Multisystémique

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Elles reçoivent des injections de vecteurs par plusieurs voies et des prélèvements de sang à la queue, l'effet étant lu à travers une baisse provoquée de leur température corporelle, pour évaluer des molécules censées franchir la barrière du cerveau. Le porteur reconnaît un risque de choc immunitaire, de réaction allergique ou de détresse cardio-respiratoire, tout en pariant sur l'absence d'effet à court terme. Les animaux sont tués par exsanguination sous dose létale d'anesthésique pour prélever sang et tissus.

Objectifs

Les neuropathies, myopathies, et maladies rares font partie des causes majeures de handicaps sévères dans le monde et, à l'heure actuelle, les besoins médicaux actuels restent très insatisfaits, sans aucuns traitements curatifs, ou palliatifs. Les maladies neurodégénratives telles qu’Alzheimer ou démences associées, les maladies lysosomales, les myopathies (Duchenne) sont des exemples d'enjeux de santé publique. Ces dernières années, les recherches privées et publiques ont augmenté leurs efforts de recherches, suscitant de grands espoirs pour les patients malades et leurs familles. Cette demande de projet s’inscrit dans cette dynamique, avec pour objectif d’améliorer et de proposer à terme des perspectives thérapeutiques. Le savoir-faire de la société consiste en la conjugaison de peptides vecteurs à des pro-drogues ou molécules en cours de développement, voire déjà utilisées sur le marché, mais dont l'efficacité reste insuffisante ou encore à démontrer. En effet, la plupart des médicaments restent inefficaces par manque de passage et d'accès au région ou organes à traiter. La maladie d’Alzheimer est un de ces exemples de neuropathies majeures, pour laquelle aucun traitement efficace n’existe, tout comme bon nombre de pathologies périphériques ou cancers. L’objectif principal de notre société sera donc de proposer de nouvelles formulations capables de reconnaitre des partenaires endogènes spécifiques (récepteurs cellulaires) et d'utiliser leurs mécanismes naturels de trancytoses pour traverser les barrières cellulaires, protectrices des régions et organes sensibles de l'organisme. Dans notre cas, il s'agira en priorité du passage de la Barrière HématoEncéphalique (BHE) vers le système nerveux central (SNC). Par ce principe, nous pouvons passer naturellement ces barrières et amener in situ le médicament par la technique du cheval de Troie. Un avantage considérable qui permet de concentrer les médicaments au niveau des tissus à traiter et ainsi, de potentialiser les chances de traitements. Cette demande de projet s'inscrit dans ce contexte, en développant et optimisant nos molécules-vecteurs (VHH : Domaine variable chaine lourde Anticorps) pour améliorer la délivrance d’agents thérapeutiques. Par des approches systémiques, en administration intra-veineuses ou dermiques, en sous-cutanées, nous tenterons d’améliorer le potentiel d’actions de nos vecteur-médicaments, sur lignée murine consanguine (C57BL/6J) et génétiquement modifiée pour un récepteur cible.

Bénéfices attendus

En ce qui concerne la partie expérimentale, notre procédure met en avant la sensibilité d’action de nos VHH et les faibles quantités administrées (3R : raffinement), ce qui réduit également les risques de toxicités pour les animaux. Le faible nombre d'individus et l'optimisation des tests mettent en avant l'importance et la nécessité de bien caractériser la procédure. D'un point de vue médical, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos Vecteurs médicaments (VHH) constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Procédures

Au cours de notre procédure, nous allons manipuler les animaux en vigile, ce pour toutes les administrations (administration i.v. 5.5ml/kg ; i.p. ou s.c.10ml/kg) ou prélèvements de sang intermédiaires (Prélèvement caudal ≤50 μl). Les administrations, rapides (quelques secondes) et précises, se feront sous forme de bolus ou injections répétées. L’expertise des expérimentateurs garantit la rapidité du geste et de la manipulation sans stress. De même, le prélèvement intermédiaire, en caudal (PI) (≤ 50 microlitres) sera réalisé en 1 seule fois. L'animal sera alors placé et immobilisé en contention spécialisée, puis, par une légère et micro-incision cutanée de l’extrémité de la queue (idem biopsie génotypage), le sang sera collecté sur tube hépariné (10UI/ml) ou EDTA, à raison de 2-3 gouttes de 50 µl de sang. En point final de la procédure, les animaux seront euthanasiés pour l’exsanguination et les prélèvements de tissus/organes. Les prélèvements finaux en post-mortem (exsanguination, prélèvements tissulaires) se feront sur animal euthanasié : anesthésié/analgésié à dose létale (Kétamine 150 mg/kg ; Xylazine 15 mg/kg), aiguille 25G (‘’5/8’’ ; 0.5*16mm), environ 10 minutes avant la fin de la cinétique. Donc ici, pas de procédures chirurgicales avec réveil, seulement une euthanasie et prélèvements sur du post-mortem.

Impact sur les animaux

Dans ce projet nous proposons d’étudier nos VHH sur des temps d’incubation relativement courts. D’une part, sur un read-out de la thermorégulation corporelle, pour valider le passage spécifique à travers la barrière hémato-Encéphalique du cerveau. D’autre part et sur les mêmes animaux, une biodistribution plus précise et quantifiable de nos VHH sélectionnés, et/ou une mesure d’efficacité, par dosage des quantités d’ANRm rémanentes dans les organes ou tissus d’intérêts. Les cinétiques d'incubations (maximum quelques jours) ne suffisent pas à générer d'effets indésirables ou de conséquences physiologiques, notamment, car les conjugués administrés présentent une demi-vie relativement courte, de quelques minutes à quelques heures. Le principal risque se trouve être la réaction immunitaire aigüe et spontanée. Dans le cadre de nos recherches, ces problématiques sont étudiées en amonts et en post-expérimentales (immunogénicité) couplée par de la littérature, ainsi que de notre expertise chimie et in vivo. Les composés VHH administrés aux souris ne doivent pas présenter de toxicité. Le savoir-faire de la société et les données issues de la littérature nous permettent d'anticiper les principaux risques de toxicité, couramment observés post-administration (choc immunitaire (anaphylactique) ; réaction allergique ; détresse cardio-respiratoire ; modification et troubles comportementaux). Dans le cadre de nos études, les conjugués VHH pourront être couplés à des peptides, drogues, ou autres, tel que de petits ARN interférents (siRNA). Ces derniers nous intéressent particulièrement, car leur rôle sera de bloquer en amont les ARN messagers responsables de l’expression de protéines impliquées dans l’apparition symptomatique de certaines pathologies. Notre étude, sur fond standard C57BL/6J et lignée hTfr (même fond ; cf. Annexe 2), permettra de mieux comprendre et appréhender les disfonctionnements physiologiques, sans que pour autant nos conjugués VHH n'aient, à court termes, d’effets sur la santé et le bien-être animal (3R : raffinement). Malgré ces précautions, une observation comportementale des animaux sera faite de manière quotidienne, à la recherche du moindre signe de souffrance (cf. Procédure, annexe1 MGS), le tout accompagné d'un suivit du poids des animaux entre le début et la fin des cinétiques, afin de s'assurer que les animaux ne perdent pas plus de 10% de poids initial.

Devenir

A l'issue de la procédure (biodistribution) les animaux seront euthanasiés pour réaliser les prélèvements de sang et tissus (Dose létale d'anesthésique en intrapéritonéal ; Kétamine 150 mg/kg ; Xylazine 15 mg/kg). Si des problèmes ou souffrances anormales sont rencontrées en cours de procédure, alors les animaux seront immédiatement sédatés par la même solution d’anesthésique à dose létale, suivit d’un sacrifice par une dislocation des cervicales.

Remplacement

Pour mener à bien nos modèles précliniques après validation in vitro, nous envisageons de réaliser des expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, modèle indispensable pour l’étude des mécanismes in situ (3R : remplacement). Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique. Le modèle vivant, ici la souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres physiologiques, mécanistiques et homéostasiques, indispensables pour étudier une efficacité pharmacologique chez les mammifères. Le principal désavantage concerne donc le recours à l’utilisation d’animaux. Il s’agit pour cela de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus. Les faibles cohortes d'animaux permettront, malgré tout, d’obtenir un maximum de résultats, suffisant pour l’obtention de données statistiques significatives (3R : remplacement et réduction).

Réduction

L’optimisation de nos vecteurs en fonction de la voie d’administration permet d'envisager une médication optimisée et réduite (doses moins importantes), limitant de ce fait les possibles effets secondaires non souhaités (Raffinement), mais aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure (Réduction). Le nombre total d’animaux se répartit sur de petits groupes de n=4, à raison de 240 souris/an, réparties sur 3 études de 80 individus (10 groupes sur fond C57BL/6J et 10 groupes sur fond mutant hTfr), suffisant pour appréhender un effet de la sélection de conjugués sur les souris des 2 lignées. Cette estimation a été faite d’après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par la société. Pour une analyse statistique, le faible « n » (4 individus) nous orientera vers des modèles non-paramétriques. Sur de l’expérimentation in vivo, tous les paramètres ne sont pas maîtrisés, et sont basés sur des populations aléatoires de souris ou chaque animal présente des variables individuelles. Nous pourrons réaliser un équivalent du test d’homogénéité entre groupes, un test de Kolmogorov-Smirnov ou encore une analyse de variance (N.S one-way ANOVA). En cas d’analyse dite qualitative, on parlera de succès ou d’échec. Pour la partie échantillonnage et prélèvements de tissus en fin de procédure, une liste précise et déclinée sur plusieurs types de post-expérimentations, permettra d'optimiser chacune des souris, de manière qu'il n'y ait pas d'utilisation abusives et inutiles de souris. La réalisation de prélèvements intermédiaires (Prélèvement caudal ≤50 μl) en cours de cinétique permettra d'obtenir des données plasmatiques supplémentaires, ce qui va également dans le sens d'une optimisation et réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

La formation initiale et l’expérience du personnel permettent d’avoir suffisamment de recul pour appréhender tout signe et/ou comportement caractéristique d’une douleur ou gène chez l’animal (voir points limites Annexe 1 MGS), appuyés si besoin par la présence sur site d’un pharmacien et vétérinaire pour exercer dans le respect des 3R. Comme cité dans cette même partie de la procédure, nous porterons une attention particulière à la phase amont de l’expérimentation qui regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux. Au minimum la veille des tests, les souris sont sorties de l’animalerie dans une pièce cyclée (12h/12h), insonorisée, armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont ainsi maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), avec la même cage (taille standard pour portoir ventilé+couvercle à filtre), un maximum de 4 individus par cage, litières (copeaux de bois) et raffinements (maison en carton et Sizzle-Nest). Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Le choix des cinétiques sera également affiné au plus juste pour éviter de longs tests inutiles et de possibles angoisses supplémentaires. De plus, travaillant sur animal sain (C57BL/6J et C57BL/6J hTfr), la simplicité des administrations uniques ou répétées (administration i.v. 5.5ml/kg (Aiguilles 27G (3/4 ; 0.4/19mm)) ; s.c. 10ml/kg (Aiguilles 26G (‘’3/8’’ ; 0.45*10mm)) et i.p. 10ml/kg (Aiguilles 25G (‘5/8’’ ; 0.5*16 mm))) sur animal vigile et le court laps de temps d’exposition des molécules (cinétique de quelques heures à maximum 1 semaine), nous permettent d’éviter toute apparition potentielle de phénotypes dommageables chez les animaux. Dans cette procédure, nous utiliserons des animaux issus d’élevages extérieurs de chez deux fournisseurs différents.

Choix des espèces

Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières études pré-cliniques. Le développement préclinique nécessite tôt ou tard une première approche in vivo, sur un modèle animal tel que le rongeur, dans notre cas, la souris. C’est le modèle le plus standardisé et utilisé dans la racherche en expérimentation animale, notamment par sa physiologie connue (mammifère) et relativement proche de l’homme. Le modèle rongeur facilite les manipulations, les injections et observations comportementales. Il est aussi plus adapté et intéressant pour la partie pharmacologie (diminution des posologies). En pratique, on l’utilise principalement pour la facilité de mise en place des expérimentations, l’obtention de groupes jusqu’à 6-8 individus sans trop de contraintes de stabulation. Le modèle souris est surtout préférentiel lorsqu’il s’agit de mette en place l'élevage d’une lignée génétiquement modifiée avec une (des) mutation(s) donnée(s), ou encore d'étudier de nombreux modèles de pathologies, plus facilement accessibles. Les animaux seront utilisés pour réaliser des suivis pharmacologiques, des échantillonnages de tissus, organes ou liquides physiologiques, ceci à des fins scientifiques. Pour notre procédure, nous utiliserons des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 8 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter individus, qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Ce stade « jeune adulte » présente un poids moyen de 25-27g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).

192 rats transgéniques HLA-B27 vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent des prélèvements de sang par voie rétro-orbitaire sous anesthésie tous les sept jours jusqu'à J63, pour tester des inhibiteurs d'ERAP contre des maladies auto-immunes comme la spondylarthrite ankylosante. Le porteur indique que l'inflammation de ce modèle reste légère et transitoire, ce qui l'amène à ne prévoir ni analgésique ni anti-inflammatoire. Il présente ces maladies comme relevant d'un fort "besoin médical" et le rat transgénique comme un modèle de référence.

Objectifs

Les ERAPs sont des cibles thérapeutiques intéressantes pour traiter les maladies auto-immunes et auto-inflammatoires. Les ERAP 1 et 2 sont des amino-peptidases intracellulaires (métalloprotéases) chargées de la transformation finale des antigènes peptidiques pour présentation par les molécules du CMH de classe I. Ils régulent ainsi la réponse immunitaire adaptative par les lymphocytes T cytotoxiques (LcT) et affectent l'immunodominance en impactant le répertoire peptidique global présenté par le CMH-I. Ces enzymes ont beaucoup attiré l'attention depuis la première découverte d'ERAP1, puis d'ERAP2. Les enzymes ERAP ont des rôles complémentaires et des fonctions importantes in vivo. Un certain nombre d'haplotypes ERAP sont liés au risque de souffrir de diverses maladies auto-immunes ou auto-inflammatoires, notamment le diabète de type 1 (T1D), la spondylarthrite ankylosante (SA), le psoriasis, la maladie rare de Behçet (BD) et l'uvéite de Birdshot (BU). Plusieurs études (voir état de l'art) ont révélé comment les ERAP modulent l'immunopeptidome dans différents contextes pathologiques. Un obstacle scientifique est la disponibilité de petites molécules inhibitrices d'ERAP efficaces, sélectives et biodisponibles. Aucun inhibiteur d'ERAP n'a été évalué in vivo jusqu'à présent et les rapports sur la modulation de l'immunopeptidome par les composés ERAP ne sont pas disponibles. L'objectif du projet est d'identifier des inhibiteurs pharmacologiques d’ERAP à travers méthodes intégrés de chimie médicinale (du criblage fonctionnel de la présentation de l'antigène combiné au profilage des immunopeptidomes dans les cellules des patients) et l’évaluation préclinique de leur efficacité thérapeutique dans un modèle de rat transgénique HLAB-27. Ce modèle présente une maladie inflammatoire multi-systémique avec un phénotype proche de la clinique des spondylarthropathies humaines, des arthrites réactives et autres maladies. La susceptibilité génétique des rats transgéniques exprimant l’allèle HLA-B27/β2-microglobuline humaine en fait un modèle de choix pour cet objectif.

Bénéfices attendus

Ce projet et les composés identifiés pourraient ouvrir la voie à des traitements personnalisés des maladies auto-immunes/auto-inflammatoires. A terme, nous souhaitons proposer de nouvelles options thérapeutiques pour la spondylarthrite ankylosante et la maladie de Behçet qui sont des maladies à fort besoin médical.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins réalisés en rétro-orbitaire, à partir de J0 et chaque 7 jours après le début du protocole de traitement, jusqu'au sacrifice (J63). Ces prélèvements seront effectués sous anesthésie gazeuse à l'isofluorane 2%. Le volume maximal prélevé sera égal à 500μL. Pour chaque rat, le prélèvement sanguin durera au maximum 5 minutes, y compris la durée de l'anesthésie

Impact sur les animaux

Le rat transgénique HLA-B27 présente une maladie inflammatoire multisystémique avec un phénotype proche de la clinique des spondylarthropathies humaines, des arthrites réactives, et autres maladies. L'apparition et la sévérité des symptômes inflammatoires chez le rat HLA-B27 sont liées à l'environnement extérieur (le microbiote intestinal pathogène est responsable des lésions inflammatoires plus sévères). L'état sanitaire de l'animalerie centrale de l'Institut Pasteur de Lille prévoit un élevage sans pathogènes. Dans ces conditions, notre cohorte de rats HLA-B27 présente des formes légères d'inflammation multisystémique, c'est pourquoi l'utilisation d'analgésiques ou d'anti-inflammatoires n'est pas envisagée. L'inflammation intestinale, ainsi que les douleurs articulaires apparaissent dès la 10ème semaine de vie mais surviennent de manière ponctuelle, discontinue et transitoire (d'une durée variable d'un ou deux jours) et se manifestent, respectivement, par des diarrhées, sans perte de poids et par des douleurs d'articulations, touchant les membres inférieurs, uni ou bilatérale. L'uvéite se manifeste aussi de façon ponctuelle et transitoire avec un dégrée de sévérité très limité. Concernant les molécules candidates qui seront administrés, leur toxicité est préalablement testée par la plateforme ADME de l'institut Pasteur de Lille et leur administration tiendra compte des études de toxicité et de pharmacodynamique afin de ne pas avoir d'effets indésirables qui pourraient interférer avec les résultats de l'expérimentation.

Devenir

A l'issue de la procedure tous les animeaux seront euthanasiés

Remplacement

Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, le criblage d'une série d'inhibiteurs d'ERAP1/2 préalablement modélisés et synthétisés par l'équipe partenaire (Deprez) sera réalisé sur des modèles cellulaires par la plate-forme ADME de l'Institut Pasteur de Lille (incluse dans l'Infrastructure Nationale ChembioFrance), par quantification LCMS-MS. De plus une évaluation de la sécurité sera exprimée sous la forme d'un rapport IC50 et CC50 (test cellulaire à haut contenu d'apoptose ou de nécrose (Caspase-3/7 activité Propidium iodure) et évalué la plateforme Equipex Imaginex. Les inhibiteurs candidats seront préalablement testés par des expériences de pharmacodynamiques afin de garantir une exposition et une voie optimale avant les tests chez les rats HLA-B27.

Réduction

Dans le respect des règles des 3R, le nombre minimum d'animaux sera utilisé pour garantir une analyse statistique correcte prenant également en compte la variabilité de l'expression des gènes. Les paramètres mesurés seront analysés par des tests non-paramétriques pour petits échantillons (tests de Kruskal Wallis, Wilcoxon, Mann-Whitney, et corrélation de Spearman). Le nombre d’animaux par groupe est de n = 8, qui est calculé sur la base de la puissance statistique des tests utilisés (intégrant la dispersion des valeurs individuelles, déterminés auprès de la littérature et suite à des expériences pilotes).

Raffinement

Tout rongeur montrant des signes de douleur ou de mal-être sera euthanasié. Les animaux sont observés et pesés d’une manière quotidienne pour une attention particulière aux points limites suivants: -une modification du comportement (prostration, poils hérissés, cris, blessure) -une perte de poids supérieur à 15%. Le suivi quotidien de l'état de santé des rats permettra d'observer l'apparition et l'évolution des manifestations inflammatoires typiques de ce modèle (uvéite, orchite, douleurs articulaires). Le modèle de rat HLA-B27 est maitrisé au laboratoire depuis plusieurs années et nous avons pu observer que ces types de manifestations inflammatoires sont transitoires (d'une durée maximale d'un ou deux jours) et souvent extrêmement légères et ne sont pas prises en compte comme points limites.

Choix des espèces

Le rat transgénique HLA-B27/β2-microglobuline est, à ce jour, considéré comme un modèle animal de référence des maladies inflammatoires systémiques. Caractérisé par un faible nombre de copies de HLA-B27 et une expression transgénique élevée de la β2-microglobuline humaine, le rat HLA-B27 présente une forte ressemblance clinique et histologique avec les spondylarthropathies humaines, avec arthrite réactive, rhumatisme psoriasique, inflammation articulaire périphérique et axiale, uvéite et l'iritis. Chez l'homme, ces maladies sont fortement associées à l'allèle HLA-B27. Les bases moléculaires de la maladie inflammatoire multisystémique chez les rats HLA-B27 résident principalement dans le stress du réticulum endoplasmique (RE) généré par le mauvais repliement des chaînes lourdes de HLA-B27 avant leur association avec ß2m, avec une accumulation conséquente dans le RE induisant l'activation de la réponse protéique dépliée (UPR), en particulier dans les macrophages. Ces évidences soutiennent la pertinence du modèle HLA dans l'évaluation de l'effet thérapeutique des inhibiteurs d'ERAP. L'utilisation des rats non transgéniques (nTg-Fisher 344) de la même colonie sera justifiée par la nécessité de comparer d’un côté la difference du niveau d’inflammation entre les rats HLA-B27 et les rat wild-type et d’un autre coté les effets des molécules testées dans un modèle non inflammatoire.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Une partie reçoit une injection abdominale de substance inflammatoire avant mise à mort à quatre jours, l'autre des injections de peptides deux fois par semaine pendant six à douze mois, tous les prélèvements étant faits après euthanasie. Le porteur affirme que les traitements testés, aux effets "anti-inflammatoires et anti-oxydants", devraient améliorer l'état des animaux et n'entraîner aucune souffrance particulière. Il indique avoir prévu des étapes in silico et in vitro, mais soutient que les lignées cellulaires ne conviennent pas à l'étude du vieillissement.

Objectifs

Le vieillissement est l'une des principales causes du développement de nombreuses maladies chroniques liées à l'âge. La compréhension des mécanismes impliqués dans les altérations fonctionnelles au niveau cellulaire et tissulaire ainsi que le développement de stratégies préventives et/ou thérapeutiques permettant de limiter les effets délétères de l'âge sont ainsi devenus des enjeux majeurs de santé publique. Sous l'effet de différents inducteurs intrinsèques et/ou environnementaux, le vieillissement se caractérise notamment par l'accumulation progressive au sein de l'organisme d'altérations cellulaires et d'une inflammation chronique. Dans ce contexte, notre objectif est de prévenir voire limiter l'apparition des marqueurs du vieillissement et de l'inflammation dans le contexte de l'âge. Nous nous intéressons plus particulièrement aux effets d'une protéine aux propriétés anti-oxydantes et anti-inflammatoires largement démontrées. Avec l'âge, cette protéine peut être clivée conduisant à la perte de l'effet anti-oxydant et exerçant un effet pro-inflammatoire. Ce clivage, augmentant avec l'âge, l'utilisation de la protéine non clivée comme outil thérapeutique dans ce contexte reste limité. Nous avons ainsi développé des peptides dérivés de cette protéine. Les objectifs de notre projet sont d'une part d'analyser les effets de ces peptides sur le vieillissement cellulaire et de comprendre les mécanismes du clivage protéique mis en jeu au cours de l'âge d'autre part. Ceux-ci sont essentiels au développement de nouvelles approches thérapeutiques visant à limiter le vieillissement et les maladies qui lui sont associées.

Bénéfices attendus

Compte-tenu du vieillissement de la population et de l'augmentation des pathologies qui lui sont associées, le développement de traitements préventifs et/ou thérapeutiques est devenu un enjeu majeur de santé publique. Dans ce cadre, nous nous intéressons à une protéine au potentiel thérapeutique important dans de nombreuses pathologies liées au vieillissement. Cependant, les précédentes études la concernant ont été réalisés dans des modèles biologiques mais pas dans le contexte du vieillissement. Par ailleurs, son clivage, qui augmente chez les individus âgés, conduit à penser que son utilisation thérapeutique est compromise dans ce cas de figure. Notre projet propose 2 approches complémentaires pour optimiser les bénéfices thérapeutiques de cette protéine. La caractérisation des effets anti-inflammatoire, anti-oxydant et anti-vieillissement de peptides dérivés de cette protéine doit permettre le développement de nouveaux traitements pour la prévention et la thérapie des maladies liées à l'âge. Par ailleurs, l'identification des mécanismes impliqués dans la formation de la protéine clivée pro-inflammatoire pourra également conduire au développement d'inhibiteurs spécifiques pour limiter le clivage et l'inflammation liée à l'âge qui en découle.

Procédures

La 1ère partie du projet nécessite d'isoler des cellules à partir des animaux. Afin d'augmenter le nombre de cellules isolées par animal et de de réduire le nombre d'animaux utilisés, ceux-ci doivent subir l'injection unique d'une substance inflammatoire au niveau abdominal. La durée de cette intervention est de 5 secondes maximum. Les animaux sont euthanasiés 4 jours après injection selon une méthode réglementaire. La 2ème partie de notre projet vise à étudier les effets anti-vieillissement et anti-inflammatoire de peptides dans le contexte de l'âge. Pour les animaux utilisés dans cette procédure, une solution contenant ces peptides sera injectée au niveau abdominal 2 fois par semaine sur une durée de 6 à 12 mois. La durée de chaque injection est de 5 secondes maximum. Les prélèvements biologiques seront tous effectués sur animaux euthanasiés.

Impact sur les animaux

Les 2 procédures nécessitent des injections au niveau abdominal qui peuvent être source d'inconfort et de douleur légère passagère au moment de l'injection. Toutefois, les injections sont réalisées dans des conditions adaptées pour limiter ce phénomène (volume injecté, taille de l'aiguille, angle d'inclinaison de l'aiguille, fréquence des injections). Concernant l'injection unique de la substance qui permet d'isoler un nombre optimisé de cellules par animal, aucun effet ne devrait être observé dans la mesure où les animaux sont euthanasiés dans un délai relativement court après injection (4 jours). Concernant l'injection des peptides, aucune souffrance n'est à prévoir pour l'animal dans la mesure où les animaux seront euthanasiés avant tout prélèvement biologique. Par ailleurs, en accord avec leurs effets anti-inflammatoires et anti-oxydants, les injections devraient améliorer l'état physiologique de l'animal à un âge avancé. Il n'est donc pas attendu de souffrance particulière liée à ce traitement.

Devenir

Les prélèvements et analyses biologiques doivent être réalisés post-mortem, ce qui nécessite l'euthanasie de l'ensemble des animaux.

Remplacement

La caractérisation des effets anti-inflammatoire, anti-oxydant des peptides dans le contexte de l'âge est dans un premier temps réalisé in vitro sur des cultures de cellules isolées à partir de souris. Les études expérimentales sur cellules in vitro peuvent généralement être réalisées sur des lignées cellulaires capables de proliférer rapidement er résistantes aux altérations du temps mais cela est strictement impossible ici dans la mesure où l'objectif de l'étude vise à analyser des paramètres liés au vieillissement. Les lignées cellulaires ne sont donc pas des modèles appropriés pour ce type d'étude. Concernant l'identification des mécanismes impliqués dans le clivage de notre protéine anti-inflammatoire, la problématique est identique. Nous proposons également de débuter notre étude par des approches informatiques in silico ainsi que par des réactions de clivage in vitro en utilisant des séquences protéiques ne nécessitant aucun animal. Ces approches permettront de remplacer l'utilisation d'animaux par des méthodes de substitution.

Réduction

Ce projet nécessite l'utilisation de 240 souris. La taille des effectifs a été optimisée grâce à l'utilisation d'un calcul de puissance permettant de s'assurer de l'obtention de résultats fiables à l'issue de l'expérience. La fiabilité de ces résultats sera confortée par une analyse statistique adaptée.

Raffinement

Ce projet visant à étudier des substances à effets préventifs/thérapeutiques sur le vieillissement, il est important de veiller au bien-être de l'animal et de limiter tout stress qui pourrait entrainer un biais dans les résultats obtenus. Ce projet visant à étudier des effets préventifs/thérapeutiques sur le vieillissement, il est important de veiller au bien être de l'animal et de limiter tout stress qui pourrait entrainer un biais dans les résultats obtenus. Les animaux proviennent d’un éleveur agréé. Les animaux sont acclimatées pendant une durée minimale de 8 jours après leur arrivée. L’hébergement est assuré en cages enrichies (nid végétal et/ou buchettes) à raison de 5 animaux par cage mais d'éventuels désagréments observés au cours du projet et inhérents à la promiscuité avec les autres animaux pourront nous conduire à réduire ce nombre. Les animaux seront sous surveillance avec un accès facilité à la nourriture et à l'eau. Une surveillance quotidienne sera exercée pour s’assurer du bon état général des animaux. Les personnels de zootechnie sont formés à l’observation des animaux et tout signe de mal-être est immédiatement signalés au responsable du projet qui prend la décision sur leur devenir, en accord avec le vétérinaire référent si nécessaire. Nous évaluerons l’inconfort, la douleur, la souffrance et l’angoisse ou le stress engendré par la procédure expérimentale sur les souris. Des points limites observables sans processus invasif ont été définis : hérissement des poils, agressivité, immobilité, prostration, déshydratation, troubles de la marche, dos vouté, grimaces faciales, yeux larmoyants, perte de poids de 20% (animaux pesés quotidiennement ou toutes les semaines selon la procédure), atrophie musculaire, troubles du comportement alimentaire, troubles respiratoires visibles (fréquence respiratoire augmentée, essoufflement). Dans le cas où un de ces points limites est atteint, nous réduirons la durée de l’étude et les animaux concernés seront euthanasiés afin de réduire la souffrance.

Choix des espèces

Compte-tenu des résultats précédents issus de la littérature scientifique à propos du vieillissement et des maladies liées à l'âge, il apparait que la souris est largement utilisée. Il est donc important, dans le cadre de notre projet, d'utiliser ce même modèle pour lequel nous de nombreuses données sont déjà publiées. Par ailleurs, il existe de nombreux modèles de souris de maladies liées à l'âge (maladies cardiovasculaires, obésité/diabète...) et les perspectives thérapeutiques de notre étude vis à vis de ces pathologies nécessite de privilégier le modèle murin.

7 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit des injections de vecteurs-médicaments et des prélèvements de sang à la queue, avant d'être tué par une dose létale d'anesthésique pour prélever sang et organes et mesurer la distribution des composés. Le projet, mené par une société, prévoit d'utiliser environ 1 200 souris par an pour valider ses candidats-médicaments. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucune modélisation prédictive ne remplace le modèle murin et le présente comme "l'idéal" et le plus facile à mettre en place.

Objectifs

Plusieurs stratégies sont en cours d’exploration pour faciliter le passage et l'adressage de biomolécules vers les tissus et organes cibles. Parmi ces stratégies, on trouve le développement de molécules-vecteurs qui améliorent la biodisponibilité et le passage d’agents thérapeutiques, notamment à travers la Barrière Hémato-Encéphalique (BHE) du cerveau. Ainsi, grâce à la reconnaissance spécifique d’un partenaire ou d’un récepteur (protéine), le complexe vecteur-médicament pourra reconnaître sa cible et franchir cette barrière pour agir dans le parenchyme nerveux. Le réseau sanguin irrigant étroitement la totalité de l’organisme, ce principe de délivrance pharmacologique peut s’appliquer à tout type de tissu ou organe périphérique. Notre société développe de peptides vecteurs (peptides, fragments d’anticorps), conjugués avec différentes classes de molécules (agents d'imagerie, drogues thérapeutiques, siRNA) et proposés comme potentiels candidat-médicaments VHH. Dans notre cas, des peptides, drogues, ou dernièrement de petits ARN interférents (siRNA), dont la finalité sera de bloquer en amont les ARN messagers responsables de l’expression de certaines protéines impliquées dans l’apparition symptomatique de certaines pathologies. Les études sur sujets sains permettent notamment de mieux comprendre et appréhender leurs disfonctionnements, sans que pour autant elles n’aient à court termes d’effets sur la santé et le bien-être animal. Dans ce projet (procédure 1) nous proposons d’étudier à différents temps d’incubation, la biodistribution de nos vecteurs conjugués (VHH) et/ou leurs efficacités, par mesure des quantités d’ANRm rémanentes dans les organes ou tissus d’intérêts. L'assurance de l'innocuité de nos conjugués VHH par des études d'immunogénicité, nous amène à doser certaines protéines plasmatiques et, rapporté à une gamme de référence (procédure 2), à quantifier et identifier toute apparition d'une inflammation.

Bénéfices attendus

Parmi les avantages de nos procédures, on retrouve la sensibilité d’action de nos VHH et les faibles quantités administrées (posologies), qui seront de fait dans ce projet, revues à la baisse par rapport aux autres thérapies plus lourdes, actuellement utilisées (3R : raffinement). Egalement, qui dit doses moindres, dit, risques de toxicités moindres pour les animaux. Le potentiel de ciblage thérapeutique et l'innocuité de nos Vecteurs médicaments constituent en soit les principaux objectifs de nos recherches, dont les conséquences, par le bénéfice thérapeutique, peuvent jouer un rôle considérable dans le milieu médical et surtout, à terme, sur le quotidien des patients.

Procédures

Au cours des 2 procédures, nous allons manipuler les animaux en vigile, au cours des administrations (administration i.v. 5.5ml/kg ; i.p. ou s.c.10ml/kg) et des prélèvements de sang intermédiaires (Prélèvement codal ≤50 µl). Puis, dans un deuxième temps; en post-mortem, pour l’exsanguination et les prélèvements de tissus/organes. -Les administrations, rapides (quelques secondes) et précises, se feront sous forme de bolus ou bolus répétés. L’expertise des expérimentateurs garantit la rapidité du geste et de la manipulation sans stress. -De même, le prélèvement intermédiaire, en caudal (PI) (≤ 50 microlitres) sera réalisé en 1 seule fois, sur un temps intermédiare : L'animal sera placé et immobilisé en contention spécialisée, puis, par une légère et micro-incision cutanée de l’extrémité de la queue (idem biopsie génotypage), le sang sera collecté sur tube hépariné (10UI/ml) ou EDTA, à raison de 2-3 gouttes 20 microlitres de sang. Nb : Seuls les temps longs nécessitent un prélèvement intermédiaire. Par la suite, les prélèvements (exsanguination, prélèvements tissulaires) se feront sur animal euthanasié en post-mortem : anesthésié/analgésié à dose létale (Kétamine 150 mg/kg ; Xylazine 15 mg/kg); Aiguilles 25G (‘5/8’’ ; 0.5*16 mm) environ 10 minutes avant la fin de la cinétique. Donc ici, pas de procédures chirurgicales avec réveil, seulement une euthanasie et prélèvements sur du post-mortem.

Impact sur les animaux

Les composé VHH administrés aux souris ne doivent pas présenter de toxicité avérée. En cas de souffrances, choc, ou effets indésirables en cours de cinétique (les animaux sont quotidiennement suivits et annotés), une procédure spéciale d'euthanasie à forte dose d'anesthésiques est prévue (cf. 5.6.1). Pour notre 2ème procédure, les quantités de LPS administrées sont largement inférieures au quantitiés rapportées comme toxiques voire létales dans la bibliographie et ces tests communs et standardisés restent significativements en dessous de la DL50, de 10mg/kg.

Devenir

A l'issue de la procédure (fin cinétique d'incubation des vecteurs médicaments ou de cinétique d'endotoxémie) les animaux seront euthanasiés pour réaliser les prélèvements de sang et tissus (Dose létale d'anesthésique en intrapéritonéal; Kétamine 150 mg/kg ; Xylazine 15 mg/kg); Aiguilles 25G (‘5/8’’ ; 0.5*16 mm)

Remplacement

Pour mener à bien notre modèle préclinique, nous envisageons après validation in vitro de réaliser des expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, indispensable pour l’étude de ces mécanismes (3R : remplacement). Actuellement, le modèle murin ne peut pas encore être remplacé par des modélisations prédictives ou autres alternatives de remplacement. Seul le modèle animal mammalien et proche de l'homme permets de prendre en compte les mécanismes physiologiques pour prédire du comportement d'un médicament, d'un modèle thérapeutique et de son efficacité. Dans ce contexte, le modèle murin, ici la souris, reste l'idéal et surtout, le plus facile à mettre en pace pour ce genre de procédures.

Réduction

Procédure : Le nombre d’animaux ou groupe expérimental nécessaire à l’obtention d’une significativité statistique (Réduction, règle des 3Rs) se fera sur de petits groupes (n=4 à raison de 1200 souris/an en procédure 1 et 240 souris/an en procédure 2), suffisant pour appréhender un effet des conjugués sur les souris. Cette estimation a été faite d’après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par la société. Pour une analyse statistique, le faible « n » (4 individus) nous orientera vers des modèles non-paramétriques. Sur de l’expérimentation in vivo tous les paramètres ne sont pas maîtrisés, et sont basés sur des populations aléatoires de souris ou chaque animal présente des variables individuelles. Nous pourrons réaliser un équivalent du test d’homogénéité entre groupes, un test de Kolmogorov-Smirnov ou encore une analyse de variance (N.S one-way ANOVA). En cas d’analyse dite qualitative, on parlera de succès ou d’échec.

Raffinement

Comme cité dans cette même partie de la procédure, nous porterons une attention particulière à la phase amont de l’expérimentation qui regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux. Au minimum la veille des tests, les souris sont sorties de l’animalerie dans une pièce cyclisée (12h/12h), insonorisée, ventilée, sous température et hygrométrie contrôlée, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont ainsi maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), avec la même cage, litières et raffinements (dômes, tunels). Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Le choix des cinétiques sera également affiné au plus juste pour éviter de longs tests inutiles et de possibles angoisses supplémentaires.

Choix des espèces

Toutes études de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique ou pharmacocinétique, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l'heure actuelle aucune alternative qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions mécaniques et physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. La partie développement de nos VHH ne peut être réalisée que par une approche in vivo pour réellement mesurer le bénéfice des conjugués développés. L'utilisation de rongeurs (ici, n= 1200 souris/an) impose la prise en compte de la règle des 3 R, la conformité vis à vis des recommandations (Article R. 214-105, code rural et pêche maritime) et cahier des charges.