Éthologie / comportement / biologie animale

Une amputation de la phalange distale dans les huit premiers jours de vie, pratiquée sur toutes les souris pour les identifier et les génotyper, ouvre le protocole. 5 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, exposées à des sons de deux heures et pouvant aller jusqu'à huit heures, puis suivies par des séances d'audition d'une heure toutes les une à deux semaines, une partie subissant en plus une chirurgie d'une heure suivie de deux heures de mesures. L'objet est de mesurer ce que le bruit abîme dans le système auditif et ses relais cérébraux, chez des souris dont beaucoup portent des mutations de gènes de surdité. Toutes sont tuées, le porteur indiquant qu'elles "ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés", et que leurs corps servent ensuite, quand c'est possible, à des entraînements à la dissection au sein du centre de recherche.

Objectifs

Objectif : Etudier les conséquences d’un son d’intensité moyenne à forte et ce dans la durée sur les réseaux neuronaux auditifs et la santé des individus. LE SYSTEME AUDITIF Le système auditif humain comprend l’oreille externe, l’oreille moyenne, l’oreille interne, ainsi que les centres neuronaux de traitement des stimuli auditifs. La cochlée comporte l’organe de Corti, qui abrite les cellules sensorielles, dites cellules ciliées. Il repose sur une membrane basilaire, qui contribue à l’analyse fréquentielle du son. Il y a quelques 14 000 cellules ciliées chez l’homme. Sous l’effet de la stimulation sonore, leur dépolarisation conduit à la libération de neurotransmetteur. Au total, ces 30 000 neurones chez l’homme forment le nerf auditif, qui lie la cochlée au noyau cochléaire, premier relais auditif du cerveau. Ensuite, l’information chemine à travers les divers autres noyaux du cerveau jusqu’au centre auditif. LE BRUIT ENVIRONNEMENTAL L’exposition à un bruit excessif est la première cause environnementale de troubles de l’audition. La surexposition sonore dans les mégapoles dont la densité de population ne cesse de croître ainsi que dans de nombreuses activités de loisirs pour lesquelles l’exposition sonore est peu ou mal contrôlée constitue une menace grandissante pour l’audition à l’échelle planétaire. Les conséquences au niveau central, aussi bien du point de vue des réseaux neuronaux que du point de vue des performances de l’individu dans des tâches auditives sont en outre peu étudiées. A un niveau plus intégratif encore, les conséquences du bruit sur la santé des individus et leurs interactions sociales restent également un sujet de recherche actif. Des résultats suggèrent en outre que les lésions cochléaires dues à une surexposition au bruit sont à l’origine d’une exacerbation de la progression de la perte auditive liée à l'âge (presbyacousie).

Bénéfices attendus

En caractérisant les atteintes auditives liées à la surexposition sonore et également dans les formes génétiques de surdité, notre projet permettra les avancées suivantes : - Nous déterminerons les mécanismes physiopathologiques à l’origine des surdités dans les modèles porteurs des mutations des gènes étudiées. - Un grand nombre de cas de surdités progressives reste souvent inexpliqué. En caractérisant très finement la signature audiologique des souris mutantes, notre travail aidera à identifier les cas de surdités non expliqués qui pourraient être liés à des expositions sonores répétées d’intensités moyennes. - Enfin, notre travail générera des pistes pour de nouvelles approches thérapeutiques susceptibles de prévenir la surdité chez les patients exposés ou porteurs de mutations spécifiques dans des gènes de surdité en testant de nouvelles molécules aux effets protecteurs face à une exposition traumatique sonore.

Procédures

Les interventions seront : - Un prélèvement de phalange sera effectué sur tous les animaux pour l’identification des souris, dans les 8 premiers jours de vie du projet afin de déterminer s’ils sont porteurs ou non de mutations du gène étudié et pour pouvoir commencer les expérimentations à partir du stade P12. Cette procédure dure une dizaine de secondes. Les prélèvements seront utilisés pour le génotypage. De plus cela permettra de constituer les cohortes avant le sevrage et de ne pas maintenir en vie des animaux non nécessaires à la reproduction ou aux expérimentations. Pour les expérimentations sur l’adulte, les animaux seront identifiés soit par prélèvement auriculaire soit par une puce implantée en sous-cutané. - Nous effectuerons un suivi de l’audition de modèles de souris pour des atteintes auditives à la suite de de l’exposition sonore et dépendant du gène étudié. Ce suivi aura lieu à la suite de l’exposition et au cours du temps, approximativement toutes les unes à deux semaines afin de suivre l’évolution de la surdité induite par le bruit. Chaque suivi dure environ 1h. - Une partie des animaux auront une chirurgie soit terminale soit pour permettre des enregistrements électrophysiologiques sur l’animal éveillé ensuite. Chaque chirurgie aura une durée de 1h et suivi de 2h de mesures fonctionnelles.

Impact sur les animaux

La plupart des procédures impliquent des expérimentations légères ou modérées ou une succession d’expérimentations légères. Quelques manipulations du projet pourraient entraîner des nuisances : - L'identification se fait par amputation de la phalange distale dans les 8 premiers jours de vie, douleur au moment de l’amputation. - Certaines expositions sonores d’une durée de 2h et pouvant aller jusqu’à 8h pourraient induire un stress temporaire sur l’animal, n’excédant pas quelques heures. C’est pourquoi les différentes mesures utilisant ces tests sont espacées dans le temps. Les études des cinquante dernières années sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité liée au bruit chez les rongeurs. - En ce qui concerne les chirurgies : Si celles-ci sont terminales, un protocole de médication antidouleur sera appliqué à l’animal en début de procédure. Pour les chirurgies de préparation aux enregistrements neuronaux sur animal éveillé, la douleur et l’inconfort modérée seront contrôlés par des antalgiques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, l’ensemble des animaux du projet sont des organismes génétiquement modifiés, de nombreuses procédures nécessitent la mise à mort de l’animal pour récupérer des tissus afin d’effectuer différentes expérimentations ex vivo. D’autres procédures impliquent des interventions qui signifient qu’on ne peut pas les réutiliser. La plupart des animaux sont porteurs de mutations de gènes de surdité très spécifiques rendant impossible leur réutilisation par d’autres équipes. Cependant, une fois les animaux mis à mort, nous essayons de les utiliser pour des entraînements à la dissection et la mise au point de nouveaux protocoles lorsque c’est possible. Ces partages se font typiquement à l’échelle du centre de recherche au-delà de notre équipe.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative que ce soient des études au niveau cellulaire ou tissulaire ne sont connues et envisagées pour ce projet. En effet, il n’est pas possible actuellement de simuler de manière pertinente les effets des entrées sensorielles sur des circuits cérébraux composés de millions de neurones densément connectés, en interaction avec l’évolution des niveaux de stress des animaux.

Réduction

La réduction a pour objectif d’utiliser le nombre suffisant d’animaux pour avoir des résultats scientifiques significatifs. Les groupes sont constitués afin de garantir une puissance statistique de 80% pour des différences de 20%. Nous utilisons des tests classiques pour tester la significativité de nos résultats. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et nous appliquons plusieurs mesures sur le même animal dès que possible.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement par les expérimentateurs ou les zootechniciens. Ce projet ne concerne que des procédures dont la mise en œuvre ne devrait se traduire ni par une dégradation de l’état de santé de l’animal ni par des douleurs importantes. Si nous observions un comportement anormal en termes de santé (observation du poids, du pelage, etc.) dès l’initiation de l’intégration dans un groupe expérimental, l’animal serait immédiatement mis à mort. Plusieurs méthodes de raffinement sont utilisées dans nos projets. Nous avons par exemple veillé à ce que nos tests comportementaux ne reposent pas sur des motivations par des déprivations de nourriture ou d’eau. Lors des chirurgies, des antalgiques et des couvertures chauffantes sont utilisées afin de limiter au strict minimum le risque d’hypothermie et de stress physique. Un renforcement des enrichissements (igloo, coton, tunnel, roue…) est utilisé dans les cages d’hébergements. En cas d’hypothermie, des couvertures chauffantes sur le fond de la cage sont également utilisées. En cas de déshydratation, des réhydratations sous-cutanées sont réalisées ainsi que la fourniture de gel nutritif ou de croquettes mouillées. Plusieurs points limites spécifiques et précoces pendant la chirurgie (hémorragies, baisse des constantes vitales etc…), post-chirurgie (infections, douleurs persistantes) ou post-stimulation sonore basés sur une grille de scorage incluant aspect extérieur, activité de déplacement, capacité à boire et s’alimenter, réactivité à la préhension, isolement du groupe, sont établis pour éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Nous souhaitons recourir aux souris de laboratoire dont le système auditif est similaire à celui de l’homme. De plus, la souris de laboratoire est le seul mammifère modèle pour lequel on dispose d’outils génétiques conséquents. L’audition se met en place chez la souris autour de P10-P12. Le projet impliquera principalement donc des animaux âgés d’au moins P10 afin de pouvoir étudier les effets du bruit sur le système auditif au cours de la vie de l’animal.

Une instillation nasale de virus grippal ou une injection de cytomégalovirus dans le péritoine, puis une série de tâches non nommées mesurant anxiété, humeur et mémoire : 856 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'infection provoque un syndrome fébrile pouvant durer sept jours, avec perte de poids et anxiété, et chaque souris passe jusqu'à dix jours seule en cage pour l'évaluation individuelle. Le porteur écrit pourtant que "les tests comportementaux ne génèrent aucun stress" et qu'il n'a pas noté d'état de stress lié à l'isolement, dans un projet dont l'objet est précisément de mesurer un état d'abattement et d'isolement provoqué par l'infection. Toutes sont tuées en fin de procédure pour prélever organes et sang.

Objectifs

Le système immunitaire est requis pour la défense de l’hôte contre les agressions de corps étrangers (virus, bactéries, etc..). Les cellules dendritiques (DC) sont des acteurs clés du système immunitaire, en première ligne dans la reconnaissance des microbes. Lorsqu’elles détectent un corps étranger, les DC produisent des molécules véhiculées dans tout le corps pour orchestrer l’activation de tous les autres acteurs du système immunitaire. Une production de ces molécules spécifiques dérégulée en temps et/ou en quantité peut avoir un rôle délétère, parfois fatal, sur l’individu infecté, comme observé récemment dans le cadre du Covid. Au cours des infections virales, les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC), sont la principale source de molécules spécifiques qui signalent l'infection et sont source d'inflammation appelées Interférons (IFN). Les IFN sont indispensables pour limiter la propagation de virus. Cependant, lorsque les pDC sont absentes ou incapables de produire des IFN, l'hôte infecté contrôle toujours efficacement l'infection. La capacité des pDC de produire des IFN est retrouvée dans la majorité des vertébrés, cette capacité est donc probablement très ancienne. Il est alors possible que cette fonction ne serve pas uniquement à combattre des infections virales, mais aussi à remplir d'autres fonctions importantes dans l'organisme. Notre objectif est de tester si les molécules produites par les pDC induisent un état d'abattement, d’isolement et d'affaiblissement des capacités de reconnaisance/conscience de l'environnement à court ou long-terme, comportement qui ressemble aux états dépressifs. Les pDC pourraient aussi participer à la mise en place d'une détérioration des cellules du cerveau dans la maladie d'Alzheimer (AD), la première maladie neurodégénérative qui affecte plus d'1 million de personnes en France, a un poids sociétal lourd pour les familles et reste sans traitement efficace. Afin de tester cette hypothèse nous induirons la perte des cellules pDC dans un modèle de souris, combinée ou non à des caractéristiques de la maladie d'Alzheimer et que nous infecterons avec deux types de virus : la souche A du virus de la grippe (IAV) qui induit une infection restreinte du système respiratoire, ou le cytomégalovirus murin (MCMV) qui induit une infection dans tout l'organisme et persiste sous forme latente, cachée. Nous évaluerons l’impact de ces infections sur le comportement des souris par des tests comportementaux.

Bénéfices attendus

Nos travaux vont certainement contribuer à accroitre nos connaissances concernant les interactions entre systèmes immunitaire et nerveux. Si notre hypothèse est correcte, il sera envisageable de cibler la production d'agent participant à l'inflammation pour développer de nouvelles stratégies de thérapie pour les patients dépressifs, ou souffrant d'un affaiblissement des capacités de reconnaisance/conscience de l'environnement progressifs. Ces nouvelles approches seront d’abord validées dans un cadre infectieux, ensuite elles pourront être étendues à d’autres contextes inflammatoires, les maladies impliquant une dégénérescence des cellules du cerveau et en particulier la maladie d'Alzheimer.

Procédures

Des souris seront infectées soit par une courte injection par voie intrapéritonéale à l'état vigile d'un faible volume de liquide physiologique contenant du virus. D'autres souris recevront une faible dose de virus par instillation nasale réalisée une seule fois sous anesthésie générale gazeuse de courte durée. Une prise de sang sera effectuée sur les souris infectées, une seule fois sur animal vigile. Il s'agit d'un geste rapide (moins de 5 minute par souris). Un point de compression sera ensuite réalisé à l'aide d'une compresse stérile jusqu'à arrêt d'un saignement potentiel. Les souris effectueront ensuite une séquence de tâches afin d'évaluer leur comportement et plus précisément leur niveaux naturels d'anxiété, leur humeur motivée ou déprimée, et leurs capacités d'apprentissage et de mémoire. La séquence durera moins de deux semaines et comprendra la séparation des animaux pour leur évaluation à l'échelle individuelle sur une durée correspondant à moins de 30 minutes au total par jour pendant 4 jours, ou pendant moins de 10 jours dans le cas de l'évaluation de la mémoire à long-terme. Les souris seront libres de leurs mouvements et en capacité d'explorer dans des cages au cours de chaque test comportemental. Aucune tâche nécessite un effort particulier, ou génère quelque douleur ou angoisse, du fait que les stimulations ne dépassent pas celles rencontrées naturellement en zootechnie, et sont associées à des récompenses alimentaires positives.

Impact sur les animaux

Dans le cas d'infection par les virus, les animaux présentent un syndrome fébrile, associé à des symptômes généraux comme de la fièvre indiquant que l'organisme lutte contre une infection. Ce dernier peut durer jusqu'à 7 jours et entraîner une perte de poids, et de l'anxiété. Les injections ne sont source d'aucun stress particulier, du fait qu'elles ne sont pas répétées, du faible volume injecté, et du fait de la manipulation journalière préalable des souris par le personnel qualifié dans la semaine précédente. La prise de sang peut généré un stress léger du fait de la contention. Dans le cadre d'un test d'évaluation du comportement, les animaux sont hébergés temporairement en cage individuelle. Du fait de l'enrichissement de leur habitat, du caractère temporaire (moins de 10 jours), il n'a pas été noté d'état de stress lié à l'isolement, mais ces manifestations seront étroitement surveillées. Les souris étant libres d'exploration, non restreintes et les tâches étant toutes effectuées dans la salle d'hébergement où elle ont été acclimatées, les tests comportementaux ne génèrent aucun stress et du fait que les stimulations ne dépassent pas celles rencontrées naturellement en zootechnie, et sont associées à des récompenses alimentaires positives, ceci afin de pouvoir justement mesurer leur état d'anxiété naturel.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de réaliser divers prélèvements d'organes et/ou de sang utilisés pour des analyses complémentaires. Ces prélèvements sont essentiels pour étudier les paramètres inflammatoires et les mécanismes cérébraux entrant en jeu dans ce projet.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude intervient après de nombreuses études in vitro utilisant des modèles cellulaires qui ont démontré l’impact de facteurs produits par des pathogènes et de l’inflammation sur l’activation des cascades moléculaires impliquées dans les capacités cognitives et la réponse adaptative des comportements. Les études in vitro ne permettent pas d’étudier l’importance des manipulations proposées sur le comportement et la cognition, et sont ainsi complétées par l'utilisation de l'animal qui seule permet d'étudier la coordination des différentes régions du cerveau entre elles et leurs intéractions avec le reste de l'organisme et en particulier le système immunitaire.

Réduction

Tous ces animaux seront sous un même fond génétique homogène (gènes communs) pour nous permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés en évitant au maximum les variabilités. Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en permettant une analyse statistique valide des résultats. Des études sur des modèles animaux similaires ont montré que l'analyse d'un total de 12 animaux par groupe répartis sur deux expériences reproduites étaient nécessaires. En outre, un même groupe d'animaux pourra être utilisé pour plusieurs tests comportementaux et nous reproduirons chaque expérience 2 fois de manière indépendante.

Raffinement

Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement à l’initiation du modèle. Les animaux seront gardés tant que possible en groupes sociaux stables formés de 2 à 5 individus compatibles. Un animal sera euthanasié en cas de mal-être trop important évalué par l'utilisation d'une grille de scoring. Ces signes, nous les avons défini en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Ces signes sont : respiration anormale, perte de poids >20% du poids initial, déshydratation, léthargie, aspect du poil anormal. Les souris sont préalablement familiarisées avec l'aliment de convalescence (gel) dans les jours précédant l'infection, ce qui optimise leur convalescence. Des mesures seront prises pour limiter l’anxiété et l’impact environnemental sur les souris (amélioration de l'enrichissement par de petites maisonnettes, tubes en carton et bâtons de bois à ronger, et ajouts de coton pour la confection de nids). Une surveillance journalière, par observation directe de l'attitude des souris dans la cage et leur pesée, par le personnel animalier ou expérimentateur permettra de déterminer l’éventuelle souffrance des animaux (comme précisé pour chacune des expériences). Lors des prélèvement de sang, avec utilisation de tubes de contention, l'animal sera surveillé et le geste sera réalisé rapidement afin de limiter l'évènement stressant, les souris seront replacées avec leurs congénères et il sera vérifié que le prélèvement ne les a pas affaiblies ou perturbées (changement de comportement). Enfin, les tests comportementaux sont choisis et menés en respectant les besoins écologiques des modèles: la recherche spatiale est motivée par récompense positive, les souris sont acclimatées à tous les tests et habituées aux dispositifs au moins une semaine avant chaque test. Les tests ne requièrent que mobilité, exploration libre d'objets, d'eau de boisson sucrée ou stimulus sonore de niveau équivalent à celui auquel elles peuvent être exposée lors du change de cage.

Choix des espèces

Les réactions physiologiques de la souris face à des corps étrangers, ici des virus, sont suffisamment proches de celle de l’homme pour que son étude nous permette d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire et nerveux de ces 2 espèces. Ce point est maintenant formellement établi dans la littérature en ce qui concerne l’étude des sous-populations de cellules dendritiques. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées pour lesquelles des animaux génétiquement modifiés sont nécessaires, notamment pour l'étude de la maladie d'Alzheimer. Seuls des animaux adultes seront étudiés ici de façon à ce que leur système immunitaire soit mature. Enfin dans le cas des modèles de la maladie d'Alzheimer, une maladie neurodégénérative dont le premier facteur de risque est l'age, des animaux adultes plus mûrs mais non vieillissants seront étudiés pour correspondre au mieux au métabolisme d'un humain de 45 ans ou plus.

Six tests comportementaux par souris sur trois semaines, dont un labyrinthe en Y et une piscine équipée d'une plateforme de sortie, plus quatre prélèvements sanguins isolés et trois séries de prélèvements étalées sur deux heures : 288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux de dix-huit jours reçoivent de l'ovalbumine par voie intrarectale sous anesthésie, puis sont tués par dislocation cervicale une heure après leur réveil. L'objet est de mesurer les effets des additifs des laits infantiles sur l'intestin et le cerveau, avec des résultats destinés à éclairer l'Efsa et l'Anses. Le porteur qualifie ces tests comportementaux de "non invasifs et n'induisant pas de stress", tout en annonçant que certaines souris pourraient développer une inflammation intestinale chronique et un comportement anxieux.

Objectifs

Le lait maternel joue un rôle essentiel dans la croissance des nouveau-nés. Il module entre autres le microbiote intestinal, qui lui-même participe au bon développement du cerveau et de la santé. De nombreux nourrissons sont alimentés avec des laits de substitution en poudre. Ces préparations contiennent des additifs, utilisés notamment pour améliorer leur texture ou leur conservation. Il a déjà été montré que certains de ces additifs peuvent perturber l’équilibre du microbiote intestinal, entraînant une dysbiose et une inflammation intestinale chez l’adulte. En revanche, leurs rôles et leurs conséquences sur le développement du cerveau durant la période néonatale sont peu explorées et leurs effets à plus long terme sur le comportement restent inconnus. Ce projet a pour objectif d'étudier chez l'animal les effets de la consommation durant la période néonatale de laits contenant ces additifs sur l’axe intestin-cerveau à différentes périodes de la vie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont multiples. Sur le plan fondamental, ce projet apportera des connaissances nouvelles sur les mécanismes par lesquels l'alimentation agit sur la santé intestinale et le développement cérébral durant la période néonatale, et sur la façon dont les perturbations précoces du microbiote peuvent influencer l’apparition d’inflammation intestinale et le comportement à long terme. Sur le plan appliqué, les résultats viendront éclairer les évaluations des risques sanitaires liés à ces additifs chez les nourrissons. Ils pourront orienter l'optimisation des formulations des laits infantiles et fournir des éléments scientifiques utiles aux instances de réglementation (Autorité européenne de sécurité des aliments (Efsa), agence nationale de sécurité sanitaire (Anses)), dans une perspective de meilleure protection de la santé des nouveau-nés. Enfin, ces travaux contribueront à enrichir les recommandations nutritionnelles destinées aux familles et aux professionnels de santé.

Procédures

Les animaux subiront 4 prélèvements uniques de sang pour une durée inférieure à 1 minute afin de mesurer la gly-cémie. Les animaux subiront 3 prélèvements multiples de sang sur une durée de 2h, chacun de ces prélèvements mul-tiples seront séparés d’au moins une semaine afin de mesure la glycémie lors d’un test de tolérance au glucose. Les animaux adultes seront impliqués dans des tests de comportement non invasifs et n'induisant pas de stress chez l'animal. Les animaux adultes seront au préalable soumis à une phase d’habituation d’une semaine qui n'induira que peu ou pas de stress chez: chaque jour, ils seront exposés à l’expérimentateur et à la salle de comportement pendant une durée de 30 minutes à 1 heure, afin de réduire le stress lié à la manipulation et à l’environnement expérimental. À l’issue de cette période, une série de tests comportementaux sera réalisée pour évaluer différents aspects tels que l’anxiété, la sociabilité, la mémoire et l’hyperactivité. Ces évaluations reposeront sur les paradigmes suivants : • tes de l’anxiété : Les dispositifs expérimentaux combineront des zones ouvertes/éclairées et des zones fermées/protégées. Le temps de présence dans chaque type de zone sera quantifié sur une période de 10 minutes • évaluation de la mémoire : phase d’habituation de 10 minutes durant laquelle l’animal est placé dans une arène contenant des objets, dans un labyrinthe en Y ou dans une piscine équipée d'une plateforme pour permettre à l'animal de sortir de l'eau. Suite à une modification de la configuration (changement d’objets ou d’accessibilité des zones), une phase de test de 10 minutes permettra de mesurer la capacité de reconnaissance ou de spatialisation de l’animal. • évaluation de la sociabilité : mesureront la préférence naturelle de l’animal à interagir ou à passer du temps à proximité d’un congénère plutôt que d’un objet inanimé, sur une durée de 10 minutes Chaque test comprendra une phase d’habituation de 10 minutes à l’arène, suivie d’une phase de test de 10 minutes par animal. La fréquence des tests est limitée à un seul test par jour et par animal au maximum, pour un total d’environ 6 tests par animal répartis sur une période de trois semaines. • animaux jeunes adultes agés de 18 jours subiront une administration intrarectale d’ovalbumine après anesthésie à l’isoflurane. Après 1h de phase de réveil, ils seront mis à mort par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Certaines procédures pourraient induire une inflammation intestinale chronique de bas bruit sans ulcération majeure et qui n’a pas de conséquences visibles sur le phénotype. De plus, certains animaux pourraient développer des dérégulations métaboliques, caractérisées notamment par une augmentation de la masse grasse ainsi que présenter un comportement anxieux. Les tests comportementaux réalisés sur animaux adultes entraineront peu ou pas de stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car l’analyse de leurs organes est nécessaire pour répondre à notre hypothèse de travail.

Remplacement

Des modèles in vitro de culture de microbiote intestinal ainsi que des modèles cellulaires permettant de mimer la barrière intestinale existent. Cependant, le recours au modèle murin est indispensable dans le cadre de ce projet afin de comprendre les interactions hôte / microbiote et notamment cerveau/intestin/microbiote en lien avec le développement d’inflammation chronique de bas bruit et de troubles du comportement. Des animaux plus simples tels que la drosophile, C. elegans ou le poisson zèbre ne peuvent pas non plus être utilisés car la physiologie du développement cérébral et du comportement de ces animaux est très différente de celle des mammifères.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions sera inclus dans chaque groupe. Des études précédentes ont montré que dans le même type de procédure, l’utilisation de 12 souris par condition et par sexe était nécessaire afin d’atteindre des résultats interprétables et garantir l’utilisation de tests statistiques appropriés. Les tests statistiques envisagés dans le cadre de ce projet l’ont été après avis recueilli auprès de biostatisticiens pour des projets similaires. De plus, il s’agit d’une expérience au design longitudinal, ce qui nous permet d’observer le phénotype des souris aux différents stades de développement et donc limiter le nombre de souris nécessaires.

Raffinement

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Dans un souci de raffinement, un suivi étroit des animaux et des points limites précoces et adaptés seront mis en place tout au long des expérimentations. Des points limites spécifiques et précoces sont définis pour chaque protocole. Dès l’apparition d’un signe clinique, différentes méthodes de raffinement seront appliquées pour éviter ou minimiser l’inconfort ou la douleur : utilisation de gel de réhydratation, réhydratation sous-cutanée, renforcement de l’enrichissement.

Choix des espèces

Cette étude privilégie la souris comme modèle de référence pour analyser l'impact des additifs alimentaires sur le microbiote intestinal et le développement cérébral néonatal. Ce choix se justifie par la capacité à suivre précisément les interactions microbiote-système immunitaire dès la naissance grâce à des outils d'analyse avancés. Bien que simplifiée, la physiologie mu-rine offre une pertinence conceptuelle et souvent directe pour comprendre les mécanismes chez le nouveau-né humain. En pratique, la souris est indispensable : sa reproduction rapide permet d'obtenir de grandes portées pour suivre les effets à long terme d'une exposition nutritionnelle précoce, de la nais-sance à l'âge adulte. De plus, c'est l'espèce la mieux maîtrisée pour évaluer les fonctions co-gnitives et comportementales en milieu contrôlé. Ces avantages combinés garantissent une efficacité optimale dans la recherche tout en assurant une représentation physiologique fiable des processus biologiques humains. Le premier groupe sera suivi jusqu’à l’âge du sevrage, soit environ trois semaines. Cette période constitue la phase d’exposition aux additifs ; c’est également une fenêtre de développement où le microbiote intestinal et le cerveau sont particulièrement sensibles à l’environnement nutritionnel. Le second groupe sera suivi jusqu’au 18ème jour de vie. Cette période constitue la phase d’exposition aux additifs ; c’est également une fenêtre de développement où le microbiote intestinal et le système immunitaire sont modulés par l’environnement nutritionnel. Le troisième groupe sera maintenu dans les mêmes conditions jusqu’à l’âge adulte, l’exposition aux additifs étant limitée à la seule période néonatale. Ce suivi longitudinal permettra de vérifier si les éventuelles perturbations observées chez le jeune animal perdurent et influencent le comportement et l’état général à long terme. L’utilisation de ces deux stades est indispensable à la démarche scientifique : la période néonatale représente le moment critique de l’exposition alimentaire, tandis que l’évaluation à l’âge adulte est nécessaire pour mesurer l’existence d’effets différés.

Opérées une ou plusieurs fois au cours d'interventions de quarante-cinq à quatre-vingt-dix minutes, puis abreuvées à la nicotine pendant trois semaines, 1 900 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Leur comportement est filmé en continu par groupes de trois pendant une à deux semaines dans de grandes cages, et leur activité neuronale est manipulée avant ou pendant la tâche au cours de sessions d'une heure. L'objectif déclaré est d'établir dans quel sens joue le lien entre organisation sociale, plasticité dopaminergique et sensibilité à la nicotine, un lien que le porteur affirme impossible à mettre en évidence sans recourir à des lignées animales. Toutes sont tuées : le porteur écrit que "la mort des animaux est nécessaire pour l'étude post mortem" du cerveau, afin de localiser les injections et les enregistrements.

Objectifs

L’addiction à la nicotine présente une forte variabilité interindividuelle qui n’est pas entièrement expliquée par des facteurs génétiques. L’organisation sociale constitue un régulateur majeur de la fonction dopaminergique et du traitement de la récompense, et pourrait ainsi influencer la vulnérabilité à la nicotine. À l’inverse, l’exposition chronique à la nicotine modifie la plasticité dopaminergique ainsi que les comportements sociaux. L’objectif de ce projet est de déterminer la relation causale réciproque entre l’exposition chronique à la nicotine, la plasticité dopaminergique et l’organisation sociale. En combinant des approches comportementales, neurobiologiques et de manipulation neuronale, ce projet permettra d’identifier les mécanismes par lesquels l’environnement social et la plasticité cérébrale façonnent la sensibilité individuelle à la nicotine.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier comment l’environnement social et la plasticité dopaminergique interagissent pour façonner la vulnérabilité individuelle à l’addiction à la nicotine. Il apportera une compréhension mécanistique causale reliant l’organisation sociale à la sensibilité aux drogues, des mécanismes qui ne peuvent être mis en évidence sans recourir à des modèles animaux. Ces résultats pourront contribuer au développement de nouvelles stratégies de prévention et d’intervention dans l’addiction à la nicotine, intégrant explicitement la dimension sociale.

Procédures

Les souris subiront une ou plusieurs procédures chirurgicales (durée : environ 45–90 min). Certaines souris seront exposées à un traitement chronique dans l’eau de boisson pendant une durée de 3 semaines. Les souris sont placées dans de grandes cages, et leur comportement est enregistré en continu pendant une semaine. Un test de sensibilité sera réalisé en administrant différentes doses du traitement aux animaux pendant l’enregistrement de l’activité neuronale (deux enregistrements d’une heure chacun). Chez un autre groupe de souris, l’activité neuronale est manipulée avant la tâche (une session de 60 minutes) ou pendant celle-ci (deux sessions de 60 minutes) afin d’évaluer l’impact sur le comportement. Le comportement des animaux sera évalué par groupes de trois pendant 1–2 semaines dans une grande cage. À la fin de certaines procédures, un enregistrement unitaire de neurones sera effectué sur les animaux anesthésiés.

Impact sur les animaux

La douleur post-opératoire transitoire et une diminution temporaire de la mobilité peuvent apparaître à la suite des interventions chirurgicales. Une irritation locale ou une inflammation au niveau des sites d’implantation peut également induire une douleur de courte durée, rapidement prise en charge. Des troubles digestifs peuvent survenir en lien avec l’exposition chronique à la nicotine, provoquant un stress ou une gêne légère de courte durée. Un stress léger et transitoire peut aussi être associé aux administrations répétées de nicotine et aux manipulations expérimentales. Enfin, un stress social léger et de courte durée peut survenir lors de l’établissement et du maintien de l’organisation sociale au sein des groupes.

Devenir

La mort des animaux est nécessaire pour l’étude post mortem du cerveaux (localisation des injections et enregistrements).

Remplacement

Les niveaux d’analyse proposés dans ce projet nécessitent l’étude du comportement chez des souris évoluant librement, car les interactions entre l’organisation sociale, le comportement individuel et l’activité cérébrale ne peuvent pas être appréhendées à l’aide de systèmes simplifiés ou de modèles in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux sera maintenu au strict minimum nécessaire. Le suivi comportemental continu à haute résolution permet des analyses longitudinales et multidimensionnelles approfondies pour chaque souris, maximisant ainsi la valeur scientifique des données recueillies, qui pourront également être partagées avec d’autres équipes de recherche. Le nombre d’animaux requis a été déterminé à l’aide d’une analyse statistique, sur la base d’une littérature solide et de données pilotes. Les procédures ont été conçues afin de permettre à un même animal de participer à plusieurs expériences successives, limitant ainsi le recours à de nouveaux animaux. Une marge supplémentaire a été prévue afin de tenir compte d’éventuelles pertes liées aux procédures chirurgicales. Des réévaluations régulières des effectifs seront réalisées au cours du projet et le nombre d’animaux pourra être ajusté à la baisse si les résultats obtenus permettent d’atteindre les objectifs scientifiques avec un effectif plus faible.

Raffinement

Des mesures de raffinement sont mises en place afin de limiter la douleur et le stress. Lors des procédures chirurgicales, des anesthésiques locaux et des analgésiques sont administrés, et les sites opératoires sont étroitement surveillés. Des critères d’arrêt précoces sont définis à l’aide d’une grille d’observation scorée.

Choix des espèces

Le cerveau de la souris possède des circuits dopaminergiques qui sont très similaires à ceux de l’Homme, et de nombreux comportements liés à l’addiction sont bien établis chez cette espèce. La souris dispose également d’outils génétiques uniques permettant de moduler finement certains circuits neuronaux et de mieux comprendre comment la nicotine agit sur le cerveau et le comportement. Ces outils n’étant pas disponibles chez d’autres espèces, la souris constitue le modèle le plus adapté pour notre étude. Les animaux seront utilisés au stade adulte (à partir de 8 semaines d’âge). Ce stade est choisi car les circuits neuronaux impliqués dans les comportements liés à l’addiction et à la motivation sont alors matures et stables, permettant une étude fiable des effets de la nicotine sur le cerveau et le comportement. L’utilisation d’animaux adultes permet également de limiter les variations liées au développement du système nerveux observées chez les animaux plus jeunes.

Chauffés jusqu'à la perte d'équilibre, 440 poissons d'eau douce capturés en nasses subissent une élévation rapide de la température pendant 80 minutes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois espèces seront retenues parmi le gardon, la perche soleil, la grémille, le goujon, le rotengle et le gobie à tache noire, maintenues jusqu'à 48 heures en bourriche et à jeun, la manipulation pouvant leur faire perdre mucus et écailles. Tous sont ensuite tués pour des mesures sur les tissus. Le porteur qualifie pourtant le test employé, le CTmax, de "mesure de tolérance thermique non létale".

Objectifs

Les effets des changements climatiques se manifestent de manière particulièrement prononcée dans les écosystèmes d’eau douce, où les vagues de chaleur augmentent en fréquence et en intensité. Les organismes ectothermes (e.g. poissons) y sont particulièrement vulnérables, dans la mesure où leur température corporelle dépend de celle de leur environnement. En conséquence, la tolérance des organismes aquatiques aux variations rapides de la température dans leur environnement constitue un facteur déterminant de leur résilience et de leur survie. Toutefois, comment un individu répond au stress thermique dépend des interactions biotiques (interactions intra- et interspécifiques) inhérentes à tout écosystème et qui persistent pendant un épisode de vague de chaleur. En ce sens, des données indiquent que les interactions entre espèces peuvent influencer des processus physiologiques tels que la croissance, la reproduction et le taux métabolique. Cependant, les recherches sur la manière dont ces interactions influencent la tolérance thermique individuelle sont limitées, puisque les études se sont jusqu’à présent focalisées principalement sur des individus isolés, sans tenir compte des interactions intra- et interspécifiques. L’objectif du présent projet de recherche est de mesurer l’impact des interactions intra- et interspécifiques sur la tolérance thermique chez les poissons. Plus précisément, notre objectif sera composé de deux volets expérimentaux : (1) Établir si les interactions intra- et interspécifiques augmentent ou réduisent la tolérance thermique maximale (volet 1) (2) Déterminer si les interactions intraspécifiques augmentent ou réduisent la tolérance thermique maximale, selon le sexe (mâle vs. femelle), en tenant compte de l’âge, de la taille et de la charge parasitaire comme covariables. (volet 2). Afin de répondre à nos objectifs de recherche, nous mesurons la tolérance thermique maximale via le test CTmax ; une mesure de tolérance thermique non létale couramment utilisée chez les poissons. La mesure de CTmax permet d’estimer rapidement la température maximale au-delà de laquelle les performances physiologiques d’un organisme ne sont plus soutenues. Pour chaque objectif nous quantifierons la charge parasitaire de chaque individu car cette interaction biotique peut avoir un effet sur la tolérance thermique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'acquérir des connaissances fondamentales sur les limites thermiques des poissons, un aspect essentiel pour comprendre comment les organismes répondent au stress thermique dans leur environnement. Pour chaque espèce, il est possible de déterminer une température de tolérance maximale (CTmax), à partir de laquelle les performances de l'individu chutent fortement et comment la tolérance varie en fonction des facteurs biotiques (présence de congénères ou d’individu d’autres espèces). Dans un contexte de réchauffement climatique, la valeur de CTmax est particulièrement importante, puisqu’elle indique la température maximale que l'organisme peut supporter et donc prédire la résilience des populations face aux changements climatiques. Ce projet est novateur sur deux aspects, puisqu’il utilise des organismes issus de milieux naturels et réplique les interactions biotiques présentes dans l’écosystème, alors que la plupart des études sur la tolérance thermique maximale utilisent des organismes élevés en laboratoire et ne considèrent pas ces interactions.

Procédures

Pendant l’expérience de tolérance thermique, les individus subiront une augmentation rapide de la température jusqu’à perte d’équilibre : 1 seule fois pendant 80 minutes

Impact sur les animaux

La mise en place du protocole expérimental décrit ci-dessus peut amener les nuisances ou effets indésirables suivants sur les animaux : (1) Stress lié à la capture en nasses (2) Stress lié au maintien temporaire en bourriche et au jeûne (maximum 48h). (3) Stress lié à la manipulation qui peut entrainer une perte de mucus ou d’écailles. (4) Stress lié à l’augmentation rapide de la température pendant le protocole de CTmax

Devenir

Tous les poissons utilisés seront mis à mort pour effectuer des mesures sur tissus.

Remplacement

Le but de notre étude est de comprendre comment la dynamique entre espèces et au sein d’une même espèce affecte la tolérance thermique de l’individu. Cela apportera des informations sur la dynamique de l’écosystème auquel ces espèces appartiennent, susceptible de changer en réponse aux changements climatiques. Le modèle animal demeure indispensable puisque nous examinons les interactions biotiques et la manière dont la réponse comportementale à une vague de chaleur est affectée par celles-ci. En conséquence, le remplacement est impossible ici, puisqu'il s’agit d'analyser la réponse intégrale de l'organisme face à une vague de chaleur à l'aide de mesures comportementales. Nous privilégions l'utilisation des poissons, qui sont souvent les principaux prédateurs poïkilothermes dans les écosystèmes aquatiques et jouent un rôle fonctionnel clé.

Réduction

Afin de répondre au principe de réduction, le nombre d’individus a été calculé pour fournir un pouvoir statistique suffisant pour évaluer les variations de la tolérance thermique maximale entre les trois groupes expérimentaux. Sur la base de publications récentes, nous estimons le CTmax du gobie à tache noire (Neogobius melanostomus) autour de 35 °C, celle de la perche soleil (Lepomis gibbosus) à environ 34 °C, ainsi qu’à 30 °C chez la grémille (Gymnocephalus cernua), 32 °C chez le goujon (Gobio gobio) et 36 °C chez le rotengle (Scardinius erythrophthalmus).

Raffinement

Pour la stabulation, les poissons seront placés dans des bourriches immergées dans la rivière afin de maintenir les poissons en milieu semi-naturel avant le début du protocole expérimental CTmax. Entre le moment de la capture et le début du protocole expérimental (CTmax), un délai maximal de 48 h sera observé afin de limiter le temps passé en dehors de leur milieu naturel. Lors de la stabulation dans les bourriches, la densité sera limitée à un maximum de 12 individus pour permettre le maintien des interactions intra- et interspécifiques tout en évitant les interactions antagonistes. Les bourriches seront enrichies de rochers et de végétation pour refléter les conditions naturelles, tout en favorisant des zones de repli afin de réduire le stress. Pour les trois aquariums expérimentaux, nous utiliserons des aquariums non enrichis pour observer la perte des fonctions locomotrices, qui se traduit par un retournement indiquant que la limite de tolérance thermique maximale de l’individu est atteinte. Le protocole expérimental sera réalisé dans des glacières dont le fond et les quatre côtés seront opaques afin de limiter les stimulations visuelles liées à la présence humaine. La présence des manipulateurs sera limitée grâce à un système de surveillance vidéo à distance. Tous les aquariums seront équipés d’un bulleur afin de maintenir une concentration en oxygène dissous proche de 100 %. L’eau utilisée proviendra de la rivière. La température, le pH et l’oxygène dissous seront mesurés par sonde durant le test. Pour chaque test, les individus seront sous la surveillance d’un binôme formé et expérimenté en manipulation animal. Des limites établies pour assurer le bien-être animal permettront une intervention rapide en cas de signes indiquant que l’individu est en souffrance. Un arbre décisionnel guide les actions à entreprendre en fonction de l’état clinique observé. Si l’état des individus se dégrade, des critères d’arrêt peuvent entraîner la fin anticipée de l’expérience, conformément à la réglementation en vigueur. L’augmentation de la température sera planifiée de manière différenciée entre les trois set-up expérimentaux, de sorte que les individus d’une unité n’atteignent jamais simultanément leurs limites thermiques avec ceux d’un autre mésocosme, garantissant ainsi une prise en charge rapide et individualisée.

Choix des espèces

Afin de remplir l’objectif du volet 1, nous sélectionnerons parmi la liste d’espèces suivante, les trois espèces qui seront trouvées en abondance et dont la niche écologique est similaire : gardon (Rutilus rutilus) ; perche soleil (Lepomis gibbosus) ; grémille (Gymnocephalus cernua) ; goujon (Gobio gobio) ; rotengle (Scardinius erythrophthalmus) ; gobie à tache noire (Neogobius melanostomus) Les trois espèces seront choisies pour leurs caractéristiques écologiques communes et leur pertinence pour l’étude des réponses aux stress thermiques. Les trois espèces d’écrevisses sont des espèces exotiques à fort impact écologique. Il est donc particulièrement pertinent d’étudier leur limite thermique. Pour le volet 2, nous avons choisi le gobie à tache noire, une espèce exotique envahissante à fort impact écologique, dont l’étude de la tolérance thermique permet de mieux comprendre son potentiel de persistance et d’expansion dans un contexte de réchauffement climatique.

Deux chirurgies, l'une d'une heure, l'autre d'une heure quarante-cinq, séparées d'au moins cinq jours, implantent des électrodes cérébrales, une électrode sous-cutanée au thorax et une canule nasale. Viennent ensuite des sessions d'enregistrement en contention allant jusqu'à trois heures par jour pendant sept jours, et pour une partie des 128 souris un entraînement quotidien à une tâche auditive qui peut se prolonger plusieurs mois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent des substances qui augmentent l'anxiété ou la sensation de panique, et subissent de brefs stimuli aversifs, goût amer ou jet d'air. À la fin, chaque souris est opérée sans réveil pour le prélèvement de son cerveau, destiné à l'analyse histologique.

Objectifs

La perception, implicite ou explicite, que nous avons de l’état de notre corps repose sur un sens, appelé interoception. Ce sens participe à réguler nos états affectifs (émotionnels ou motivationnels) et donc affecte les décisions que nous prenons. En conséquence, une dérégulation de cette perception peut être liée à des maladies psychiatriques. Cependant les bases neuronales qui nous donnent accès à l’interoception sont mal connues. Nous ne savons pas par exemple quelle région de notre cerveau représente notre fréquence cardiaque ou respiratoire et avec quelle précision. L’objectif de ce projet est d’une part d’étudier comment le cerveau représente ces informations. D’autre part, nous testerons si cette représentation est modifiée dans des conditions liées à l’anxiété ou les crises de panique. Pour ce faire nous administrerons des agents pharmacologiques utilisés en psychiatrie qui augmentent ou diminuent respectivement le niveau d’anxiété ou de panique de l’animal. Finalement, nous évaluerons ci cette représentation est modifiée pendant la prise de décision. Pendant ces expériences, le nombre d’animaux nécessaire et le nombre de sessions d’enregistrement seront réduits grâce à l’utilisation de systèmes d’enregistrement de point permettant d’acquérir une grande quantité de données en peu de sessions. De plus, nous raffinerons le protocole en utilisant des traitement anesthésiques et analgésiques adaptés, administrés selon des points limites clairement établis à l’avance et évalués à l’aide de grilles d’évaluation. Nous développerons et calibrerons des méthodes d’enregistrement non-invasifs pour la respiration qui pourront aussi être utile pour la communauté plus largement. A chaque étape, puisque nous enregistrons non seulement le comportement de l’animal mais aussi son état corporel, nous disposerons d’un suivi fin et en temps réel de son état. Ce projet permettra de mieux comprendre notre capacité à percevoir notre corps et contribueront, à plus long terme, à la meilleure compréhension de la participation de notre corps aux états affectifs et à établir comment cette perception intéroceptive peut être dérégulée.

Bénéfices attendus

Il existe de nombreuses hypothèses suggérant que notre corps influence notre état émotionnel et donc les décisions que nous prenons. Ceci découle en partie de l’expérience subjective du lien très fort entre notre état émotionnel et notre corps mais également de mesures en laboratoire qui ont montré que l’état de notre corps et comment nous le percevons varie avec nos émotions. De plus lorsque cette perception du corps dérégulée, des troubles psychiatriques peuvent résulter. Celles-ci peuvent être liées à une intéroception de précision réduite (autisme, trouble du déficit de l’attention) ou hypersensible (anxiété, syndrome de l’intestin irritable). Cependant les zones cérébrales qui sous-tendent cette perception et comment elle est modifiée dans des états émotionnels normaux et pathologiques reste mal connu. Ce projet permettra d’identifier des mécanismes par lesquels le cerveau représente ce que nous percevons de notre corps (par exemple : quelle est notre fréquence cardiaque ? quelle est notre fréquence respiratoire ?). En particulier nous pourrons identifier où dans le cerveau ces informations sont représentées et avec quelles précision. De plus nous testerons si la façon dont notre cerveau représente notre corps est modifié dans deux conditions : d’une part dans des états liés aux crises de panique ou l’anxiété (grâce à l’utilisation d’agents pharmacologiques utilisés en psychiatrie) et d’autre part lors de la prise de décisions difficiles suscitant des émotions. Une retombée concrète du projet sera de mieux connaître quelles régions corticales encodent l’état de notre corps. Ceci peut permettre de cibler plus efficacement les études de neuro-imagerie chez l’humain qui étudient ces déficits intéroceptifs. De plus, ces mesurer l’impact d’agents pharmacologiques utilisés dans le cas de maladies psychiatriques sur la représentation neuronale de l’état corporel. Ceci permettra d’évaluer si ces agents agissent directement sur la perception du corps, permettant de préciser leurs mécanismes d’action.

Procédures

Tous les animaux sont soumis à deux chirurgies pendant lesquelles nous implantons des électrodes cérébrales, une électrode sous-cutanée au niveau du thorax et une canule nasale. Les chirurgies durent respectivement 1h et 1h45 maximum et sont séparées d’au moins 5 jours ou plus pour que l’animal récupère un état ‘normal’ d’après notre grille d’évaluation. Tous les animaux sont également soumis à des sessions d’enregistrement allant jusqu’à 3h par jour pendant un maximum de 7 jours. Pendant ces sessions, les animaux sont maintenus en contention mais peuvent exprimer divers comportements (course sur une roue, sommeil, toilettage). Un sous-ensemble d’animaux sont également entraînés dans une tâche auditive pendant une à deux heures par jour sur une durée pouvant aller jusqu’à plusieurs mois selon la vitesse à laquelle les animaux acquièrent la tâche. A la fin des procédures, les animaux subissent une chirurgie sans réveil pour prélévement du cerveau.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, les animaux peuvent présenter une activité réduite et ressentir une douleur légère à modérée au niveau de la zone opérée en fonction de la réponse aux traitements antalgiques administrés. Le protocole de contention peut engendrer l’inconfort chez l’animal, surtout lors des premières sessions d’habituation. Un sous ensemble d’animaux recevra l’administration d’agents pharmacologiques liés à l’anxiété ou les crises de panique. Parmi ces agents, 2 ont tendance à diminuer soit l’anxieté soit la sensation de panique . Les 2 autres ont tendence à augmenter soit l’anxiété soit la sensation de panique. Dans ce cas, nous utilisons des doses calibrées pour que l’augmentation du stress dure au maximum quelques heures. Pendant le protocole, l’animal sera soumis à de brefs stimuli légèrement aversifs (goût amer ou jet d’air) qui pourront engendrer une gêne.MODIFICATION: [Les animaux sont hébérgés à plusieurs mais en cas de dégradation des implants par les congéneres les animaux peuvent être co-hébérgés dans une cage commune avec séparateur, ce qui peut engendrer un stress dû au changement de conditions.]

Devenir

A la fin de chaque procédure, l’animal est mis à mort afin de réaliser l'analyse histologique du cerveau.

Remplacement

Le projet vise à comprendre comment le cerveau réagit à l’état du corps et donc nécessite une interaction intacte entre les deux, il est donc impossible in vitro ou in silico. De plus, afin de relier l’interoception à l’état affectif, il est essentiel d’effectuer notre étude chez un animal éveillé qui montre une grande diversité d’états et effectue une tâche sensorielle. Finalement, chez l’animal anesthésié, l’encodage neuronal est profondément modifié et le système cardio-respiratoire dans un état très ralenti, totalement différent de l’éveil. D’éventuels résultats obtenus sous anesthésie seraient donc très difficiles à généraliser.

Réduction

Les souris sont particulièrement adaptées à l’étude grâce aux outils performants d’enregistrement électrophysiologies et somatique qui existent. Ces outils permettent d’obtenir très efficacement de grandes populations de neurones et donc de réduire à la fois le nombre d’animaux et le nombre de sessions d’expérience nécessaire pour échantillonner les différentes régions d’intérêt. Nous avons un protocole adapté à cette diminution : - L’utilisation d’électrodes implantées « en aigu » permet d’enregistrer à un endroit différent chaque jour et donc de couvrir efficacement une grande zone anatomique - Nous utiliserons des électrodes qui contiennent un grand nombres de sites d’enregistrement. Ceci augmente l’efficacité de la récolte de données.

Raffinement

MODIFICATION [Hébérgement : Les animaux sont hébergés dans des cages enrichis (dôme, coton) et si possible (pas de conflit ou dégradation de l'implant) à plusieurs.] Chirurgie : Nos procédures sont optimisées pour diminuer la souffrance et le risque anesthésique. Pendant la chirurgie, l’état de l’animal est suivi à intervalles réguliers pour adapter le niveau d’isoflurane. De plus un analgésique systémique et une analgésique locale sont administrées avant et après l’intervention. En post-opératoire, les animaux reçoivent une analgésie supplémentaire ajouté dans l’eau de boisson ou Dietgel pendant 5 jours) et les animaux sont suivis quotidiennement. Manipulations : Les animaux seront d’abord habitués à la manipulation manuelle nécessaire pour les transporter jusqu’à l’environnement de l’expérience. Toute manipulation par la queue sera évitée. Contention en tête fixée : L’animal est habitué en augmentant progressivement les durées. De plus, il est placé sur une roue où nous avons observé des comportements divers (sommeil, course, toilettage) dans des proportions similaires à un animal libre de ces. A chaque session la respiration, l’activité cardiaque et la température sont enregistrés et le comportement de l’animal suivi par vidéo. La mesure de toutes ces variables permettra, en temps réel, de surveiller très finement l’état de l’animal. Développement de procédures raffinées : Pendant ce projet nous enregistrons la respiration avec une canule intranasale, ce qui nécessite une chirurgie invasive. Nous essayerons de raffiner ce protocole en mettant en œuvre des mesures non-invasives de la respiration : soit avec un capteur externe de pression soit par suivi vidéo en caméra thermique des narines de l’animal. La canule intranasale étant la méthode de référence donnant les informations les plus précises, nous devons d’abord calibrer les autres méthodes contre celles-ci avant d’éventuellement utiliser ces nouvelles approches moins invasives. Utilisation de statistiques adaptées : Les analyses statistiques utilisées dans cette étude seront basées sur le nombre de neurones enregistrés et non le nombre d’animaux. Puisque nos méthodes permettent d’enregistrer un grand nombre de neurones par session et par animal, ceci permet d’acquérir une grande puissance statistique avec peu d’individus. Nous utiliserons des statistiques paramétriques et appariées.

Choix des espèces

Il est essentiel d’utiliser un mammifère dans cette étude puisque le système cardio-respiratoire est radicalement différent chez les invertébrés ou les amphibiens et reptiles (pas de poumons, pas de flux d’air nasal ou buccal pour les premiers, non-homéothermes pour les seconds). La souris est un excellent modèle pour acquérir efficacement (donc avec peu d’animaux et dans un temps d’expérience réduit) de grandes populations de neurones parce que les outils d’enregistrement massifs ont été mises au point chez cet animal (implantation aigue d’électrodes multi-sites). De plus, des développements ultérieurs de cet axe de recherche nécessiteront l’utilisation d’outils de manipulation qui reposent sur notre excellente connaissance génétique de la souris. Finalement, l’équipe possède une grande expertise dans la chirurgie et le comportement chez la souris, ce savoir-faire assure une application de qualité des procédures. Les souris étudiées seront adultes (plus de 8 semaines) au début des expériences. A cet âge, leur cerveau a fini son développement, ce qui est critique pour le bon positionnement des implants dans les régions visées.

La souris sylvestre est un rongeur nocturne dont la reproduction varie avec la durée du jour, ce qui vaut à cette espèce d'être retenue pour un projet sur la pollution lumineuse. 312 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux groupes sont exposés sept semaines durant à des LED allumées la nuit, avec une prise de sang par semaine sur souris consciente, soit sept prélèvements par individu. Une partie des cerveaux sera prélevée pour des études ultérieures, et le porteur annonce que les corps des souris surnuméraires et de celles n'ayant subi que des prises de sang seront congelés puis mis à disposition des enseignants et des responsables d'animalerie de l'université pour des travaux pratiques d'anatomie comparée.

Objectifs

Chez tous les organismes, dont les mammifères, c’est l’horloge biologique interne qui contrôle les rythmes de nombreuses fonctions (sommeil, reproduction, etc.) selon un cycle d’environ 24 heures. Cette horloge est principalement synchronisée par l’alternance naturelle du jour et de la nuit grâce à la lumière, qui influence notamment la production de mélatonine, une hormone impliquée dans le rythme veille-sommeil. Lorsque l’environnement nocturne est éclairé artificiellement, comme avec l’éclairage public, ce signal naturel peut être perturbé. Cette pollution lumineuse risque alors de dérégler l’horloge biologique et d’avoir des conséquences sur la santé et le fonctionnement de l’organisme. Dans ce contexte, le projet a pour objectif de reproduire une exposition à la pollution lumineuse pendant la nuit (LAN) chez un mammifère nocturne particulièrement sensible à la durée du jour et de la nuit, la souris Sylvestre, en s’appuyant sur des protocoles expérimentaux réalisés en conditions contrôlées. Plus précisément, il vise à explorer les conséquences d’une exposition nocturne à deux types de lumières LED, l’une majoritairement utilisée dans l'éclairage public nocturne, qui stimule fortement les mécanismes contrôlant l’horloge biologique, et l’autre émettant dans une gamme de longueur d’onde plus élevée, qui pourrait être moins perturbatrice. Le projet a pour objectifs d’évaluer l’impact de la LAN sur : 1) les régions du cerveau qui contrôlent la reproduction ; 2) la production d’hormones liées à la reproduction. Les analyses seront réalisées sur des individus mâles et femelles de la génération F0 exposés ou non, ainsi que chez des individus mâles et femelles de la génération F1 afin de voir si les effets peuvent se transmettre à la génération suivante. Les résultats obtenus contribueront à une meilleure compréhension des effets de la pollution lumineuse et permettront d'élaborer des stratégies d’éclairage respectueuses de la biodiversité pour une meilleure gestion environnementale de la pollution lumineuse.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de 4 ordres principaux. 1/ Les résultats obtenus contribueront à mieux informer les décideurs sur les conséquences écologiques de la pollution lumineuse. En effet, les pouvoirs publics pourront s’appuyer sur les données scientifiques précises obtenues à l’issue de ce projet pour établir des recommandations visant à limiter l’exposition aux LED. Ces recommandations pourraient inclure une meilleure régulation de l’usage des LED en fonction de leur spectre lumineux, en privilégiant des spectres moins perturbateurs pour la biodiversité. 2/ Les mécanismes moléculaires et les systèmes neuroendocriniens sous-jacents au fonctionnement de l’horloge circadienne sont communs à une vaste majorité de vertébrés. Les résultats obtenus à l’issue de ce projet seront donc susceptibles de concerner d'autres taxons et participeront à la compréhension du rôle de la lumière artificielle la nuit dans la contribution au déclin ou à l'extinction des populations d'espèces. 3/ Au-delà des aspects applicatifs et réglementaires, ce projet aura également un impact sociétal en sensibilisant le grand public aux effets des LED sur la biodiversité. 4/ Ce projet contribuera également à élargir nos connaissances sur les effets de la LAN sur la santé humaine, en particulier sur les rythmes circadiens et les régulations neuroendocriniennes. Les données scientifiques issues de ce projet pourront fournir des éléments contribuant au reclassement de la pollution lumineuse nocturne comme un agent physique à effet perturbateur endocrinien.

Procédures

Deux groupes de souris seront exposées à un traitement luminaux nocturne chacun durant 7 semaines. Les souris auront 1 prise de sang par semaine pendant 7 semaines, soit 7 prélèvements/souris (vigile) au total. Chaque prélèvement dure entre 30 secondes et 1 minute.

Impact sur les animaux

Les potentiels effets indésirables attendus sont les suivants : - Une exposition à des traitements lumineux nocturnes peut entrainer des perturbations comportementales et physiologiques, ce qui constitue l’objet de notre étude ; - Une douleur transitoire hebdomadaire suite à l’introduction de l’aiguille lors des prélèvements de sang ; - Un stress aigu de quelques dizaines de secondes n’induisant pas d’effet à long terme peut être généré dû à la manipulation des animaux.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort et pour une partie d’entre eux les cerveaux seront prélevés pour des études ultérieures. Nous congelerons des animaux surnuméraires ainsi que ceux n’ayant subit que des prises de sang et les mettrons à disposition des enseignants chercheurs ainsi des responsables d'animalerie de l’Université pour des TP d'anatomie comparée sur cadavres.

Remplacement

A ce jour aucune méthode alternative non animale (in vitro et/ou in silico) ne peut être utilisée pour ce projet qui étudie l’effet d’une exposition à la LAN sur les systèmes neuroendocriniens. Il est donc impératif d’utiliser l’animal entier pour en comprendre les effets et étudier les mécanismes altérés.

Réduction

Le nombre d’animaux a été optimisé de façon à obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement valides. Afin de limiter le nombre de naissances et d'éviter la production d'animaux surnuméraires, une gestion rigoureuse des accouplements sera mise en place en adoptant une stratégie d'accouplements discontinus.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupe sociaux (3 à 5 souris par cage) en présence de plusieurs enrichissements (abris cartonnés avec matériel de nidification et jouets en bois) avec un accès à la nourriture et boisson ad libitum. La surveillance des souris sera accrue lors de leur première semaine d'exposition à la lumière artificielle nocturne. Suite à la prise de sang hebdomadaire, l’animal sera placé dans une cage sans congénère pour récupération et jusqu’à l’arrêt complet du saignement (1-2 min). Un petit morceau de cookie lui sera donné en récompense. Il sera ensuite replacé avec ses congénères. Une grille de score d'évaluation du comportement des souris sera mise en place afin d'identifier précocement d'éventuels points limites adaptés. Un arbre décisionnel guidera la décision de retrait des animaux du protocole lorsque les critères prédéfinis seront atteints afin d'interrompre toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Nos recherches portent sur les effets d’une exposition à la lumière artificielle nocturne sur les systèmes neuroendocriniens contrôlant la fonction de reproduction chez les mammifères nocturnes. La souris Sylvestre est un excellent modèle animal de référence puisqu’elle est photosensible et présente des variations saisonnières de ses fonctions de reproduction, physiologiques et comportementales. Ces caractéristiques sont indispensables pour la réalisation de ce projet. Nous utiliserons des animaux mâles et des femelles adultes qui seront âgés de 6 à 16 semaines au début des expériences.

Une puce implantée sous la peau après incision, une pompe posée sous la peau ou dans la cavité abdominale pour cinq semaines de traitement continu, puis jusqu'à seize heures de tests par souris réparties sur quatre semaines : 2 784 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des crises d'épilepsie leur sont provoquées et leur sensibilité à la douleur est mesurée, deux points dont le porteur indique qu'ils entraînent un inconfort supérieur à celui des autres tests. L'objet déclaré est d'évaluer cinq médicaments déjà autorisés pour d'autres maladies neurologiques et de chercher des mécanismes communs à deux troubles du neurodéveloppement. Les tests restent désignés par leurs catégories, sociaux, moteurs, de mémoire et stéréotypés, sans qu'aucun dispositif soit nommé, et l'effectif tomberait à 864 souris si deux mesures de réduction s'appliquaient, écart que le résumé laisse sans commentaire.

Objectifs

Les troubles du neurodéveloppement liés à des anomalies de la communication entre les neurones du cerveau touchent environ 1% de la population mondiale. Ils sont fréquemment associés à des formes d’autisme, des déficits intellectuels et moteurs, ainsi qu’à de l’anxiété, de l’épilepsie et à des altérations des sensations, notamment de la perception de la douleur. À ce jour, ces troubles ne disposent encore que de peu ou pas de médicaments efficaces. Dans le cadre d’un projet financé par le programme Européen sur les maladies rares (ERDERA) réunissant quatre associations de patients et cinq équipes de recherche, ces travaux, dans leur ensemble, visent à mieux comprendre les mécanismes à l’origine de ces troubles, à identifier des marqueurs biologiques et à évaluer le potentiel de repositionnement de candidats médicaments dans des modèles murins. Comme ces troubles pourraient partager certains mécanismes communs, le premier objectif de cette étude est de les identifier en étudiant le comportement et le fonctionnement de ces neurones dans deux modèles murins de ces troubles. Le second objectif du projet consiste à évaluer cinq médicaments déjà approuvés pour d’autres maladies neurologiques (repositionnement) afin de déterminer s’ils pourraient également être bénéfiques pour ces deux troubles. Leur efficacité sera étudiée dans ces deux modèles murins en analysant leurs effets sur les anomalies comportementales et sur le fonctionnement neuronal. Les résultats de cette étude, intégrés au projet européen dans son ensemble, permettraient d’envisager un transfert vers la clinique et les patients à court terme.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer les connaissances sur les troubles du neurodéveloppement liés à des anomalies de la communication entre les neurones du cerveau. Cette étude contribuera à mieux comprendre les mécanismes communs à l’origine de ces maladies et évaluera le potentiel de médicaments déjà utilisés pour d’autres maladies. Dans leur ensemble, ces travaux permettront d’accélérer le développement de médicaments pour les patients concernés par ces troubles.

Procédures

Les souris anesthésiées seront implantées avec une puce d’identification par radiofréquence à l’aide d’une petite incision (une seule fois, 5 minutes par animal). Cette puce permettra d’identifier chaque animal et de suivre ses interactions avec les autres souris lors des tests de comportement. Si un des médicaments ne peut pas être donné oralement dans l’eau de boisson ou la nourriture, une pompe placée sous la peau pourra également être utilisée pour administrer certains traitements de façon continue pendant cinq semaines (en même temps que les puces). Si aucune de ces voies n’est possible, une intervention chirurgicale sera réalisée pour placer la pompe dans la cavité abdominale. Les souris seront évaluées sur leurs comportementaux sociaux, moteurs, de mémoire et stéréotypés et leur sensibilité à la douleur et leur prédisposition aux crises d’épilepsie (maximum 60 minutes par jour sur 4 semaines, soit un total de 16 heures par animal).

Impact sur les animaux

La manipulation des souris, et les tests comportementaux peuvent entraîner un léger stress temporaire chez l’animal. Leur sensibilité à la douleur et leur prédisposition à l’épilepsie peuvent entraîner un inconfort modéré, supérieur à celui associé aux autres tests comportementaux. L'implantation des puces et des pompes peut provoquer une légère douleur minorée par l'administration d'antalgiques. Des crises d’épilepsie seront induites, ce qui pourrait entraîner une diminution de leur bien-être.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures pour réaliser des prélèvements de différents tissus (sang et cerveau) et faire des analyses moléculaires.

Remplacement

Les médicaments seront d’abord testés sur des cellules en laboratoire. Seuls les 5 plus prometteurs seront évalués dans cette étude chez la souris. Il n’existe pas de méthode alternative pour les expériences de comportement et tester des médicaments, car elle nécessite un organisme vivant entier, depuis l’injection, leur passage dans le cerveau jusqu’à l’observation de leurs effets in vivo.

Réduction

Le nombre de 2784 animaux a été optimisé pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement valides. Si aucun effet sexe n’est observé lors de la caractérisation des modèles, le nombre de souris sera réduit de moitié pour l’évaluation des effets des médicaments. De plus, si la dose la plus faible d’un médicament permet d’obtenir des résultats satisfaisants, la dose plus élevée ne sera pas testée. Si ces deux mesures de réduction peuvent être appliquées, le nombre total d’animaux nécessaires sera limité à 864.

Raffinement

L’environnement des souris est enrichi et renouvelé régulièrement pour optimiser le maintien de leur chaleur corporelle et de leur bien-être. Les tests de comportement seront réalisés dans une pièce calme et faiblement éclairée, et seront les plus brefs possibles afin de minimiser l’inconfort et l’anxiété des animaux. De plus, les animaux seront habitués à cette pièce et au contact des expérimentateurs, mais également pour vérifier leur état de santé. Les caractéristiques génétiques des souris et les croisements utilisés ont été adaptés afin de limiter l’apparition de signes indésirables pouvant affecter leur bien-être. Les souris soumises à une incision pour injecter des puces d’identification ou les pompes libérant le médicament seront traitées avec des antidouleurs jusqu’à leur rétablissement pour limiter leur douleur et, comme pour tout changement chez un animal, feront l’objet d’une surveillance renforcée. Des points limites adaptés à chaque procédure ont été mis en place et seront appliqués.

Choix des espèces

Les souris sont de petits animaux sociaux, et dont les comportements sont proches de ceux de l’homme. Elles constituent ainsi un modèle pertinent pour étudier les troubles du neurodéveloppement qui ont un impact important sur la qualité de vie des personnes atteintes. Les études seront réalisées chez des souris adultes âgées de deux mois, ayant un cerveau mature, qui recevront les traitements avec ces médicaments un mois ou une semaine avant l’évaluation de leurs comportements.