Multisystémique

30 rats mâles adultes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit huit injections dans la veine de la queue, deux fois par semaine pendant quatre semaines, puis enchaîne une semaine de tests, activité locomotrice spontanée sur cinq minutes, mémoire immédiate sur dix minutes, deux mesures d'anxiété de cinq minutes chacune et une mémoire de travail évaluée trois matinées de suite. L'objet est d'observer si des vésicules produites par des cellules de foie en culture exposées à des polluants alimentaires provoquent anxiété et troubles de la mémoire, les biomarqueurs et les cibles thérapeutiques annoncés relevant de l'espoir que le porteur formule. Sur le remplacement, il indique avoir remplacé les animaux non-humains par des hépatocytes en culture pour produire les vésicules, et affirme que leur effet sur le cerveau ne peut pas l'être.

Objectifs

La stéatohépatite non alcoolique est une maladie chronique qui concernerait plus de 200 000 personnes en France chaque année. Elle correspond à une accumulation de graisses dans le foie sous forme de gouttelettes lipidiques associée à une inflammation. En dehors des altérations purement hépatiques, ces stéatoses peuvent aussi être reliées à des troubles cérébraux (anxiété, stress et dépression). Des études ont conduit à évaluer l’exposition aux polluants environnementaux comme facteur favorisant la progression de cette maladie du foie. Les polluants qui seront étudiés ici sont présents dans l’alimentation et en raison de leurs propriétés lipophiles, ils s’accumulent dans le foie et le cerveau, où ils peuvent générer des troubles de l’anxiété et des altérations cognitives. L’exposition à ces polluants modifie également la quantité et les caractéristiques des petites vésicules produites par le foie, vésicules qui peuvent perturber le fonctionnement d’autres cellules de l’organisme. Dans le cadre de ce projet, nous évaluerons chez le rat adulte les conséquences hépatique et cérébrale de l'injection de ces vésicules libérées et isolées à partir de cellules de foie en culture et exposées à des conditions enrichies en gras et aux polluants étudiés.

Bénéfices attendus

Nous espérons ainsi identifier de nouveaux biomarqueurs d’exposition et/ou d’effets des polluants choisis ainsi que de nouvelles cibles thérapeutiques en étudiant le rôle des vésicules dans la progression de cette maladie du foie et le lien avec de possibles atteintes cérébrales. Cette étude devrait nous permettre : d’étudier l’impact au niveau du foie et du cerveau de l’administration de ces vésicules chez des rats.

Procédures

La seule intervention pouvant être à l’origine de mal-être est l’injection des vésicules à la veine de la queue, injection qui sera répétée 8 fois pour chaque animal tout au long des 4 semaines de traitement. Chaque animal sera donc injecté 2 fois par semaine pendant 4 semaines consécutives. Les tests comportementaux seront quant à eux effectués sur une période d’une semaine, entre 8h et 13h. Un premier test consistera à évaluer l'activité locomotrice spontanée de l’animal durant 5 minutes. La mémoire immédiate de l’animal sera également testée pendant une durée de 10 minutes. Deux tests complémentaires, chacun d’une durée de 5 minutes seront réalisés pour évaluer le niveau d'anxiété des animaux. Un dernier test se proposera d'évaluer la mémoire de travail des animaux. Il sera réalisé sur 3 jours consécutifs pendant 5 minutes par matinée. Ainsi chaque animal effectuera un à deux tests par jour pendant une semaine.

Impact sur les animaux

Les nuisances/effets indésirables identifiés attendus sont les suivants : stress de contention lié à l'injection des vésicules extracellulaires ainsi que le stress lié à l’introduction de l’aiguille dans la veine caudale . D’après les éléments de la littérature et l’expérience des porteurs du projet, aucun des tests comportementaux prévus ne provoque des signes de mal-être chez les animaux.

Devenir

Une fois les tests comportementaux réalisés, les animaux seront mis à mort et les tissus d’intérêts à l’étude seront prélevés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Nous avons remplacé l’utilisation d’animaux pour la production des VE par des hépatocytes en culture soumis à un environnement enrichi en graisse et/ou en polluants environnementaux. Cependant, l’impact de ces vésicules sur les fonctions du foie et du cerveau (activité, anxiété, mémoire de travail) ne peut pas être évalué sur des cellules de foie isolées, ni remplacé.

Réduction

Le nombre total d'animaux est le nombre estimé juste et nécessaire pour pouvoir atteindre les objectifs du projet dans des conditions de réalisation acceptables garantissant ainsi le bon déroulement de l'expérimentation, la prise en charge adaptée des animaux de façon à garantir au mieux leur bien-être et une exploitation statistique satisfaisante des résultats. Le nombre de 27 animaux prévu a été déterminé pour une puissance statistique fixée a priori de 0,90, des effectifs égaux dans les 3 groupes expérimentaux (n=9/groupe) et la variation estimée la plus sensible dans l'ensemble des mesures effectuées. A ce nombre, nous nous laissons la possibilité d’ajouter 1 individu supplémentaire par groupe de manière à pallier à une éventuelle atteinte de seuils critiques irréversibles. Soit un total de 30 animaux au maximum (n=10 par groupe).

Raffinement

Les animaux qui seront achetés pour ce projet seront maintenus et élevés selon les conditions d’élevage habituelles en accord avec les contraintes fixées par la réglementation, placés à 2 par cage selon les dispositions réglementaires dans des portoirs ventilés avec des buchettes et frisure de papier kraft comme enrichissement. Leur comportement sera surveillé afin de s'assurer de l'absence de mal-être ou de comportement agressif entre les animaux. En ce qui concerne les injections à la veine caudale, la douleur sera contrée par badigeon avec un anti-douleur local et le stress induit par le tube de contention sera réduit par une habituation d'une durée d'une semaine.

Choix des espèces

Des rats adultes mâles ont été choisi pour être plus représentatif de la réalité humaine où les hommes présentent un taux d’incidence de stéatohépatite deux fois plus élevé que les femmes. Les animaux entreront dans l’étude à l’âge de 6 semaines et seront acclimatés à leur nouvel environnement pendant 8 à 10 jours. A ce stade ils auront atteint leur maturité sexuelle et sont donc considérés comme jeune adulte, ce qui est représentatif du profil de la population touchée.

Pour vérifier si le microbiote intestinal de patientes anorexiques oriente les préférences alimentaires, 252 souris reçoivent par gavage des selles humaines transplantées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour l'étude de leurs tissus. Chaque animal subit six prélèvements sanguins sur animal vigile, un régime riche en fibres qui fait perdre du poids, un hébergement individuel et huit tests comportementaux, les 126 femelles recevant en plus trente-six frottis vaginaux. Le porteur signale un risque de traumatisme de l'œsophage lié au gavage et un risque d'anémie lié aux prises de sang, et renvoie à des points limites dont il ne dit pas lesquels.

Objectifs

L’anorexie mentale (AM) est un trouble des conduites alimentaires (TCA) qui touche jusqu’à 3.6% de la population féminine et dont le taux de mortalité est élevé. Il s’agit d’une maladie psychiatrique chronique qui se caractérise par une restriction alimentaire volontaire, une peur intense de devenir gros alors que le poids est faible et par une perturbation de l’image de son propre corps. La restriction alimentaire est qualitative et quantitative avec une aversion intense pour les lipides et les glucides et une alimentation très riche en fibre et pauvre en protide. Les causes exactes de l’anorexie mentale restent encore mal connues. Il a été mis en évidence la présence d’un déséquilibre du microbiote intestinal chez les patients AM. Ce déséquilibre pourrait être secondaire à la restriction alimentaire, mais aussi responsable de la préférence alimentaire et donc jouer un rôle majeur dans la persistance des symptômes chez les patientes souffrant d’une forme chronique de la maladie. Dans ce projet de recherche, nous émettons l’hypothèse que la préférence alimentaire particulière de l’anorexie mentale est déterminée par l’environnement microbiotique intestinal. L’objectif de l’étude est de mettre en évidence une différence de préférence alimentaire entre les groupes mimant l’anorexie mentale et les sujets sains pour répondre à la l’hypothèse que le microbiote dans patients atteints d’anorexie mentale les pousse à préférer manger des aliments végétaux. Cette étude permettra aussi de montrer le transfert de symptômes de l’anorexie mentale touchant de nombreux organes à travers le microbiote.

Bénéfices attendus

L’étude permettra la validation du modèle de l’anorexie mentale par transfert de microbiote fécal, d’améliorer la compréhension de la physiopathologie de l’anorexie mentale, de la compréhension des mécanismes d’influence microbiote/hôte.

Procédures

Tous les animaux vigiles seront gavés 4 fois soit au total. La contention et le gavage sont réalisés en moins de 10 secondes. Prélèvement de selles : 252 animaux 3 prélèvements par animal seront réalisés. Réalisé après émission naturelle. Durée 1 minute. Prélèvement sanguin : 252 animaux Les prélèvements seront réalisés sur animaux vigiles. Chaque prélèvement dure en moyenne 10 secondes, pour un nombre total de 6 prélèvements par animal soit au total 1 minute de prélèvement sanguin par animal. Prélèvement d’urine : 252 animaux Emis naturellement sur animal vigile. Durée du recueil : 10 secondes, 1 fois au cours du protocole. frottis vaginaux : 126 animaux Réalisation de frottis vaginaux chez les groupes d’animaux femelles. 36 prélèvements par animal durée du recueil 10 secondes. 252 animaux subiront 1 fois chaque test comportemental pour une durée totale de 40 min. Ceci porte le nombre de tests à 8 par animal. La durée cumulée d’épreuves comportementales sera de 145 min sur 6 semaines. Pour 252 souris. Injection sur animal vigil d’une durée de 5 secondes. Soit 1 injection par animal.

Impact sur les animaux

Gavage oral : Risque de traumatisme de l’œsophage lors de la manipulation. Hébergement individuel : Stress induit par l’isolement du fait des caractéristiques communautaires de l’espèce non satisfaites. Régime : perte de poids lié au régime riche en fibre. Prélèvements sanguins: douleurs et stress induit par la prise manuelle et la piqure et la coupure effectuée par la lancette. Les prélèvements seront tous espacés d’un minimum de 7 jours. Risque d’anémie lié aux prélèvements sanguins. Injections: Douleur liée à la piqure et l’injection de liquide Lavage vaginal : stress lié à la prise par la queue et le lavage. Tests comportementaux : induction d’un stress volontaire par la mise en conditions expérimentales. Mise a jeun une fois d’une durée de 4h et une fois d’une durée de 6h. Stress lié à la privation d’aliment dans l’environnement Prélèvement d’urine : émission naturelle, stress lié au placement en pot de recueil

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour l’étude scientifique des tissus

Remplacement

Notre projet nécessite l'utilisation d'animaux de laboratoire car il n'existe pas de techniques actuellement satisfaisantes et éthiques pour étudier le retentissement à un niveau physiologique du déséquilibre bactérien intestinal chez l’humain et ses effets sur la physiologie de l’intestin et le comportement alimentaire. Les techniques in vitro permettent des études à des échelles microscopiques (interactions au sein d’un tissu) mais non à l’échelle globale de l’organisme, ne permettent pas des études d’un point de vue comportemental. Les techniques d’études in silico ne sont pas applicables à l’échelles des interactions microbiote hôte d’un point de vue comportementale et physiologique car les connaissances ne sont actuellement pas assez développées pour créer des modèles informatiques prédictifs.

Réduction

Le nombre d’animaux destiné au projet a été estimé au regard d’une étude autorisée précédemment, et afin de garantir une puissance nécessaire et suffisante d’analyse statistique. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum. Les tests statistiques comportent des analyses descriptives et des analyses de comparaisons.

Raffinement

Les nuisances pour les animaux seront prévenues par une surveillance accrue dans les suites de la transplantation de microbiote fécal sur le plan du comportement, du stress, de la douleur et du poids. Afin de limiter le stress lié aux tests comportementaux, les animaux seront habitués aux procédures et au matériel de manière progressive. Afin de limiter le stress associé à l’hébergement individuel les cages sont transparentes, permettant un contact visuel et olfactif avec les congénères, et enrichies (papier à déchiqueter, matériel de nidification et bâton à ronger). Les points limites déterminés seront appliqués par les expérimentateurs en cas de constatation de leurs manifestations.

Choix des espèces

Nous utiliserons la souris qui est une espèce de référence et un modèle très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies humaines. Cette espèce est bien référencée sur les études comportementales et la littérature existante permettra une analyse de qualité. Les souris seront des jeunes adultes âgés de 6 semaines au début de l'expérience. Ceci est nécessaire pour être au plus proche des conditions de maladie chez l’homme qui débute au jeune âge adulte.

800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour produire la version humaine d'une molécule de l'inflammation, elles reçoivent une puce sous-cutanée, un prélèvement au bout de la queue, une injection déclenchant soit une inflammation cérébrale soit une inflammation systémique avec insuffisance cardiaque et lésions multi-organes, puis un cathéter et une séance d'imagerie. Le porteur indique qu'elles peuvent cesser de manger et de boire, maigrir et rester prostrées, et précise qu'elles ne seront pas gardées au-delà des 24 heures que durent les modèles. Sur le remplacement, il affirme qu'il faut mesurer l'affinité de l'agent de contraste à l'échelle d'un "organisme entier" et conclut au "caractère de stricte nécessité" des procédures.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de valider une nouvelle technique d'imagerie ciblée sur une souris génétiquement modifiée qui exprime la version "humaine" de la cible d'intérêt. En effet, au sein de notre équipe de recherche, nous développons un nouvel agent de contraste, une substance qui augmente artificiellement le contraste d'une imagerie médicale. Cet agent de contraste est conçu pour se fixer sur des molécules qui apparaissent spécialement pendant l'inflammation. Nous avons développé une version de cet agent de contraste qui pourrait potentiellement être utilisable chez l'Homme, notamment pour évaluer l'inflammation cérébrale (dans le cadre du diagnostic de l'AVC par exemple) ou encore dans le cadre de l'inflammation cardiaque (infarctus du myocarde ou atteinte cardiaque inflammatoire). Cet agent de contraste a la particularité d'être "ciblé" c'est-à-dire qu'il reconnaît une molécule exprimée lors de l'inflammation. Le but de ce projet est de tester si cet agent de contraste est efficace pour imager l'inflammation cardiaque ou cérébrale chez des souris modifiées génétiquement pour exprimer (c'est-à-dire "produire") la version humaine de cette molécule cible.

Bénéfices attendus

Ce nouvel agent de contraste a montré une sensibilité et une spécificité élevées pour détecter l'inflammation cérébrale et cardiaque chez des souris non génétiquement modifiées et qui expriment donc la version murine de la molécule cible. Il est donc attendu que l'agent de contraste cible tout aussi bien la version humaine de la molécule exprimée par les souris modifiées génétiquement. Si les résultats de cette étude sont pertinents, cela permettrait d'ajouter des preuves solides au fait que l'agent de contraste développé ici pourrait être un jour utilisé en clinique chez l'Homme pour mieux diagnostiquer, évaluer et prendre en charge les pathologies inflammatoires cérébrales et cardiaques.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : o 1 prélèvement d'ADN pour confirmation du génotype (prélèvement d'un bout de queue) et insertion d'une puce en sous-cutanée (durée: 5min) o Induction du modèle inflammatoire par une unique injection d’un produit induisant l’inflammation (durée : inférieure à 20min) o Pesée lors des manipulations (durée : inférieure à 5 min) o 1 pose d’un cathéter sous anesthésie profonde (durée : environ 15min) o 1 imagerie avec injection de produit de contraste (durée : environ 20min).

Impact sur les animaux

L'étape de génotypage par puçage et prélèvement d'ADN peut induire un inconfort chez l'animal, tels que la douleur au niveau du site d'insertion de la puce sous-cutanée et des saignements, surtout au bout de la queue prélevée. Les deux modèles d'inflammation utilisées chez la souche de souris transgéniques peuvent produire des effets indésirables chez les animaux. Dans le premier modèle, une inflammation cérébrale créée pourra mener à des altérations de la signalisation neuronale et donc des problèmes cognitifs et comportementaux. Les animaux sont susceptibles d’éprouver une douleur de courte durée au niveau des points sutures et du site d’injection. Le deuxième modèle induit une inflammation systémique avec insuffisance cardiaque et des lésions multi-organes. Les animaux pourraient ressentir un inconfort physique et une souffrance de courte durée. Cette situation de mal-être et de stress pourra alors être repérée par une malnutrition liée à un arrêt de la prise alimentaire et de boisson suivie d'une perte de poids, de la prostration et une inactivité dans la cage.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les différents organes d'intérêt des animaux (cerveau, coeur, foie, rate), permettant ainsi de compléter les résultats obtenus in vivo par des résultats post-mortem (biodistribution, caractérisations immunohistologiques). De plus, les caractérisations histologiques sont très souvent demandées pour justifier les résultats obtenus lorsqu'une nouvelle technique d'imagerie pré-clinique est étudiée.

Remplacement

Des tests de ciblage in vitro ont été réalisés pour évaluer l'affinité de l'agent de contraste ciblant la molécule d'intérêt sur des cultures de cellules endothéliales humaines mises en conditions inflammatoires. Toutefois, les expériences in vivo ne peuvent pas être totalement remplacées par des études in vitro car il est nécessaire d'estimer l'affinité de l'agent de contraste pour la molécule humaine exprimée à l'échelle d'un organisme entier sans pouvoir pour autant tester chez l'Homme de suite. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures par rapport à nos précédents projets ayant utilisé les mêmes modèles animaux et les mêmes types d'agents de contraste. Dans ces deux études précédentes, différents groupes de souris avec des doses variables du produit induisant l’inflammation avaient été mis en place et il semble nécessaire de reprendre ces mêmes groupes afin de comparer rigoureusement l'efficacité de ciblage des agents de contraste entre les molécules d'intérêt murine (résultats des études précédentes) et humaine (nouveaux résultats attendus). De plus, il est nécessaire qu'un groupe contrôle soit mis en place avec des souris recevant des agents de contraste dits « contrôle » (non ciblés) pour mettre en évidence la spécificité de détection chez les souris transgéniques. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a en plus été confirmé par un calcul de taille d'échantillons.

Raffinement

Les animaux auront le temps d’acclimatation d’une semaine. Un enrichissement du milieu d'hébergement des souris est prévu. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 afin de conserver les interactions sociales. Avant toute mise en place des modèles, un génotypage des animaux sera réalisé par puçage et prélèvement d'ADN. Cela se fera sous anesthésie générale à l'isoflurane et au protoxyde d'azote. A partir du début de la mise en place des modèles, une attention particulière sera accordée à l'état général des animaux, notamment pour vérifier l'absence d'apparition de signes de détresse ou de douleur extérieure ainsi que la bonne prise alimentaire et de boisson. Une coupelle de croquettes humides aura été préalablement placée dans la cage afin de permettre aux animaux malades de s'alimenter et de s'hydrater plus facilement. Une attention particulière sera aussi accordée à l'évolution de la masse corporelle avec une pesée quotidienne afin de vérifier que la perte de poids n'est pas supérieure à 15%. Après induction des deux modèles, une surveillance sera faite 15 minutes après les injections du produit induisant l'inflammation, puis 1 heure après et 2 fois par jour jusqu’à la mise à mort des animaux. De plus, la douleur des animaux sera réduite au maximum en veillant à couvrir les temps d'étude par une analgésie. Enfin, les animaux ne seront pas gardés pour des études sur le long terme pour ne pas les laisser en souffrance au-delà des 24 heures que durent les modèles.

Choix des espèces

La souris (mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des pathologies de type inflammatoire. L’anatomie et la physiologie de la circulation sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’Homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier les pathologies inflammatoires. Nous utiliserons des souris mâles adultes de 8 semaines, en rapport avec l’âge des animaux utilisés dans les études pilotes.

4 800 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées pour les prélèvements finaux, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune est refroidie jusqu'à 32 °C par hypothermie provoquée, avec dix à quinze prises de température rectale espacées de quinze à trente minutes sur trois à cinq heures, une à trois administrations intraveineuses ou sous-cutanées et jusqu'à quatre prélèvements de sang, sans anesthésie ni analgésie. Cette hypothermie sert de signal pour mesurer si des molécules attelées à un médicament franchissent les barrières de l'organisme, sur une lignée dont le récepteur cible a été humanisé. Le porteur écrit travailler "faute d'alternatives de remplacement" et présente la souris comme "le seul système physiologique" intégrant les paramètres qu'il veut mesurer.

Objectifs

Les maladies neurologiques, musculaires et les maladies rares font partie des causes majeures de handicaps sévères dans le monde. À l'heure actuelle, les besoins médicaux actuels restent malheureusement très insatisfaits, sans aucun traitement curatif, ou palliatif. Une des raisons majeures réside dans l’inefficacité de nombreux médicaments à passer la barrière protectrice du cerveau et ainsi à accéder aux régions à traiter. Dans ce contexte, notre avons développé un savoir-faire qui consiste en l’association de molécules à des pro-drogues ou médicaments, capables de passer les barrières biologiques protectrices de l’organisme et ainsi atteindre plus efficacement les tissus cibles (cerveau, muscles…). Notre technologie repose sur une stratégie de cheval de Troie : Nos médicaments sont capables de reconnaître des partenaires spécifiques, au niveau des barrières protectrices de l'organisme et utilisent leurs mécanismes naturels de passage cellulaire pour atteindre le tissu cible. À travers cette demande de projet, nous souhaitons développer et optimiser de nouveaux médicaments afin d’améliorer la délivrance d’agents au fort potentiel thérapeutique. Par différentes voies d'administration, nous tenterons de potentialiser l’effet de nos médicaments, sur une lignée murine humanisée pour le récepteur cible de ce projet.

Bénéfices attendus

Choix d’une lignée murine humanisée pour notre récepteur d'intérêt : La transposition de nos recherches sur un modèle de souris humanisées, permet d’appréhender les futurs développements pré-cliniques de nos molécules et les possibles effets secondaires ou toxicités associées. De plus, elle assure de développer au maximum les études sur le modèle souris avant la phase préclinique et la transposition à l’homme, qui aurait nécessité des séries de tests sur divers modèles animaux. Enfin, le fait de pouvoir humaniser notre cible chez la souris constitue un excellent outil stratégique et scientifique, se traduisant par une réduction importante du nombre d’animaux au sein des études, par un gain de temps considérable (et de coût), tout en réduisant par la suite de potentiels essais sur modèles animaux plus gros. D'un point de vue médical, sur du plus long terme, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos médicaments constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Procédures

Les manipulations expérimentales seront réalisées sur animaux vigiles et de manière précises et rapides (≤ 2min). Elles incluent : L’annotation des queues au moyen d’un marqueur spécifique permettant l’identification des individus (1 fois /semaine). Les pesées : Une pesée sera réalisée avant chaque administration et une avant l’euthanasie des animaux. La prise de température rectale (10 à 15 prises espacées de 15 à 30 minutes sur une durée de 3 à 5 h). La mise en contention (avant toutes administrations (1 à maximum 3) ou prélèvements intermédiaires (maximum 4). Les administration(s) intraveineuse(s) ou sous-cutanée(s) : 1 à maximum 3. A noter : Dans le cas d’administration répétées, un délai de minimum 24 à 48h sera respecté entre deux administrations. Les administrations intrapéritonéales : 1 seul/individu (euthanasie). Les prélèvements intermédiaires : Des prélèvements sanguins intermédiaires seront réalisés en cours de cinétique (maximum de 4 prélèvements de 50µl/semaine). Cette procédure ne présente pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni de chirurgie avec réveil.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sont les suivants : Un stress physique peut être induit lors de la mise en contention des animaux, la réalisation des différentes administrations (une ou trois maximum par individu), l’introduction d’une sonde rectale (prise discontinue sur 5h maximum) lors du monitoring de la température et lors de la réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires (au maximum 4 prélèvements /individus, n’excédant pas 10% de la volémie sur 7jours). Un stress thermique pouvant quant à lui être généré par l’hypothermie induite (jusqu’à 32°C).

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront mise à mort pour réaliser les prélèvements tissulaires et sanguins finaux. Si, en cours de cinétique, un individu atteint un point limite, l'animal sera également mis à mort en urgence après validation du vétérinaire et porteur de projet.

Remplacement

Pour mener à bien nos projets, nous réalisons en amont de nos procédures toute une série de tests in vitro. Cette première série de tests permet notamment de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires, mais en aucun cas de prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d'éliminations) qui conditionnent le succès de nos médicaments. Pour faire face à cette sélection physiologique, nous envisagerons donc de réaliser nos expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique, ou suffisamment informel. Le modèle vivant, ici la souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres mécanistiques précédemment cités, indispensables à l’étude d’une efficacité pharmacologique chez les mammifères. Dans notre cas, le principal désavantage concerne donc le recours à l’utilisation d’animaux. Il s’agit alors de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus. L’utilisation de faibles cohortes d'animaux permettra d’aller en ce sens, tout en allant exploiter un maximum de résultats et par l’obtention de données statistiques significatives.

Réduction

L’optimisation de nos vecteurs en fonction de la voie d’administration permet d'envisager une médication optimisée et réduite (doses moins importantes), limitant de ce fait les possibles effets secondaires non souhaités (Raffinement), mais aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure (Réduction). Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes mixtes 4 individus (2 mâles/2 femelles), à raison de maximum 8 groupes par étude et 15 études par an, sur chacune des deux lignées de souris. Aussi, nous n’aurons besoin que de 960 animaux par an (4 *8*15*2), soit un total de 4800 souris sur 5 ans (960*5). Il est important de noter que ce nombre total d’animaux sera mixte (50%mâles et 50% femelles (cages séparées). Le faible nombre d’individus (4, ici) sera suffisant pour obtenir une analyse statistique robuste. Les prélèvements de tissus en fin de procédure, nous permettrons d’optimiser cette dernière sur plusieurs types de post-expérimentations en apportant des données supplémentaires et ainsi, nous permettront d’éviter une utilisation abusive et inutile d’animaux (Réduction). De façon identique, la réalisation de prélèvements sanguins en cours de cinétique permet d'obtenir davantage de données pharmacocinétique, permettant ainsi de renforcer et d’optimiser l’étude et in-fine de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

La formation initiale et l’expérience du personnel sont nécessaires pour appréhender les moindres signes et/ou comportements caractéristiques d’une douleur ou gène chez l’animal. Nous porterons une attention particulière à la préparation en amont de l’expérimentation. Elle regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux (7 à 14 jours avant expérimentation). 48h à 72h avant les administrations, les souris sont sorties de l’animalerie dans une pièce avec un cycle de lumière obscurité (12h/12h), insonorisée, en armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Un maximum de 4 individus de même sexe par cage, maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), dans la même cage (taille standard pour portoir ventilé + couvercle filtrant), litières (copeaux de bois) avec un triple enrichissement. Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Le choix des cinétiques sera également affiné au plus juste pour éviter de longs tests inutiles et de possibles angoisses supplémentaires. De plus, travaillant sur animal sain, la simplicité des administrations uniques ou répétées sur animal vigile et le court laps de temps d’exposition des molécules, nous permettent d’éviter toute apparition potentielle de phénotypes dommageables chez les animaux. Dans cette procédure, nous utiliserons des animaux issus d’élevages extérieurs issus de deux fournisseurs différents.

Choix des espèces

Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, pratique pour les études de pharmacologies et comportementales, elle est donc idéale pour la mise en place de premières études précliniques (groupes de 4 individus). À l’heure actuelle, faute d’alternatives de remplacement, le modèle rongeur, ici la souris, reste le seul modèle accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de l’homme. Par sa petite taille, il devient également très intéressant pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques et diminution des posologies). Notre modèle de transposition sur la lignée humanisée est particulièrement avantageux, car il présente une cible humanisée (récepteurs) tout en gardant les avantages cités précédemment. Les données obtenues sur ce modèle permettront notamment une extrapolation plus pertinente au modèle humain, d’envisager un gain de temps dans le développement futur du projet, mais aussi, d’éviter un certain nombre d’études et une utilisation significative d’animaux. Les animaux seront utilisés pour réaliser des suivis pharmacologiques, des échantillonnages de tissus, d'organes ou de liquides physiologiques, ceci à des fins scientifiques. Pour notre procédure, nous utiliserons pour les deux lignées, des animaux dits « jeunes adultes », âgés en moyenne de 8 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter-individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Ce stade « jeune adulte » présente un poids moyen de 27-30g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).

Une partie des souris utilisées est immunodéficiente et porte une greffe de peau humaine, le méningocoque n'interagissant qu'avec des vaisseaux humains. 1 145 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Greffe de peau de quarante-cinq minutes sous anesthésie générale, infection par injection intraveineuse, injections intrapéritonéales d'anticorps et d'inhibiteurs, jusqu'à cinq ponctions veineuses : le porteur indique que l'infection peut provoquer une baisse d'activité, une perte de poids et une hypothermie, des points limites devant permettre de tuer les souris avant que l'infection ne le fasse. Le sang est ensuite prélevé par ponction dans le cœur sous anesthésie, l'analyse des vaisseaux et des organes exigeant leur mort à toutes.

Objectifs

La méningite et le purpura fulminans sont des infections bactériennes foudroyantes et sévères qui touchent principalement les enfants et les jeunes adultes. La mortalité approche 100% en l'absence de prise en charge médicale. En France, malgré une prise en charge adaptée, le taux de mortalité reste élevé : 3%pour les cas de méningite et 30% pour les cas de purpura fulminans qui se traduit par des plaques hémorragiques cutanées et un choc septique foudroyant. De plus, lorsque l’évolution n’est pas fatale, les séquelles sont fréquentes, graves et handicapent leur vie durant les jeunes patients atteints : amputations, troubles de la vision, perte partielle ou totale de l’audition, déficience mentale permanente, difficultés d’apprentissage, mémorielles, dépression nerveuse… Le purpura fulminans est un syndrome infectieux très sévère, qui associe une septicémie à des lésions tissulaires nécrotiques disséminées sur la peau et les organes internes. Ces infections sont complexes et impliquent plusieurs organes et systèmes physiologiques à l’échelle de l’organisme. Une étape essentielle de ces infections sévéres est l'infection des vaisseaux sanguins. La bactérie responsable de ces infections n’interagit qu’avec les vaisseaux sanguins humains, nous utiliserons donc une lignée de souris gréffées avec de la peau humaine (modèle mimant le purpura fulminans). Différents variants bactériens seront utilisés afin de déterminer l’importance de différents facteurs de virulence. Nous analyserons le rôle des cellules du système immunitaire dans ces infections. Nous chercherons également à valider in vivo les effets d’agents pharmacologiques préalablement validés in vitro .

Bénéfices attendus

Les résultats attendus sont importants, car mieux comprendre les mécanismes de la méningite cérébro-spinale et du purpura fulminans, pourra conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cela permettra à terme de diminuer voire supprimer la mortalité et les séquelles dramatiques de ces infections sévères et fulgurantes.

Procédures

Ce projet comporte 5 types d'intervention : - 1 Greffe de peau humaine, durée : 45 min. sous anesthésie générale - 2 : Infections expérimentales à méningocoque par injection intraveineuse, durée de 4h pour les souris NOD/SCID gréffées et 72h pour les souris Balb/c. une infection par animal - 3: Injection d’anticorps et d'inhibiteurs par voie intra-péritonéale (moins de 5 min) (deux injections par animal, 24 et 48h avant l'infection). Injection d’agents pharmacologiques en association ou non avec un antibiotique (moins de 5 min) (une injection par animal). - 4 : Mesure de la bactériémie chez les souris par ponction veineuse (moins de 5min). (une mesure pour les souris NOD/SCID; 5 pour les souris Balb/c)- 5 : Prélèvement de sang par ponction intracardiaque sur des souris anesthésiées avant leur mise à mort 3 min.

Impact sur les animaux

La greffe peut provoquer un stress lié à l’anesthésie. La greffe peut produire une inflammation ou une infection. L’infection peut provoquer un stress chez les souris se traduisant par une diminution de leur activité, une perte de poids ainsi qu’une potentielle hypothermie, la définition des points limites permet de mettre à mort les animaux avant la léthalité due à l'infection. L’injection d’agents pharmacologique peut produire un stress. La mesure de la bactériemie peut produire du stress lié à la manipulation et la contention.

Devenir

L'analyse de l'impact de l'infection et des traitements sur l'intégrité vasculaire et l'analyse de différents organes, nécessite la mise à mort de tous les animaux.

Remplacement

Ces infections sont complexes et impliquent plusieurs organes et systèmes physiologiques à l’échelle de l’organisme (cellules endothéliales, circulation sanguine, coagulation, système immunitaire…), c’est pourquoi notre étude nécessite le recours à un modèle animal. Il est impossible de mener une telle étude sur les modèles in vitro existants.

Réduction

Nous utiliserons pour chaque expérience le nombre minimal d'animaux permettant d'observer une différence significative en se basant sur des données publiées. Pour les comparaisons statistiques entre les groupes de souris, nous utiliserons un test adapté aux petits effectifs in vivo. Afin de réduire le nombre d’animaux dans l’étude, nous avons développé des expériences permettant l'analyse de plusieurs paramètres sur un même animal, comme par exemple les analyses sanguines et les analyses sur les greffons de peau.

Raffinement

Pour réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des souris au cours de notre étude, de l’enrichissement sera ajouté dans chaque cage d’hébergement (coton et maison en carton) afin de limiter le stress des animaux. De plus, nous réaliserons les greffes sous anesthésie générale et des analgésiques seront utilisés en période péri- et postopératoire. L’analgésie per et post-opératoire sera réalisée par injection sous-cutanée d’un antalgique 30 min. avant la chirurgie et dans les deux jours suivants. Des points limites ont été définis et leur atteinte entraînera la mise à mort anticipée de l’animal.

Choix des espèces

La souris est un bon modèle d'infection à méningocoque largement décrit dans la littérature. Il permet d'obtenir une bactériémie reproductible et prolongée après infection par voie intraveineuse. Ce modèle sera utilisé pour analyser les effets de différents variants bactériens et agents pharmacologiques sur l’initiation et la progression des lésions tissulaires. Souris femelles adultes âgés de 7 à 10 semaines car il est nécessaire que ces souris présentent une surface corporelle suffisante pour greffer des fragments de peau.

50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par gavage avec un nématode intestinal, puis par injection dans l'abdomen d'un parasite du paludisme, subissent sept prélèvements de sang en vingt et un jours par incision de la queue puis retrait de la croûte de cicatrisation, et reçoivent jusqu'à six injections de traitement. La coïnfection provoque une anémie plus marquée et plus longue qu'une infection isolée, le porteur qualifiant par ailleurs l'infestation par le ver d'asymptomatique. Il conclut que les interactions entre l'hôte, le ver et le parasite ne peuvent pas être reproduites in vitro, et que les souris ne peuvent pas être réutilisées, leur système immunitaire n'étant plus naïf.

Objectifs

L’objectif du projet est d’identifier des traitements possibles en vue d’améliorer les symptômes de la coïnfection entre nématodes intestinaux et malaria. Les infections par des nématodes intestinaux sont toujours très prévalentes dans les pays en voie de développement et on estime que 3 milliards d’êtres humains souffrent d’au moins une infection par des helminthes au cours de leur vie. La carte de prévalence des infections par des helminthes coïncide en grande partie avec celle d’endémicité du paludisme, et on constate que souvent ces populations sont coïnfectées par les deux parasites. La coïnfection entraine des dynamiques différentes par rapport à celles observées quand les helminthes ou les Plasmodiums infectent seuls leurs hôtes et cela a des conséquences sur l’état de santé des individus coïnfectés. En particulier, lorsque Plasmodium infecte un hôte préalablement infecté par le nématode, on constate une aggravation des symptômes par rapport aux cas où les hôtes sont uniquement infectés par Plasmodium. Dans ce projet, nous souhaitons évaluer l’efficacité de certains traitements pouvant contribuer à améliorer les symptômes en cas de coïnfection.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier les mécanismes pouvant jouer un rôle dans l’aggravation des symptômes produits par Plasmodium lors de coïnfections avec un nématode intestinal. Ces parasites infectent des millions de personnes chaque année dans les pays du Sud en voie de développement. On estime que 600.000 personnes décèdent chaque année des suites d’une infection par une des espèces de Plasmodium, essentiellement en Afrique subsaharienne. Ces mêmes personnes souffrent souvent d’infections chroniques par différentes espèces d’helminthes. Dans le cas de coïnfection, on constate souvent une aggravation des symptômes induits par Plasmodium. Notre projet vise donc à identifier des pistes thérapeutiques pouvant améliorer les symptômes observés dans les cas de coïnfection.

Procédures

Les animaux sont soumis aux interventions suivantes (tous les animaux ne sont soumis à toutes ces interventions, cela dépendant des groupes expérimentaux): gavage à l’aide d’une sonde souris, une seule fois, durée

Impact sur les animaux

Le nématode produit des infections asymptomatiques (aucun changement comportemental ou dans l’apparence de l’animal n’est constaté). Très rarement (< 1% des cas), l’émergence des vers peut provoquer une augmentation de la perméabilité intestinale. Etant donné que les animaux sont surveillés quotidiennement et deux fois par jours pendant la période d’émergence des vers, si on constate une détérioration de l’état de santé des souris elles sont immédiatement retirées de l’expérience et euthanasiées par dislocation cervicale sous anesthésie à l’isoflurane. Plasmodium yoelii 17X NL est une souche non létale. L’infection produit une lyse des globules rouges entrainant une anémie transitoire (culminant entre les jours 14 et 16 post-infection). A partir de jour 24 post-infection les valeurs de concentration de globules rouges par microlitre de sang reviennent à la normale. Cependant, en cas de coïnfection on constate des niveaux plus importants d’anémie et un temps de récupération plus long. L’infection avec le nématode est effectuée par gavage (intervention réalisée en quelques secondes), à l’aide d’une sonde souris (rigide). Chaque individu n’est gavé qu’une seule fois avec un petit volume d’eau. L’infection avec Plasmodium est effectuée par injection intrapéritonéale (intervention réalisée en quelques secondes). Les traitements avec l’érythropoïétine et l’hémopexine nécessitent trois et six injections intrapéritonéales respectivement. Ces injections seront au minimum espacées d’un jour. Les prélèvements de sang sont réalisés en pratiquant une petite incision à la pointe de la queue pour le premier et en ôtant la croute de cicatrisation pour les prélèvements successifs. Deux prélèvements maximum par semaine sont réalisés. Ces différentes interventions ne concernent pas toutes les souris. Un chronogramme fourni en annexe indique les interventions pour chaque groupe expérimental.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort car ils ne peuvent pas être réutilisés dans d’autres expériences, n’ayant plus une réponse immunitaire naïve par rapport aux parasites utilisés.

Remplacement

L’objectif de notre étude est d’explorer des mécanismes pouvant conduire à l’aggravation des symptômes induits par Plasmodium chez les hôtes coïnfectés et de tester des traitements visant à améliorer ces symptômes. Ceci met en jeu des interactions complexes entre les trois acteurs (l’hôte, le nématode et le Plasmodium) qui ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Réduction

L’effectif de souris utilisé dans ce projet a été calculé afin d’en minimiser le nombre tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour obtenir des résultats fiables. Il s’agit en effet de 10 souris par groupe expérimental.

Raffinement

Plusieurs mesures sont prises pour réduire au minimum l’inconfort et le stress des animaux utilisés dans ce projet. D’abord, tous les animaux sont hébergés en groupe (5 individus par cage) afin de permettre l’expression des comportements sociaux. Toutes les cages sont enrichies et ont du matériel pour la construction de nids. Toutes les manipulations sont effectuées par du personnel expérimenté, dans un environnement calme qui minimise le stress des animaux. Dans la mesure du possible, les animaux sont transférés d’une cage à l’autre grâce à la technique du tunnel (au lieu de la préhension par la queue) ce qui a été démontré réduire le stress des animaux. Enfin, tous les animaux sont surveillés au moins une fois par jour pour évaluer leur état général. Si une dégradation de l’état de santé est constatée, nous utiliserons une grille quantitative de notation qui permet de définir des points limites suffisamment prédictifs

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour ce type d’expérience. Les parasites sont des parasites spécifiques de souris qui reproduisent assez fidèlement les coïnfections observées chez l’homme entre nématodes intestinaux et malaria. Nous utiliserons des animaux entre 8 et 10 semaines. Il s’agit d’individus adultes avec une système immunitaire complétement développé.

Tuées à la fin des expérimentations pour que leurs tissus soient prélevés, 96 rates Lewis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont suspendues par un harnais qui décharge leurs pattes arrière pour reproduire un alitement, ce qui peut provoquer sur les premières quarante-huit heures une perte de poids et des bouchons d'urine. S'y ajoutent trois prélèvements de sang à la veine de la queue et, trois fois au cours du protocole, un test de vitesse maximale aérobie sur tapis roulant d'une vingtaine de minutes, un test d'endurance de trente à soixante minutes et un test de force d'agrippement. Le porteur écrit que ces procédures "n'entraînent pas de douleurs spécifiques" et qualifie le recours aux rates d'"étape obligatoire" mais aussi d'"extrêmement enrichissante du point de vue scientifique", pour évaluer un extrait de romarin contre la fonte musculaire.

Objectifs

Le romarin est connu depuis quelques décennies pour avoir des effets antioxydants et anti-inflammatoires pouvant être bénéfiques pour l’être humain dans certaines circonstances. Le projet vise à tester les effets d’une substance naturelle extraite du romarin et de ces dérivés afin de prévenir la perte de masse musculaire et d’endurance lors d’une immobilisation prolongée ou bien résultante d’une maladie musculaire. Ce projet présente plusieurs objectifs. Dans un premier temps, il s’agira de tester l’efficacité des composés contre la perte de masse musculaire et la perte d’endurance lors d’une immobilisation en utilisant le modèle de suspension par harnais chez le rat. Il s’agira aussi de compléter la connaissance des mécanismes de fonctionnement du composé principal. Dans un second temps, l’objectif de ce programme est de développer des substances dérivées mais avec des propriétés sur la masse musculaire et sur l’endurance plus importantes. Ces substances seront développées et d’abord testées sur des cultures de cellules musculaires humaines. La ou les molécules les plus efficaces seront ensuite testées pour lutter contre la diminution de masse musculaire et la perte d’endurance lors d’une immobilisation en utilisant le même modèle de suspension). L’ensemble de ce projet vise donc à la fois des aspects fondamentaux mais aussi appliqués avec le développement d’une nouvelle stratégie de prévention de la perte de masse musculaire et d’endurance. Les effets du modèle de suspension par harnais qui sera utilisé se rapprochent énormément de ceux retrouvés lors d’un alitement clinique chez l’humain et par conséquent la réussite de ce projet pourrait avoir un impact important chez les patients alités et par extension dans les diverses situations entrainant une diminution de l’activité physique (plâtrage, sédentarité) ou dans diverses maladies musculaires impliquant les cibles du composé et de ses dérivés.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet permettront à la fois d’accroitre les connaissances scientifiques en lien avec l’appareil locomoteur et l’inactivité, mais également d’évaluer des mesures concrètes pour en atténuer les effets néfastes en se basant sur de nombreux travaux antérieurs. En effet, l’inactivité est un réel problème en matière de santé publique. Ces expérimentations portent donc sur un axe de recherche primordiale en matière de santé humaine.

Procédures

Tous les animaux subiront 3 prélèvements de sang sur animal vigile en respectant les recommandations en termes de volume, de fréquence et de site de prélèvement. Les animaux réaliseront ensuite des tests non invasifs. Pour les qualités d'endurance, 2 tests seront réalisés sur tapis roulant à savoir le test de VMA (vitesse maximale aérobie) qui dure une vingtaine de minutes et le test de temps limite qui dure entre 30 et 60 minutes en général. L’étude de la composition corporelle dure 2 min. Le test de force d’agrippement dure une quinzaine de minutes (3 séries de 5 essais de 2-3 secondes entrecoupées de 5 minutes de récupération). L'ensemble des tests seront réalisés 3 fois au cours de la procédure à raison d'une fois par semaine sur 3 semaine distinctes (avant le début du traitement, après le traitement et après la suspension). L'ordre des tests au cours des 3 périodes de test sera la suivant. Le test de composition corporelle sera réalisé 3 fois au cours de la procédure. Il sera réalisé une fois le premier jour de chacune des 3 semaines de test. Le test d’agrippement est réalisé au jour 2. Le test de vitesse maximale aérobie est réalisé à 3 jours et le test d’endurance est réalisé à 5 jours pour permettre un repos complet de l’animal.

Impact sur les animaux

La principale nuisance à laquelle vont être soumis les animaux durant l’expérimentation sera le stress lié à l’inactivité induite par le modèle de suspension des pattes arrières qui peut entrainer sur les premières 48h une perte de poids ainsi que des bouchons d’urine. Les animaux seront aussi stressés lors des tests fonctionnels sur tapis roulant (3 tests de 20-30 minutes espacés de 2-3 semaines) et ou pendant l’évaluation de la force d’agrippement (3 tests de 5 répétitions d’agrippement durant 2-3 secondes chacune espacés de 2-3 semaines) ainsi que lors des 3 prélèvements sanguins au niveau de la veine de la queue. De plus, lors des 3 prélèvements sanguins, les animaux pourrait ressentir une légère douleur au moment de l'introduction de l'aiguille dans la veine caudale.

Devenir

A la fin des expérimentations, les animaux sont euthanasiés pour permettre les différents prélèvements de tissus pour analyses.

Remplacement

Dans le cadre de ces expérimentations très spécifiques, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d’animaux étant donné l’absence de modèle cellulaire permettant de mimer les effets corps. De plus, ces expérimentations ne peuvent pas être directement réalisées chez l’homme. L’utilisation d’animaux est donc ici une étape obligatoire mais également extrêmement enrichissante du point de vue scientifique de par les résultats pré-cliniques très précieux qu’elle génère.

Réduction

Ces expérimentations ont été adaptées pour diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés aux moyens de trois axes de réductions. Le premier axe consiste à regrouper les procédures de 2 équipes de recherches lors d’une unique expérimentation animale, réduisant ainsi par 2 le nombre de rats qui aurait été classiquement employé. Le deuxième axe consiste à utiliser les mêmes animaux pour obtenir des données fonctionnelles et des données cellulaires et moléculaires permettant là encore de réduire le nombre de rats par 2 sans affecter la qualité des résultats. Enfin, le troisième axe consiste à réduire le nombre d’animaux par groupe au moyen d’analyses statistiques réalisées préalablement avec un logiciel.

Raffinement

Du point de vue du raffinement, les procédures engagées durant l’expérimentation n’entraînent pas de douleurs spécifiques. Pour les tests physiques réalisés sur tapis roulant, les animaux y sont préalablement habitués progressivement pour réduire le stress induit. L’animal est libre de cesser de courir. Les différents composés sont intégrés dans la nourriture pour éviter toute injection ou gavage. Les procédures de suspensions par harnais sont validées et optimisées, et des soins quotidiens sont réalisés pour prévenir toutes complications. De plus, les rats seront hébergés par deux dans une même cage pour éviter l’isolement social. Pour éviter le refroidissement, la température de la pièce d'élevage sera de 24-25° et les animaux auront à disposition de la ouate pour réaliser leur nid. Chaque phase de l’étude possède également des points limites et critères d’arrêts strictes en cas d’évènements potentiellement néfaste du point de vue des animaux en ce qui concerne la douleur, le mal-être etc. Les suivis quotidiens des animaux, des poids corporels et la consommation de nourriture sera un paramètre intégré à nos protocoles. Enfin, pour permettre les prélèvements finaux des différents tissus d’intérêt, les animaux sont anesthésiés avant d’être mis à mort pour éviter toute douleur.

Choix des espèces

Le rat Lewis est privilégié pour de plusieurs raisons. Les espèces murines rat et souris sont des espèces se rapprochant de l'humain en ce qui concerne le système musculaire. Cette espèce est de même plus petite et moins lourde que les rats Wistar nous permettant d’utiliser le modèle de suspension par harnais en toute sécurité. Enfin, ces expérimentations se feront sur des rats femelles, afin de combler le manque de résultats sur ce sexe. Les animaux seront utilisés entre 11 et 22 semaines d’âge. L’expérimentation commencera à 12 semaines car à partir de cet âge la croissance musculaire des rats Lewis devient très lente.