour tous les groupes. Les point limites de l'expérience sont définis sur les critère habituels de bien être des animaux (posture, état du pelage) mais aussi sur l'évolution du poids corporel et de la prise de poids induite par le regime enrichi en graisse. Toute perte de poids de plus de 10% constatée sur 2 pesées hebdomadaires consécutives entrainera le retrait de l'expérience. Pour l’étape 2 : La pesée hebdomadaire et la mesure non invasive de la composition corporelle sont réalisées dans un environnement calme pour minimiser le stress lié a la manipulation. Pour l’évaluation metabolique par le test de tolerance au glucose, la mise a jeun temporaire (4h) est réalisée en laissant les animaux dans leur cage habituelle. Après chaque prélèvement d’une goutte de sang a la queue, les animaux vigiles sont immédiatement remis dans leur cage habituelle avec leurs congénères. Pour l’étape 3 nécessitant un prélèvement sanguin retro orbital et le prélèvement d’organe post mortem, une anesthésie gazeuse sans réveil est réalisée immédiatement suivie de dislocation cervicale.

Choix des espèces

Les modèles murins utilisés sont pertinents car la souris est la seule espèce de mammifère dans laquelle des invalidations géniques ciblées et spécifiques de certains tissus peuvent être réalisées dans l’état actuel des connaissances techniques et scientifiques. Les souris sont faciles à manipuler et la présence du centre d’explorations fonctionnelles sur le site nous permet d’utiliser ce modèle dans de bonnes conditions d’élevage. Stade adulte (soit age de 6 semaines) pour induction d'une obésité nutritionnelle. Le suivi pondéral des animaux permet de détecter le phénotype obèse qui se traduit par une prise de poids superieure à celle des animaux en régime standard. Les modeles commerciaux sont elevés comme reproducteurs pour generer les groupes experimentaux, ils ne sont pas utilisés dans le protocole. Les animaux sont identifiés par un marquage aux oreilles. Le genotypage est effectué par PCR sur de l'ADN genomique extrait de fragments de queue prelevés par les personnels de l'animalerie avent le sevrage.

150 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent six injections sous-cutanées d'antigène associé à un adjuvant et trois prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux vendus comme réactifs à des équipes de recherche. Le porteur indique que les immunisations peuvent provoquer des ulcérations aux points d'injection. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est aussi efficace et que le recours à l'animal vivant reste "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces immunoglobulines constituent des ressources largement utilisées dans des applications analytiques et thérapeutiques. Les AcP sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ils trouvent des applications en biologie et en biochimie, en tant que ligand de colonne d’immunoaffinité. Ils possèdent également de nombreux emplois en recherche tel que la détection de molécules dans les essais du type enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), les révélations de Western Blot, les procédures immunohistochimiques et d'immunoprécipitation, en immunofluoromicroscopie et en immunoélectromicroscopie. Notre processus de production assure la production d’AcP pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les antisérums sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps ; lorsque le titre est suffisamment élevé, on prépare un antisérum en effectuant une prise de sang suivie de l'isolement du sérum puis, si nécessaire, de la purification des anticorps à partir du sérum

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux (AcP) seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. Les anticorps développés de cobaye dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe. L’utilisation du cobaye interviendra dans des projets particuliers pour lesquels, cette espèce présente un avantage par rapport à d’autres. En effet, les cobayes présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal le plus communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Le cobaye étant phylogénétiquement plus éloigné de la souris que le rat, il permet l’obtention d’anticorps anti-protéines de souris. Plusieurs exemples ont montré l’intérêt des cobayes en comparaison d’autres espèces, notamment pour la production d’anticorps dirigé contre l’insuline porcine, où les cobayes ont permis d’obtenir d’une meilleure réponse en comparaison des lapins.

Procédures

Six injections aux cobayes en sous-cutané de l’antigène associé à un adjuvant. Trois prélèvements sanguins seront réalisés, au niveau de la veine saphène sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné). Injection sous-cutanée : 8 minutes dont 4 minutes pour prendre avec délicatesse l’animal, le rassurer et le préparer, 30 secondes par injection et 30 secondes pour masser la zone injectée (4 injections), c’est-à-dire 4 min. Prélèvement : l’endormissement sous anesthésie gazeuse prend 10 minutes pour être effective. Le prélèvement sous anesthésie au masque est réalisé pendant 3 à 4 minutes. Le réveil de l’animal prend 1 à 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Il n’y a pas d’opération chirurgicale dans les protocoles. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie.

Devenir

Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (3 cobayes par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant dans l’obtention des protéines médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Raffiner : L’environnement des cobayes est enrichi pour améliorer leur bien-être (tunnel de jeu, friandises, foin, jouets,…). Les animaux seront particulièrement suivis pendant les 24h suivant les injections, puis quotidiennement pour examiner leur état de santé. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et permet ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Les prélèvements réalisés, sous anesthésie, concerneront de faibles volumes afin de ne pas induire de souffrance chez l’animal. Il s'agit d'un protocole de simple vaccinations avec adjuvants.

Choix des espèces

Les cobayes présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal le plus communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Etant phylogénétiquement plus éloigné de la souris que le rat, ils permettent l’obtention d’anticorps anti-protéines de souris. Plusieurs exemples ont montré l’intérêt des cobayes en comparaison d’autres espèces, notamment pour la production d’anticorps dirigé contre l’insuline porcine, où ils ont permis d’obtenir d’une meilleure réponse en comparaison des lapins. Ils permettent également l’obtention d’anticorps ayant une forte capacité à fixer le système du complément. Ils permettent en comparaison des souris de Réduire le nombre d’animaux engagés dans chaque protocole à 3 individus. La production d’anticorps chez le cobaye nécessite de faibles doses d’antigène. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les cobayes entreront en protocole à l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine d’une semaine, sans incident durant ce temps, ils seront aptes à rentrer en protocole.

440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles subissent des régimes gras, des injections d'un composé toxique pour le foie ou une chirurgie de ligature des voies biliaires, pour étudier une protéine impliquée dans la fibrose du foie liée au diabète. Le porteur reconnaît que la ligature des voies biliaires "entraîne des douleurs" et que certains régimes font perdre du poids aux animaux, suivis jusqu'à un point limite. Il affirme que l'usage de souris génétiquement modifiées est "nécessaire" et ne peut être remplacé par des méthodes sans animaux vivants.

Objectifs

Des études épidémiologiques ont établi un lien entre l’accumulation de tissu adipeux dans la région intra-abdominale (obésité viscérale), la stéatose et la fribro-inflammation du foie avec le risque de développer un diabète de type-2. L’accumulation anormale de lipides dans le foie va induire un stress inflammatoire provoquant le développement d'une fibrose hépatique. L’état d’inflammation chronique, est considéré comme un facteur important de la détérioration de l’homéostasie glucidique. Il est bien établi aujourd'hui que les macrophages hépatiques (cellules de kupffer) jouent un rôle important dans la mise en place de cette fibrose. Récemment la protéine GPS2 (G-protein pathway suppressor 2) a été identifiée comme un modulateur de l'activation des macrophages dans le contexte du diabèté et de l'obésité́. Son rôle dans l'inflammation hépatique reste cependant énigmatique. Ce projet a pour but de démontrer le rôle de cette protéine dans les processus cellulaires impliqués dans le développement de la fibrose hépatique. Pour ceci, des souris invalidées pour GPS2 spécifiquement dans les macrophages et des souris contrôles subirront différents modéles d’induction de fibrose hépatique (régimes, traitement pharmacologique et chirurgie).

Bénéfices attendus

Nous devrions démontrer l’importance de GPS2 dans un programme transcriptionnel orchestrant les altérations cellulaires et structurales du foie qui favorisent la fibrose hépatique et le développement du diabète de type-2. Ce projet de recherche fondamental a pour objet de définir et d’identifier l’implication du facteur de transcription GPS2 dans les altérations du foie associées au diabète de type-2. A terme, réduire l’activité de GPS2 pourrait être proposé comme une nouvelle approche thérapeutique pour contrôler l’inflammation afin d'atténuer le risque de diabète de type-2.

Procédures

Les animaux seront soumis à différents régimes (régime riche en graisse HFD, régime déficient en méthionine et en choline MCD, régime gras déficient en choline CD-HFD), à des injections de CCL4, à une procédure chirurgicale de ligature des voies biliaires et enfin à des tests métaboliques. 30 min avant la chirurgie, les souris reçoivent une injection de buprénorphine (0,09mg/mL) en SC. Puis elles sont anesthésiées par isoflurane (5% d’isoflurane et 2L/min d’air) dans une chambre d’induction, puis maintenues sous anesthésie sur une plaque chauffante munie d’un masque d’anesthésie (2,5% d’isoflurane, 0,5L/min d’air et 0,2L/min d’oxygène). Une injection de buprénorphine est réalisée 2 fois par jour le lendemain et le surlendemain de l’opération.

Impact sur les animaux

Les animaux placés sous régimes enrichis en lipides (HFD et CD-HFD) vont prendre du poids tout au long des semaines de régime et vont devenir un peu moins active. Les souris placés sous régime MCD vont perdre du poids, elles seront surveillées de près pour ne pas qu'elles dépassent une perte de poids de 20%. La chirurgie de la ligature des voies biliaires entraine des douleurs chez la souris.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasié à la fin de leur procédure afin de récupèrer différents organes pour phénotyper les altérations fibro-inflammatoires du foie par histologie, cytométrie en flux, expression de gènes…

Remplacement

Afin de prouver l'implication de notre protéine d'intérêt, dans le développement de la fibrose et de l'inflammation hépatique, nous avons utiliser la strégie d'invalidation génique dans des cellules spécifiques comme les macrophages. Pour ceci, nous avons utilisé le systéme "Cre-Lox" chez la souris. Ces souris sont actuellement disponibles. De plus, la souris est un des meilleurs modéles avec le rat dans l'étude de la fibrose hépatique. Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants. En effet, dans le but de répondre à notre étude du rôle de la protéine GPS2 dans la régulation de voies de signalisation métabolique et inflammatoire, l’utilisation des modèles murins génétiquement modifié est nécessaire. Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé est de 440. Afin de réduire le nombre d’animaux dans l’étude, nous avons développé des protocoles permettant l'analyse de plusieurs paramètres sur un même animal, comme par exemple l’évaluation de la tolérance au glucose et l’évaluation de la sensibilité à l’insuline. Avec une période de récupération d’au moins 3 jours entre chaque test, chaque animal sera soumis aux 2 évaluations. Pour chaque condition expérimentale, des groupes de 20 souris seront créés. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance. De plus, des tests statistiques seront nécessaires pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés et ont un accès ad libitum a la nourriture. Les conditions de température et d'hygromètrie sont controlées et monitorées tous les jours. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (8h-20h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Si, pour des raisons de protocole, une souris devait se retrouver seule dans une cage, l’enrichissement sera augmenté. Pour s’assurer du « bien être » des souris, elles bénéficieront de coton et de « maisons » en carton afin de les occuper et afin qu’elles puissent se construire un « nid ». Les souris seront sous surveillance journalière. Pour l'ensemble des procédures, des points limites ont été établis. Des protocoles d'anesthésie et d'analgésie ont été mis en place lorsque cela était nécessaire.

Choix des espèces

Le modèle murin est utilisé dans ce projet car les modèles génétiques ont été validés chez la souris. Les souris sont faciles à manipuler et la présence du centre d’explorations fonctionnelles sur le site nous permet d’utiliser ce modèle dans de bonnes conditions d’élevage. Les souris utilisées auront entre 8 et 10 semaines au début de chaque procédure.

218 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Diabétiques ou non, elles reçoivent des injections de peptides puis subissent des prélèvements sanguins répétés et des tests métaboliques par incision de la queue, pour évaluer la toxicité et les effets de ces molécules sur le diabète et la stéatose hépatique. Le porteur anticipe une possible perte de poids et une atteinte neurologique liées à l'action des peptides sur le cerveau. Il juge "erronée" la corrélation entre viabilité cellulaire in vitro et humain, et affirme qu'un "système animal entier" est "nécessaire".

Objectifs

La prévalence de l'obésite, du diabète de type 2 (DT2) et de la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) a doublé au cours des 20 dernières années et représente dans la région Grand-Est, environ 1/4 de la population. La prise en charge de ces pathologies, appelées syndrome métabolique, est une priorité en santé publique et mérite un intérêt marqué pour la recherche clinique expérimentale. Il convient de noter le succès relativement limité des médicaments biologiques et chimiques disponibles pour traiter l'obésité pathologique et les maladies associées. Dans ce contexte, nous avons identifié des petites molécules appelées peptides dérivés de l'élastine (PDE) qui sont notamment impliquées dans le développement du diabète de type 2. Ces mêmes peptides activent une molécule présente à la surface des cellules que l'on appelle la neuraminidase-1, NEU-1. Le regroupement de deux NEU-1 (processus de dimérisation) permet l'élimination d'acides sialiques (appelée désialylation) présents sur certaines molécules. Par exemple, la désialylation du récepteur de l'insuline (RI) provoque le développement du diabète de type 2 mais également de la stéatose hépatique. Afin de réduire l'impact de la désialylation induite par NEU-1 sur le développement de ces pathologies, nous avons élaboré une stratégie innovante par l'utilisation de peptides interférents (PI). Ils ont été mis au point et testés sur différents types de cellules. En effet, ils diminuent la dimérisation de NEU-1 et le phénomène de désialylation associé. De ce fait, ces PI pourraient empêcher le développement du diabète de type 2 et de la stéatose hépatique. Il nous semble donc crucial de tester ces molécules sur un modèle animal (souris). Une première approche animale a été menée sur un modèle de souris développant des tumeurs de façon importante et spontanée. Une injection unique de ces molécules a été testée lors de cette première étude et une détection de ces dernières 7 jours après injection a été observée au sein des tumeurs. Cependant aucune donnée sur les effets indésirables de ces molécules et de leur temps d'action n'a été évoquée sur modèle animal. C'est pourquoi nous proposons une étude sur le temps d'action, la dose, la fréquence d'injection ainsi que sur la potentielle toxicité de nos molécules (procédure 1 à 3) avant toute investigation thérapeutique comme l'impact de ces molécules sur le développement du syndrome métabolique induit par l'activation de NEU-1 (procédure 4).

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra, à court terme et à long terme, d’obtenir des données cruciales pour la suite des expérimentations et permettra une avancée importante dans la recherche translationnelle tant en clinique humaine qu’en clinique vétérinaire. En effet, la procédure 1 nous permettra de déterminer la dose optimale et sous-optimale des peptides interférents fluorescents à injecter. Par la suite, nous connaîtrons, via la procédure 2, la fréquence d’injection optimale afin d’éviter un potentiel effet cytotoxique des peptides fluorescents injectés de façon chronique. Enfin, grâce à la procédure 3, nous pourrons vérifier si une potentielle intolérance pourrait être observée chez des animaux insulino-résistants et qui seront utiles pour la suite des expérimentations. Enfin la procédure 4 nous permettra d’évaluer les effets biologiques des peptides interférents sur l’insulino-résistance et la NASH développée par l’accumulation de PDE observées chez les sujets vieillissants ou diabétiques. Ces PDE et le CRE qui y est associé, ont été décrits comme des inducteurs de maladies cardio-vasculaires (thromboses, athérosclérose, hypertension artérielle…), métaboliques (NASH, insulino-résistance, fibrose adipeuses…), cancer (sein, mélanome, …), … Si les peptides interférents ont un réel effet sur l’insulino-résistance, alors ces peptides pourraient avoir un impact thérapeutique important sur diverses pathologies dont les traitements sont peu convaincants.

Procédures

Procédure 1 : Une semaine après l’arrivée des souris au laboraroire, 100 µL de sang maximum sera prélevé au niveau de la veine caudale à l’aide d’une aiguille 27G sous anesthésie générale. Puis au moins 7 jours plus tard, 100 µL seront de nouveau prélevés. La fréquence de prélèvement ne dépassera pas deux fois par semaine et le volume n'excèdera pas 100 µL de sang par prélèvement. Ainsi le volume prélevé ne dépassera pas le seuil reglémentaire autorisé (20% du volume sanguin total soit environ 280 µL de sang). Procédures 2 et 3 : Une semaine après l’arrivée des souris au laboraroire, 100 µL de sang maximum sera prélevé au niveau de la veine caudale à l’aide d’une aiguille 27G sous anesthésie générale. Puis au moins 7 jours plus tard, 100 µL seront de nouveau prélevés. La fréquence de prélèvement ne dépassera pas une fois par semaine et le volume n'excèdera pas 100 µL de sang par prélèvement durant toute la durée du traitement. Ainsi le volume prélevé ne dépassera pas le seuil reglémentaire autorisé (20% du volume sanguin total soit environ 280 µL de sang). Procédure 4 : Etape 1 : Aucun prélèvement n’est effectué. Etape 2 : Une incision de 1 mm au niveau de la queue est réalisée afin de recueillir une goutte de sang (

Impact sur les animaux

Nos données préliminaires (COS-7, SKBR-3, MCF-7, HepG2) sur cellules, n’ont pas montré de modifications sur la prolifération, la viabilité ou la sénescence cellulaire. De ce fait, l’injection de doses raisonnables de peptides interférents (ne dépassant pas 1 mg/kg) ne devrait pas induire d’effets indésirables. Cependant, dans notre cas, il serait possible que ces injections induisent une perte de poids par manque d’appétit. En effet, NEU-1 a été décrit dans le système nerveux central (hippocampe) mais pourrait aussi être exprimé dans d’autres régions comme l’hypothalamus renfermant notamment le centre de la faim. La présence de NEU-1 dans le système nerveux central et l’inhibition de son activité par les peptides interférents pourraient entraîner une atteinte neurologique associée à une modification du comportement.

Devenir

Les animaux de chaque procédure (procédures 1 à 4) seront mis à mort afin de réaliser des études de biodistribution de la fluorescence et de cytotoxicité organe par organe (procédures 1 à 3), ou des études biochimiques/histologiques (procédures 1 à 4).

Remplacement

Le recours aux modèles in vitro a été réalisé en amont de la demande d’autorisation de projet. En effet, des résultats in vitro ont été obtenus concernant l’étude de la viabilité cellulaire de différentes lignées cellulaires (COS-7, SKBR-3, MCF-7, HepG2) après incubation avec le peptide transmembranaire interférent ou le véhicule seul (micelles de Lithium Dodécyl Sulfate ou LDS qui est un détergent utilisé en biologie). Bien que nous n’ayons observé aucune cytotoxicité de ces peptides et des micelles à 1 µM et 0,1 µM après différents temps d’incubation (10), la corrélation de cette étude de viabilité sur des modèles cellulaires isolés avec l’Homme est erronée d’un point de vue scientifique. Il est donc nécessaire d’étudier la posologie et la potentielle cytotoxicité de ces peptides dans un système animal entier afin d’obtenir des informations clés pour la suite des expérimentations (procédure 1 à 3). En ce qui concerne la procédure 4, à notre connaissance, aucun modèle in silico et in vitro ne peut remplacer un modèle in vivo pour cette application et cette thématique (développement d’un syndrome métabolique, à savoir, l’insulino-résistance et la NASH).

Réduction

Les procédures 1 à 3 ont été réalisées afin de se limiter aux expérimentations jugées absolument indispensables pour la procédure 4. Une réflexion biostastistique (G-Power) a été intégrée à la création de ce projet afin d’éviter qu’une réduction trop drastique ne nuise à la fiabilité des résultats du projet. Ainsi la procédure 1 nous permettra de déterminer la dose optimale à injecter tandis que les procédures 2 et 3 nous permettront de déterminer la fréquence d’injection afin d’atteindre les objectifs fixés dans la procédure 4, tout en garantissant le bien-être animal. L’avantage d'avoir mis au point ces procédures liées est qu'il sera possible et nécessaire d’arrêter le projet si les conditions fixées ne sont pas respectées pour l’ensemble ou l’un des deux sexes, réduisant ainsi le nombre d’animaux. De plus, pour les procédures 1 et 2, nous avons envisagé une prise de sang avant l’injection de peptides interférents afin que chaque individu soit son propre contrôle. En effet, une semaine avant le début des injections, un prélèvement de sang de 100 µL sera effectué pour chaque individu. Ceci permet de réduire le nombre d’individus nécessaire en éliminant un groupe contrôle ne subissant aucune injection. Pour les études de tomographie, un suivi dans le temps est réalisé par individu permettant d’éviter les sacrifices d’animaux aux temps intermédiaires de mesures (1h, 6h, 24h, 3 jours). Pour la procédure 4, comme les informations nécessaires à sa réalisation seront connues (posologie et biodistribution des peptides interférents), le nombre d’animaux sera le nombre minimum nécessaire. De plus, les étapes expérimentales dans cette procédure 4 impliquent de nombreuses méthodologies non invasives, permettant là encore une réduction du nombre d’animaux. Enfin des analyses statistiques seront réalisées à l’aide d’un test Mann-Whitney (test non paramétrique) ou de test de rang de type Wilcoxon qui sont adaptés pour l’étude sur un faible nombre d’individus.

Raffinement

Une période de stabulation sera réalisée à l’arrivée des souris, leur permettant de s’acclimater à leur nouvel environnement. La température et l'hygrométrie du local sont relevés quotidiennement. La nourriture et l’eau seront vérifiées tous les jours et disponibles ad libitum. Les cycles jour/nuit de 12h seront respectés. La litière sera changée deux fois par semaine, voire trois fois en cas de diurèse excessive des souris diabétiques. Les cages aux dimensions réglementaires (30x40cm) présenteront un enrichissement adapté et plusieurs animaux du même sexe y seront hébergées. Lors des phases d’expérimentation, les animaux seront isolés (une souris / boîte) afin de limiter la transmission du stress inter-individu. La manipulation se fera en dehors du champ de vision des animaux en attente d’expérimentation. Pour le bien-être de l’animal, les souris seront anesthésiées (isoflurane 4% pour l’induction et 1,5% pour le maintien) lors de certaines méthodologies (échographie/ tomographie) ou habituées au moins une semaine à l’avance à la contention. Cela devrait réduire le stress au minimum. Une vigilance d’autant plus accrue sera déployée à la suite des injections de peptides fluorescents ou de véhicule seul. En effet, un suivi régulier des animaux (au moins deux fois par jour) sera effectué notamment en déterminant, à l’aide d’une grille de score préalablement définie, le bien-être animal (voir document associé). Toute modification du comportement de l’animal (prostration, anxiété, isolement, troubles de l’équilibre), d’une variation significative du poids (environ 20% de perte ou de gain de la masse corporelle) ou d’une hyperglycémie (supérieur à 600 mg/dl de glucose) seront des points limites clés afin de juger de la nécessité ou non de mise à mort de l’animal. Au cours de l’expérimentation et notamment juste avant les phases de tomographies, de prélèvements de sang, des anesthésiques généraux ou locaux seront administrés. De plus, les ponctions de sang seront réalisées sous anesthésie générale à la suite de la mesure au FMT afin de réduire le temps de manipulation, le stress et la souffrance des souris. Une grille de score définie (voir en annexe) nous permettra de définir l’état dans lequel se trouvent les individus. Des tests neurocomportementaux (Labyrinthe à 8 branches, Labyrinthe en Croix Surélevé, Open Field) pourront être envisagés pour s'assurer qu'il n'y ait pas d'atteintes neurologiques suite aux traitements.

Choix des espèces

Les maladies métaboliques touchent principalement les adultes. Ainsi, afin de se placer dans les conditions les plus représentatives de ce que l'on peut retrouver chez l'Homme, les souris seront âgées de 8 semaines lors de la réception.