Multisystémique
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Étude des fonctions de modifications du squelette cellulaire et leur implication dans les pathologies
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
5 209 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse de leurs organes, dans des procédures relevant de la gravité sévère ou menées sous anesthésie sans réveil. Une partie ne subit qu'un suivi de son état clinique, d'autres une ouverture du thorax sous anesthésie profonde sans reprise de conscience, pour étudier la régulation du squelette des cellules. Le porteur signale qu'une souche présente une ataxie et que l'état des nouvelles lignées créées reste inconnu à l'avance. Il justifie l'usage de la souris par l'étude de ces mécanismes au niveau de l'"organisme entier".
Objectifs
Ce projet a pour but d’analyser les rôles et les fonctions de différents aspects de la régulation du squelette cellulaire (cytosquelette): d’un côté ses composantes propres, de l’autre les éléments qui interagissent avec lui, au niveau de l’organisme entier, la souris. Le cytosquelette étant impliqué dans de nombreuses fonctions cellulaires, sa régulation est susceptible d’avoir des effets sur de nombreux processus cellulaires, qui, perturbées, pourrait avoir des répercussions sur la bonne survie de l’organisme entier. Ainsi, comprendre la régulation du cytosquelette et pouvoir l’influencer, permettra d’élucider son impact sur le maintien de la survie cellulaire et, comment sa dérégulation participe au développement de maladies. A terme, ce projet permettra de développer les moyens de dépistage et de nouvelles thérapies ciblant les maladies reliées à la dérégulation du cytosquelette. Le cytosquelette est présent dans toutes les cellules, ou il exerce des rôles très divers : il donne aux cellules leur forme, participe au mouvement des cellules et au transport intracellulaire, rend possible la division cellulaire et le déplacement de spermatozoïdes lors de la fécondation. Le cytosquelette interagit avec de nombreuses protéines qui contrôlent ses fonctions. Une des hypothèses suggère que le choix des éléments utilisés pour construire le squelette cellulaire et les modification de ces éléments constituent un code, qui définit ses propriétés et influence les interactions avec les autres protéines spécifiant ainsi ses fonctions. Le présent projet est une continuation d’un projet précèdent, qui a permis de démontrer le rôle essentiel de la régulation du cytosquelette dans la survie des neurones et dans la fertilité. Nous proposons maintenant d’étendre notre analyse à d’autres modèles murins de ce code de cytosquelette.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre les rôles des mécanismes de régulation du cytosquelette. Étant donné que le cytosquelette a des fonctions essentielles dans toutes les cellules, cela suggère que sa régulation pourrait être impliquée dans le développement normal de l’organisme. Inversement, les défauts de cette régulation pourraient être à l’origine de maladies telles que les neurodégénérescence, cancer ou infertilité. Cette étude vise à éclaircir le mode d’action de ces mécanismes de régulation du cytosquelette et de développer les moyens de dépistage et les traitements des pathologies liées à sa dérégulation.
Procédures
Les animaux sont soumis à une analyse phénotypique (analyse de l’état clinique des animaux) pendant leur vie mais ne subiront aucune intervention. A différents âges, les animaux seront anesthésiés et ensuite mis à mort pour fixation de leurs organes.
Impact sur les animaux
Une des souches murines utilisée dans ce projet a été décrite comme ataxique, c'est à dire qui présente des problèmes de coordination de mouvements. Pour les nouveaux modèles qui seront générés dans le cadre de cette étude, la condition des animaux n’est pas connue à l’avance. Les nuisances subies par les animaux seront celles liées à une thoracotomie sous anesthésie générale profonde. Les nuisances s'arrêteront en fin de chirurgie (procédure sans réveil).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyses de leurs organes
Remplacement
Après les premières étapes d'analyse des enzymes, impliquant la culture cellulaire (expression d’enzymes dans les lignées cellulaires et observation de leurs activités), le projet a pour but maintenant de comprendre la fonction de ces enzymes et leur mécanisme d’action au niveau de l'organisme vivant intégré et autonome, la souris.
Réduction
Les animaux générés lors de ce projet seront utilisés à la fois pour l’analyse phénotypique et pour l'analyse de leurs organes, permettant de réduire le nombre total d’animaux. Le nombre d’animaux nécessaires à la bonne exécution de ce projet sera suffisant pour obtenir les résultats statistiquement significatifs. Les croisements seront optimisés pour produire les animaux d'intérêt. Les animaux contrôles proviendront des mêmes portées que les animaux d’intérêt.
Raffinement
Les animaux seront surveillés deux fois par semaine minimum. Tout signe de mal-être, tel que la perte de poids, blessure, mauvaises relations sociales sera détecté et l‘animal sera soigné et soit isolé, soit mis à mort. Les soins peuvent inclure l’application d’une crème désinfectante (blessure) ou d’un complément nutritif (perte de poids). Une grille de score est mise en place pour le suivi clinique des animaux.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en biologie du développement, de cancer et de la neurodégénérescence. Les modèles génétiquement modifiés des éléments de cytosquelette, protéines interagissant avec le cytosquelette et les enzymes impliquées dans la régulation du cytosquelette permettent de définir leurs rôles dans ces différentes maladies. Du fait de la parenté biologique avec l’Homme, les modèles murins sont d’excellents modèles de différentes pathologies. Les analyses seront effectuées à 6 différents âges : nouveau-né, 1 mois (animal jeune), 4 mois (animal adulte), 12 mois (animal âgé) et 18 et 24 mois (animaux très âgés). En effet, les niveaux de modifications changent au cours du développement de l’organisme. De plus, certains mutants devront être analysés très âgés, vu que l’on veut observer la dégénérescence liée à l’âge chez ces animaux. Les analyses de certaines lignées (à phénotype non-dommageable uniquement) nécessiteront la génération d’embryons au stade embryonnaire E14.5 ou E17.5 (soit 14,5 jours-post fécondation ou 17,5 jours post-fécondation) E14.5 ou E17.5. En effet à partir d’embryons de ces âges (en jour post-fécondation) il est possible de cultiver les cellules primaires nécessaires pour l’étude de mécanismes cellulaires impliqués.
Étude de la circulation des cellules ILC2s au cours de l’inflammation de type 2.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système respiratoire
176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont jointes chirurgicalement deux par deux par parabiose, opération d'environ 45 minutes créant une circulation sanguine commune, puis reçoivent des injections et des prélèvements de sang au sinus rétro-orbital sous anesthésie. Le porteur décrit un protocole "parfaitement maîtrisé" et une "absence de signes quantifiables de souffrance". Il étudie la circulation de cellules immunitaires liées à l'asthme et renvoie les applications thérapeutiques au long terme.
Objectifs
Le système immunitaire permet de se défendre contre les agressions des pathogènes, mais sa dérégulation est aussi impliquée dans le développement diverses maladies telles que l’asthme. Le système immunitaire est partagé en deux grandes parties : la partie innée, préexistante, et reconnaissant des caractéristiques partagées entre différents pathogènes, et la partie adaptative, qui comme son nom l’indique s’adapte en fonction du pathogène rencontré, par des jeux de sélection et de prolifération de cellules extrêmement spécifiques du pathogène en question. Les cellules innées de groupe 2 (ILC2s) sont des lymphocytes innés résidents des tissus (poumons/intestin). Elles participent à la défense contre les parasitique, à la réparation tissulaire mais aussi aux processus physiopathologiques comme l’asthme. Les ILC2 se développent dans la moelle osseuse puis se maintiennent à long terme dans les tissus, avec la capacité de proliférer et répondre in situ en cas d’inflammation. Des résultats récents indiquent cependant qu’il existe des sous-populations ILC2s circulantes stimulées par l’inflammation et impliquées dans le maintien de l’intégrité d’un tissu, selon un axe intestin-poumon et/ou axe moelle osseuse-poumon. La fonction de ces ILC2s est encore peu connue (inflammation/régénération). Seules des expériences de parabioses peuvent permettre dans un même tissu de différencier les cellules ILC2s circulantes du sous-groupe des cellules résidentes. Les objectifs du projet sont donc 1- de déterminer les situations inflammatoires qui aboutissent à une circulation d’ILC2 2- comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans cette circulation 3- déterminer le stade de développement auquel les ILC2s circulent (progéniteur ou cellule mature) 4- déterminer l’importance physiologique de ce recrutement sur la situation inflammatoire et la régénération tissulaire. Cliniquement, il est important de comprendre ces processus car dans les cas d’allergies et asthme, la présence d’ILC2 en circulation corrèle avec une évolution défavorable ; déterminer leur rôle et mode de migration nous permettra d’envisager de bloquer leur migration chez les patients à risque.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet scientifique permettra de comprendre ce qui régit la circulation des ILC2 en détaillant les mécanismes moléculaires mis en jeu par cette population pour se propager dans les tissus en inflammation. Le mode de circulation de populations cellulaires initialement considérées comme résidentes est encore peu compris mais des données préliminaires indiquent que leur rôle serait crucial pour obtenir une réponse adaptée du tissu. A long terme, ces données moléculaires de la circulation de sous-populations d’ILC2s pourrait représenter une source importante de moyen d’actions supplémentaires pour lutter contre les crises d’asthme ou d’allergies non résolues par les corticoïdes. Ces cas sont nombreux et en constante augmentation au vu du nombre croissant d’allergies dans le monde. Il est clairement établi que ces ILC2 seraient « trop » inflammatoires dans le cas d’inflammation chronique de type 2 et donc qu’un moyen d’empêcher la mise en place d’un recrutement constant de cellules supplémentaires dans les voies aériennes des patients pourraient représenter une chance thérapeutique de deuxième intention.
Procédures
• Chirurgie de parabiose : 1 chirurgie par animal, environ 45 minutes d’anesthésie générale • Prélèvements de sang au sinus rétroorbital sous anesthésie, 1 fois 5 minutes. Si le chimérisme n’est pas effectif, les animaux pourront être prélévés de la même manière à 4 semaines et à 6 semaines • Des injections de molécules non toxiques seront réalisées dans l'abdomen des animaux anesthésiés à raison de 3 à 7 fois sur une semaine. Des administrations de molécules non toxiques seront réalisées en intranasale sur des animaux anesthésiés à raison de 2 à 3 fois. Pour ces interventions les anesthésies sont de l’ordre de 5 minutes.
Impact sur les animaux
Le protocole de parabiose est parfaitement maîtrisé dans notre laboratoire tant au niveau réalisation qu'au niveau de la gestion de l'analgésie pré et postopératoire avec une absence de signes quantifiables de souffrance animale, sans réduction de la mobilité. Injections de cytokines et d’anticorps antagonistes. Toutes les injections sont réalisées par voie intrapéritonéale ou intranasale après anesthésie des animaux en utilisant l’isoflurane, le dépôt dans la première narine est réalisé en sortant la souris une minute de la chambre à induction suivi d’un retour et du dépôt dans la seconde narine de façon identique. Ces injections n’induisent pas de douleur perceptible chez les animaux traités (pas de perte de poids, pas de changement de comportement alimentaire, pas de perturbation du comportement social ou nerveux (mobilité, interactions, agressivité ou prostration).
Devenir
les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Aucune data préliminaire in vitro ne peut être réalisée pour motiver cette étude de circulation. La présence d’une fréquence de cellules ILC2s non négligeable dans le sang de patients asthmatiques contrairement aux contrôles sains est une motivation importante pour décider de comprendre ce qui génère des cellules circulantes à partir de populations résidentes et le mécanisme de circulation mis en place. La circulation des populations immunes à travers les différents organes est très contrôlée. Les cellules passent par une circulation sanguine et lymphatique qui sont des environnements complexes et impossible à mimer sur des tests in vitro. Afin de pouvoir conclure sur des fonctions différentielles de nos cellules circulantes versus celles résidentes et de comprendre les mécanismes moléculaires en jeu, les expériences in vivo sont absolument essentielles et aucun système in vitro n’existe pour obtenir des résultats préalables.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires, l'étude des mécanismes moléculaires (anticorps bloquants) ne sera réalisée que si le taux circulation des ILC2s est significativement différent entre les conditions testées. De plus, les données de la littérature et celles déjà générées au laboratoire nous permettent de limiter le nombre d’hypothèses à tester. Enfin, le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Seulement dans les conditions adéquates où l'augmentation du taux circulant des ILC2s est validé, une étude du blocage des molécules de circulation se fera par l’injection des anticorps bloquants. Nous vérifierons ainsi en étudiant le tissu cible si les populations ILC2s bloquées avaient plutôt un effet inflammatoire ou réparateur. Appliquer les bloquants uniquement dans le cas d’une circulation statistiquement signifiante permet de réduire les effectifs requis et visera à réduire le nombre de souris nécessaires pour maintenir une interprétation biologique robuste.
Raffinement
Les animaux seront manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences afin de les habituer et de limiter leurs stress. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement lors de la première semaine post-chirurgie, puis deux à trois fois par semaine afin d’assurer leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress. Une grille de score a été établie afin d’évaluer régulièrement la souffrance des souris, et des points limites ont été définis. Une fiche d’observation tout au long des procédures permettra de vérifier leur état (pelage, poids, respiration, mobilité…) et des scores seront tenus afin de vérifier que le traitement n’induit pas de modifications des habitudes et du bien-être animal. En cas de changement des scores, des points limites sont établis (perte de poids rapide, modification aspect pelage/alopécie, déshydratation, changement de consistance/couleur des selles) et le suivi rapproché des animaux permettra de définir s’il est nécessaire de - diminuer la dose et/ou d’administrer des antalgiques selon la gravité des changements de comportement. Ces conditions s’appliquent à toutes les procédures.
Choix des espèces
Une circulation d’ILC2s chez l’homme est corrélée à la sévérité des allergies/crises d’asthme. La souris est un modèle de choix par la forte similitude des systèmes immunitaires humains/murins. Elles sont les plus facilement manipulables (chirurgie ici et génétiquement modifiées) pour comprendre la circulation (système sanguin/lymphatique et production des cellules immunes). Nous avons besoin de travailler avec différents types de souris depuis longtemps utilisées dans les laboratoires et qui ne présentent pas de signe de souffrance. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (6 à 10 semaines après la naissance, afin d’avoir un système immunitaire mature). Nous n’attendons pas d’effet lié à l’âge des souris. Cependant, des animaux plus âgés ont aussi une peau plus épaisse. Nous éviterons donc de les utiliser.
Essai d’efficacité d’une nouvelle thérapeutique de la maladie de Menkès (EU 1/2), avenant au projet
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent des injections sous-cutanées cinq jours sur sept de J5 à J56 et sept tests neurocomportementaux dont le porteur ne précise pas la nature, pour tester un transporteur synthétique de cuivre contre la maladie de Menkès. Les souris malades non traitées présentent des défauts de croissance et un risque de mort par rupture aortique, et toutes sont tuées à J56 pour prélèvement des organes. Le porteur affirme qu'aucune alternative in vitro n'existe et conclut à la "nécessité" de recourir à la souris vivante.
Objectifs
La maladie de Menkès est une maladie rare causée par un défaut de transporteur de cuivre (ATP7A) au niveau des barrières intestinales, placentaires et cérébrales causant alors de nombreuses altérations des fonctions biologiques et un décès dans les premières années de vie. Les traitements actuels sont inefficaces et le devenir des enfants atteints reste extrêmement pauvre. Dans le contexte de cette maladie, l’obstacle du passage au niveau des barrières intestinales et cérébrales est responsable de la pathologie. Le développement et l’étude des nanoparticules ont montré qu’elles avaient une capacité de diffusion inter et intracellulaire augmentée grâce à leur faible taille leur permettant alors de traverser la barrière hématoencéphalique. Dans ce cas l’utilisation d’un transporteur synthétique de cuivre serait une solution thérapeutique. Dans un projet précèdent, nous avons démontré son passage cérébral par l’augmentation de la quantité de cuivre dans le cerveau de souris malades traitées avec le « médicament ». Ces premières études ont montré la tolérance au transporteur ayant permis de déterminer la dose et le rythme optimal d’injection. Le but de ce projet est alors d’optimiser les effets de l’administration répétées chez les souris atteintes sur la biodisponibilité du cuivre et la restauration des fonctions altérées des animaux malades. L’objet de cet avenant porte sur l’ajout d’un groupe d’étude composé de 10 animaux atteints traitées avec du cuivre-histidine, traitement actuel inefficace de la maladie. En effet, bien que le cuivrehistidine restaure une concentration normale de cuivre dans le sang, ce dernier n’atteint pas le cerveau et ne permet donc pas de restaurer les atteintes neurologiques. Nous voulons donc montrer que notre traitement expérimental sera plus efficace que le traitement actuel de la maladie.
Bénéfices attendus
Chez les animaux malades traités avec le Transporteur synthétique de cuivre : 1) Restauration des fonctions altérées, 2) Restaurations des fonctions cognitives principales, 3) Amélioration de la survie, 4) Restaurations des troubles squelettiques observés. L'objectif de ce projet est de produire un médicament capable de soigner des enfants porteurs de la mutation et qui ont une espérance de vie très réduite.
Procédures
1/Injections sous cutanées répétées de médicament ou placebo 5 jours sur 7 à partir de J5 et ce jusqu’à la fin du protocole à J56. 2/Tests neurocomportementaux au nombre de 7 allant de J3 à J56
Impact sur les animaux
Chez les animaux malades non traités avec le TSC : défauts de croissance et difficultés d'alimentation, risque de mort des animaux non traités par rupture/anévrismes aortiques. Chez les animaux malades traités avec le TSC, une toxicité liée au produit peut apparaitre mais cela n'a encore jamais été observé dans les études que nous menons depuis juillet 2020. Des études de recherche de toxicité in vitro sur cellules hépatocytaires sont en cours.
Devenir
L’ensemble des animaux du protocole (60 animaux) seront gardés en vie après chaque procédure et ce jusqu’à la fin du protocole (fixé à J56 d’âge) afin de suivre l’évolution des animaux malades en réponse au traitement médicamenteux. L’âge de survie des animaux mutants non traités ou traités avec un placebo est comprise entre 3 et 5 semaines d’âge. En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et tous les organes d'intérêt seront rapidement prélevés et conditionnés afin de réaliser des analyses biochimiques, enzymologiques et anatomopathologiques.
Remplacement
Il est nécessaire d’étudier l’efficacité du transporteur synthétique du cuivre (TSC) sur des animaux vivants car l’objectif principal de l’étude est de montrer que ce traitement permet une pénétration du cuivre au niveau cérébral et une restauration des fonctions cérébrales liées aux cuproprotéines cérébrales. Le seul traitement actuel (administration parentérale d’histidinate de cuivre) permet de traiter les tissus non neurologiques des patients, donc sans effet sur le cerveau. L’intérêt majeur du TSC réside donc dans sa capacité à franchir la barrière hématoencéphalique ce qui conduit à l’hypothèse qu’il pourra restaurer ainsi les fonctions cérébrales des sujets atteints. Les études préliminaires ont montré un dosage du cuivre plasmatique en hausse chez les animaux traités à l’aide du TSC ainsi qu’une accumulation de cuivre au niveau cérébral (colorations par rhodanine (analyse laboratoire Anatomopathologie, CHRU Nancy-Brabois). Il n’existe pas d’alternative d’approche in vitro car le projet porte sur l’étude de l’allongement de la durée de vie et l’amélioration du comportement de l’animal porteur de la maladie de Menkès en fonction de la réponse au traitement.
Réduction
L’étude comportementale portera sur 60 souris de laboratoire, réparties en 6 groupes de 10 mâles dont 2 groupes de 10 souris saines et 4 groupes de 10 souris malades. Cette cohorte de 60 souris mâles sera étudiée et mise à mort une fois les tests comportementaux terminés, à l’âge de 2 mois. L’étude sera réalisée avant 2 mois si les points limites sont atteints avant cette échéance. Il s'agit du nombre d'animaux nécessaires pour mener à bien cette étude afin d’obtenir une puissance statistique suffisante. Au final, 40 mâles hémizygotes et 20 mâles de type sauvage seront issus des accouplements de 40 femelles hétérozygotes à 40 mâles de type sauvage, et 20 femelles de type sauvage à 20 mâles de type sauvage, cela afin de garantir une indépendance totale des échantillons (en se basant sur l’unité indépendante correspondant à la portée). Ainsi environ 420 animaux seront générés dans le contexte de cette étude mais seuls les mâles hémizygotes ou de type sauvage seront mobilisés pour le protocole expérimental. Les animaux surnuméraires de type sauvage et ne subissant aucun traitement, seront attribués à d’autres projet après accord du vétérinaire référent
Raffinement
Les procédures expérimentales auront lieu au sein de l'animalerie, dans un environnement sécurisant pour les souris. Ces 2 procédures comprennent 1/ la gestion de la lignée mutante qui présente un phénotype dommageable pour l’animal et 2/ l’injection du transporteur synthétique du cuivre par piqure sous-cutanée et répétée 5 fois par semaine, associée à 7 séries de tests comportementaux, puis une mise à mort des animaux pour prélèvement des organes. Une procédure d’estimation et suppression de la douleur est mise en place : différents éléments visuels chez l’animal sont évalués afin d’établir un score qui permet d’anticiper et d’éviter d’atteindre les points limites déterminés au préalable, et qui tient compte des signes éventuels de mal-être (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids, yeux et abdomen creux). Plus globalement, les animaux malades non traités subiront comme les autres l'ensemble des procédures expérimentales mais ils seront surveillés avec encore plus d'attention afin d'anticiper au mieux les points limites.
Choix des espèces
La souris ATP7AMoblo est le seul modèle de mutation spontanée permettant une étude de cette pathologie génétique. D’autre part, ce choix se justifie par la possibilité de faire des liens avec d’autres modèles transgéniques murins d’autres maladies métaboliques Les géniteurs ont été produits par le Jackson Laboratory, puis importés en France en mai 2020 par la société Charles River avant d’être livrés à l’ACBS où la lignée est maintenue. Il s’agit de la lignée B6Ei.Cg-Atp7aMo-blo/J établie sur fond génétique C57Bl/6J Nous focaliserons l’étude sur les souriceaux durant la lactation des souris mères et jusqu’au-delà du sevrage, à J56, correspondant à la fin du dernier test comportemental. En effet, durant cette période nous pourrons évaluer l’efficacité du traitement sur l’évolution de l’activité neurocomportementale des animaux en réponse au traitement médicamenteux.
Essai d’efficacité d’une nouvelle thérapeutique de la maladie de Menkès (EU 2/2), Avenant au projet
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 30 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des souris porteuses de la mutation de la maladie de Menkès reçoivent des injections sous-cutanées cinq jours sur sept jusqu'à l'âge de 56 jours et subissent sept tests neurocomportementaux, les animaux non traités pouvant mourir de rupture d'anévrisme aortique. L'objectif est de tester un transporteur synthétique de cuivre présenté comme un futur médicament pour les enfants atteints. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire" d'étudier l'efficacité chez l'animal vivant.
Objectifs
La maladie de Menkès est une maladie rare causée par un défaut de transporteur de cuivre (ATP7A) au niveau des barrières intestinales, placentaires et cérébrales causant alors de nombreuses altérations des fonctions biologiques et un décès dans les premières années de vie. Les traitements actuels sont inefficaces et le devenir des enfants atteints reste extrêmement pauvre. Dans le contexte de cette maladie, l’obstacle du passage au niveau des barrières intestinales et cérébrales est responsable de la pathologie. Le développement et l’étude des nanoparticules ont montré qu’elles avaient une capacité de diffusion inter et intracellulaire augmentée grâce à leur faible taille leur permettant alors de traverser la barrière hématoencéphalique. Dans ce cas l’utilisation d’un transporteur synthétique de cuivre serait une solution thérapeutique. Dans un projet précèdent, nous avons démontré son passage cérébral par l’augmentation de la quantité de cuivre dans le cerveau de souris malades traitées avec le « médicament ». Ces premières études ont montré la tolérance au transporteur ayant permis de déterminer la dose et le rythme optimal d’injection. Le but de ce projet est alors d’optimiser les effets de l’administration répétées chez les souris atteintes sur la biodisponibilité du cuivre et la restauration des fonctions altérées des animaux malades. L’objet de cet avenant porte sur l’ajout d’un groupe d’étude composé de 10 animaux atteints traitées avec du cuivre-histidine, traitement actuel inefficace de la maladie. En effet, bien que le cuivre-histidine restaure une concentration normale de cuivre dans le sang, ce dernier n’atteint pas le cerveau et ne permet donc pas de restaurer les atteintes neurologiques. Nous voulons donc montrer que notre traitement expérimental sera plus efficace que le traitement actuel de la maladie.
Bénéfices attendus
Chez les animaux malades traités avec le transporteur synthétique de cuivre : 1) Restauration des fonctions altérées 2) Restaurations des fonctions neurologiques principales, 3) Amélioration de la survie, 4) Restaurations des atteintes squelettiques observés. L'objectif de ce projet est de produire un médicament capable de soigner des enfants atteints de la maladie et qui ont une espérance de vie très réduite.
Procédures
1/Injections sous cutanées répétées de médicament ou placebo 5 jours sur 7 à partir de J5 et ce jusqu’à la fin du protocole à J56. 2/Tests neurocomportementaux au nombre de 7 allant de J3 à J56
Impact sur les animaux
Chez les animaux malades non traités avec le « médicament » : défauts de croissance et difficultés d'alimentation, risque de mort des animaux non traités par rupture/anévrismes aortiques. Chez les animaux malades traités avec le « médicament », une toxicité liée au produit peut apparaitre mais cela n'a encore jamais été observé dans les études que nous menons depuis juillet 2020. Des études de recherche de toxicité sur cellules de foie sont en cours.
Devenir
L’ensemble des animaux du protocole (60 animaux) seront gardés en vie après chaque procédure et ce jusqu’à la fin du protocole (fixé à J56 d’âge) afin de suivre l’évolution des animaux malades en réponse au traitement médicamenteux. L’âge de survie des animaux mutants non traités ou traités avec un placebo est comprise entre 3 et 5 semaines d’âge. En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et tous les organes d'intérêt seront rapidement prélevés et conditionnés afin de réaliser des analyses biochimiques, enzymologiques et anatomopathologiques.
Remplacement
Il est nécessaire d’étudier l’efficacité du transporteur synthétique du cuivre (TSC) sur des animaux vivants car l’objectif principal de l’étude est de montrer que ce traitement permet une pénétration du cuivre au niveau cérébral et une restauration des fonctions cérébrales liées aux cuproprotéines cérébrales. Le seul traitement actuel (administration parentérale d’histidinate de cuivre) permet de traiter les tissus non neurologiques des patients, donc sans effet sur le cerveau. L’intérêt majeur du TSC réside donc dans sa capacité à franchir la barrière hémato-encéphalique ce qui conduit à l’hypothèse qu’il pourra restaurer ainsi les fonctions cérébrales des sujets atteints. Les études préliminaires ont montré un dosage du cuivre plasmatique en hausse chez les animaux traités à l’aide du TSC ainsi qu’une accumulation de cuivre au niveau cérébral par colorations à la rhodanine (analyse laboratoire Anatomopathologie, CHRU Nancy-Brabois). Il n’existe pas d’alternative d’approche in vitro car le projet porte sur l’étude de l’allongement de la durée de vie et l’amélioration du comportement de l’animal porteur de la maladie de Menkès en fonction de la réponse au traitement.
Réduction
L’étude comportementale portera sur 60 souris de laboratoire, réparties en 6 groupes de 10 mâles dont 2 groupes de 10 souris saines et 4 groupes de 10 souris malades. Cette cohorte de 60 souris mâles sera étudiée et mise à mort une fois les tests comportementaux terminés, à l’âge de 2 mois. L’étude sera réalisée avant 2 mois si les points limites sont atteints avant cette échéance. Il s'agit du nombre d'animaux nécessaires pour mener à bien cette étude afin d’obtenir une puissance statistique suffisante. Au final, 40 mâles hémizygotes et 20 mâles de type sauvage seront issus des accouplements de 40 femelles hétérozygotes à 40 mâles de type sauvage, et 20 femelles de type sauvage à 20 mâles de type sauvage, cela afin de garantir une indépendance totale des échantillons (en se basant sur l’unité indépendante correspondant à la portée). Ainsi environ 420 animaux seront générés dans le contexte de cette étude mais seuls les mâles hémizygotes ou de type sauvage seront mobilisés pour le protocole expérimental. Les animaux surnuméraires de type sauvage et ne subissant aucun traitement, seront attribués à d’autres projet après accord du vétérinaire référent
Raffinement
Les procédures expérimentales auront lieu au sein de l'animalerie, dans un environnement sécurisant pour les souris. Ces 2 procédures comprennent 1/ la gestion de la lignée mutante qui présente un phénotype dommageable pour l’animal et 2/ l’injection du transporteur synthétique du cuivre par piqure sous-cutanée et répétée 5 fois par semaine, associée à 7 séries de tests comportementaux, puis une mise à mort des animaux pour prélèvement des organes. Une procédure d’estimation et suppression de la douleur est mise en place : différents éléments visuels chez l’animal sont évalués afin d’établir un score qui permet d’anticiper et d’éviter d’atteindre les points limites déterminés au préalable, et qui tient compte des signes éventuels de mal-être (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids, yeux et abdomen creux). Plus globalement, les animaux malades non traités subiront comme les autres l'ensemble des procédures expérimentales mais ils seront surveillés avec encore plus d'attention afin d'anticiper au mieux les points limites.
Choix des espèces
La souris ATP7AMoblo est le seul modèle de mutation spontanée permettant une étude de cette maladie génétique. D’autre part, ce choix se justifie par la possibilité de faire des liens avec d’autres modèles transgéniques murins concernant d’autres maladies métaboliques. Nous focaliserons l’étude sur les souriceaux durant la lactation des souris mères et jusqu’au-delà du sevrage, à J56, correspondant à la fin du dernier test comportemental. En effet, durant cette période nous pourrons évaluer l’efficacité du traitement sur l’évolution de l’activité neurocomportementale des animaux en réponse au traitement médicamenteux.
Etude de l activité motrice de souris deficiente pour l’activité mitochondriale
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles courent sur un tapis roulant motorisé dix minutes par jour pendant quatre jours, et une partie reçoit une injection de fixateur sous anesthésie, pour mesurer l'effet d'une protéine sur l'activité motrice et le fonctionnement des mitochondries. Le porteur indique que le tapis peut provoquer un léger stress et de la fatigue. Il conduit une partie du projet sur des cellules in vitro et réserve l'animal aux tests d'effort et aux analyses de tissus.
Objectifs
Dans le cadre de notre projet nous nous intéressons à une famille de protéine, dont un membre de la famille est responsable d’une maladie mitochondriale caractérisée par des atteintes neuromusculaires sévères. A ce jour, les causes de cette pathologie sont inconnues. Récemment, nous avons montré que des homologues de cette protéine possèdent la même fonction dans la régulation du métabolisme énergétique et nous avons donc mis en évidence un mécanisme original pouvant expliquer l’atteinte mitochondriale observée chez les patients. Afin de confirmer que ce mécanisme est bien à la base de la pathologie et de la régulation du métabolisme énergétique, nous voulons étudier le rôle d’un des membres de cette famille de protéines selon 3 axes : 1-Tester l’impact de la protéine sur l’activité motrice de la souris puisque les attentes énergétiques engendrent des déficits musculaires et une intolérance à l’effort. Pour cela, nous souhaitons mesurer la vitesse roulant motorisé et l’endurance des souris à l’aide d’un tapis de course. La vitesse du tapis sera progressivement augmentée et l’activité locomotrice de l’animal sera monitorée grâce à une caméra hautes fréquences. 2-Nous voulons mesurer l’atteinte énergétiques au niveau des tissus par des tests biochimiques. 3- nous voulons voir les défauts d’organisation et de morphologie des usines énergétiques des tissus, les mitochondries) par des analyses histologiques.
Bénéfices attendus
La mitochondrie sont les usines de production d’énergie dans les tissues et elles sont donc nécessaire au bon fonctionnement des différents organes chez l’homme. Des déficits mitochondriaux induisent des pathologies sévères. A l’heure actuelle, plus de 120 syndromes mitochondriaux ont été décrits pour lesquels aucun traitement n’existe. Aussi, il est nécessaire de comprendre quelles sont les causes cellulaires de ces pathologies. Notre projet se place dans ce cadre. Nous souhaitons comprendre le rôle important joué par une famille de protéines dans la production énergétique. La protéine que nous étudions dans ce projet fait partie d’une famille de protéines dont certains membres sont responsables de syndromes mitochondriaux et dont la fonction reste inconnue. A court terme, en comprenant le mode d’action et l’impact de notre protéine sur la mitochondrie, notre projet permettra d’établir les causes des pathologies mitochondriales associées à cette famille et cela permettra de développer des traitements pour ces pathologies à plus long terme.
Procédures
Concernant, les tests d'effort, les animaux seront placés sur un tapis roulant motorisé pour une durée maximale de 10 minutes pendant 4 jours consecutifs. De plus, 40 animaux seront soumis a une injection unique de fixateur de tissus. Ces injections se feront sur des animaux anesthésiés. Au total, cette intervention dure 15 minutes au total.
Impact sur les animaux
Le versant comportemental de notre étude est basé sur une analyse de la marche sur tapis roulant. Ce test peut engendré un stress leger chez l'animal du à la découverte de l appareillage. Ces tests de efforts pouvent engendrés de la fatigue physique. Pour ce qui est de la perfusion intracardiaque, la procédure réalisée sur animal anesthésié suit les normes et pratiques en vigueur.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort afin de réaliser des analyses biochimiques et histologiques sur les tissus en postmortem.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet, nous combinons l’utilisation de modèles in vitro et animaux. L’utilisation des modèles animaux est limitée aux études qui ne peuvent être conduites sur les modèles in vitro. Ainsi, les tests d'effort locomoteur (sur tapis roulant) et les analyses biochimiques, morphologiques et structurelles des tissus sont des impératifs incontournables de notre projet qui, en l'état des connaissances et des méthodes disponibles, ne peuvent pas s'affranchir de l'utilisation d'un modèle animal. En revanche, les investigations des mécanismes cellulaires et des voies de signalisation sont développées sur des modèles cellulaires in vitro.
Réduction
D'un point de vue général, nous réalisons une grande partie de notre projet sur des modèles cellulaires in vitro et limitons autant que possible les approches expérimentales réalisées sur l'animal. Ces dernières sont uniquement destinées à valider/confirmer l'implication des processus révélés in vitro au niveau de l’organisme. Pour notre projet, nous avons procédé à une réflexion pour déterminer le nombre d’animaux par groupe. Nous avons établi strictement le nombre d’animaux nécessaire. Afin de limiter l'utilisation d'animaux, les tests biochimiques (20 animaux) et histologiques (40 animaux) seront effectués à partir des tissus collectés sur les animaux évalués sur tapis roulant (60 animaux). Cette approche combinée permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire à la réalisation du projet.
Raffinement
Nos souris seront hébergées dans une animalerie conventionnelle, au sein de laquelle le bien-être et la santé des animaux sont suivis quotidiennement, permettant de détecter toute anomalie physique ou comportementale potentiellement révélatrice de signes cliniques. Les animaux sont hébergés en cages collectives dans les conditions les mieux adaptées au modèle murin. Nos animaux sont hébergés en présence de raffinement spécifique permettant la création de nids (important pour les femelles gestantes et allaitantes) des tunnels en carton, qui leur servent à se cacher et à jouer. Dans le ,cadre spécifique de la procédure du projet, nous avons inclus une étape préalable d’habituation aux appareillages afin de limiter le stress et l'anxiété des animaux. Nous avons également établi des points limites objectifs et précoces permettant de mettre fin à toute procédure le cas échéant, et appliquons systématiquement un traitement analgésique et des mesures de soins lorsque nécessaire. L’ensemble des procédures est encadré et mis en oeuvre par du personnel dument formé et habilité aux méthodologies utilisées et au bien-être animal.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des animaux adultes âgés de 10 à 14 semaines. A cette période, les souris sont adultes et présentent la capacité d’activité élevée. Ainsi, il est plus facile d’observer des différences entre les phénotypes, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés.
KO thermique frequence Modélisation numérique de l’interaction des champs RF sur les récepteurs thermiques – Mécanismes et expérimentations vivo (MOTHERR1 )
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système nerveux
135 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plus lourde est l'implantation chirurgicale de capteurs télémétriques dans l'abdomen, dont le porteur reconnaît qu'elle peut provoquer décès sous anesthésie, infection ou arrêt cardiaque, l'hébergement en cage individuelle affectant en outre le bien-être social des souris. Elles sont ensuite exposées de façon répétée à des champs radiofréquences puis mises à mort pour analyser les organes de la thermorégulation. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro n'est possible tant que la cible moléculaire n'est pas identifiée.
Objectifs
Les champs radiofréquences (RF) deviennent de plus en plus ubiquitaires. Au-delà des interrogations soulevées par le public, cela justifie de rechercher s’il existe un risque même faible, de telles expositions à faible niveau, répétées ou continues. A faible intensité, il a été montré par plusieurs équipes qu’une exposition chronique ou répétitive à des RF de faible niveau à 900MHz - 1 à 30 V/m - peut produire des réponses chez la souris semblables à celles provoquées par le froid. L’objectif de notre projet est de préciser l’effet des champs RF dans ces réponses en étudiant les mécanismes biologiques impliqués chez les souris exposées de façon répétée aux champs radiofréquences (RF) et en identifiant les cibles moléculaires responsables des changements observés. Ce projet vise à vérifier quels récepteurs thermiques sont à l'origine des comportements manifestés par les animaux exposés. Plus spécifiquement les questions abordées dans ce projet sont: 1) Est-ce que le phénomène de vasoconstriction observé chez les animaux exposés se produit dans la même plage de température lorsque la température ambiante augmente et lorsqu'elle diminue ? 2) Est-ce que cet effet se produit aussi chez des souris privées d’un gène pour un récepteur thermique (souris mutantes) ? 3) Dans quelle gamme de fréquences cet effet est-il observable ? Dans ce projet, 135 souris adultes seront utilisées, 108 mâles et 27 femelles.
Bénéfices attendus
L’identification de la cible moléculaire d’interaction du champ RF permettra d’envisager d’une part les possibles conséquences sanitaires des effets des RF sur la régulation thermique chez les animaux, d’une part l’éventuelle extrapolabilité ou non à l’homme des effets observés.
Procédures
Une implantation intra-péritonéale de capteurs télémétriques sera effectuée sur 119 souris, 92 mâles dont 14 mutées sur le gène TRPM8 et 27 femelles dont 14 mutées sur le gène TRPM8. La durée d'intervention est d'environ une demi-heure. Les souris doivent être hébergées isolément en cage individuelle en post-opératoire (4 jours, 119 souris), ou sur 2 jours pour les mesures de température par caméra infra-rouge (16 souris).
Impact sur les animaux
L’acte le plus sévère sur une partie des animaux est la chirurgie d’implantation de capteurs télémétriques. Les effets indésirables attendus sont une mauvaise réaction à l’anesthésie (décès), et dans les 3 à 4 jours post-opératoires une agressivité des congénères, une infection de la plaie, sous-cutanée ou du péritoine, un possible lâchage de suture nécessitant une reprise chirurgicale. Un arrêt cardiaque post-chirurgical ou une rupture de suture dans les 24h ont quelquefois été observés dans nos expérimentations antérieures. L’exposition au champ RF ne produit a priori pas d’effet indésirable attendu. La fragilité post-opératoire nécessite 3 à 4 jours d'hébergement en cage individuelle et les mesures de température par caméra infra-rouge sur 48h nécessitent également un hébergement en cage individuelle. Cet isolement en cage individuelle supérieur à 24h a un retentissement sur le bien-être social des souris.
Devenir
A la fin de la période d’exposition, les animaux seront mis à mort pour étudier les modifications tissulaires et moléculaires des organes impliqués dans la régulation thermique.
Remplacement
Les premiers objectifs de cette étude visent à préciser les cibles moléculaires ou tissulaires des effets observés sur la régulation thermique lors d’expositions répétées à des champs RF. Ceci permettra lorsqu’elles auront été identifiées d’envisager des études in vitro pour explorer les paramètres efficaces de ces effets. D’ici là, la réaction de régulation thermique étant un effet systémique global, cet effet ne peut pas être observé par des méthodes in vitro tant que la cible d’interaction moléculaire ou cellulaire n’est pas clairement identifiée, et il n’existe pas de modèle tissulaire partiel qui éviterait de rechercher cet effet in vivo.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires à une bonne compréhension des mécanismes mis en jeu, des études in vitro et une modélisation en dynamique moléculaire sont envisagées dans ce projet. Ces travaux devraient permettre de cibler plus rapidement les paramètres efficaces de l’effet étudié et ainsi limiter le nombre d’expérimentations in vivo effectuées à cette fin. De plus, plusieurs expérimentations sont conditionnées aux résultats antérieurs, et ne seront donc pas effectuées lorsqu’elles n’ont pas d’utilité. A la fin de la période d’exposition, les animaux seront mis à mort. Pour optimiser l’utilisation des animaux et limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, de nombreux échantillons de tissus seront prélevés pour réaliser des analyses biochimiques et immunohistochimiques.
Raffinement
Ce projet sera réalisé dans des chambres réverbérantes, où les animaux seront hébergés pendant l’exposition. Un fond sonore sera diffusé la journée pour leur permettre de s’habituer au bruit généré par les manipulations et ainsi limiter le stress pouvant être ressenti durant les expérimentations. Du matériau leur permettant de nidifier, des tubes colorés et des bâtons en bois à ronger seront également disposés dans leurs cages d’hébergement pour favoriser leur développement cognitif. Les protocoles expérimentaux limiteront fortement l’intensité et la durée de l’inconfort ou de l’angoisse des souris qui seront utilisées par l’utilisation d’antalgiques pré et post-opératoires, et permettront de réduire au minimum le nombre d’animaux nécessaires, pour obtenir des résultats concluants. Des procédures d’anesthésie et de mise à mort éviteront toute douleur ou angoisse prolongées. Une surveillance régulière permet également de détecter toute souffrance aigue et d’anticiper l’aggravation de l’état des animaux.
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée dans la recherche fondamentale et bien documentée dans la bibliographie. Ce qui permet des comparaisons de nos résultats avec ceux obtenus précédemment concernant les effets thermiques des champs RF dans la litérature scientifique. L’équipe possède une expertise en toxicologie expérimentale, ainsi que dans le domaine des effets des champs RF et de la régulation thermique. L’équipe dispose ainsi des compétences et de l’équipement nécessaires à l’exposition des souris aux RF et à l’évaluation des effets précités.
Des probiotiques greffés sur un dispositif implanté dans l’intestin grêle pour moduler le métabolisme de l’hôte : preuve de concept sur le métabolisme des glucides alimentaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
24 mini-porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, la plupart tués à l'issue et deux gardés vivants s'ils perdent leur implant. Chaque animal subit une demi-journée de chirurgie pour poser un dispositif intestinal abritant des probiotiques, puis des prélèvements sanguins répétés jusqu'à 168 ml par cinétique sur deux mois de régime gras. Le porteur vise à terme une application chez l'humain contre le diabète de type II et l'obésité, mais l'objectif immédiat reste d'évaluer la tolérance du dispositif. Sur le remplacement, il affirme que la biodisponibilité des nutriments ne peut pas être reproduite in vitro et retient le mini-porc pour son système digestif proche de celui de l'humain.
Objectifs
Le dispositif "Symbiote" testé dans le projet pourrait avoir de nombreuses applications chez l’Homme, en particulier une contribution à la prise en charge du diabète de type II et des obésités : dans ces situations, il est admis que l’élimination d’un pourcentage significatif de la ration calorique présente un intérêt médical. De nombreuses approches thérapeutiques (inhibiteurs de l’alpha-Glucosidase pour diminuer l’absorption des sucres, médicaments diminuant le seuil de réabsorption du glucose, pour éliminer une partie du glucose sanguin dans l’urine) ont été proposées pour cela. Malgré leur intérêt thérapeutique, leurs indications sont limitées par leurs effets secondaires non négligeables. Notre dispositif "Symbiote" pourrait représenter une alternative à ces méthodes. En effet, les bactéries abritées dans le « réacteur » pourront représenter une masse biologique significative, consommant pour leur propre compte des nutriments qui auraient normalement été absorbés (d’autant que le « réacteur » est positionné dans une zone de l’intestin où la concentration en bactéries est relativement faible). Les bactéries seront choisies ou bien parce qu’elles sont déjà naturellement présentes dans l’organisme (par exemple divers types de Lactobacillus normalement présents dans l’organisme, dont Lactobacillus salivarius), ou bien parce qu’elles ont démontré un potentiel probiotique intéressant (E. Coli Nissle, par exemple, qui présentent le double intérêt d’avoir démontré un intérêt anti-inflammatoire et d’être relativement facilement accessible au génie génétique, ce qui permettra dans le futur d’envisager d’utiliser ces bactéries pour produire des molécules d’intérêt, par exemple des vitamines). Avant d’envisager une étude chez l’homme, l’objectif de cette étude pré-clinique sur du long terme chez le mini-porc est d’évaluer les effets du dispositif implanté sur la physiologie digestive de l’hôte, et sur son potentiel d’action dans le contrôle du métabolisme dans des situations de perte d’homéostasie (obésité et diabète de type II, mais potentiellement à terme également les pathologies liées à un dysfonctionnement du microbiote). L’ensemble des dispositions prises dans ce projet répond aux principes fondamentaux des 3Rs (réduction, raffinement, remplacement) dans le cadre de l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont la contribution au traitement des pathologies induites par un microbiote inadapté : de nombreuses études ont mis en évidence le lien entre microbiote et diverses pathologies (dont obésité, certains cancers, etc). Les études cliniques qui deviendront possibles après cette expérimentation animale permettront d’explorer ce qui pourrait être une méthode originale de modulation du microbiote intestinal. Un tel dispositif a toute ces chances pour être bien toléré chez l’homme, car dans de nombreuses situations cliniques des sondes duodéno-jéjunales sont installées, et l’expérience montre qu’elles sont très bien tolérées.
Procédures
Des prélèvements de sang seront réalisés à 0, 15 et 60 jours après la mise en régime des animaux. Pour chacune des journées de prélèvements, 8 ml de sang seront prélevés sur chaque cathéter selon la cinétique suivante -0.5, 0, 0.5, 1, 2, 5 et 7h après le repas. Ce qui représente un volume total de 168 ml par cinétique (8 mL x 3 cathéters x 7 temps), ce qui est acceptable pour des animaux de plus de 25 kg. Des prélèvements de sang artériels seront effectués tous les 15 jours sur tous les animaux. Ces prélèvements uniquement sur du sang artériel seront réalisés à jeun pour permettre un suivi du statut physiologique des animaux pendant toute la durée de l’expérimentation. Chaque animal subira une demi-journée d’intervention chirurgicale. Les prélèvements de sang réalisés à J0, J15 et J60 après la mise en régime des animaux, s’effectueront pour chaque animal sur 3 demi- journée de cinétique de prélèvement de sang, cumulé sur 60 jours.
Impact sur les animaux
La douleur imposée aux animaux pendant l’expérimentation est liée à l’acte chirurgical. Elle peut se manifester dans les premiers jours suivant l’opération, mais après cette période de récupération, elles restent mineures. Pendant la période de récupération, les animaux sont surveillés régulièrement (visite toutes les 2 h pendant la journée). L'évaluation de la gêne et de la douleur est faite par observation du comportement des animaux : reprise de l'alimentation, du transit intestinal, posture, vocalises, réactivité et la température corporelle. Les critères d’arrêt concernent essentiellement la période de récupération post-opératoire. Si l’alimentation et le transit digestif ne sont pas normalisés au bout de 10 jours, malgré les soins apportés pour soulager la douleur à l'aide d'un analgésique et stimuler la motricité intestinale et/ou si une perte de poids supérieure à 20% du poids avant l’apparition des premiers signes cliniques d’altération de l’état physiologique est observée, Les animaliers et les responsables de l’étude effectueront une observation plus poussée de l’animal et renseigneront le tableau d’observation des points limites. Si 3 points limites notables ou 1 point limite grave sont observés, nous discusterons avec le personnel de l’animalerie, afin de décider si l’animal sera soigné ou euthanasié.
Devenir
Les animaux de la procédure 1 seront mis à mort à la fin de la période expérimentale après 2 mois d’un régime HF-HF, sauf si le point limite est atteint avant. Les animaux expérimentaux sont mis à mort en fin d’expérience pour : 1) vérifier le bon positionnement des cathéters sanguins et du tænia artificiel 2) réaliser des prélèvements tissulaires pour des études métaboliques. Tous les animaux de la procédure 2 seront mis à mort pour vérifier le positionnement et l’état de l’ancrage du dispositif implanté. Dans le cas ou l’animal perde son dispositif et qu’il se retrouve dans les fèces, celui-ci sera gardé en vie et pourra être réutilisé à des fins pédagogiques au sein de la structure.
Remplacement
La biodisponibilité des nutriments fait intervenir de nombreux processus biologiques coordonnés et régulés, qui à ce jour ne peuvent pas être reproduits in vitro. Le porc présente un certain nombre de similitudes anatomiques et physiologiques avec l'homme. C’est la raison pour laquelle il est fréquemment utilisé comme modèle pour les études biomédicales. Le mini-porc permet de travailler sur des adultes (à stabilité pondérale) d'une taille compatible avec l'expérimentation animale. Il présente de plus l'avantage d'avoir un système digestif très proche de celui de l'Homme et d'accepter de manger tous types d'aliments.
Réduction
L'effectif prévu dans le schéma expérimental de la phase 1 est réduit au minimum en tenant compte de la variabilité du principal paramètre mesuré, estimée à partir de nos précédentes études sur la biodisponibilité des nutriments réalisées avec un design expérimental similaire. Après analyse de la fonction de répartition de la loi de Chi2, un nombre minimal de 6 animaux/lot est nécessaire pour obtenir une différence significative à 5% entre les lots sur le critère principal (biodisponibilité du fructose). 2 mini-porcs supplémentaires sont également prévus pour faire face aux aléas (mauvaise récupération chirurgicale des mini-porcs, perte précoce de perméabilité des cathéters, ...). Ils seront alloués aux différents groupes (si c’est le cas) en fonction des besoins. L’effectif prévu pour la phase 2 est le minimum requis pour un test de faisabilité d’implantation et de pérennité de l’ancrage du dispositif dans l’intestin par la voie endoscopique. 14 animaux seront utilisés pour la première phase du projet (procédure 1). Ils seront distribués en 2 lots : un lot témoin (dispositif implanté sans probiotique) et un lot expérimental (dispositif implanté avec probiotique greffé). 10 animaux seront utilisés pour la phase 2 du projet pour tester la fiabilité de la technique d’ancrage du dispositif par endoscopie. (procédure 2). L’approche développée sera peu invasive, et peu traumatisante pour l’animal. La douleur imposée aux animaux pendant l’expérimentation est liée à l’acte chirurgical. Les animaux recevront pendant 6 jours un traitement analgésique et spamolytique, mais après cette période de récupération, elles restent mineures. Pendant la période de récupération, les animaux sont surveillés régulièrement (visite toutes les 2 h pendant la journée). L'évaluation de la gêne et de la douleur est faite par observation du comportement des animaux : reprise de l'alimentation, du transit intestinal, posture, vocalises, réactivité et la température corporelle.
Raffinement
La douleur imposée aux animaux pendant l’expérimentation est liée à l’acte chirurgical. Elle peut se manifester dans les premiers jours suivant l’opération, mais après cette période de récupération, elles restent mineures. Pendant la période de récupération, les animaux sont surveillés régulièrement (visite toutes les 2 h pendant la journée). L'évaluation de la gêne et de la douleur est faite par observation du comportement des animaux : reprise de l'alimentation, du transit intestinal, posture, vocalises, réactivité et la température corporelle. Les critères d’arrêt concernent essentiellement la période de récupération post-opératoire. Si l’alimentation et le transit digestif ne sont pas normalisés au bout de 10 jours, malgré les soins apportés pour soulager la douleur et stimuler la motricité intestinale et/ou si une perte de poids supérieure à 20% du poids avant l’apparition des premiers signes cliniques d’altération de l’état physiologique est observée, nous discuterons avec le personnel de l’animalerie, afin de décider si l’animal sera soigné ou euthanasié. Pendant toute la durée de la période d'expérimentation, les animaux seront hébergés dans des cages au sol de taille réglementaire avec des copeaux de bois comme litière leur permettant de réaliser une activité de fouissage, et avec des parois latérales en plexiglass pour que les animaux puissent se voir et intéragir entre eux. Leur environnement est enrichi à l’aide d’une chaîne en métal fixée sur les parois et de ballons. La pièce est à température régulée. Les animaux ont libre accès à l'eau.
Choix des espèces
Le porc présente un certain nombre de similitudes anatomiques et physiologiques avec l'homme. C’est la raison pour laquelle il est fréquemment utilisé comme modèle pour les études biomédicales. Le mini-porc permet de travailler sur des adultes (à stabilité pondérale) d'une taille compatible avec l'expérimentation animale. Il présente de plus l'avantage d'avoir un système digestif très proche de celui de l'Homme et d'accepter de manger tous types d'aliments.
Impact du ciblage des cellules sénescentes sur la longévité et l’espérance de vie en bonne santé
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Laissées vieillir jusqu'à 18 à 24 mois, elles reçoivent un anticorps ou un composé sénolytique par injection ou gavage tous les quinze jours, avec prélèvements de sang et d'urine, pour étudier l'élimination des cellules sénescentes dans le vieillissement. Le porteur anticipe la mort d'environ 20 % des animaux avant la fin, et la mise à mort de ceux qui perdent 15 % de leur poids. Il justifie le recours à la souris par la nécessité d'étudier un "organisme entier".
Objectifs
Ce projet fait partie d'une étude plus globale de caractérisation du rôle de la surveillance immunitaire des cellules sénescentes dans le vieillissement, les maladies liées à l’âge et le cancer. Ce projet est basé sur les résultats obtenus au sein du laboratoire qui démontrent un lien entre la surexpression d’un glycolipide à la surface des cellules pulmonaires sénescentes et leur échappement au système immunitaire. L’objectif du projet est de déterminer l’effet du blocage de glycolipide par un anticorps sur la réponse immunitaire et le développement de maladies liées à la senescence chez la souris âgée. L’interaction et la communication entre les cellules sénescentes et les cellules immunitaires seront étudiées pour établir le mécanisme par lequel ces cellules exercent des pressions d’adaptation mutuelles observée in vitro. Le développement et l’avancement de diverses maladies liés à l’âge (Fibrose pulmonaire, fibrose rénale, fibrose hépatique, arthrose, ostéoporose, cancer) seront également suivis afin d’évaluer l’effet thérapeutique de l’anticorps comparé à un sénolytique connu (une combinaison de molécules éliminant les cellules sénescentes). Nous voulons évaluer si cette approche immunothérapeutique pourrait augmenter la durée de vie des souris ainsi que diminuer leur état de fragilité générale. La finalité de ce projet pourrait permettre de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre le vieillissement pathologique en ciblant spécifiquement des molécules de surfaces associées aux cellules sénescentes. Cette approche pourrait être utile pour les patients dans de nombreuses maladies liées à l’âges incluant le cancer. Les résultats de cette étude devraient nous permettre de mieux développer l’anticorps et d’envisager des essais cliniques de phase précoce chez l’homme.
Bénéfices attendus
Par cette étude on s’attend à avoir une meilleure compréhension mécanistique des interactions entre le système immunitaire et les cellules sénescentes au cours du vieillissement mais également de déterminer le rôle et l’importance des point de contrôles immunitaires associés à la sénescence dans l’élimination des cellules sénescentes. Nous nous attendons également à comprendre si une approche immunothérapeutique visant ce ganglioside pourrait être envisagée afin de traiter et prévenir les maladies liées à l’âge et la comparer à un traitement déjà connu.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - Administration de l’anticorps ou le sénolytique de référence ou les solutions contrôles (PBS ou isotype contrôle) par injection intrapéritonéale ou par gavage, pour tous les animaux, une fois tous les 15 jours pour 6 injections/gavages; durée d'environ 3 minutes par animal par injection/gavage - Pesée (toutes les semaines pour tous les animaux; durée moins d'une minute par pesée - Prélèvement sanguin (200µl une fois par mois pour tous les animaux) ; durée d'environ 5 minutes de manipulation (dilatation de la queue puis incision etrécupération, coagulation par pensement coagulant) par animal par injection - Collecte d’urine (tous les mois pour tous les animaux) sur animal vigile; durée moins d'une minute par anaimal - Imagerie µCT sur animal anesthésié (5 par groupe), durée d'environ 7 minute par animal.
Impact sur les animaux
Le phénotype âgé est un phénotype dommageable car il peut induire l’apparition de nombreuses maladies. Entre 18 et 24 mois nous nous attendons à avoir 20% de perte d’animaux par mort « naturelle ». Une feuille de score adaptée au vieillissement sera faite pour suivre le bien-être des animaux. On notera que les souris seront systématiquement pesées chaque semaine. Une baisse de 15% du poids de la souris par rapport à la précédente pesée conduira à sa mise à mort.
Devenir
Pour les 2 procédures, nous voulons déterminer l’état physiologique de l’animal et sa durée de vie. Pour cela, nous devons analyser sa survie globale sans souffrance et mettre à mort tous les animaux qui ne seraient pas décédés de causes naturelles pour pouvoir prélever les organes et les analyser en histologie, cytométrie et RNAseq mais aussi de tester les capacités fonctionnelles des cellules ex vivo. L’analyse concernant les tissus ne peut se faire autrement que ex vivo. La mise à mort de l’animal est donc nécessaire afin de pouvoir prélever les organes. Un maximum de tissus seront récupérés afin que de tirer le plus d’information possible de cette expérience. Ainsi, l’objectif scientifique de ce projet nécessite la mise à mort (ou la mort naturelle) de tous les animaux.
Remplacement
La sénescence et le système immunitaire étant un processus intégré impliquant une communication intra- et inter- cellulaire et tissulaire, ce projet nécessite une étude à l’échelle de l’organisme entier. Notre projet vise à étudier les mécanismes biologiques à l’origine du vieillissement et en particulier à l’origine du vieillissement pathologique. Nous voulons comprendre comment un organisme peut vieillir et déterminer si de nouvelles stratégies thérapeutiques peut empêcher le vieillissement pathologique et l’incidence de nombreuses maladies liées à l’âge. Ces mécanismes reposent sur de nombreuses interactions entre différentes cellules telles que les cellules âgées dites « sénescentes » ou les cellules immunitaires mais également sur la communication entre différents organes. À la vue de la complexité des mécanismes étudiés aucun modèle in vitro ou synthétique ne peut mimer le niveau de complexité de ces interactions ni remplacer l’étude sur l’animal. Seul l’analyse au niveau d’un organisme vivant pourra nous permettre de déterminer si le ciblage des cellules sénescentes par notre anticorps permet de limiter la présence des cellules sénescentes dans les tissus, d’évaluer l’état d’activation du système immunitaire, les conséquences sur l’incidence de maladies liées à l’âge, l’effet sur la longévité et sur l’espérance de vie en bonne santé. En revanche, lorsque les mécanismes principaux seront identifiés, leur étude mécanistique sera réalisée le plus possible par des méthodes de remplacement en réalisant des expériences in vitro de coculture.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs avec le nombre minimum de souris pour les 2 approches expérimentales (longévité globale et vieillissement en bonne santé). L’ensemble du projet a donc été conçu pour REDUIRE au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en conservant une puissance statistique robuste. Pour cela nous avons utilisé 3 approches complémentaires. - Tout d’abord une analyse complète des données de la littérature sur les agents sénolytiques pour connaitre la taille des effets biologiques et connaitre les nombres d’animaux et les effets statistiques déjà observés. - Ensuite, nous avons choisi de coupler nos analyses avec un suivi longitudinal des animaux par utilisation de l’imagerie par scanner (microCT ; technique équivalente au PET-Scan utilisé en clinique pour l’évaluation de la fibrose chez l’homme mais adaptée au petit animal). Ceci a pour effet de réduire drastiquement le nombre d’animaux en procédant à un suivi individualisé de chaque souris. - Nous avons « croisés » les contrôles pour les 2 procédures. Ainsi, le groupe contrôle recevra 6 IP d’anticorps isotype contrôle et 6 gavages contrôles, le groupe expérimental D+Q recevra 6 gavages de D+Q et 6 IP d’isotype contrôle et enfin le groupe anti ganglioside recevra les 6 IP d’anticorps anti ganglioside et 6 gavages contrôles. Ceci est exactement identique pour les 2 procédures. Cette stratégie a permis de supprimer complètement un groupe contrôle et donc de réduire le nombre d’animaux utilisé. - Nous réaliserons les 2 procédures en parallèle puisque les animaux sont issus du même lot chez le fournisseur et seront stabulés initialement et traités exactement de façon identique. Ceci permettra de comparer les résultats entre les 2 procédures, d’utiliser les mêmes animaux contrôles de 18 mois (les 15 animaux t0) et donc de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés en évitant de reproduire des contrôles inutilement. - Enfin, nous avons calculé précisément la grandeur de l’effectif nécessaire pour notre étude grâce au logiciel Gpower avec un test ANOVA oneway de puissance statistique de 0.8 associé à un effet taille moyen calculé sur les données déjà publiées d’effet de sénolytique (0.5) pour p≤0.05.
Raffinement
Les procédures de ce projet comprennent les éléments de raffinement suivants : Suivi quotidien des animaux, à l’aide d’une fiche de suivi appuyée par une grille de score clinique comprenant des points limites précoces et adaptés. Les animaux sont hébergés dans des pièces spécifiquement dédiées aux expériences sur le vieillissement permettant d'exercer un suivi plus précis et de limiter le stress et les risques de contamination en réduisant le passage dans ces zones. La conservation d’une cohésion sociale durant la durée de vie de l’animal. L’ajout d’éléments supplémentaire d’enrichissements incluant des maisons à ronger et des twists pour modifier la nidification en complément de l’enrichissement standard incluant des maisons rouges solides et des cotons carrés. Les animaux seront manipulés régulièrement par les mêmes expérimentateurs afin de les habituer et de limiter le stress lors des procédures. Les protocoles d’imagerie non invasive permettant un suivi longitudinal sont menés sous anesthésie gazeuse. L'ensemble de ces mesures de raffinement visent à assurer le bien-être des animaux et assurer des résultats scientifiques de qualité pour éviter toute reproduction expérimentale inutile.
Choix des espèces
Le modèle murin est un modèle de choix avec une physiologie proche de l’homme (squelette osseux, poumons) et un cycle de vie relativement court (animal âgé à 18 mois). Chez la souris, les mécanismes de réparation et de dérégulation de la physiologie des tissus sont très bien décrits. Ils permettent une analyse précise de l'ensemble des phases mises en jeu au cours de ces évènements biologiques. Le modèle murin choisi est le seul nous permettant une approche intégrative des processus impliqués dans les maladies liées à l’âge. En effet, il permet d’étudier de façon concomitante les cellules immunitaires, les cellules sénescentes, l’avancement des maladies et l’expression du ganglioside. La physiopathologie des tissus est considérée suffisamment proche de celle de l’homme pour en tirer des données exploitables. La souris est le seul modèle accessible pour ce genre d’étude afin de répondre au questionnement scientifique de ce projet. Des souris âgées de 18 mois au début des expérimentations seront utilisées. Voulant étudier un large panel de maladies liées à l’âge et à la sénescence, le modèle le plus pertinent est donc d’utiliser des souris en vieillissement, soit ici 18 mois d’âge équivalent à 60 ans chez l’Homme. Les deux procédures décrites ici utiliseront donc des animaux au même stade de développement. Les données de la littérature montrent que certains phénotypes liés à l’âge émergent à partir de 12 mois mais que leur incidence est significativement plus élevée à partir de 18 mois. Pour analyser les capacités thérapeutiques de l’anticorps anti ganglioside et les conséquences de celui-ci sur l’émergence de ces maladies liées à l’âge et la longévité des animaux, nous allons utiliser donc des souris adultes âgées de 18 mois. Ceci nous permettra d’étudier comment le traitement fonctionne dans un organisme déjà vieillissant. D’autre part, en démarrant l’étude avec des animaux issus des mêmes croisements et directement âgés, en provenance du même fournisseur et avec un statut sanitaire SOPF très contrôlé, nous limiterons les effets de variabilité expérimentale.
Analyse des cascades moléculaires du développement de la crête neurale
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
200 xénopes femelles vont être utilisées, réutilisées et non tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une stimulation hormonale pour produire des ovocytes, jusqu'à trois fois par an sur une période reproductive de quinze ans, sans autre geste. Le porteur mentionne par ailleurs que les mâles sont tués pour prélever leurs testicules destinés à la fécondation in vitro, sans que ces mises à mort soient comptées dans le projet. Il affirme que l'usage d'animaux vivants revêt un caractère de "stricte nécessité" faute de lignée cellulaire et d'ovocytes commerciaux.
Objectifs
La crête neurale (CN) est une population cellulaire spécifique de l’embryon des Vertébrés, qui donne naissance à différentes structures telles que le système nerveux périphérique, les cellules pigmentaires, les os et cartilages de la face et du crâne. Des anomalies du développement ou de fonctionnement de la CN sont responsables d’un grand nombre de syndromes ou malformations néonataux. De même, certains cancers résultent de la transformation tumorale de cellules issues de la CN. L’étude des mécanismes qui contrôlent la formation de la CN et sa différenciation est donc cruciale pour en comprendre les dérégulations. De plus, précocement dans l’embryon, les cellules de la CN subissent un processus appelé « transition épithelio-mésenchymateuse (TEM) », qui leur permet de migrer à travers l’embryon vers de multiples organes ou tissus cibles, où elles se différencient en cellules spécifiques. La TEM est un mécanisme général complexe, permettant à des cellules migrer en petits groupes ou de devenir des cellules migrantes individuelles et c’est ce processus que l’on retrouve lors de la formation de métastases. La CN est donc un modèle de choix pour étudier le contrôle de la TEM, comprendre comment ce phénomène est activé et régulé dans l’embryon et comparer ces régulations aux phénomènes de TEM tumorale. Le projet proposé concerne l’analyse des molécules qui contrôlent le développement de la crête neurale et notamment la mise en place de la TEM. Ce programme tire parti d’outils moléculaires sophistiqués créés spécifiquement chez l’embryon d'amphibien. Le projet utilisera des embryons de Xenopus laevis.
Bénéfices attendus
Xenopus laevis, espèce tétrapode non mammifère, est un organisme modèle important pour l’étude du développement des vertébrés en général car ces mécanismes sont fortement conservés évolutivement. De plus cette espèce est évolutivement plus proche des mammifères que le poisson téléostéen. Les études réalisées à partir de ce modèle permettent de mieux comprendre les processus développementaux des modèles tétrapodes mammaliens dont l’homme, comme ceux des autres vertébrés. En outre, l’analyse du génome de Xenopus montre d’importantes similitudes avec le génome humain, notamment 79% des gènes identifiés dans des maladies humaines ont des orthologues chez Xenopus laevis et tropicalis. Notre projet permet donc d'identifier des mécanismes moléculaires, cellulaires et tissulaires qui éclairent les mécanismes d'induction et de diversification cellulaires au cours du développement et des cancers, ainsi que les migrations cellulaire normales et pathologiques (métastases, fibrose). Ces recherches éclairent directement la compréhension des malformations congénitales et des cancers ainsi que, à terme, les stratégies de diagnostique et de prise en charge des patients. Le modèle amphibien présente de nombreux avantages techniques tels que la facilité d’accès à ses ovocytes (ponte externe, conservation des femelles), l’accessibilité à l’expérimentation dans le milieu de culture des embryons et l’abondance du matériel d’expérimentation (milliers d'œufs par ponte). L’utilisation de cette espèce permet donc de réduire le nombre de femelles adultes utilisées et de remplacer l’emploi de femelles mammifères.
Procédures
Injection sous cutanée d’une substance non toxique et indolore en une seule administration sur animaux vigiles tous les 4 mois.
Impact sur les animaux
Les femelles seront utilisées uniquement pour la production d’ovocytes. En dehors de la stimulation hormonale, les animaux ne subiront aucun geste. Aucune nuisance n’est donc attendue ici.
Devenir
les femelles retournent en élevage dans les animaleries.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants revêt un caractère de stricte nécessité pour les raisons suivantes : - il n'existe pas de lignée cellulaire immortalisée de cellules de CN, nécessitant de préparer des cellules primaires issues d'embryons ; de plus les analyses en culture ne donnent que des réponses incomplètes des mécanismes in vivo - les analyses in vivo sont indispensable à l'analyse des signalisations endogènes et des migrations cellulaires - il n’existe pas de solution commerciale pour la fourniture d’ovocyte. - le but étant d'étudier le développement des cellules de la crête neurale et la TEM in vivo, il est nécessaire que cela se fasse à l'échelle de l'organisme
Réduction
Pour réduire à son minimum le nombre d’animaux utilisés sans compromettre les objectifs du projet, nous prenons en compte que : - Nos analyses fonctionnelles sont restreintes aux stades embryonnaires antérieurs à la forme larvaire autonome. - Les femelles ont une période reproductive longue (15 ans et plus), et peuvent donc être induites à pondre de nombreuses fois pendant cette période. Ceci permet donc de restreindre le nombre d'animaux utilisés. Par ailleurs, l’induction hormonale de la ponte constitue la seule méthode pour obtenir en grande quantité des embryons. De plus le recours à la fécondation in vitro permet d'obtenir le développement synchrone des embryons et des stades précis, en nombre suffisant pour satisfaire aux analyses statistiques (tests de conformité à un standard). Il s'agit de la seule façon d’obtenir des ovocytes matures de manière non invasive (sans chirurgie). - De plus, bien que le sacrifice d’animaux qui n’ont subi aucun geste expérimental et qui ne présentent pas de phénotype dommageable ne nécessite pas d’autorisation de projet, il est à noter que les testicules des mâles euthanasiés disséqués pour la fécondation in vitro sont utilisés pour plusieurs expériences et par plusieurs expérimentateurs minimisant ainsi le nombre de mâles sacrifiés.
Raffinement
Dans le but de réduire le plus possible toute douleur, souffrance ou stress, nous utilisons les femelles par roulement. Nous limitons les stimulations hormonales à 3 par an (une tous les 4 mois).
Choix des espèces
L'amphibien Xenopus laevis est un organisme modèle important pour l’étude du développement des vertébrés. Il occupe une place phylogénétique-clé (vertébré tétrapode non-mammifère). Le génome est séquencé. Nous disposons à présent des génomes pour deux espèces : X.tropicalis et X.laevis et l’analyse montre d’importantes similitudes avec le génome humain, notamment 79% des gènes identifiés dans des maladies humaines ont des orthologues chez Xenopus laevis ou tropicalis. X.laevis est un modèle de choix en biologie du développement. En effet, il est facile à élever et à maintenir en laboratoire. Les ovocytes sont récupérés par pontes externes (i.e. par une procédure non invasive) qui peuvent être obtenues toute l'année après stimulation hormonale. Les embryons sont nombreux et robustes. Le développement externe permet des analyses d’embryologie expérimentale dès la fécondation et une observation non-invasive à tous les stades. Tout comme le poisson zèbré, le xénope fait partie d’une sélection de modèles pour lesquels les approches de génomique fonctionnelle sont réalisables. Il s’agit d’animaux adultes ayant atteint la maturité sexuelle pour qu’ils puissent se reproduire.
Thérapie cellulaire de la sclérodermie systémique
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
1700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections quotidiennes d'acide hypochloreux dans la peau, cinq jours par semaine pendant six semaines, induisant une fibrose et des ulcérations cutanées, pour tester une thérapie cellulaire contre la sclérodermie. Elles sont toutes tuées en fin de procédure pour prélever les organes. Le porteur affirme que l'efficacité d'un tel traitement ne peut être évaluée sur les seuls modèles in vitro dans un contexte d'inflammation et de fibrose.
Objectifs
La sclérodermie systémique (ScS) est une maladie auto-immune grave. Elle est caractérisée par une fibrose systémique, des anomalies vasculaires et une auto-immunité. Cette fibrose peut concerner d’autres organes que la peau, notamment le poumon qui représente une atteinte fréquente, sévère et mortelle de cette maladie systémique. Elle touche aussi les reins ou le cœur. Des thérapies basées sur les cellules stromales mésenchymateuses (ASC) sont en cours d'évaluation clinique et les résultats préliminaires sont encourageants. Nous avons récemment montré que les vésicules extracellulaires (VE) produites par ces cellules ont des effets biologiques comparables aux cellules parentales. Cependant, des données controversées existent sur la capacité thérapeutique des ASC isolées de patients et aucune étude in vivo dans un modèle proche de la pathologie humaine n’a été réalisée. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique des cellules stromales mésenchymateuses ou des vésicules extracellulaires issues de patients sur la sclérodermie induite chez la souris.
Bénéfices attendus
Ces approches de thérapie cellulaire chez l’animal ont une portée translationnelle avant leur utilisation en clinique chez des patients souffrant de sclérodermie et pour lesquels il n’existe aucun traitement disponible à ce jour. Les cellules sont déjà en cours d’évaluation en clinique et les vésicules extracellulaires pourraient être utilisées à moyen terme dans cette pathologie. Nos études in vitro ont identifié des molécules qui pourraient jouer un rôle dans l’effet thérapeutique des cellules. Si elles confirment leur intérêt in vivo, nous pourrions valider un nouveau médicament plus efficace que les cellules en cours d’évaluation clinique. En terme de santé publique, l’impact attendu est majeur puisqu’il n’existe pas de traitement de la sclérodermie qui est une maladie mortelle. Améliorer les stratégies actuelles de thérapie cellulaire aura des retombées énormes à moyen terme sur la prise en charge des patients.
Procédures
Les animaux recoivent des injections d’acide hypochloreux (HOCl) en intra-dermique (5 jours/semaine pendant 6 semaines) et une injection intraveineuse du traitement 1 fois à J21. L’épaisseur de la peau est mesurée au site d’injection avec un caliper toutes les semaines pour évaluer la fibrose cutanée. Ces mesures permettent d’avoir un suivi clinique de la pathologie.
Impact sur les animaux
Les cellules stromales mésenchymateuses et leurs vésicules extracellulaires ont été déjà validées pour leur rôle thérapeutique dans ce modèle de sclérodermie avec un bénéfice associé au traitement. Les injections répétées d’HOCl peuvent générer un inconfort des souris mais elles ne montrent plus de signes d’inconfort après quelques jours de manipulation quotidienne. L’injection quotidienne d’HOCl prend moins d’1 min sans anesthésie. Le modèle peut provoquer des ulcérations cutanées mais qui sont améliorées par le traitement. Le suivi des ulcères est réalisé au quotidien et les injections de HOCl sont suspendues le temps de la cicatrisation.
Devenir
L’ensemble des animaux sera euthanasié à l’issue des procédures pour permettre l’analyse du modèle expérimental et des traitements réalisés (prélèvements d’organes et histologie).
Remplacement
Avant de proposer une thérapie cellulaire chez l’homme, il est important de démontrer l’efficacité thérapeutique des cellules stromales mésenchymateuses ou de leurs vésicules extracellulaires dans un modèle pré-clinique pertinent. Des modèles in vitro sont utilisés en amont mais ne suffisent pas seuls à évaluer l’efficacité de ces traitements dans un contexte in vivo comportant de l’inflammation, de la fibrose et du remodelage tissulaire qui sont observés au niveau cutané et pulmonaire.
Réduction
Nous nous sommes basés sur les expériences réalisées précédemment au laboratoire et avons calculé que l’inclusion de 8 souris par groupe expérimental permet d’obtenir des valeurs significatives pour au moins deux marqueurs importants de la maladie.
Raffinement
Enrichissement du milieu : Les animaux sont hébergés en portoirs statiques avec couvercles filtrants. L’enrichissement du milieu consiste en l’apport de copeaux dans les litières et carrés de cellulose. Des igloos sont également installés dans les cages. Les animaux font l’objet d’un contrôle quotidien. Surveillance liée aux procédures : Les souris sont examinées tous les jours pour vérifier l’apparition potentielle d’ulcères et l’absence d’infections. Si un ulcère apparait, le comportement des souris est particulièrement observé pour s’assurer que d’autres signes de souffrance n’apparaissent. L’injection intraveineuse des traitements est une procédure très rapide qui ne génère qu’un léger stress lié à la manipulation des souris pendant moins d’une minute
Choix des espèces
Le modèle murin de sclérodermie systémique a été choisi parce qu’il présente l’avantage de reproduire assez fidèlement les caractéristiques cliniques observées chez l’homme et est considéré comme une référence de sclérodermie. Les animaux sont utilisés à l’âge de 6 semaines, à maturité sexuelle. Les études de mise en place du modèle ont montré une incidence à 100% de la sclérodermie.
Etude de biodistribution de vecteurs AAV (visant à traiter des dystrophies musculaires) chez le primate non-humain par injection systémique
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système musculosquelettique
4 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent par voie intraveineuse des vecteurs viraux de thérapie génique, subissent des prélèvements sanguins répétés sous anesthésie, puis sont mis à mort pour prélever organes et tissus. Le projet vise à vérifier chez le primate si un vecteur efficace chez les rongeurs conserve ses propriétés avant un éventuel essai chez l'humain. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à une espèce proche de l'humain et décrit le macaque comme l'"espèce de choix" pour la biodistribution.
Objectifs
Les dystrophies musculaires englobent un groupe hétérogène de maladies neuromusculaires rares. Ce sont des maladies génétiques pour lesquelles plus de trente gènes ont été identifiés à ce jour. Les plus fréquentes sont la myopathie de Duchenne, la myopathie facio-scapulo-humérale et le groupe des dystrophies musculaires des ceintures. Elles se manifestent par une diminution progressive de la force des muscles qui va conduire dans la majorité des cas à la perte de la marche . Elles impactent donc fortement sur la qualité de la vie du patient. Dans certaines formes, l’atteinte des muscles cardio-respiratoires est une cause majeure de mortalité et de morbidité. Il n’existe pas de traitement à l’heure actuelle et uniquement la prévention des complications. Il existe donc un besoin médical important. Au vu du caractère génétique de ces maladies, des pistes de traitement possibles s’orientent vers la thérapie génique en utilisant des virus (vecteur) comme transporteur de gènes correcteurs. Etant donné que le muscle représente plus de la moitié de la masse corporelle, ces approches nécessitent des doses élevées de vecteur afin de pouvoir atteindre de façon efficace le tissu cible. Ces doses posent des questions de sécurité. Il est donc important d’améliorer l’efficacité des vecteurs. Ce projet se place dans cet objectif. Il vise à déterminer si un vecteur nouvellement développé avec une affinité plus grande pour le muscle squelettique chez les rongeurs va conserver cette propriété dans une espèce la plus proche possible de l’homme afin d’évaluer les perspectives d’utilisation de ce vecteur en essai clinique chez l’homme. Dans ce projet, nous voulons comparer la biodistribution d’un de ces nouveaux vecteurs par rapport à un vecteur déjà connu chez le macaque. Un système de « code-barres » a été développé pour pouvoir retrouver séparément les vecteurs lors des analyses moléculaires, les deux vecteurs peuvent donc être injecté dans les mêmes animaux. Cette stratégie a pour intérêt de réduire le nombre d’animaux nécessaires au projet.
Bénéfices attendus
Les bénéfices devant découler de ce projet concerne le domaine de la santé humaine. Il vise à valider un nouveau support de thérapie génique sous la forme d’un nouveau vecteur dérivé du virus associé à l’adéno-virus, Ce vecteur a été validé chez les rongeurs comme permettant un transfert de gène augmenté dans le muscle. L’objectif du projet est de valider que cette propriété se retrouve chez le macaque, espèce proche de l’homme. La validation de ce vecteur permettra des applications thérapeutiques chez l’homme dans le domaine des maladies musculaires qui n’ont pas de traitement disponibles à ce jour. Ce vecteur permettra une meilleure efficacité et une meilleure sécurité des stratégies de thérapie génique des maladies musculaires
Procédures
Le but de cette étude est d'injecter par voie intraveineuse (IV) les différents vecteurs AAV afin d’en déterminer la biodistribution . L’injection sera réalisée sur animal anesthésié en perfusion lente sur 30 min et au niveau de la veine saphène. Des prélèvements sanguins seront effectués juste avant l’injection du vecteur, mais aussi tout au long de l'étude sous anesthésie légère, pour permettre un suivi hématologique et biochimiques, et pour stock de sérum pour toute analyse ultérieure. Une détermination de la sérologie sera en outre réalisée en pré-injection ainsi qu’au sacrifice de l’animal. Des prélèvements post-mortem seront réalisés en fin de protocole.
Impact sur les animaux
A ce jour, l’administration intraveineuse de vecteurs AAV chez le macaque n’a pas d’effet délétère notable sur l’état de santé général de l’animal (études menées par plusieurs équipes de recherche). La majorité des gestes réalisés sur ces animaux seront non invasifs (injection du vecteur thérapeutiques par voie IV lente, et prélèvements sanguins par ponction veineuse). Ils seront réalisés sur animaux anesthésiés L’euthanasie sera également réalisé sous anesthésie, et une injection de morphine sera réalisée avant l’acte afin de garantir une analgésie. Si besoin, avec accord du vétérinaire de l’UE, un traitement analgésique (ex : Buprénorphine ou Perfalgan si douleur) pourra être mis en place dans les jours suivant la procédure. - Un suivi rapproché des paramètres cliniques (observations quotidiennes et examens cliniques) et des paramètres sanguins (hématologie et chimie clinique) des animaux sera mis en place afin de pouvoir détecter toute anomalie.
Devenir
A l'issu de la procédure décrite dans ce projet, tous les animaux de cette étude seront sacrifiés afin d’obtenir des échantillons de tissus et d’organes et ainsi déterminer la biodistribution, vérifier l’absence de toxicité et l’expression du vecteur. Ces analyses ne peuvent se faire du vivant de l'animal.
Remplacement
Notre projet s’inscrit dans une démarche translationnelle. Les études nécessitant le recours à l’animal, du rongeur au Primate Non-Humain (macaques fascicularis), correspondent aux étapes précliniques permettant potentiellement de passer aux études cliniques chez l’Homme. Afin d’estimer l’efficacité de nos approches expérimentales, il est nécessaire d’administrer les vecteurs dans un organisme entier capable de répondre physiologiquement aux traitements administrés. Ceci ne peut être obtenu in vitro, et justifie notre recours à des animaux.
Réduction
Quatre animaux seront inclus dans l’étude et seront injectés avec un mélange de vecteur marqué par un « code-barres » à une seule dose. Ce système permet d’injecter en même temps les deux vecteurs et ainsi de diviser par deux le nombre d’animaux nécessaires. Cela permet également la variabilité interindividuelle. Le nombre d'animaux (n=4 animaux) utilisé est donc réduit à son minimum pour une exploitation possible des résultats. Cette répartition permettra d’obtenir des résultats cohérents et reproductibles. Une analyse statistique ne sera réalisée que pour les mesures où le nombre d’échantillons permettra d'avoir une puissance statistique suffisante. Afin de réduire le nombre d’animaux d’avantage, le groupe témoins injectés avec le véhicule sera celui du projet précédent.
Raffinement
L’état général et l’alimentation des animaux seront surveillés quotidiennement (techniciens animaliers et vétérinaire). Des protocoles anesthésiques seront mis en place selon la procédure à réaliser. Les administrations expérimentales se dérouleront sous anesthésie générale. Les prélèvements sanguins seront effectués sous protocole anesthésique permettant d'obtenir une anesthésie de courte durée (environ 10 min.). Ces actes étant peu douloureux, aucun protocole analgésique ne sera mis en place d'emblée pour ces procédures. Pour favoriser les échanges sociaux entre animaux et favoriser leur bien-être, les macaques seront hébergés en cage en post-injection, et en volières dès que possible pour favoriser les déplacements verticaux.
Choix des espèces
L’objectif principal de ce projet étant d’évaluer le tropisme et la biodistribution d’un nouveau vecteur, il est indispensable de choisir en conséquence l’espèce animale adaptée pour en déduire au plus près le comportement du vecteur chez l’homme. Les études chez le primate non-humain apportent les meilleures connaissances transposables à l’homme en terme de ciblage de tissus et de biodistribution du vecteur. Des études préalables ont été menées chez le rongeur avec ce même mélange de vecteurs. Aussi, la capacité de ces vecteurs viraux à pénétrer dans un organe/tissu et y faire exprimer un gène thérapeutique est dépendante de l'espèce. Un vecteur peut être efficace chez le rongeur mais pas chez l'homme. Le macaque fascicularis représente l’espèce animale de choix dans le modèle pré-clinique de par sa morphologie, sa physiologie, sa proximité phylogénétique et sa similitude avec le système immunitaire de l’homme. 4 singes (Macaca fascicularis) mâles (2-3 ans, 2-4 kg) seront inclus dans l’étude. Il s'agit donc de jeunes adultes, matures sur le plan immunitaire notamment. Les dystrophies musculaires des ceintures se manifestent généralement chez l’adulte jeune
Etude, chez le rat à microbiote humain, des flux microbiens et de l’impact sur la santé de produits laitiers fermentés (yaourts et fromages) fabriqués à partir de lait de vaches issues d’élevages agro-écologique ou intensif.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
224 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nés sans flore intestinale, ils reçoivent par gavage le microbiote de volontaires humains, subissent des prélèvements de selles hebdomadaires, un passage isolé de 24 heures en chambre respiratoire et une contention en tube pour mesurer leur composition corporelle, avant autopsie. Le porteur reconnaît que l'hébergement individuel et le gavage sont sources de stress, tout en les présentant comme brefs. L'objet du projet est de comparer l'effet sur la santé de yaourts et fromages issus d'élevages "agro-écologique ou intensif", et il affirme un "recours absolu" au modèle animal.
Objectifs
L’objectif du projet est de déterminer si des produits laitiers fermentés (yaourts et fromages affinés) fabriqués à partir de lait de vaches élevées en système agro-écologique ou intensif, impactent différemment la santé du consommateur
Bénéfices attendus
Le projet vise à faire la preuve de concept de la divergence de qualité de différents produits laitiers (fromages affinés ou laits fermentés) fabriqués à partir de lait de vaches en élevage agro-écologique ou intensif et des conséquences positives ou négatives respectives sur la santé du consommateur
Procédures
Les animaux seront soumis à 4 types d'interventions au cours du pojet : 1) gavage orogastrique permettant l'implantation du microbiote du volontaire chez les rats axéniques (animaux nés sans microflore bactérienne colique) : 1 seule intervention, en tout début de projet et d'une durée inférieure à la minute car elle est pratiquée par des zootechniciens formés et expérimentés 2) prélèvements de selles : 1 intervention pas semaine et par animal, d'une durée inférieure à la minute, 3) Le passage dans les chambres respiratoires, qui permet de mesurer les gaz excrétés par les animaux (H2, CO2 et CH4), est réduit à son minimum de 24h et enfin 4) la composition corporelle est mesurée a l'aide d'un appareil analytique type RMN qui effectue les mesures en 3 min, pendant cette durée les animaux sont contentionnés dans un tube PVC afin qu'ils restent immobiles pour la précision des mesures.
Impact sur les animaux
Il s’agit d’un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif, en particulier celles réalisées à partir d’animaux gnotobiotiques à microbiote humain. Le rat est en effet reconnu pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote humain du donneur. Les donneurs étant, dans le cadre de ce projet des volontaires sains, l'alimentation est, de plus, adaptée, n'entrainant pas de troubles digestifs ou de croissance. La supplémentation, basée sur des produits laitiers fermentés de consommation courante, n'entraine pas non plus de nuisance ou d'effets indésirables pour les animaux. Cependant le gavage orogastrique qui va permettre l'établissement du modèle peut être source de stress, lié à la contention de l'animal. C'est pourquoi les animaux sont préalablement conditionnés à la manipulation et que le geste technique est réalisé par des zootechniciens formés et expérimentés qui vont limiter significativement la durée de ce stress potentiel (moins d'une minute). De la même façon, le prélèvement de selles chez l'animal peut être source de stress lié, également, à sa contention nécessaire, toutefois considérant la fréquence (1 fois pas semaine) et de la rapidité du geste (moins d'une minute), les effets indésirables sont très limités. Le placement des animaux en cage individuelle peut occasionner un stress lié à la découverte d'un nouvel environnement et à l'absence de congénaire. Bien que les animaux s'adaptent rapidement, une surveillance accrue sera mise en place pendant toute la durée de la procédure pour détecter d'éventuels signes de mal être. Si des signes apparaissent et persistent pendant les 3 premières heures du passage en chambre respiratoires, les animaux retourneront dans leurs hébergements d'origine. Ce stress est limité par le temps de passage dans les chambres respiratoires réduit à son minimum (24h) et des enrichissements type Sizzle Nest sont également ajoutés à l'environnement pour permettre la réalisation de nid par les animaux.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de cette procédure puis autopsiés afin de récupérer l'ensemble des organes et fluides métaboliques nécessaires aux futures analyses biologiques, génomiques et histologiques.
Remplacement
L’évaluation de l’impact santé de produits laitiers fermentés étudiés (yaourts et fromages produits à partir de lait de vaches en élevage agro-écologique ou intensif) nécessite le recours absolu à un modèle animal pour atteindre notre objectif. Il est en effet très difficile voire impossible d’analyser l’effet potentiel de ces produits sur l’intégrité intestinale (perméabilité, immunité) et la santé cardio-métabolique (masse grasse, tissus adipeux et hépatiques) chez l’homme. Ceci nécessite en effet une alimentation contrôlée et similaire pour tous les individus ainsi que des mesures et des prélèvements particulièrement difficiles à effectuer chez l’homme.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au strict nécessaire pour observer des effets statistiquement significatifs. De plus, les tissus prélevés seront soient analysés pour répondre au questionnements scientifiques proposés par le projet, soient conservés pour de futures analyses, non prélablement prévues dans le cadre du projet, et qui pourraient complémenter les résultats obtenus.
Raffinement
Les procédures, nécessitant un raffinement de leur exécution pour limiter leur impact sur les animaux, sont les gavages orogastriques, les prélèvements de selles et le passage en chambre respiratoire. Celles ci seront réalisées par des zootechniciens formés et expérimentés qui permettront de limiter la durée de la procédure par animal (moins d'une minute pour le gavage et les prélèvemets de selles. De plus, avant la première intervention, une habituation à la contention sera réalisée prélalablement par ces zootechniciens permettant ainsi de diminuer le stress suceptible d'être occasionné par ce geste technique. Les animaux font l'objet d'une surveillance quotidienne pour détecter, réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse. la classification modérée lors du passage en chambre respiratoire est justifiée par le fait que les animaux doivent etre places seul dans ces equipements afin de mesurer individuellement les excretions de gaz. Quelle que soit la procédure appliquée, si un animal présentait les signes suivant : perte de poids, prostration, comportement agressif, léthargique, etc... (points limites notables) ou plaies, saignement nasaux ou fécaux, etc...(points limites graves), l'arbre de décision concernant l'application des point limites serait suivi immédiatement.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies sont des rats mâles nés axéniques de la lignée Fischer âgés de 8 semaines. Il s’agit d’un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif, en particulier celles réalisées à partir d’animaux gnotobiotiques à microbiote humain. Le rat est en effet reconnu pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote humain du donneur. Il permet également le recueil d’une quantité plus importante de fèces et de contenus caecaux nécessaires aux études de la composition et de l’activité du microbiote intestinal que la souris. Les rats seront âgés de 8 semaines au moment de l'implantation du microbiote de volontaire par gavage oro gastrique. Cet âge correspond à un stade de développement optimal pour l'acceptation et la stabilisation dans le temps du microbiote transplanté.