Éthologie / comportement / biologie animale

150 chevreuils sauvages vont être utilisés, puis relâchés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Capturés au filet et anesthésiés, les brocards subissent une collecte de sperme par électro-stimulation, un prélèvement de sang à la jugulaire et des prélèvements de fèces et de poils, une fois par an. Le porteur reconnaît des risques de blessures, de stress de capture et de myopathie de capture pouvant être mortelle. Il justifie l'étude de la sénescence de reproduction par la nécessité d'une population sauvage suivie de longue date, qu'aucune population captive ne pourrait remplacer.

Objectifs

La sénescence de reproduction - le déclin des performances de reproduction avec l'âge - est un processus biologique très répandu dans le vivant, associé à de profondes implications biologiques, démographiques et sociétales. Pourtant, très peu d’études se sont intéressées à la sénescence de reproduction des mâles en milieu naturel. L’objectif de notre projet est donc d’identifier les facteurs biologiques (ex : effort de reproduction en début de vie, santé des individus) et écologiques (ex : qualité des ressources, exposition à des polluants) qui modulent les performances de reproduction au cours de la vie des mâles, en milieu naturel. Pour mener à bien ce projet, il est par essence indispensable de travailler sur une population animale sauvage pour laquelle les individus sont suivis de la naissance à la mort. En outre, il est nécessaire que les trajectoires individuelles des mâles qui seront échantillonnés soient déjà disponibles (données sur la croissance ou la santé des individus). Nous analyserons les causes évolutives de la sénescence de reproduction des chevreuils mâles (brocards) dans une population française de chevreuil. Nous organiserons des captures estivales afin de collecter de nouvelles données sur les traits pré-copulatoires (ex : morphologie des bois) et post-copulatoires (ex : qualité des spermatozoïdes) pendant la période du rut. Nous testerons ensuite des prédictions issues des théories évolutives du vieillissement, en examinant si une forte allocation à la croissance et à la reproduction en début de vie est associée à une sénescence de reproduction plus précoce ou plus marquée. De plus, nous explorerons si ces associations sont modulées par les conditions environnementales et par une dégradation de santé des individus (évaluée par divers marqueurs de la sénescence, tel que l'âge épigénétique). Basé sur une combinaison unique de données comportementales, physiologiques, génétiques et de traits d’histoire de vie, ce projet permettra d’obtenir une compréhension fine des causes et conséquences évolutives de la senescence de reproduction. Ces travaux menés chez un mammifère longévif en milieu naturel ouvriront de nouvelles perspectives de recherche aussi bien pour la biologie évolutive que pour la biogérontologie. Les individus qui composent la population d'étude sont suivis individuellement depuis plus de 40 ans.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’identifier des marqueurs phénotypiques (ex : taille des caractères sexuels secondaires) et moléculaires (ex : âge épigénétique) de la sénescence de reproduction des mammifères mâles. A terme, ce projet permettra d’identifier les mâles souffrant d’une fertilité réduite par des mesures bien moins invasives que l’électro-stimulation (ex : par simple mesure phénotypique ou dosage sanguin). Ainsi, l’identification plus aisée des mâles les plus fertiles permettra d’affiner les protocoles de gestion des populations. La majeure partie de nos connaissances actuelles sur le vieillissement est basée sur des expériences menées sur des modèles animaux à courte durée de vie dans des environnements contrôlés (par exemple des rongeurs de laboratoire), ce qui rend difficile l'extrapolation des résultats à des espèces à longue durée de vie comme l'humain. Dans ce contexte, notre projet est porteur pour la recherche biomédicale car le chevreuil présente un cycle de vie lent (c'est-à-dire une faible fécondité annuelle et un taux de survie élevé à l'âge adulte) plus proche de celui de l'homme que de nombreux organismes de laboratoire. En outre, il se concentre une population naturelle, et pour laquelle les individus sont suivis de la naissance à la mort et les échantillons biologiques couvrant toute la vie des individus déjà disponibles. De plus, il fournira des informations essentielles sur le rôle joué par les conditions environnementales sur le déclin des capacités reproductrices masculines. En effet, les perturbations écologiques actuelles sont susceptibles d'avoir des conséquences néfastes sur la fertilité des mâles, et pourraient être déjà impliquées dans la détérioration inquiétante de la santé reproductive des hommes comme actuellement documentée dans la plupart des populations humaines du monde entier. À plus long terme, ce projet pourra également fournir des connaissances fondamentales sur l'étiologie des maladies reproductives masculines. Jusqu'à présent, les études sur le vieillissement reproductif masculin dans les sciences vétérinaires et biomédicales n'ont pas intégré de considérations éco-évolutives. Pourtant des approches similaires, réalisées dans des populations sauvages de mammifères longévifs ont déjà conduit à des percées dans notre compréhension de la santé reproductive des femmes.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : pose de boucles auriculaires à la première capture (si non marqué - durée 1 min), pose d'une puce d’identification injectable à la première capture (si non marqué - durée 1 min), une anesthésie, une collecte de sperme par an (durée 20 min maximum), 1 prélèvement de sang dans la jugulaire (14 ml mL maximum) (durée 1 min), un prélèvement de fèces au niveau rectal (durée 2 min), 1 prélèvement de ~100mg de poils au niveau du miroir (durée 1 min), 1 prélèvement de touffes de poils au niveau des glandes interdigitales et métatarsales (durée 2 min).

Impact sur les animaux

Les deux effets indésirables principaux sont i) les risques de blessures superficielles et de traumatologie (fractures extrêmement rares mais possibles lorsque l’animal se prend dans le filet) et ii) le stress causé par la capture (phase de course qui précède la capture au filet puis démaillage et mise en sabot). Contrairement aux captures hivernales, le stress lié à la contention sera atténué puisque les animaux seront anesthésiés. La conséquence la plus fréquemment observée de ce stress de capture est une réduction de l’activité locomotrice journalière dans les jours suivant la capture, dont la durée a été évaluée à 14 jours chez le cerf de Virginie. Plus rarement peut survenir une hyperthermie liée au stress et à la contention, ou une myopathie de capture, s’exprimant essentiellement soit sous la forme d’un choc post-capture (dans les 6 heures suivant la capture, avec risque mortel) soit sous la forme d’un syndrome d’ataxie-myoglobinurie (dans les heures ou jours suivant la capture). Les prélèvements d’échantillons seront réalisés sur des animaux anesthésiés et analgésiés. Ainsi, le stress associé aux protocoles d’échantillonnage sera limité (collecte de fèces, prise de sang, pose de boucles auriculaires et d'une puce d'identification injectable, éléctro-stimulation), et l’inconfort et les douleurs associées (potentiellement détectées par des vocalisations) au protocole seront modérées, de courte durée et ne persisteront pas au-delà de la manipulation. L’inconfort qui pourrait émaner de ces protocoles sera réduit au minimum par l’administration d’un analgésique à action centrale. Aucun des prélèvements n’est à même de provoquer une douleur qui persisterait une fois l’animal réveillé et relâché.

Devenir

Les animaux seront remis en liberté.

Remplacement

Ce projet de recherche sur le chevreuil repose sur le suivi individuel de brocards. Il vise en particulier à explorer les trajectoires d’allocation dans la reproduction des brocards au cours de la vie et de comprendre comment celles-ci sont modulées par les conditions environnementales (ex : niveau de pollution, conditions climatiques) à la naissance ou au cours de la vie adulte et influent la survie des individus à long termes. Ce projet est dans la lignée des suivis à long-termes en écologie basés sur le suivi le plus long et le plus complet possible des individus au cours de leur vie en milieu naturel. Il n’existe donc, par essence, aucune méthode substitutive à notre protocole de recherche. Les approches in vitro ou in silico, ne permettent pas d’étudier simultanément les réponses des individus aux variations de conditions environnementales de manière intégrée (prises en comptes du spectre complet de traits reproducteurs, morphologie des bois, sécrétions odorantes, quantités et qualité des spermatozoïdes) au niveau individuel ainsi que les conséquences à long terme sur la valeur sélective des individus. En outre, une compréhension fine du rôle de l’environnement sur la sénescence nécessite, par essence, de se focaliser sur des populations sauvages. Nous avons en effet démontré que les conditions de captivités modifient les patrons de sénescence. Les populations de mammifères captives ou de laboratoire ne constituent donc pas une alternative pertinente à l’utilisation de populations sauvages lorsqu’il s’agit d’étudier le rôle de l’environnement sur le processus de sénescence. Notre protocole est calibré pour que toutes les quantités de tissus prélevées soient en adéquation avec des objectifs prédéfinis précis. Toutefois, si certains échantillons s’avéraient non utilisés (en particulier les échantillons de sperme pour lesquels nous ne pouvons pas contrôler de manière précise la quantité que nous allons collecter) ou si une amélioration des protocoles de biologie moléculaire permettait de réduire la quantité de tissus à utiliser pour la quantification d’un paramètre donné, les échantillons supplémentaires et restants seraient mis à disposition de notre réseau de collaboration (et participerait ainsi à du remplacement pour des projets futurs).

Réduction

Notre objectif est de réaliser le protocole sur un total de 30 brocards (d’âges connus ou non), lesquels seront recapturés annuellement le temps de la durée du projet. Ce nombre de 30 individus est le nombre minimal pour pouvoir utiliser les outils statistiques appropriés à l’étude de la sénescence en milieu naturel (ex : modèle linéaire mixte généralisé avec un effet aléatoire de l’individu sur l’intercept du modèle. Dans cette étude nous ciblerons, lors des mini-traques, des mâles déjà marqués lors de captures hivernales précédentes (pour lesquelles le comité d’éthique a déjà rendu un avis favorable) et pour lesquels une partie des trajectoires individuelles est déjà connue. Ce ciblage permet de limiter la capture de nouveaux individus tout en se concentrant sur ceux ayant le plus de valeurs scientifiques. Si un animal venait à être capturé une seconde fois au cours du même été, aucun prélèvement ne serait pris et l’animal serait immédiatement relâché sur son site de capture. Toutes les femelles et les individus de moins de 1 an (faons de l’année) seront également immédiatement relâchés. Le nombre et la quantité des échantillons prélevés seront minimisés lors des captures estivales. La quantité de sang prélevée passera notamment de max 1 ml/kg (volume max= 20ml) à 14 ml (individus >20kg) afin de quantifier uniquement les paramètres physiologiques qui seront mis en lien avec les traits reproducteurs (ex : morphologie des bois, sécrétions odorantes, quantités et qualité des spermatozoïdes) et la santé des brocards. Les fèces collectés en amont de l’électro-stimulation avant de vider le rectum seront conservés pour des analyses d’éco-physiologie. La réduction des prélèvements est également anticipée par le stockage des échantillons non utilisés et leur mise à disposition pour notre réseau de collaborations. Les données collectées sur les 6-8 individus capturés au cours des trois jours de tutorat seront utilisées dans les analyses (avec ajout d’un facteur ‘phase pilote’ dans l’analyse) et contribueront donc à réduire le nombre d’individus capturés (ces brocards feront parties des 30 individus prévus dans le projet).

Raffinement

Le respect du bien-être animal est une préoccupation majeure du programme chevreuil. Afin de minimiser l’inconfort et la douleur des individus, plusieurs dispositions ont été prises. - Les protocoles ont déjà été travaillés en amont pour limiter les nuisances pour les animaux. Par exemples, l’ajout d’un analgésique (butorphanol 0.2 mg/kg) a déjà été rajoutée au protocole d’anesthésie afin de limiter de façon substantielle les possibles douleurs associées à l’électro-stimulation. - Les protocoles d’anesthésie et d’électro-stimulation seront optimisés en fonction des réponses du chevreuil aux protocoles initialement définis (ex : diminution de la tension maximale si trop de vocalisation, voir ci-après). D’autres alternatives qui pourraient le cas échéant être envisagées ont également été listées, comme par exemple la collecte de sperme par pharmaco-induction si l’électro-stimulation s’avérait trop inconfortable pour les animaux. - Des points limites spécifiques à la réalisation du protocole, l’anesthésie et l’électro-stimulation ont déjà été établis (voir section ci-après). - L’équipe technique sera tutorée (6 personnes tutorés: 3 pour l’anesthésie et 3 pour l’électro-stimulation) par des vétérinaires experts de l’anesthésie et de l’électro-stimulation. Pour les années suivantes, les experts reviendront le premier jour des captures pour revalider les compétences de l’équipe technique et éventuellement raffiner les protocoles en fonction des progrès et avancées réalisées dans le domaine. - Les manipulations seront effectuées dans un local réservé à cet effet par du personnel qualifié afin de minimiser le stress pour les animaux capturés. Les brocards auront les yeux couverts d’un tissu le temps que les prélèvements soient réalisés. Une fois manipulés, les brocards seront remis dans un sabot (caisse de contention adaptée à la morphologie du chevreuil et permettant un déplacement rapide des animaux) de façon à être immédiatement relâchés au plus près de leur territoire (sur la parcelle où ils ont été capturés).

Choix des espèces

Le chevreuil est pertinent pour l’étude de la sénescence reproductive masculine puisqu’il s’agit d’une espèce longévive et que les brocards allouent de façon complexe à la reproduction (ex : territorialité, pousse des bois, émission de molécules odorantes). La population ciblée revêt en de nombreux avantages pour ce projet. Dans cette population, clôturée et très faiblement chassée, les individus sont suivis individuellement de la naissance à la mort depuis bientôt 50 ans. Les animaux d'âge connu sont suivis de près tout au long de leur vie grâce à des captures hivernales et des observations sur le terrain. De nombreuses données (ex : démographiques, phénotypiques, génétiques) sont donc déjà disponibles pour plus de 50% des individus de la population, notamment ceux qui seront ciblés en priorité pour ce projet de recherche. De plus le recours à des populations captive ou de laboratoire ne permettrait pas de répondre aux objectifs de notre projet. Le projet repose sur l’étude de la reproduction des mâles. Les études antérieures sur les brocards ont révélé que les mâles étaient sexuellement matures à 9-10 mois ou un peu plus tard (14 mois environs, c’est à dire le second été suivant leur naissance). Nous inclurons donc dans notre étude, uniquement des mâles ayant au moins 14 mois. Au cas où un mâle plus jeune (c’est à dire un faon de l’année) se ferait piéger dans les filets au moment des captures, il serait relâché aussitôt.

1 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent l'implantation d'électrodes dans le cerveau et des injections de virus, suivies d'enregistrements pendant l'éveil et le sommeil, avec douleur post-chirurgicale, risques anesthésiques et hébergement isolé. Le porteur mène une recherche fondamentale sur les récepteurs du glutamate et renvoie au long terme d'éventuelles stratégies contre les troubles anxieux. Il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe et que la modélisation informatique de ces réseaux reste hors de portée.

Objectifs

Le projet a pour but d’étudier des récepteurs activés par le glutamate et fortement présents dans le système nerveux central des vertébrés. Ces récepteurs jouent un rôle central dans la communication et le fonctionnement de nos neurones, ainsi que dans les mécanismes associés à l’apprentissage et la mémoire. Ces récepteurs étant également impliqués dans de nombreuses pathologies neurologiques et psychiatriques (épilepsie, neurodégénérescence, troubles cognitifs), ils constituent des cibles thérapeutiques à fort potentiel. L’objectif de ce projet est d’évaluer et comprendre le rôle et l’importance de la régulation d’un des récepteurs au glutamate dans le fonctionnement des circuits neuronaux, à la fois dans un cadre physiologique et pathologique. Nous voulons comprendre si et comment ces récepteurs participent à l’activation et au dialogue de différentes structures du cerveau durant la veille et le sommeil. Pour cela, nous réaliserons des enregistrements de l’activités des neurones chez des souris libres de leurs mouvements et endormies.

Bénéfices attendus

Les troubles anxieux sont des troubles psychiatriques très répandus et constituent une préoccupation croissante pour la santé publique mondiale. Ils sont aussi systématiquement associés à des troubles du sommeil, considérés soit comme une cause, soit comme une conséquence des symptômes. Ce projet de recherche fondamentale utilisera des modèles animaux pour développer nos connaissances sur les mécanismes neurophysiologiques précis potentiellement affectés chez les patients humains. A long terme, il permettra ainsi de développer et de mettre en œuvre des stratégies thérapeutiques précises de prévention et de guérison axées sur le sommeil dans les troubles anxieux.

Procédures

Selon la procédure considérée, les animaux seront soumis à un ou deux types de chirurgie au niveau du cerveau (implantation d’électrodes (2-6h) et/ou injection de virus (1h30)) avec ou sans enregistrement de l’activité des neurones pendant l’éveil et le sommeil sur animal vigile (2 à 8 h, 1x/jr). Ainsi, 3 options peuvent se présenter : 1) implantation d’électrodes + enregistrement de l’activité des neurones ; 2) injection de virus ; 3) injection de virus + implantation d’électrodes + enregistrement de l’activité des neurones. A la fin de chaque procédure, il sera réalisé sur chaque individu une euthanasie selon une méthode réglementaire qui permet les prélèvements et analyses ultérieurs (10min). L’ensemble des actes est réalisés sous anesthésie et analgésie.

Impact sur les animaux

Nous détaillons ci-dessous l’ensemble des dommages prévus dans ce projet. Nuisances induites par les actes effectués : Chirurgie du cerveau : implantation d’électrodes et injection de virus (légère perte de poids, problème de cicatrisation et douleur post-chirurgicale pendant 48h) ; risques anesthésiques (hypothermie, détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, etc) ; isolement (stress modéré).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de réaliser des analyses histologiques (prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem).

Remplacement

Un impératif concernant les études sur récepteurs natifs est de conserver l’intégrité d’un réseau neuronal afin de préserver les connections synaptiques. A ces fins, il n’existe, à ce jour, aucune méthode alternative à l’utilisation de modèle rongeurs. Les techniques d'enregistrement chroniques sont invasives et ne peuvent être effectuées chez l'homme chez le sujet sain. Elles sont utilisées chez des patients épileptiques dont l'activité cérébrale est par conséquent anormale. Ceci ne permet pas d'effectuer des études systématiques car le placement des électrodes est dicté par l'impératif médical. D'autre part, l'état des connaissances actuelles et la puissance requise d'un point de vue technologique ne permettent pas de modéliser le fonctionnement de ces réseaux sur ordinateur.

Réduction

Les enregistrements électrophysiologiques de grande ampleur in vivo permettent d'enregistrer un grand nombre de neurones simultanément, ce qui augmente la puissance statistique des analyses et permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Pour les tests comportementaux, le nombre d'animaux proposé reste standard par rapport à la littérature existante. Le couplage entre électrophysiologie in vivo et comportement permet également de corréler les résultats comportementaux des individus avec leur activité neurale. Ceci permet de s'affranchir partiellement du problème de variabilité individuelle et de réduire le nombre d'animaux. Le calcul du nombre d’animaux a également été réalisé en fonction des travaux précédents. Au total, sur 5 ans, ce projet de recherche impliquera 1360 animaux.

Raffinement

Après leur réception, les animaux sont habitués à l’animalerie de l’Institut pendant une semaine avant de débuter toute procédure. Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les enregistrements en soi ne sont pas douloureux. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux sont stabulés dans les conditions d'hébergements standards (enrichissement de nidification) comme défini dans l'agrément de notre établissement. Les animaux implantés seront maintenus en isolation: la présence d'une autre souris pourrait ralentir la cicatrisation et endommager les électrodes implantées chroniquement (grattage, rognage) entraînant l’euthanasie de l’animal et ne permettant pas de récolter des données. Le maintien en isolation permet donc de maximiser la quantité de données récoltées sur chaque animal et ainsi de minimiser le nombre total d'animaux pour le projet. Les animaux non-implantés servent de groupe contrôle et doivent donc être logés dans les mêmes conditions que les animaux implantés. Cependant, pour diminuer le stress lié à l’isolement les animaux sont maintenus dans des cages contenant 2 compartiments séparés par une cloison transparente percée de trous permettant ainsi à l’animal d’avoir des interactions avec l’animal isolé dans le second compartiment (contiguïté visuelle, olfactive, auditive). Afin de garantir la taille minimale réglementaire au sein d'un compartiment une fois la cloison installée, les cages utilisées sont des cages prévues pour des rats. Pour éviter toutes blessures et d’endommager les électrodes, la nourriture sera directement dispersée dans la sciure. Cette démarche aura pour avantage d’enrichir l’environnement de l’animal puisqu’il sera obligé de fouiller la sciure pour trouver les croquettes et facilitera l’accès à la nourriture. Cet enrichissement sera également complété par le dépôt de morceaux de bois dans la cage de l’animal. Une construction de lego sera mise en-dessous du biberon d’eau pour réduire la hauteur et faciliter l’accès à l’eau. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur (utilisation de l’échelle de grimace), les animaux seront exclus du protocole.

Choix des espèces

Le choix de la souris est scientifique : il s’agit d’un mammifère de petite taille, au cycle de vie reproductif rapide et qui possède un système nerveux central ‘développé’. La souris est un modèle classique pour l'étude de la physiologie des réseaux neuronaux en lien avec le comportement. Seules des souris au stade adulte seront utilisées pour ce projet (à partir de 6 semaines), plus alertes et plus prompts à explorer leur environnement que les animaux âgés.

65 saumons atlantiques sauvages vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie de moins de cinq minutes pour implanter dans leur cavité abdominale un capteur de fréquence cardiaque, puis sont relâchés en rivière avant d'être mis à mort après leur reproduction pour récupérer le matériel et les données. Le projet est décrit comme une étude de faisabilité visant à mesurer la réponse physiologique de l'espèce au réchauffement des cours d'eau. Le porteur relativise la mise à mort en indiquant que 90 % des saumons de cette population meurent de toute façon après la reproduction, jugeant l'effet "marginal" sur la population locale.

Objectifs

Les populations sauvages de saumon atlantique Salmo salar ont chuté de 70% depuis les années 1970. De nombreux facteurs sont incriminés parmi lesquels le réchauffement climatique. Le saumon atlantique est une espèce d’eau froide, et les températures observées dans les cours d’eau et en mer et celles prédites pour les décennies à venir sont suspectées être au-delà de l’optimum physiologique pour différentes étapes du cycle biologique. Les données disponibles sur la réponse physiologique aux températures élevées sont très éparses mais néanmoins nécessaires pour mieux prédire le devenir des populations et mieux les gérer. Les développements technologiques de ces dernières décennies, en matière de miniaturisation des capteurs notamment, permettent de réaliser des mesures physiologiques sur les animaux in situ. L’objectif de ce projet est d’évaluer la possibilité d’utiliser, sur des saumons sauvages de retour en rivière après leur phase de croissance marine, des capteurs de fréquence cardiaque implantés dans la cavité péritonéale à proximité du cœur. Nous souhaitons notamment mesurer la relation qu’il existe entre la fréquence cardiaque – utilisé comme proxy de l’activité métabolique – et la température afin d’évaluer les limites physiologiques des saumons et l'effet des températures estivales élevées sur le comportement et la survie.

Bénéfices attendus

A court terme : Ce projet est en fait une étude de faisabilité qui vise notamment à évaluer notre capacité à récupérer les émetteurs et les données récoltées et le taux de perte ainsi que la qualité des données produites par le capteur afin de valider ou ajuster le paramétrage. Elle permettra en outre de produire des premières données sur la physologie des saumons lors de la phase de migration retour et d'évaluer la réponse physiologique aux températures estivales qui sont suspectées affecter la survie ou à la reproduction des saumons. A long terme : Il s'agit de mieux comprendre comment cette espèce emblématique des cours d’eau français répond aux contraintes thermiques et pourra faire face (ou non) aux conditions futures, dans le contexte du changement climatique. Il s'agit aussi de fournir des pistes pour améliorer la gestion des populations et des habitats, par exemple en préservant ou restaurant des habitats refuges.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule opération chirurgicale visant à l'introduction dans la cavité générale de matériel scientifiques (capteurs de fréquence cardiaque et radioémetteur). Cette opération durera moins de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Insertion par chirurgie du capteur et de l'émetteur (réalisée sous anesthésie ) : les nuisances potentielles (douleurs, saignements, infection) sont limitées par l'utilisation de mesures prophylactiques et des traitements adaptés et définis avec la collaboration d'un vétérinaire spécialisé. Cette intervention est considérée comme "modérée". Les individus choisis pèseront un poids qui leur permettra de supporter l'insertion du matériel scientifique. Ce dernier ne dépassera pas 2% du poids de l'animal comme recommandé dans la littérature.

Devenir

A l'issue de la procédure expérimentale, c'est à dire à l'issue de la reproduction des individus, tous les animaux sont mis à mort part surdose d'anesthésiant afin de récupérer le matériel scientifique et les données enregistrées. NB: 90% des saumons de la population étudiée meurent après la reproduction, épuisé par un effort et un investissement intense. Leur mise à mort est considérée comme n'ayant qu'un effet marginal sur la population locale.

Remplacement

L'objet de l'étude est de produire des connaissance sur les déplacements et la physiologie du saumon Atlantique dans le milieu naturel. Le modèle biologique ne peut être substitué par des alternatives non animales.

Réduction

L'effectif d'animaux utilisés (65) a été déterminé en fonction de critères scientifiques (effectifs suffisant pour apporter des réponses aux questions posées) et le bien être animal (les interventions sur les individus se déroulent-elle comme prévu et quelles sont les effets notamment en terme de comportement et de survie après remise dans le milieu naturel). D'un point de vue scientfique, 65 est un nombre suffisant pour valider les réglages des paramètres d'enregistrement des biologgers dans un premier temps et produire des données représentatives de la variabilité phénotypique au sein de la population.

Raffinement

Les principales mesures de raffinement concernent la limitation des nuisances (angoisse et douleur) lors de la manipulation des animaux avant, pendant et après la chirurgie et la limitation des risques d'infection post-opératoire. La combinaison d'utilisation de produits anesthésiques de concentration adaptée (1- concentration pour l'anesthésie pré-opératoire et 2- pour le maintien de l'anesthésie pendant l'opération) et d'antalgiques limitent directement l'angoisse et la douleur pendant et après l'opération et l'administration d'antibiotiques limite les risques d'infections liés à l'opération. Les mesures prophylactiques classiques (désinfection du matériel) limitent également les sources d'infection pouvant induire des nuisances post-opératoires. Les opérations de chirurgie seront effectuées par du personnel habilité et spécifiquement formé par un vétérinaire. Le protocole opératoire est co-construit avec un vétérinaire. Les conditions environnementales d'importance première pour les poissons (température et oxygénation de l'eau) seront contrôlées avant, pendant et après la capture et l'opération. Les individus seront gardés en observation dans un vivier placé dans la rivière afin de contôler la façon dont ils récupèrent de l'anesthésie et seront relâchés lorsqu'ils auront retrouvé un comportement actif normal (équilibre dans la colonne d'eau, nage).

Choix des espèces

L'espèce ciblée, le saumon atlantique, est étudié dans son milieu naturel. Les populations de saumon sont actuellement menacées par divers facteurs dont certains sous contrôle anthropique (ex. changement climatique). L'objectif de l'étude est in fine d'améliorer la compréhension de la réponse des saumons à ces facteurs afin de produire des connaisances permettant d'améliorer leur gestion. Les individus seront des adultes de retour en rivière après la phase de croissance en mer. Les connaissances sur ce stade de vie sensible sont encore très éparses, mais on sait que les individus sont exposés à de multiples stress et que la mortalité ou les affections subléthales sont élevées.

Infectées par voie intranasale sous anesthésie avec des souches mutantes de Mycobacterium bovis, l'agent de la tuberculose bovine, les souris reçoivent aussi une puce télémétrique et subissent une prise de sang chaque semaine. 264 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs organes, afin de préciser le rôle de trois gènes de virulence de la bactérie. Le porteur part de groupes de 24 souris pour en garder 6 au dernier jour, les autres étant mises à mort au fil du protocole quand elles atteignent les points limites, en général entre J21 et J35, avec perte de poids rapide et prostration. Il annonce une mise à mort "dès l'apparition des premiers signes de souffrance comme définis par le point limite", sans chiffrer ce seuil.

Objectifs

La tuberculose bovine est une pathologie majeure en santé animale. L'espèce mycobactérienne adaptée aux animaux, Mycobacterium bovis (Mb), est le principal agent pathogène responsable de la tuberculose bovine en Europe et au Royaume-Uni. C'est un pathogène zoonotique multi-hôtes capable d'infecter les ruminants (bovins, caprins, ovins), la faune sauvage et l'homme. Les programmes de surveillance et d’éradication, basés sur des campagnes de tests et l'abattage systématiques des bovins réactifs, n'ont pas permis d'éradiquer la tuberculose bovine (bTB). La bTB représente donc un risque direct pour les économies agricoles, la santé animale et humaine et la biodiversité dans les pays touchés. Il existe une hétérogénéité dans la réponse immunitaire de l'hôte à l'infection par Mb, ce qui influence directement le risque de transmission par les bovins infectés et la faune sauvage. Une meilleure compréhension des interactions hôte-pathogènes lors des infections à Mb est essentielle pour développer de nouvelles approches visant à éradiquer la tuberculose bovine. Le projet a pour objectif de comprendre comment Mb interagit avec le système immunitaire de l’hôte et comment cette bactérie module la progression et la transmission de la maladie. Pour cela, nous souhaitons identifier les gènes de Mb essentiel pour sa persistance et sa dissémination. Pour cela nous souhaitons i) Comparer la virulence de mutants de Mb (ii) Suivre la réponse immunitaire et le développement du granulome en réponse aux différents mutants.

Bénéfices attendus

Avec ce projet, nous mettrons au point pour la première fois la vidéosurveillance d’animaux infectés en isolateur pour raffiner nos points limites (détection plus précoce de comportements). La validation du matériel, son installation, et de la méthode d’analyse permettra de proposer ce suivi pour nos prochains projets. Les résultats permettront de caractériser le rôle de 3 gènes de virulence pour la physiopathologie et la dissémination de Mb. Enfin, nous nous attacherons à une description exhaustive des réponses immunitaires chez les animaux infectés par les différentes souches.

Procédures

Pose de la puce d’identification et télémétrique : 1 fois et 1min/animal. Anesthésie par administration médicamenteuse par voie intrapéritonéale + infection par voie intranasale : 1 fois et 15 min/animal. Prise de sang : 1 fois par semaine et 3 min/animal/prélèvement. Pesée : bi hebdomadaire et 1min/pesée/animal. Les prises de sang peuvent engendrer un hématome et la contention peut engendrer du stress pour l’animal.

Impact sur les animaux

Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après l’injection de la puce d’identification pourraient être observés. Nous savons par expérience que les souris sont sensibles aux infections mycobactériennes. Ces animaux sont plus susceptibles d'atteindre les points limites lors d'infections avec la souche M.bovis de référence. Nous pourrons observer une perte de poids assez rapide associée à une prostration des animaux. Afin d'assurer un bon suivi de ces animaux, une grille d'évaluation de bien-être des animaux a été mise en place basée sur une observation quotidienne et une pesée bi-hebdomadaire.

Devenir

L'ensemble des animaux du projet seront euthanasiés à la fin du protocole afin de permettre le prélèvement post mortem des organes (poumons, foie, rate, cerveau, ganglion médiastinal) et fluides biologiques (sang, urine et fèces). Ces prélèvements nous permettront d'effectuer l'ensemble des analyses souhaitées comme l'analyse de charge bactérienne, des lésions, du recrutement cellulaire ou de la sécrétion de médiateurs biochimiques.

Remplacement

A ce jour, aucun système in vitro ne permet de reproduire la complexité du tissu pulmonaire et les processus complexes de recrutement des cellules immunitaires. Le modèle murin constitue un modèle expérimental pertinent.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux, un test statistique de calcul de la puissance ou de l'effectif nécessaire en utilisant un test de comparaison de deux échantillons indépendants a été réalisé. Pour les données mesurées que ce soit le recrutement cellulaire, cytokines secrétées, nous obtenons une puissance de test pour un effectif de 6 animaux de 87% pour un test statisitique. Pour obtenir un groupe de 6 souris au dernier jour du protocole, nous savons qu’il nous faut partir d’un groupe de 24 animaux. En effet, tous les animaux ne réagissent pas pareil à l’infection, certains la contrôlent en formant des granulomes pulmonaires matures (25% des animaux), et les autres doivent être sacrifiés au fur et à mesure du protocole car ils atteignent les points limites (entre J21 et J35 classiquement). Chez ces animaux sensibles, des lésions désorganisées sont observables dans le poumon. En résumé, nos protocoles comprennent 24 souris, nous analysons les réponses immunitaires de deux groupes : les animaux résistants (5-6 souris) et sensibles (18-19 souris). Nous utilisons des souris consanguines dont la variabilité génétique est très faible. Nous utilisons des tests statistiques non paramétriques spécialement conçus pour comparer des groupes de petits effectifs. Un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge du pathogène).

Raffinement

Les animaux seront élevés en communauté dans des cages enrichies avec du papier essuie tout, tunnel carton. Des visites des animaliers seront quotidiennes et la vidéosurveillance sera mise en place pour mieux suivre les souris. Les animaux seront 6 par cage de 530 cm2. Nous réduisons, et limitons au maximum l'inconfort, la douleur, pouvant être subie par les animaux. les animaux seront habitués en amont à la cellule d’expérimentation, une semaine avant le début de l’expérimentation Pour cela les animaux sont anesthésiés lors des infections et leur état général est suivi tout le long de l’expérimentation (poids, prostration…). Ainsi les animaux sont euthanasiés dès l’apparition des premiers signes de souffrance comme définis par le point limite. Après chaque prise de sang, une récompense positive alimentaire de type bouchée fruités ou rondelle de banane séchée ou popcorn sera réalisée.

Choix des espèces

Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser la complexité de la réponse immunitaire d'un organisme entier. De plus, les modèles murins d'infections mycobactériennes sont très bien établis et permettent de mimer la physiopathologie observée chez l'homme et le bovin. De plus le modèle murin permet une manipulation en animalerie A3 et nous avons à notre disposition de nombreux outils pour cette espèce. Le modèle murin nous offre la possibilité d’utiliser des souris génétiquement modifiées pour les voies de signalisation ou cytokines impliquées dans les réactions immunitaires. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 semaines (sexe indifférent). Pour ce projet, il nous faut des animaux ayant un système mature compétent pour cela il nous faut des animaux adultes mais pas trop âgées. De plus nous utilisons un modèle validé par la communauté scientifique.