Système endocrinien

6 porcs miniatures vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie puis des séances d'imagerie au fil d'une succession de cinq procédures dont la dernière est terminale, pour tester une substance censée moduler la détection du sucre près du foie. Le porteur présente le diabète de type 2 comme concernant environ 500 millions de personnes et annonce une "solution thérapeutique innovante". Il justifie le recours au porc par sa taille proche de l'humain et l'impossibilité de reproduire in vitro la régulation de la glycémie sur un "animal entier".

Objectifs

Le projet vise à définir la dose minimale d’une substance susceptible de moduler la manière dont le système de détection de l’arrivée de sucre situé à proximité du foie renseigne le cerveau après le repas. L’objectif final est de traiter le diabète de type 2 en limitant les effets secondaires néfastes qui sont malheureusement classiques avec les thérapeutiques actuelles. Le modèle retenu est celui du porc miniature car il développe spontanément un des permisses du diabète de type 2 lorsqu’il est soumis à un régime alimentaire pléthorique. De plus, la taille de l’animal permet un abord chirurgical identique à celui qui sera réalisé à terme chez l’homme. Enfin, sa taille est adaptée à une imagerie du système de détection de l’arrivée du sucre.

Bénéfices attendus

Le bénéfice prévu vise à disposer d’une solution thérapeutique innovante pour le traitement du diabète de type 2. Cet objectif est réaliste car nous avons préalablement mis en évidence les mécanismes qui conduisent à la réduction d’efficacité du système de détection de l’arrivée de sucre. Cette réduction est parallèle à la survenue de la réduction de l’efficacité de l’insuline - un phénomène connu comme étant la prémisse de l’établissement du diabète de type 2. Cette cascade survient, en l’absence de prise de charge, chez tous les patients au cours de l’apparition du diabète de type 2, c’est à dire environ 500 millions de personnes dans le monde par an.

Procédures

Pour ce projet, 6 animaux seront utilisés sachant que les données sur des animaux témoins ont déjà été obtenus dans le cadre d’un projet antérieur. Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale dont la durée interventionnelle est de 10 minutes. Les animaux subiront également des imageries (2 imageries par animal) pour évaluer l’efficacité de la thérapeutique. Ces animaux sont produits à cet effet dans une structure agréée qui tient compte de l’éthique animale et assure l’élevage et le suivi quotidien des animaux dans les meilleures conditions de bien-être conformément à la législation et à la règle des 3R.

Impact sur les animaux

Ce projet sera réalisé́ en s’assurant qu’aucune angoisse, douleur ou souffrance inutile ne soit ressentie lors de toute intervention sur les animaux. Une observation quotidienne et une interaction positive quotidienne avec les animaux sera effectuée pour s’assurer de leur bien-être. En cas d’effet inattendu, les traitements appropriés seront mis en œuvre en accord avec les responsables du bien-être animal de notre établissement utilisateur.

Devenir

Ce projet correspond à la succession temporelle de 5 procédures - les 4 premières conduisant à la réutilisation de l’animal pour la procédure suivante, la cinquième et dernière étant terminale. A la fin de chaque procédure, les animaux seront suivis par un vétérinaire pour décider d’enclencher la procédure suivante. Trois procédures sont de classe légère, une procédure de classe modérée (chirurgie) et une sans réveil.

Remplacement

Les procédures ne peuvent être faites que sur l’animal entier car la régulation de la glycémie est liée à une série de réponses biologiques non reproductibles intégralement in-vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux est volontairement réduit car les données sur les animaux témoins ont déjà été obtenues dans le cadre d’un projet antérieur. Cette réduction significative du nombre d’animaux n’induit donc pas une réduction de la significativité statistique alors qu’elle divise par deux le nombre d’animaux impliqués.

Raffinement

Des points limites sont fixés au préalable, et un suivi des animaux est effectué́ de façon très régulière. Les procédures chirurgicales et d’imagerie ont été́ conçues et validées par un vétérinaire en incluant une valence analgésique forte. Les méthodes d’imagerie sont les plus sophistiquées possible à ce jour indépendamment de l’espèce utilisée. La méthode chirurgicale est reconnue comme celle produisant les suites post-opératoires néfastes les plus limités possibles.

Choix des espèces

Le porc s’impose comme un modèle privilégié pour les études en nutrition et neurosciences. En contexte nutritionnel délétère, le miniporc adulte développe une obésité similaire à la pathologie humaine. Les animaux seront des jeunes adultes lorsque leur croissance aura atteint un plateau i.e. > 1,5 an. Ceci se justife par le fait que la condition visée par notre solution thérapeutique est celle de l'obésité chez l'adulte

884 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisées d'une étape à l'autre puis mises à mort pour prélever leurs organes. 52 femelles gestantes sont immobilisées dans un tube de contention sous lumière vive trente minutes, trois fois par jour pendant six jours, pour induire un stress prénatal, et leur descendance subit des tests de tolérance au glucose avec gavage et prises de sang à la queue. Le porteur décrit ce protocole comme un modèle de stress psychologique humain transposé à la souris. Sur le remplacement, il affirme que les méthodes alternatives sont peu représentatives des pathologies humaines et rend le recours à l'animal "incontournable", le stress et les désordres métaboliques étant des réactions de l'"organisme entier".

Objectifs

La prévalence mondiale du développement de maladies métaboliques est en perpétuelle augmentation à travers le monde. L’objectif de notre projet est d'étudier les mécanismes du stress sur le développement de ces pathologies dans la descendance.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l'impact d'un stress prénatal se rapprochant d'un modèle de stress psychologique chez l'humain, chez la souris. Ce projet apportera des connaissances sur la physiopathologie des désordres métaboliques altérés par le stress au niveau cellulaire et moléculaire afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Pour générer des souris F1 issues de mères stressées, 52 femelles seront placées dans un tube de contention sous une lumière vive durant 30 min, 3 fois par jour, pendant 6 jours, du 13ème jour au 18ème jour de gestation. L'ensemble des souris F1, soit 624 sera soumis à un test de tolérance oral au glucose avec gavage sur animaux vigiles et avec prélèvement de sang à la queue. Parmi ces animaux, la moitié, soit 312 animaux seront soumis à deux tests de tolérance oral au glucose avec prélèvement de sang à la queue 3 mois après. Ces expériences seront réalisées sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Ce modèle n'induit pas de douleur spontanée chez la souris. Nous attendons le premier jour de la procédure de stress une stabilisation du poids ou une perte de moins de 3.5% du poids des mères gestantes en comparaison avec les mères gestantes non stréssées. Dès le deuxième jour de la procédure de stress les mères gestantes doivent reprendre du poids. Le stress réalisé sur les mères gestantes ne comporte pas d'effet visible comportemental. Nous attendons un stress léger sur la génération F1 qui pourrait se manifester sur les différents paramètres mesurés, notamment une augmentation de la glycémie à jeun ou en réponse à l'administration de glucose.

Devenir

Les animaux ayant servi à générer la descendance F1 seront mis à mort et des prelèvements d'organes seront réalisés. Les souris F1 sous régime normal ou sous régime particulier seront euthanasiées à différents âges : adulte jeune ou adulte mature après la procédure du test de tolérance oral au glucose. Différentes expériences seront réalisées ex-vivo et des prélèvements tissulaires seront collectés pour différentes études au niveau cellulaire et moléculaire.

Remplacement

Les méthodes alternatives, permettant une évaluation du statut métabolique au cours du temps de la descendance suite à un stress gestationnel sont peu représentatives des pathologies humaines. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale afin d'étudier les mécanismes engagés entre l'effet du stress in utéro et les désordres métaboliques observés chez la descendance. De plus, le stress et les désordres métaboliques sont des réactions intégrées de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans leur intégralité.

Réduction

Le nombre de 8 animaux par groupe expérimental est le minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, principalement due à la variabilité interindividuelle des réponses étudiées. L'ensemble des procédures seront réalisé lors de 3 expériences indépendantes.

Raffinement

Le suivi expérimental repose sur des techniques non-invasives : suivi du poids, observation du bien etre animal. L’utilisation de ces techniques non-invasives permet d’observer au cours du temps un seul animal, là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux.

Choix des espèces

La souris présente des caractéristiques physiopathologiques proches de l'espèce humaine.

24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit l'ablation des deux glandes surrénales et la pose d'une mini-pompe, puis une injection d'aldostérone et une perfusion du rein sous anesthésie avant d'être tué par dislocation cervicale pour prélever les tubules rénaux. Le porteur indique que l'ablation surrénalienne peut provoquer léthargie, perte de poids et déshydratation, et que la ligature de l'aorte peut être douloureuse, avec des points limites prévus. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode ne reproduit in vitro la complexité cellulaire du rein et juge le modèle animal "indispensable".

Objectifs

L’hypertension artérielle est un facteur de risque cardiovasculaire qui affecte entre 10 et 40% de la population en fonction de l’âge. Les reins sont indispensables pour la régulation de la pression artérielle. L'acteur majeur de cette régulation est l’hormone aldostérone, qui agit au niveau d'une portion spécifique du rein appelée tubule distal. Des dysfonctionnements de la production ou de l’action de l’aldostérone sont responsables de maladies entrainant une hypertension artérielle ou une perte rénale de sel associée avec une baisse de la pression artérielle. L’objectif du projet consiste à mieux comprendre les mécanismes d’action de l'aldostérone sur le tubule distal. Nous allons prélever les tubules distaux des reins de souris traitées ou non avec de l’aldostérone afin de réaliser une « carte d’identité cellulaire » de ces cellules et ainsi comprendre les effets de l’aldostérone sur ces cellules. Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre les mécanismes de l’action de l’aldostérone sur la régulation du sodium et du potassium par les reins et sur le contrôle de la pression artérielle. Ils seront également utiles pour le développement de nouvelles options thérapeutiques pour le traitement de l’hypertension artérielle et des maladies héréditaires touchant les tubules rénaux.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet devraient permettre d'établir une cartographie moléculaire du néphron distal et de définir de nouvelles cibles cellulaires et fonctionnelles du MR impliquées dans la réponse à l'aldostérone. L’identification de nouveaux mécanismes moléculaires de régulation de la balance hydro-sodée dépendante de l’aldostérone pourrait ouvrir des perspectives nouvelles dans la compréhension de la régulation de la pression artérielle et le développement d’hypertension dans la population générale, mais aussi une meilleure compréhension des bases mécanistiques de certaines pathologies touchant le néphron distal.

Procédures

Afin d’évaluer la réponse aigüe des cellules du néphron distal à l’aldostérone, nous devons nous affranchir de la production endogène de cette hormone par les glandes surrénales. Pour cela nous allons procéder à une surrénalectomie bilatérale ; il est cependant nécessaire de compenser la perte en glucocorticoïdes produits par cette glande par un apport exogène en glucocorticoïdes. L’établissement de ce modèle se décompose en trois étapes principales : 1) La surrénalectomie bilatérale qui permet l’arrêt de la production endogène d’aldostérone et la pose de mini-pompes osmotiques ALZET délivrant de la dexaméthasone (1ug/100g de poids corporel/jour) pour prévenir la chute du débit de filtration glomérulaire et assurer la survie des souris Durée de l'intervention 30 minutes. 2) Après 7 jours, une injection unique d’aldostérone (0,002 mg/kg de poids corporel) ou l’équivalent en volume de serum physiologique 0,9% est réalisée par la veine caudale pour évaluer les mécanismes moléculaires de la réponse aigue à l’aldostérone dans les cellules individuelles du néphron distal. 3) Une heure après l’administration d’aldostérone, les souris sont anesthésiées et le rein gauche est perfusé avec une solution contenant de la libérase afin de permettre une digestion partielle du rein et permettre la microdissection des tubules d’intérêt. Le rein est ensuite aussitôt prélevé. Durée de l'intervention 45 minutes. Les animaux sont ensuite mis à mort par dislocation cervicale. Dans la même procédure, le rein droit, le cœur, l’aorte abdominale, du tissu adipeux viscéral et le cerveau seront prélevés et stockés à -80oC pour des possibles études futures sur l’action de l’aldostérone sur autres tissus cibles.

Impact sur les animaux

Les manques en aldostérone ou en corticostérone endogènes suivant la surrénalectomie bilatérale peuvent être responsables d’une léthargie importante des souris, d’une perte de poids et d’une déshydratation. Ces effets indésirables sont prévenus par la supplémentation en dexaméthasone. La ligature de l’aorte avant la perfusion du rein avec la solution de libérase peut entrainer de la douleur aux souris. La procédure ne commence que lorsque l’animal est profondément anesthésié (immobilité, rythme cardio respiratoire lent, pas de réaction à la stimulation interdigitale). Une dose d'analgésie (Metacam 5 mg/Kg, soit 10 ml/KG SC) juste avant l’intervention est également administrée, si besoin une demi-dose supplémentaire de Kétamine seule à 10mg/kg (0,02 ml/kg) sera réinjectée. Des points limites en rapport avec ces nuisances éventuelles sont prévus.

Devenir

Il s’agit d’une procédure sans réveil qui concerne tous les animaux.

Remplacement

Il n'existe pas de méthode de remplacement permettant de reproduire in vitro la complexité de la composition cellulaire du rein en vue d’une analyse de l’impact de l’action de l’aldostérone sur cellule unique. L’utilisation d’un modèle animal est donc indispensable à la réalisation de ce projet. Une approche in vitro sera ensuite développée pour étudier l’impact des gènes et voies de signalisation identifiés dans les tubules distaux de ces animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au nombre minimum nécessaire et suffisant pour permettre l’analyse statistique des données.

Raffinement

Les animaux seront surveillés quotidiennement et nous avons établi des points-limites bien défini à chaque étape des procédures entrainant la mise à mort des animaux si nécessaire. Nous réduirons au maximum la souffrance animale, notamment en utilisant de l’analgésie et de l’anesthésie adaptée dès que cela sera nécessaire.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris (Mus Musculus) comme le modèle de choix, en raison de ses similarités génétiques et physiologiques proches de l’homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Ce raisonnement s’applique tout particulièrement à l’étude de l’hyperaldostéronisme primaire, maladie complexe et impossible à analyser in vitro mais aussi aux syndromes de perte de sel. Tous les animaux utilisés seront âgés de 12 à 14 semaines au début de la procédure. Nous avons choisi d’étudier des souris adultes post pubères afin de nous affranchir de possibles différences (souris âgées) ou d’absences (souris non matures) de réponse de la fonction rénale.

60 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans le testicule sous anesthésie pour inactiver un gène, suivie d'un prélèvement sanguin puis de tests comportementaux (exploration, prise alimentaire, interaction avec des objets et des partenaires sexuels), avant mise à mort pour prélever les testicules. Le porteur décrit une opération simple et peu invasive, avec analgésie sur 48 heures. Il affirme qu'il est "impossible" de modéliser in vitro le fonctionnement testiculaire et juge la souris "indispensable".

Objectifs

Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la régulation de la synthèse de testostérone et la reproduction chez les mammifères est indispensable tant du point de vue de la recherche fondamentale que pour les avancées évolutives et médicales qu’elle pourrait permettre. L’un de ces aspects est la régulation génétique de la synthèse de testostérone. Ce projet repose sur l’inhibition expérimentale de l’expression d’un gène régulateur de l’expression génique dans le testicule adulte, chez la souris, pour en comprendre la fonction. Les effets de ce gène sur la synthèse de testostérone embryonnaire étant connus, il est vraisemblable qu'il régule également la synthèse de la testostérone chez l’adulte. Cette régulation de l’expression génique repose sur une lignée de souris transgénique chez laquelle l’injection d’un vecteur permet l’invalidation locale du gène ciblé. Ce vecteur sera administré sous anesthésie générale couplée à des antalgiques dans les testicules adultes. Les conséquences de la réduction de l’expression du gène cible seront mesurées sur la synthèse de testostérone, le comportement reproducteur et l’anatomie des cellules testiculaires.

Bénéfices attendus

Ces connaissances permettront une meilleure compréhension des régulations du fonctionnement testiculaire, y compris ses dysfonctionnements. Les connaissances nouvelles que nous produirons, outre des avancées dans la compréhension du fonctionnement testiculaire physiologique, pourraient permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour agir sur des déficits de synthèse de testostérone et améliorer la fertilité humaine et animale.

Procédures

Ce projet comporte deux procédures de classe modérée qui reposent sur l'invalidation de notre gène d'intérêt dans le testicule. Cette invalidation nécessite l'injection d'un vecteur dans le testicule de souris adulte. Nous étudierons l’impact de cette absence génique sur la production d’hormone et le comportement reproducteur. Ainsi, une injection de 5 minutes sera effectuée au cours d'une anesthésie de 20 minutes, . Après une période de récupération de 2 semaines, un bilan hormonal sera réalisé sur un prélèvement sanguin. Lors de la procédure 2, 3 semaines après injection, les mâles seront inclus dans des analyses comportementales mettant en jeu des comportements naturels : exploration, prise alimentaire, interaction avec des objets et mise en contact avec des partenaires sexuels pour corréler les expériences réalisées avec le phénotype des animaux.

Impact sur les animaux

Le projet repose sur l'injection intratesticulaire d'un vecteur. L’injection nécessaire pour contrôler l’expression de notre gène d’intérêt sera réalisée sous anesthésie avec un contrôle analgésique multimodal pendant 48H assurant une absence de douleur. Cette opération est simple, rapide et peu invasive, ce qui permettra un rétablissement très rapide. Pendant cette période, pour permettre un Raffinement expérimental optimal, les animaux auront accès à une alimentation hydratée à leur hauteur, leur permettant de se nourrir sans effort. Ils seront surveillés quotidiennement pendant leur rétablissement et leur bien être évalué selon une grille de scoring multicritères (posture, alimentation, masse, état du pelage, déplacements). Si les animaux présentaient des signes de douleur persistante, l’expérience serait interrompue et le protocole révisé.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour permettre une analyse à postériori de leurs testicules prélevés post-mortem. Cela permettra de corréler l'efficacité du vecteur aux conséquences anatomiques et/ou comportementales induites par l'invalidation génique.

Remplacement

La maturation et le fonctionnement testiculaires (stéroïdogenèse et spermatogenèse) sont des processus intégrés et complexes. Il est impossible de les modéliser ou de les simuler intégralement in vitro. L’utilisation d’animaux est indispensable pour aborder ces questions.

Réduction

Les procédures sont conçues pour réduire le nombre d'animaux inclus dans le projet. La première procédure utilise des contrôles internes, ce qui évite de faire deux groupes distincts. La seconde procédure s'appuiera sur les résultats de la première pour permettre une efficacité optimale des conditions expérimentales pour réduire le nombre d'animaux à inclure. Enfin chaque prélèvement sera scindé en plusieurs séries, ce qui permettra de réaliser de nombreuses expériences sur chacun des prélèvements, sans avoir besoin de traiter de nouveaux animaux.

Raffinement

Les conditions d’hébergement de nos souris sont prévues pour minimiser le stress pendant la croissance et la période expérimentale : hébergement par fratries de même sexe, présence d'ouate et d’igloos dans les cages pour faciliter la construction de nids. Tout au long du projet, le bien-être des animaux sera évalué selon une grille de scoring multicritères dont les critères seront adaptés à chaque procédure.

Choix des espèces

Ce projet propose d'étudier le rôle de l'expression génique dans les fonctions endocrines et exocrines du testicule. -Cette approche génétique nécessite de travailler sur des animaux chez lesquels les outils génétiques sont disponibles et fiables. -L'organisation du testicule est différente d'un clade à l'autre. Cette étude doit donc être réalisée sur une espèce mammifère, pour que les observations soient transposables à l'ensemble des mammifères, y compris l'homme. -Notre projet repose en partie sur des analyses hormonales, comportementale et d’observation de la fertilité ce qui nécessite une espèce avec des tests validés. Seule la souris remplit l’ensemble de ces critères. En particulier, les tests que nous proposons sont validés par de nombreuses publications. Les souris seront étudiées à l’âge adulte, entre 2 et 4 mois, l’âge requis pour avoir pleinement développé un comportement adulte.

672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à une restriction alimentaire chronique à la moitié de leur ration pendant deux à six semaines, parfois avec une roue d'activité, ainsi qu'à des prélèvements de sang et des injections répétées, pour modéliser l'anorexie mentale. Le porteur présente la perte de poids comme le principal effet indésirable et indique la corriger en 24 heures si elle dépasse le seuil prévu. Il affirme qu'une approche intégrée chez l'animal est "indispensable" et ne peut être remplacée par des méthodes in vitro ou in silico.

Objectifs

L’anorexie mentale (AM) est un trouble des conduites alimentaires qui se caractérise par une restriction alimentaire et une activité physique compulsives aboutissant à une dénutrition chronique et des complications somatiques et psychiatriques sévères. Parmi les troubles psychiatriques, l’AM a le taux de mortalité le plus élevé et un taux de rechute important. La compréhension des mécanismes qui sous-tendent l’AM et son évolution est donc essentielle et représente un enjeu de santé publique. L’objectif de ce projet, mené chez des souris, est de montrer l’impact d’une restriction alimentaire chronique associée ou non à de l’activité physique volontaire sur l’évolution de biomarqueurs du métabolisme. En clinique, les patients qui souffrent d’AM de type restrictif présentent de manière surprenante une adaptation efficace de la glycémie qui reste relativement stable sur la durée. Nous nous intéressons à une hormone produite en réponse à l'état de dénutrition et dont les concentrations plasmatiques sont élevées chez les patientes souffrant d'AM. Nous nous intéressons notamment à deux isoformes de cette hormone et leur implication dans la modulation de la prise alimentaire, la glycémie et de la motivation à l’activité physique. Nous évaluerons donc comment un modèle murin conçu pour s'approcher au mieux du contexte de survenue et de chronicisation des symptômes de l'AM peut permettre la mise en évidence de biomarqueurs pertinents qui seront utilisés en clinique comme potentiels facteurs de diagnostic et surtout de pronostic de l’évolution de la maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet, en parallèle des études menées en clinique, nous permettra de préciser les adaptations métaboliques observées en situation de restriction alimentaire et/ou de renutrition et de valider des biomarqueurs prédictifs de l’évolution de la maladie.

Procédures

Restriction alimentaire chronique (50% de la quantité délivrée en ad libitum) entre deux et six semaines. Prélévements sur animaux vigiles : prélévements d'une goutte de sang à la queue pour vérifier l'état glycémique de l'animal au cours de la restriction alimentaire, tous les 2-3 jours. Injection unique en intrapéritonéal : glucose, glycérol, pyruvate, glutamine, insuline (évaluation de la régulation glucidique). Injection en sous-cutané (sub-scapulaire) en aigu (injection unique) : isoformes de la ghréline (implication dans la régulation de la prise alimentaire et de la glycémie)

Impact sur les animaux

Nous utilisons ce modèle de restriction alimentaire depuis plusieurs années. La perte de poids induite par la restriction alimentaire est le principal effet indésirable. Toutefois, le protocole permet une perte de poids progressive et contrôlée, et l'état général des animaux est surveillé de manière quotidienne. Aussi, une perte de poids plus importante que celle habituellement observée sera régularisée dans les 24h en ajoutant une quantité de nourriture plus importante, permettant une reprise rapide de poids. Afin d'obtenir l'activité physique individuelle, certaines souris seront temporairement maintenues en cage individuelle équipée d'une roue d'activité, et ce pendant 4 jours.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à chaque fin de procédure.

Remplacement

Ce projet ayant pour objectif d’étudier des altérations cérébrales et comportementales (émotions, cognition et physiologie glucidique) complexes mimant la pathologie humaine, une approche intégrée chez l’animal est indispensable qui ne peut absolument pas être substituée par des approches in vitro ou in silico

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés (réduction) lors des explorations in vivo, nous répéterons différentes procédures sur le même animal lorsque cela se justifie sur le plan expérimental. Les animaux seront ensuite mis à mort pour les analyses biochimiques et/ou moléculaires.

Raffinement

Pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux, l’état général des animaux seront suivis quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie (apparence physique, changement de comportement). Tout état anormal, évalué à l’aide de points limites bien définis, sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mises en œuvre en cas de points limites atteints (utilisation d’un analgésique, arrêt du protocole ou mise à mort). Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés.

Choix des espèces

Le modèle murin est ici un modèle de choix pour l'exploration du comportement alimentaire dans des conditions particulières de restriction chronique, des processus addictifs et du métabolisme énergétique. Les régulations métaboliques, hormonales et neurobiologiques mises en jeu ont été bien caractérisées dans cette espèce et une littérature abondante existe montrant de très nombreuses similitudes avec les observations chez l’Homme. L’organisation anatomique et fonctionnelle du cerveau est relativement proche de celle de l’Homme, ce qui permet une investigation anatomique et fonctionnelle plus élaborée que ce que peuvent nous procurer les approches par imagerie chez l’humain. De plus, ces modèles bien décrits par les expériences ultérieures menées dans notre laboratoire permettent de réaliser des études phénotypiques comparatives pour caractériser les voies moléculaires ou mimer certains aspects de pathologies humaines. Les troubles alimentaires et en particulier l’AM font partie des pathologies neuropsychiatriques qui touchent principalement des sujets jeunes adultes et des adolescents. Dans notre projet, la majorité des procédures sera réalisée chez de jeunes souris adolescentes, sexuellement matures, à partir de l’âge de 5-7 semaines. Comme l’AM est une maladie chronique, les paradigmes expérimentaux que nous avons choisis nécessitent un suivi longitudinal de plusieurs semaines, ainsi certaines souris pourront être utilisées jusqu’à l’âge de 15-20 semaines.

1 490 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Selon les lots, elles subissent une à trois chirurgies, chirurgie stéréotaxique, injection virale et vagotomie, puis portent des fibres optiques ou un cathéter gastrique pour des tests de comportement et de métabolisme. Le porteur indique des douleurs et infections postopératoires possibles et un stress lié aux dispositifs, et précise que tous les animaux sont mis à mort pour prélever des tissus. Il affirme que les expériences ne peuvent se faire in vitro car il a "besoin" d'observer une physiologie intégrée, et que les invertébrés n'ont pas les structures équivalentes aux mammifères.

Objectifs

La régulation de la prise alimentaire repose sur la balance entre besoins énergétiques et la valeur renforçatrice de la nourriture. Cette régulation résulte de l'intégration dynamique de plusieurs signaux qui façonnent collectivement les stratégies adaptatives pour le maintien de l'apport calorique et du poids corporel. Cependant, notre environnement alimentaire moderne fait évoluer les ajustements physiologiques vers des dysfonctionnements de la récompense et du métabolisme qui peuvent conduire au syndrome métabolique (obésité). Les composantes de la prise alimentaire (énergie et récompense) ont été souvent décrites et étudiées en termes de régulation par le cerveau. Cependant, dans les dernières années l’axe vagal (intestin-cerveau) a émergé comme un régulateur clé de la prise alimentaire en modulant à la fois le métabolisme énergétique et les processus de récompense. Le nerf vague représente un relai neuronal capable d’assurer le transfer de l’information intéroceptive entre les organes périphériques et le cerveau. Malgré ce rôle critique, les mécanismes sous-jacents à cette régulation en conditions physiologiques et/ou pathologiques (obésité) restent largement inconnus. Ce projet de recherche vise donc à étudier le rôle de l’axe vagal dans les processus de récompense et de métabolisme énergétique. Le projet est construit autour de 4 objectifs principaux. 1. Étudier la plasticité structurale et neuronale des neurones du système de la récompense suite à vagotomie. 2. Établir le rôle des afférences vagales intestin-cerveau dans les réponses adaptatives du circuit de récompense dans l'obésité : de l'alimentation à la détection des nutriments. 3. Interroger l'axe vagal intestin-cerveau pour restaurer les fonctions hédoniques et métaboliques 4. Explorer la signature moléculaire des neurones vagaux pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour l'obésité

Bénéfices attendus

Les dernières estimations de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) révèlent qu'en Europe, plus de la moitié des hommes et des femmes sont en surpoids, et environ un tiers sont obèses. Cela représente également un fardeau social, économique et sanitaire. Bien que certains traits génétiques (causes monogéniques) aient été identifiés et largement étudiés, il est largement reconnu que le syndrome métabolique est par essence un trouble multifactoriel et multidimensionnel qui englobe des réseaux complexes d'inadaptations physiopathologiques en aval. Malgré les progrès et les efforts récents, nous sommes toujours confrontés à un besoin de stratégies innovantes et plus efficaces contre les troubles métaboliques. En fait, à ce jour, les approches thérapeutiques les plus durables de l'obésité et des dysfonctionnements qui lui sont liés sont représentées par les chirurgies bariatriques, très efficaces mais extrêmement invasives et dangereuses, dont les mécanismes d'action restent largement inexplorés. Le développement récent de technologies de pointe et l'émergence de concepts révolutionnaires dans le domaine de la physiologie intégrative, comme le propose le projet, vont certainement élargir notre quête de connaissances et de solutions thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis : -pour 5 lots à une chirurgie d'injection virale (environ 1h), puis après une période de repos de 3 semaines minimum, à des tests de comportements, de métabolisme du glucose et/ou de mesure de calorimétrie indirecte. Des prélèvements sanguin sur animaux vigiles (175ul, 35ul et 35ul sur 3j à interval d'une semaine) seront fait sur deux de ces lots. -pour 4 lots à deux chirurgies (stéréotaxie 30min et injection virale en périphérie 40min, ou stéréotaxie 30min et après 15j de repos une vagotomie 40min), puis après une nouvelle période de repos de 15j, à des tests de comportements. -pour 1 lot à trois chirurgies qui se feront en deux fois pour le bien être de la souris (stéréotaxie 30min et injection virale en périphérie 40min, puis après 15j de repos une vagotomie 40min). Puis après une période de repos de 15 jours à nouveau, il seront soumis à des tests de comportements.

Impact sur les animaux

Pour l'ensemble des procédures il peut y avoir des douleurs ou infections post opératoires qui seront traitées par analgésie et antibiothérapie si nécessaire. Pour les procédures 1-2-3, le fait de porter des fibres optiques sur la tête de l'animal pendant les enregistrements peut initialement induire un stress. Cela peut entraîner une immobilité ou une mobilité réduite, ce qui constitue un comportement initialement indésirable cependant les fibres étant légères, les animaux s'habituent très rapidement. De plus avant d'imager l'activité neuronale, l'animal sera soumis à plusieurs séances d'habituation d'une durée de 30 min pendant 2 à 3 jours, ce qui lui permettra de s'habituer aux procédures d'enregistrement. De même pour les animaux portant un cathéter gastrique.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements de tissus.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet , nous devons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée. De plus, les invértébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et la régulation de la récompense alimentaire.

Réduction

Oui selon le dessin expérimentale et les nombres de variables (groupes; temps; régimes; comportements) nous utiliserons les tests suivant: Student T Test ; One-Way Anova (Bonferroni post-hoc multiple comparaison) ; Two-Way Anova (Bonferroni post-hoc multiple comparaison) ; régression linéaire. Par rapport aux nombres d'échantillons nous utiliserons principalement des tests paramétriques et si nécessaire des tests non-paramétriques.

Raffinement

Le soin apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures invasives en particulier. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement et du régime alimentaire. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton, batons de bois ou tunnels en carton. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé: notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à assurer des soins pré-, per- et postopératoires adéquats, à recourir à l'anesthésie et à l'analgésie, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.

Choix des espèces

Notre étude repose entièrement sur la physiopathologie intégrée et nécessite du modèle rongeur, notamment la souris car celle-ci permet l’utilisation de stratégies transgéniques et virale qui sont peu développées ou absentes dans d’autres modèles. Toutes les souris seront utilisées à l’age adulte (au moins 2 mois) afin que les réseaux neuronaux sont bien en place.