Éthologie / comportement / biologie animale

Capturés à l'hameçon ou au filet, anesthésiés six à sept minutes, puis ouverts pour recevoir une marque acoustique implantée en moins de quatre minutes, 310 poissons de récifs rocheux subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cinquante castagnoles et cinquante girelles sont suivies de près, dix individus de chacune des vingt et une autres espèces complétant l'échantillon. Le porteur reconnaît des blessures possibles liées à l'engin de pêche et à la manipulation, et décrit un protocole tenu sous dix minutes de l'endormissement au réveil. Tous sont remis à l'eau vivants sur leur lieu de capture, leurs déplacements étant suivis deux à trois mois par télémétrie.

Objectifs

Les animaux dépendent de leur comportement pour vivre, se reproduire et s’adapter à leur environnement. Ils interagissent avec leurs congénères, d’autres espèces et leur milieu pour survivre. Bien que certaines études aient observé comment des espèces marines utilisent l’espace ou interagissent entre elles, peu se sont intéressées aux interactions entre différentes espèces. Pourtant, comprendre ces relations permet de mieux connaître comment un écosystème fonctionne. Le projet vise à surveiller une zone côtière afin d’analyser comment les animaux interagissent entre eux et avec leur environnement. Grâce à des outils innovants, comme la télémétrie (suivi du déplacement des animaux) de haute résolution, le projet vise à observer : • Comment les poissons se déplacent et utilisent l’espace; • Les interactions intra- et interspécifiques (coopération, compétition, prédation); • Les variations de l’environnement, comme la température de l’eau, les vagues de chaleur, le bruit sous-marin ou l’impact des activités humaines. L’objectif est de voir comment ces animaux réagissent face aux perturbations extérieures et s’ils sont capables de s’adapter (leur résilience). Certaines espèces ou individus sont-ils plus vulnérables que d’autres ? Pour répondre à ces questions, 210 poissons de 21 espèces différentes seront équipés de petits émetteurs acoustiques qui permettront de suivre leurs déplacements pendant deux ou trois mois. Cinquante individus de deux autres espèces très courantes, la castagnole (Chromis chromis) et la girelle (Coris julis), seront étudiées de manière plus approfondie. Ce projet unique apportera des réponses précieuses pour mieux comprendre et protéger les écosystèmes marins face aux changements environnementaux.

Bénéfices attendus

Cette approche expérimentale unique en milieu naturel marin permettra d’identifier comment un écosystème réagit à des perturbations extérieures et d’en évaluer sa capacité à s’adapter. Il s’agira notamment de collecter de nombreuses informations comportementales et environnementales très fines et d’étudier le comportement des poissons à différentes échelles (individuelle, intra- et interspécifique), ainsi que les différences de réponses et de degré d’adaptation aux perturbations. En fonction des résultats, des mesures de gestion seront à l’étude et pourront être testées par le gestionnaire de la zone (eg limitation du kayac pendant certains horaire…).

Procédures

L'ensemble des individus seront soumis à une phase de captures par un hameçon ou filet en fonction de l’espèce ciblée qui durera quelques minutes, puis anesthésié pendant 6-7 mn avant une phase d'implantation d'une marque acoustique par voie chirurgicale qui dure moins de 3-4 mn.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues lors de la capture sont essentiellement le stress lié à la capture, des blessures éventuelles liées à l’engin de pêche ou à la manipulation entre l’engin et les bacs de confinements. Des mesures de raffinement sont prises pour limiter le stress et le risque de blessure.

Devenir

Tous les animaux seront relachés vivant dans le milieu naturel sur leur lieu de capture.

Remplacement

L'intérêt du projet étant d’étudier le comportement spatial de ces espèces dans leur milieu naturel, il n’est pas possible de les remplacer.

Réduction

Il est toujours difficile en écologie spatiale de déterminer le nombre d’individus nécessaires pour évaluer la variabilité de l’utilisation de l’espace pour une population. Ce nombre est variable en fonction des objectifs, des caractéristiques écologiques de l’espèce concernées et des modèles utilisés. Le projet s’intéressant aux processus comportementaux et leur hétérogénéite à l’échelle intra- et interspécifique il est nécessaire d’avoir un échantillon assez représentatif afin capter cette hétérogénéite dans l’utilisation spatiale et les intéractions entre individus. Afin de minimiser le nombre d’individus dans cette étude, nous avons choisi de sélectionner deux espèces modèles afin de répondre aux questions relatives aux interactions intra-spécifiques : la casagnole (Chromis chromis) et la girelle (Coris julis) qui sont deux espèces sociales qui fonctionnent en harem et abondante sur le site d’étude. Ainsi il est envisagé de marquer 50 individus de chaque espèce, un échantillon permettant de générer des réseaux d’interactions biologiquement représentatif tout en captant aussi la variabilité individuelle affectant la population. Pour appréhender les processus d’interaction interspécifiques, il n’est pas nécessaire de marquer autant d’individus que pour les espèces modèles. Il s’agira de marquer 10 individus de plusieurs espèces (N=21) afin de pouvoir comparer les patrons d’utilisation spatiale et les interactions entre espèces. Le nombre d’individus de ces espèces de petite taille est minimal compte tenu de leur nombre et densité en milieu naturel et la nécessité de capturer la majorité de la variabilité du comportement de cette espèces. Un total de 310 individus de 23 espèces sera marqué.

Raffinement

L’ensemble des étapes du projet est mis en œuvre de sorte à limiter les nuisances : la capture est réalisée à l’aide de filet non maillant (formant des poches) en apnée ou avec des hameçons de forme ou de taille à limiter les blessures et éviter l’ingestion par le poisson, le transfert entre bac est réalisé à l’aide d’épuisettes en silicon limitant l’abrasion du poisson à sa sortie de l’eau associée à une manipulation minimal des individus; le marquage est réalisé sous anesthésie générale, un bullage dans le bac de réveil permet une bonne récupération du poisson avant d’être relâché en douceur sans exondation. L'ensemble du protocole de l'endormissement au réveil dure moins de 10 mn.

Choix des espèces

L’étude vise à comprendre les processus comportementaux affectant les individus de plusieurs espèces d’une communauté de poissons rocheux côtiers et leur résilience face aux perturbations environnementales et anthropiques. L’idée est de pouvoir suivre et décrire une communauté à très fine échelle en sélectionnant une arène expérimentale en milieu naturel et de suivre des individus de différentes espèces communes de ces écosystèmes rocheux marins côtiers. Vingt trois espèces communes et en grandes densités ont été sélectionnées. Elles sont représentatives de la diversité fonctionnelle et trophique de ces milieux (ex : espèces herbivores et espèces prédatrices). Les espèces considérées étant de petite taille (7-20 cm environ), les animaux capturés seront des individus matures afin de suivre les règles des 2% du poids de l’animal en ce qui concerne la marque utilisée.

407 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent une neurochirurgie de 45 minutes à 1 h 30, avec craniotomie, pour l'implantation d'électrodes, puis des stimulations optogénétiques qui peuvent provoquer des mouvements involontaires, et certaines reçoivent quatre injections intrapéritonéales sous contention. Elles passent des tests fondés sur des récompenses, désignés comme des "jeux de décisions" sans que leur déroulé soit décrit, pour étudier la flexibilité comportementale et le rôle de la protéine Shank3 dans l'autisme. Elles sont tuées pour vérifier l'emplacement des implants, et le porteur affirme que son protocole comportemental "augmente le bien-être des animaux".

Objectifs

Les troubles du spectre autistique (TSA), caractérisés par des déficits de flexibilité comportementale, résultent parfois d'une mutation monogénique de gènes codant pour les protéines d'échafaudage interagissant avec les récepteurs synaptiques, régulant l'équilibre entre stabilité et plasticité de la force des connexions synaptiques (plasticité synaptique). L'équilibre entre plasticité et stabilité synaptique constitue probablement une base neurale de la "flexibilité" :la capacité à apprendre vite quand l’environnement change, mais à ne pas forcément changer de croyances quand l’environnement est stable. La flexibilité comportementale est un processus central au développement social et cognitif typique des individus, et est fortement altérée dans les TSA. Nous testerons le lien entre les protéines d'échafaudage liées aux TSA, la plasticité neuronale dans le cortex préfrontal, et la flexibilité dans un contexte d'apprentissage.

Bénéfices attendus

Précisement, nous déterminerons: - le rôle causal des aires préfrontales dans la flexibilité - le codage au niveau neuronal de la flexibilité dans les différentes aires préfrontales - le rôle de l'échauffadage des synapses glutamatergiques (protéine "Shank3") dans ces processus.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à des neurochirurgies. La durée de l'opération est de 45 minutes à 1h30, avec toutes les précautions possibles pour éviter la douleur (anesthésie gazeuse, anesthéisques locaux, morphiniques en péri-opératoire). Les seules manipulations quotidiennes consisteront en un branchement des implants à électrodes (geste non douloureux). Des injections intra-péritonéales seront réalisées pour certains animaux (4 injections par animal sur la totalité de l'expérience). Le reste des procédures implique des tests comportementaux de type "jeux de décisions", basés sur des récompenses, et décrits comme positifs pour le bien-être animal dans la littérature.

Impact sur les animaux

Les animaux qui subiront des neurochirurgies peuvent éventuellement avoir des douleurs associées aux craniotomies effectuées sur l'os mais aussi au niveau des sutures. Certains effets indésirables liés à la stimulation optogénétique peuvent survenir (artefacts moteurs) et troubler l'activité locomotrice (un mouvement incontrolable mais non douloureux comme lever une patte ou tourner un peu la tête). Les animaux d'une des procédures auront des contentions (pour lesquelles ils seront habitués en douceur) en vue d'injections intrapéritonéales sur quatre jours. La lignée de souris ne présente pas de phénotype dommageable.

Devenir

Les animaux sont tous mis à mort après les procédures pour vérifier que les sites stéréotaxiques d'injection et d'implantation sont corrects.

Remplacement

Nous cherchons à évaluer le rôle des neurones pendant le comportement de décision, il est donc impossible de remplacer les méthodes in vivo par des methodes in vitro.

Réduction

Nous avons déjà effectué des expériences similaires (pour étudier d'autres zones cérébrales) ce qui nous permet de réduire le nombre d'animaux au strict nécessaire. De plus nous développons un modèle informatique de réseau de neurones récurrent capable de modéliser la prise de décision. L'activité électrique des neurones y est fonction des connexions synaptiques, qui elle-mêmes évoluent en fonction de l'activité électrique des neurones et des récompenses reçues par l'animal (plasticité synaptique). ce modèle fournira des prédictions précises sur ce qu'il est important d'enregister comme activité électrique, ce qui réduit le nombre d'animaux.

Raffinement

Pour diminuer et abolir les douleurs chirurgicales, nous utilisons une combinaison d'anesthésiques et d'anti-inflammatoires pendant la chirurgie et en péri-opératoire. De la pommade antifongique ainsi que du désinfectant seront appliqués pour prévenir les infections. Nous stopperons les expériences d'optogénétique en cas d'artefact locomoteur. Le protocole sera interrompu si les points limites définis sont atteints, à savoir une perte de poids durable de l’animal, des signes de souffrances évalués par l’échelle Mouse Grimace Scale et une prostration, malgré les mesures prises. Nous tiendrons une feuille de suivi post-opératoire sur les deux jours suivant l'opération pour évaluer rapidement ces points. Le stress de l’animal sera limité par un enrichissement permanent de l’environnement (igloos, tunnels, nesting), ainsi qu’une habituation quotidienne à l’expérimentateur/rice et à la salle expérimentale. Le protocole de comportement consiste en un jeu de décisions et augmente le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Le système de décision (circuit mésocorticolimbique) est plus proche anatomiquement et fonctionnellement entre mammifère (rongeurs et Humains) qu'entre mammifères et invertébrés, poissons ou oiseaux. De plus, la génétique de la souris offre des outils de modulations des réseaux neuronaux. Enfin, nos tâches comportementales de type "jeux" ont été spécifiquement développées et adaptées à l'étude des prises de décision de la souris, tout en assurant leur bien-être. Ce projet implique d'utiliser des groupes de souris de même stade de développement (8 semaines) qui est un stade classique dans les études sur les prises de décision (8 semaines étant considéré comme le début de l'âge adulte dans cette espèce).

Soumises à des contentions répétées destinées à produire un état de stress, puis à l'injection d'une substance inflammatoire, 2 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles développent une perte d'appétit, une chute de température et un retrait social, que le porteur nomme "comportement de maladie" et présente comme contribuant à leur rétablissement. Il écrit par ailleurs que la contention laisse l'état général des souris stable, sans perte de poids ni changement d'activité, tout en s'en servant comme modèle de stress. Toutes sont tuées pour prélever leurs tissus, et la rubrique consacrée au remplacement décrit un travail sur les oméga-3 et les régimes alimentaires, quand l'objectif annoncé porte sur un récepteur de la neuroinflammation.

Objectifs

Les maladies psychiatriques sont un problème majeur de santé publique. A l’heure actuelle, la prise en charge de ces pathologies demeure incomplète puisqu’entre 30 et 50 % des patients souffrant de dépression sont résistants aux traitements existants. Dès lors, la recherche de nouvelle piste thérapeutique est essentielle et urgente. La neuroinflammation est une composante essentielle des pathologies psychiatriques. Notamment l’activation des cellules microgliales, unique cellule immunitaire du cerveau, a été observé dans des pathologies comme la dépression. Notre projet a débuté par une partie clinique qui a permis d’identifier différents composés biologiques d’intérêt dans la circulation sanguine chez des sujets atteints de troubles psychiatriques. Notre objectif est donc de tester si l’administration de ces molécules bioactives a des effets sur le fonctionnement cérébral, la neuroinflammation et le comportement. L’objectif final du projet sera de mettre en évidence les mécanismes par lesquels ces composés influencent le cerveau afin de pouvoir proposer de nouvelles stratégies dans la prise en charge des pathologies psychiatriques.

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension des mécanismes neuroinflammatoires impliqués dans les troubles psychiatriques, notamment via le rôle du récepteur HCAR2 dans les cellules immunitaires du cerveau et de la périphérie.

Procédures

Pour désactiver le gène spécifique HCAR2 dans certaines cellules immunitaires du cerveau (positives pour le gène CX3CR1), les souris recevront une injection par jour pendant cinq jours. Trois semaines plus tard, un groupe de souris modifiées et un groupe témoin recevront une substance inflammatoire pour observer leur réaction. Leur état sera suivi pendant les 48 heures suivantes. À la fin de l’expérience, les souris seront endormies sans douleur grâce à un anesthésiant, suivi d’une injection pour mettre fin à leur vie. Chaque injection ne prend que quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues dans ce projet sont limitées et soigneusement contrôlées grâce à des protocoles rigoureux et des mesures adaptées. La contention répétée est une méthode utilisée pour modéliser un état de stress. Bien qu’elle puisse entraîner un inconfort temporaire, l’état général des souris reste stable, sans perte de poids ni altération de leur activité habituelle, selon notre expérience et les données disponibles. L’injection d’une substance inflammatoire entraîne une activation temporaire du système immunitaire, provoquant un malaise passager caractérisé par des modifications de la température corporelle, du métabolisme énergétique, une perte d’appétit et un comportement de retrait social. Ce phénomène, appelé « comportement de maladie », contribue au rétablissement des animaux et disparaît en 48 heures. Les évaluations comportementales sont conçues pour minimiser l’impact sur le bien-être des souris, avec des durées d’exposition réduites et des manipulations adaptées. De plus, les lignées utilisées sont bien caractérisées, et un suivi rigoureux permet de détecter rapidement tout effet inattendu. Pour garantir le bien-être des animaux, des mesures spécifiques sont mises en place : une surveillance quotidienne par l’expérimentateur et bihebdomadaire par les animaliers, ainsi qu’une évaluation systématique de la douleur après chaque manipulation, avec administration d’analgésiques si nécessaire. L’enrichissement de l’environnement, des manipulations douces et une attention constante visent à réduire au maximum les effets indésirables tout en assurant des conditions optimales pour les expériences.

Devenir

A la fin de chaque procédure expérimentale ou si les points limites sont atteints au cours de l'une d'entre elle, les souris seront euthanasiés afin de préléver les tissus nécéssaires aux analyses.

Remplacement

L’étude des régimes alimentaires nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. L’objectif général du projet vise à étudier les mécanismes neurobiologiques et rôle des acides gras polyinsaturés oméga-3 dans la prévention des altérations cognitives et émotionnelles suite à un stress chronique. Pour se faire, nous utilisons des tests in vivo, et dans ce contexte, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié. Les expériences ne peuvent pas être effectuées sur des cultures cellulaires ou dans des modèles computationnels ou encore chez l’homme, car aucune de ces approches ne permet de réaliser toutes ces expériences chez un même sujet. Le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude des troubles de l’humeur reste une nécessité expérimentale majeure.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, les animaux qui passeront les tests comportementaux serviront également pour récupérer les cellules ou structures centrales nécessaires pour les études de lipidomiques et/ou moléculaires et protéomiques, évitant donc de générer une nouvelle cohorte pour ces analyses biochimiques et moléculaires. Les femelles sont également étudiées, ce qui nous permet d'utiliser tous les animaux générés durant cette étude et de ne pas euthanasier des animaux pour rien. De plus grâce à des études menées précédemment dans notre laboratoire montrent que pour avoir une puissance statistique suffisante, nous avons montré que 15 souris sont nécessaire par groupe afin de permettre une robustesse des données.

Raffinement

Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur, la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupe sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement ainsi que des traitements vétérinaires si nécessaire. Enfin, nous avons déjà inscrit ce projet dans un consortium de travail international visant à partager les données afin de limiter les doublons expérimentaux et de conduire à un raffinement des approches de recherche dans la communauté scientique.En fin d'expérimentation, les animaux seront mis a mort par une anesthésie sans reveil avec au préalable une analgésie pour limiter la douleur pendant la procédure.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser des souris en raison de leur petite taille, qui permet de les héberger facilement dans des conditions d’élevage optimales en animalerie. Nous privilégions la souris plutôt que le rat, car de nombreuses lignées transgéniques sont déjà disponibles dans notre laboratoire, contrairement aux rats. Ce choix s’inscrit également dans une démarche de réduction du nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, les cellules immunitaires de la souris et de l’homme partagent de nombreux gènes en commun, ce qui facilite la transposition des résultats obtenus chez l’animal à l’humain. Les différentes lignées transgéniques générées arriveront dans notre animalerie à l’âge de 6 semaines et bénéficieront d’une période d’acclimatation de 2 semaines avant de commencer les protocoles de stress. Les tests comportementaux débuteront sur des animaux âgés de 12 semaines au maximum.

364 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries dès la gestation avec un régime carencé en oméga 3 ou équilibré, elles subissent une injection stéréotaxique de virus dans le cerveau, une injection de N-oxyde de clozapine, puis un test de mémoire de travail spatiale et un test de mémoire associative. Ce second test consiste à associer un environnement à des "stimulations" appliquées aux pattes, susceptibles selon le porteur de provoquer une douleur passagère, sans qu'il précise lesquelles. Il affirme que le recours au modèle animal reste une "nécessité expérimentale" et qu'aucune méthode de remplacement n'apparaît dans les bases de données consultées, l'apport annoncé étant une meilleure compréhension des liens entre alimentation et mémoire.

Objectifs

Ce projet s'inscrit dans la thématique de notre équipe et fait suite à plusieurs années de recherche sur l'impact des acides gras polyinsaturés oméga 3 sur la physiologie du cerveau. Les données obtenues sur ce projet ont donné lieu à plusieurs publications et nous ont permis d'obtenir des soutiens financiers importants (ANR JCJC, JPND Solid européen). La carence en lipides oméga 3 est associée à des déficits du développement cérébral et des altérations de comportement à l'âge adulte. Nos résultats récents indiquent une augmentation de l'activité des neurones de l'hippocampe dans le cerveau lorsque les souris sont soumises à un régime déficient en lipides oméga 3 depuis la gestation chez les mâles et les femelles à l'âge adulte. Cette hausse d'activation de l'hippocampe est associée à une altération des mémoires de travail et associatives dépendantes de l'hippocampe en condition de carence en oméga 3. Notre objectif est de démontrer que cette hyper-activation est responsable des déficits comportementaux par des approches de pharmacogénétiques permettant de diminuer l'activité des neurones de l'hippocampe pendant la tâche comportementale.

Bénéfices attendus

Notre étude associe une approche nutritionnelle à une approche de pharmacogénétique et comportementale. Elle apportera des connaissances nouvelles visant à mieux comprendre les mécanismes cérébraux des troubles de la mémoire en lien avec l'alimentation.

Procédures

Les animaux seront soumis à des régimes carrencés ou équilibrés en oméga-3 depuis la gestation. Ils sont soumis à 1 test comportemental à 3 mois visant à mesurer la mémoire de travail spatiale et la mémoire associative, toutes deux dépendentes de l'hippocampe. Une injection intrapéritonéale de N-oxyde de clozapine juste avant le comportement sera réalisée.

Impact sur les animaux

Les animaux de la procédure 1 réaliseront un test de mémoire de travail spatiale qui dure 15 min au total sur deux jours (acquisition, test) et ne cause aucune détérioration de l'état général des animaux. Les animaux de la procédure 2 subiront un protocole d'association d'un environnement donné à des stimulations pouvant entrainer une douleur passagère au niveau des pates mais n'entrainant pas de perte de poids, ni d'altération de l'état général des animaux. Pour les deux procédures, les régimes équilibré, carencé en Oméga 3 n’impactent pas le bien-être général de l’animal en termes de comportements alimentaire ou social mais pourraient modifier les capacités cognitives que nous voulons étudier. Pour les deux procédures, les animaux subiront une injection stéréotaxique chirurgicale d'un virus dans le cerveau, qui induira une douleur passagère chez les animaux, traitée par une approche d'antalgiques pré et post-opératoire. Une baisse de l'appetit et une diminution du poids des animaux est possible en post-opératoire et nécessitera un suivi post-opératoire journalier. Pour les deux procédures, les animaux subiront une injection de N-oxyde de clozapine en périphérie, qui n'a pas d'effet indésirables à la dose et fréquence d'administration sur l'état de bien être des animaux, mais induira une légère douleur passagère liée au geste.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupérer les cerveaux.

Remplacement

L’étude des régimes alimentaires nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. L’objectif général du projet vise à étudier les conséquences d’une carence nutritionnelle en oméga n-3 sur les mémoires à l'âge adulte chez la souris. Pour se faire, nous utilisons des tests in vivo, et dans ce contexte, bien que certaines études soient développées sur des modèles cellulaires pour traiter les aspects neurobiologiques, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, nous avons déterminé le nombre d'animaux par une approche statistique afin de permettre un équilibre entre la robustesse des données omiques générées malgré la faible puissance statistique liée au nombre de groupes générés. Réduire ce nombre serait prendre le risque de générer des données non concluantes, ce qui pousserait à reproduire ces expériences avec un nombre plus grand et donc à terme consommerait plus d'animaux. La pertinence du nombre dans les destinations expérimentales repose sur la limite de détection du matériel que nous cherchons à évaluer, notamment concernant l'étude des exosomes. Nous ne pouvons réduire ce nombre au risque de passer sous la limite de détection des appareils de mesure. Enfin, nous avons déjà inscrit ce projet dans un consortium de travail international visant à partager les données afin de limiter les doublons expérimentaux.

Raffinement

Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur et la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupes sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu tel que des igloo en carton ou en plastique, ainsi que de l'eau et de la nourriture à volonté. Les souris auront plusieurs phases d'habituation : une semaine d'habituation à l'arrivée des géniteurs, une habituation à l'experimentateur avant les tests et/ou les chirurgies, une habituation aux pièces de comportement avant les tests. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire.

Choix des espèces

Ce projet s'inscrit dans la continuité des recherches menées par les porteurs du projet. Le projet porte sur le stade adulte des animaux pour lequel des données préliminaires ont été générées chez la souris et la genèse de données nouvelles sur le modèle murin permettra de raffiner les données existantes par leur analyse commune avec les nouvelles données générées. La souris est un modèle pertinent et reconnu en nutrition et déclin cognitif, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier notamment le cerveau et son fonctionnement notamment à l'âge adulte.

Achetés adultes chez des fournisseurs, à raison de dix individus par espèce, 120 oiseaux de douze espèces captives, du diamant mandarin au loriquet à tête bleue, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des billes métalliques leur sont implantées dans la langue, le larynx, la trachée et la syrinx, jusqu'à huit par structure, pour rendre visibles leurs mouvements sous rayons X pendant qu'ils vocalisent. Les séances de radiographie et de vélocimétrie laser durent trente minutes par individu et par demi-journée, les lasers étant placés sous les oiseaux pour éviter les brûlures de rétine. Le porteur écrit que les 120 individus seront tués si tous les oiseaux implantés vocalisent devant les caméras, le microscanner nécessaire à la reconstruction en trois dimensions imposant leur mort, et que les oiseaux non implantés qui n'auront pas vocalisé seront gardés en vie et adoptés.

Objectifs

Bien que la production de sons soit essentielle dans l'évolution des oiseaux, elle reste encore mal comprise, notamment au niveau de la mécanique des mouvements. La plupart des études sur la façon dont les oiseaux produisent des sons (chants, cris, appels) ont utilisé des méthodes indirectes, comme des dissections ou des tests sur des oiseaux anesthésiés. Notre objectif est d'exploiter les nouvelles techniques pour observer et mesurer en détail les mouvements des organes vocaux des oiseaux pendant qu'ils chantent, tout en enregistrant le flux d'air sortant de leur bec et les sons produits. L’objectif de cette étude est d’enregistrer, de quantifier pour ensuite modéliser : 1) Les mouvements du système vocal interne et externe lors de la vocalisation 2) Les flux d’air impliqués et 3) Les vocalisations produites sur une diversité d’espèces d’oiseaux. Le but est de comprendre comment les oiseaux produisent et modulent activement le son dans des conditions physiologiques, au plus proche des conditions naturelles de vocalisation. Pour cela, nous voulons filmer les oiseaux vocalisant, en utilisant à la fois un système multi caméras et de cinéradiographie biplanaire (rayons X), pour quantifier la cinématique des parties externes (par exemple bec, cou) et des parties internes (par exemple, trachée, syrinx) du haut du corps. Les enregistrements vidéo seront synchronisés avec des enregistrements acoustiques, à l’aide de microphones. Nous voulons également coupler ces observations à des mesures de flux d'air circulant à la sortie du bec, synchronisées avec des enregistrements acoustiques pendant la vocalisation. Pour cela nous utiliserons la méthode de Particle Image Velocimetry (PIV), une technique de mesure optique permettant d’obtenir le champ de vitesse d’un écoulement d’intérêt à partir de lasers. Pour comparer la production et la modulation du son entre les espèces et les sexes, nous avons choisi 4 familles d’oiseaux, représentant une diversité d’anatomies et de sons produits (c’est-à-dire Passeriformes, Columbiformes, Galliformes et Psittaciformes). Trois espèces par groupes ont été sélectionnées et des individus mâles et femelles seront utilisés pour chaque espèce de façon à mener des analyses comparatives en contexte phylogénétique.

Bénéfices attendus

En comparant la façon dont différentes espèces d'oiseaux produisent des sons, chez les mâles comme chez les femelles, nous allons identifier des structures importantes pour mieux comprendre leurs capacités vocales, à l’échelle de l’individu, du sexe et de l’espèce. Pour la première fois, nous pourrons observer tout le système vocal en mouvement, grâce à l'utilisation combinée de plusieurs techniques : des radiographies en mouvement (cinéradiographie), une méthode optique pour mesurer les flux d’air (PIV) et des enregistrements sonores. Les données détaillées que nous allons collecter permettront de répondre à d’anciennes questions non résolues sur les mécanismes impliqués dans la production de sons chez les oiseaux. En approfondissant notre connaissance de leur communication vocale, nous pourrons mieux comprendre comment des systèmes complexes de communication se développent et évoluent.

Procédures

Les animaux seront filmés à l’aide de caméras rayons X à haute vitesse et enregistrés par des microphones. 1) Les enregistrements par cinéradiographie (rayons X) couplés à des caméras haute vitesse permettront de quantifier les mouvements des structures externes et des structures internes rigides (par exemple le bec, les anneaux cartilagineux de la trachée). Pour quantifier la cinématique des structures non rigides (comme la langue, le larynx) des marqueurs radio-opaques constitués de billes de métal (alliage d’étain et d’argent) seront implantés dans les différentes structures du système vocal avant les enregistrements. Le nombre de marqueurs variera en fonction de la taille de la structure (par exemple, 5 pour la langue, 3 pour le larynx, de 5 à 8 pour la trachée, 3 pour la syrinx) et leur position sera adaptée à la forme et la fragilité de la structure (par exemple, implantés dans les anneaux cartilagineux plutôt que dans les parties molles de la trachée). Une étude pilote sur 2 individus par espèce sera réalisée pour s’assurer que les oiseaux implantés sont bien capables de vocaliser. 2) Les oiseaux filmés en cinéradiographie sans marqueurs ou avec marqueurs seront enregistrés en vélocimétrie par images de particules. Cette technique permet de quantifier les mouvements d’air impliqués dans la vocalisation à l’aide de particules en suspension dans l’air et de lasers. Cela permettra de s’assurer que les mouvements du système vocal et de l’air pendant la vocalisation ne diffèrent pas entre les oiseaux implantés et les oiseaux non implantés.

Impact sur les animaux

Les risques pour les oiseaux pendant les enregistrements par vélocimétrie par images de particules, cinéradiographie et système multi-caméras seront prévenus au maximum. Nous maintiendrons la salle à moins de 27°C, fournirons de l'eau et limiterons les enregistrements à 30 minutes par individu et par demi-journée. Les lasers susceptibles de provoquer des brûlures seront positionnés sous les oiseaux pour éviter les impacts sur les rétines, déclenchés après leur phase d'exploration, avec des flashs brefs en salle obscure et éclairée par des lampes infrarouges. Les oiseaux seront étroitement surveillés pour tout signe de détresse, et des ajustements seront faits si nécessaire. Pour la cinéradiographie, les animaux seront surveillés pour éviter la surexposition aux rayons X, bien que les études précédentes n'aient pas montré d'effets secondaires. Toute mesure sera prise pour éviter l'inconfort et la douleur lors de l’implantation des marqueurs, avec une surveillance régulière des zones implantées et du comportement des oiseaux.

Devenir

Les animaux implantés, ayant permis la prise de données cinématiques doivent être scannés en microtomographie (CTscans) pour reconstruire le mouvement en 3D des organes étudiées. Cette procédure nécessite la mise à mort des individus. Par exemple, si tous les oiseaux implantés vocalisent dans le champ des caméras rayons X, les 120 individus seront mis à mort. Les animaux n'ayant pas vocalisé dans le champ de caméras (Rayons X) ou du système de vélocimétrie par images de particules et n'ayant pas été implantés seront gardés en vie et seront adoptés.

Remplacement

Comme les organes vocaux internes sont difficiles à visualiser, la plupart des mesures et des expériences ont jusqu'ici utilisé des méthodes indirectes, telles que des dissections, des préparations d'organes vocaux excisés et des mesures de la pression des sacs aériens, ou ont été enregistrées lors de stimulations neurales d'oiseaux anesthésiés. Malgré les résultats importants fournis par ces études, une contrainte majeure demeure : les structures impliquées ne peuvent pas bouger et moduler le son comme elles le feraient in vivo. Nous souhaitons mettre à profit les progrès méthodologiques récents en termes de collecte et de traitement des données pour comprendre comment les oiseaux produisent et modulent activement le son, dans des conditions physiologiques proches des conditions naturelles. De ce fait l’utilisation d’animaux vivants, libres de leurs mouvements est incontournable.

Réduction

À part une étude réalisée en 2015, aucune n’a examiné la diversité des mécanismes de production des sons chez différentes espèces d'oiseaux. Nous nous basons sur cette étude pour choisir les espèces et le nombre d’individus à étudier. Dans cette étude, quatre groupes d’oiseaux avaient été sélectionnés : les Paléognathes, Columbiformes, Psittaciformes et Passériformes, car ils représentent une grande diversité anatomique, sonore et évolutive. Comme les Paléognathes (autruches, émeus, nandous) sont souvent de grande taille et difficiles d’accès, nous avons les avons remplacés par les Galloanserae, un autre groupe ancien qui diverge tôt dans l’évolution des oiseaux modernes. Nous avons choisi d’inclure 3 espèces par groupe (soit 12 espèces au total), afin d’avoir une étude plus équilibrée et statistiquement solide que celle de 2015, dans laquelle le nombre d’espèces par groupe variait de 1 à 2. Habituellement, les études en biomécanique impliquant la cinéradiographie ne concernent que peu d’individus (2 à 4) et d’espèces (1 à 3). Nous avons donc décidé d’étudier 5 individus par sexe (soit 10 individus par espèce), et d’analyser les données d’au moins 3 individus par sexe, ce qui permet de pallier aux difficultés de prise de données (comme un oiseau qui ne vocalise pas). Nous prévoyons d’analyser entre 5 et 20 séquences de sons par individu, ce qui nous donnera 30 à 120 séquences par espèce, un nombre considéré comme suffisant pour obtenir des données exploitables statistiquement pour des analyses comparatives entre les espèces. Nous utiliserons des modèles mathématiques appelés modèles linéaires mixtes pour comparer certains paramètres des sons (comme les fréquences de vocalisation) en fonction du type de vocalisation ou du sexe, et nous prendrons en compte les différences entre individus.

Raffinement

Les études biomécaniques sur les vocalisations des oiseaux nécessitent des observations sur des animaux non anesthésiés et en bonne santé. Le bien-être des oiseaux est essentiel à chaque étape de l'expérimentation. Ils proviendront de fournisseurs externes et seront logés dans des cages adaptées avec des enrichissements comme des perchoirs, des balançoires et des zones de bain. Chaque espèce sera hébergée individuellement pour minimiser le stress, et les sexes seront séparés pour éviter les reproductions non souhaitées. Toutes les méthodes seront adaptées pour réduire la douleur et le stress des animaux. Les procédures invasives seront limitées aux cas strictement nécessaires, avec un protocole d'anesthésie élaboré avec un vétérinaire. Une période d'acclimatation à la salle d'expérimentation sera mise en place, et des experts veilleront au bien-être des oiseaux 7 jours sur 7.

Choix des espèces

Les espèces choisies sont des espèces captives, habituellement utilisées en expérimentation animale (elles ont toutes fait l'objet d'études expérimentales sur les vocalisations ou dans des conditions expérimentales similaires). Elles sont de taille relativement réduite et donc compatible avec le protocole expérimental choisi : Poule domestique (Gallus gallus), Sarcelle à collier (Callonetta leucophrys), Caille des blés (Coturnix coturnix), Diamant mandarin (Taeniopygia guttata), Canari domestique (Serinus canaria domestica), Moineau du Japon (Lonchura striata domestica), Pigeon biset (Columba livia), Tourterelle domestique, (Streptopelia risoria), Colombe diamant (Geopelia cuneata), Calopsitte élégante (Nymphicus hollandicus), Perruche ondulée (Melopsittacus undulatus), Loriquet à tête bleue (Trichoglossus haematodus) Bien que pour certaines espèces, seuls les mâles soient considérés comme chanteurs, toutes les espèces choisies produisent des vocalisations stéréotypées (mâles et femelles) mais diversifiées avec des mécanismes de production variés. Ces espèces représentent donc une diversité morphologique et acoustique au sein du groupe des Aves. Tous les oiseaux seront achetés adultes ou sub-adultes (>1 ans), de façon à ce que leur apprentissage du chant soit consolidé et leurs organes vocaux matures. Tous les oiseaux seront achetés adultes ou sub-adultes (>1 ans), de façon à ce que leur apprentissage du chant soit consolidé et leurs organes vocaux matures.