Éthologie / comportement / biologie animale

96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris dont le gène ARNTL2 est inactivé, elles passent jusqu'à onze tests comportementaux répartis sur cinq semaines, évaluant mémoire, motricité, sociabilité, anxiété, dépression et sensibilité à la douleur, avec un jeûne de vingt-quatre heures pour l'un des tests. Le porteur indique que ces tests peuvent induire un stress léger à modéré et révéler de l'anxiété ou de la dépression, et prévoit la mort de toutes les souris pour analyser leurs tissus cérébraux. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne convient, l'évaluation comportementale exigeant l'animal vigile.

Objectifs

Le gène Arntl2 a été montré dans une précédente étude comme impliqué dans la régulation des rythmes biologiques circadiens. Dans ce projet, nous voulons voir si ce gène a aussi un impact sur les fonctions cérébrales, et notamment sur les capacités mnésiques. C’est pourquoi nous testerons des souris transgéniques pour lesquelles ce gène a été inactivé dans un large éventail de tests comportementaux. En comparant ces souris transgéniques à des souris contrôles, nous évaluerons les performances motrices, mnésiques, cognitives, émotionnelles, mais aussi de sociabilité, ou l’état de bien-être, d’anxiété ou à d’état dépressif et de susceptibilité à la douleur. Les souris adultes mâles et les femelles seront utilisées pour éventuellement mettre en évidence des effets dépendants du sexe.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l’implication des horloges cérébrales dans les processus de mémoire mais également dans d’autres fonctions telles que la nociception, la coordination motrice ou les troubles de l’humeur. Il pourrait aussi permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques (chronothérapeutiques en se basant sur les rythmes circadiens) dans la prévention et le traitement des troubles de la mémoire et/ou de l’humeur chez l’humain, voir dans les processus douloureux.

Procédures

Les animaux sont soumis à des tests comportementaux servant à évaluer les performances mnésiques, motrices, senosrielles, sociales et émotionnelles. Chaque test dure durant de 3 à 10 minutes par jour répartis sur 1 à 4 jours. 24h au minimum sépareront ces tests. Certaines cohortes d' animaux réaliseront aux maximum 11 tests répartis sur 5 semaines alors que d'autres effectueront 6 tests répartis sur 4 semaines.

Impact sur les animaux

D’après les premières études préliminaires, l’inhibition génétique du gène ARNTL2 ne semble pas induire d’effet délétère. Les tests comportementaux peuvent induire des stress légers à modérés et de l’anxiété ou de la dépression pourraient être révélées potentiellement. Pour l’un des tests, les animaux réaliseront un jeûne préalable de 24h.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en fin de procédure afin de réaliser des analyses post-mortem des tissus cérébraux.

Remplacement

Nous ne pouvons pas avoir recours à des méthodes alternatives pour réaliser un tel projet. Il est nécessaire d’évaluer les différents paramètres comportementaux sur l’animal vigile. En effet la plupart des tests comportementaux réalisés dans le cadre d'un criblage comportemental impliquent une réponse motrice et mais également intégrée de l’animal. Il nous est donc impossible pour cette étape de travailler sur un modèle autre que l’animal.

Réduction

Le nombre d'animaux a été déterminé pour obtenir des résultats fiables et robustes tenant compte de la variabilité interindividuelle, de l'inactivation ou non du gène ARTNL2 et du sexe. Un maximum de test est réalisé sur un même groupe d'animaux tant que cela n'entrave pas la fiabilité des résultats expérimentaux et le bien-être animal.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des animaleries dont le fonctionnement a été conçu pour maximiser le confort et limiter la souffrance des animaux. En particulier, les souris sont hébergées groupées. Elles font l’objet d’observations régulières tout au long de l'expérience. De l'enrichissement (carrés de coton pour favoriser la nidation, barreaux de bois à ronger et tunnel) est systématiquement disposé dans toutes les cages. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les animaux entreront en procédure doucement après habituation à l'expérimentateur et à la manipulation. Des points limites ont été établis afin de soustraire l’animal à la souffrance. En cas de signe de mal- être, des décisions seront prises en accord avec le vétérinaire, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux (SBEA) et/ou le personnel zootechnique.

Choix des espèces

Nous ne pouvons pas utiliser un autre modèle que la souris car le gène d’intérêt ARTNL2 dont nous voulons connaître les caractéristiques comportementales physiologiques et/ou éventuellement physiopathologiques n’est inhibé actuellement que chez la souris. Les animaux seront tous utilisés à l’âge adulte (âge au moins 8 semaines) avec un système nerveux ayant atteint sa pleine maturité fonctionnelle.

346 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 336 tuées à l'issue et 10 réutilisées comme femelles-stimulus. Elles sont soumises à un régime obésogène et à un mélange de phtalates, à des suivis de glycémie, à une ablation des ovaires puis à des tests comportementaux de cycle œstral, de lordose, de locomotion et de préférence olfactive. Le porteur indique que l'ablation des ovaires entraîne des douleurs post-opératoires et que gavages et injections provoquent un inconfort. Il précise que des mâles intacts sont utilisés pour les tests sans être comptés dans les effectifs, et conclut qu'aucune méthode alternative ne permet ces analyses comportementales et physiologiques.

Objectifs

Les facteurs externes ou environnementaux, tels que l'exposition à des perturbateurs endocriniens ou le régime alimentaire peuvent interférer avec les effets liés aux stéroïdes sexuels, issus des gonades, sur différents comportements et notamment avec les comportements de reproduction. Les phtalates, dont le principal est le DEHP (Di (2-éthylhexyl) phtalate), sont des perturbateurs endocriniens entrant dans la composition des plastiques et qui contaminent ainsi les aliments ou les produits d’hygiène et de cosmétique. L’exposition orale à l’âge adulte de souris femelles au DEHP, à des doses correspondant à une contamination environnementale, provoque une altération des comportements de reproduction. Ces effets sont associés à une modification des réseaux neuraux de l’hypothalamus impliqués dans le contrôle de ces comportements. Les données concernant l’influence du régime alimentaire, et plus particulièrement de l’obésité, sur les comportements de reproduction sont moins nombreuses bien que l’obésité soit souvent associée à un dysfonctionnement de l’axe hypothalamus-hypophyse-gonades. L’objectif de ce travail s’inscrit dans la perspective de créer un nouveau modèle de « malbouffe » des pays occidentaux en y intégrant les interactions entre le contenant (récipient plastique contenant des phtalates) et le contenu (alimentation riche en lipides et en sucres). Il s’agit d’explorer les effets comportementaux, moléculaires et cellulaires de l’association de ces deux types de perturbation environnementale : l’exposition à des perturbateurs endocriniens et le régime alimentaire obésogène/diabétogène.

Bénéfices attendus

Le projet se place dans la perspective d’étudier les conséquences d’une des caractéristiques du mode de vie occidental, les effets combinés de l'alimentation et des phtalates, sur la santé reproductive et son contrôle, dans un modèle murin adulte. Il permettra ainsi de faire émerger de nouvelles hypothèses concernant l’origine des altérations de la santé reproductive auxquelles sont confrontées les sociétés occidentales en combinant deux facteurs de l’exposome (régime alimentaire et exposition aux polluants chimiques).

Procédures

336 femelles seront soumises pendant 16 semaines à un régime obésogène/diabétogène et une exposition à un mélange environnementale de phtalates. Ce régime n’induit pas de nuisance particulière si l’accès à la nourriture et à la boisson n’est pas restreint. Ces souris seront soumises à des suivis de glycémie effectués par prélèvement d’une goutte de sang au niveau de la queue (durée du suivi : 180 minutes maximum et 4 tests de tolérance au glucose et 4 tests de sensibilité à l’insuline répartis sur les 16 semaines de traitement). Parmi ces souris (240), ainsi que pour un groupe-stimulus (10), subiront une ovariectomie et une supplémentation en oestradiol et progestérone. La durée de la chirurgie est au maximum de 10 minutes et elle est pratiquée une seule fois. Les femelles d’étude sont soumises à différents tests comportementaux afin de suivre leur cycle oestral (1 frottis par jour de la semaine 12 à la semaine 16), et d’étudier les paramètres de leur comportement d’accouplement (2 tests de lordose de 30 minutes en semaines 12 et 14, 1 test de locomotion de 2h en semaine 13 et 1 test de préférence olfactive de 3 fois 10 minutes en semaine 15) avant d’examiner les modifications des structures cérébrales les contrôlant.

Impact sur les animaux

Lors des tests de tolérance au glucose le gavage oral peut engendrer un inconfort, tout comme l’administration d’insuline IP (douleur au point de piqure) lors des tests de sensibilité à l’insuline. Le suivi de la glycémie se fait par prélèvement d’une goutte de sang au niveau de la queue qui peut engendrer une douleur légère et passagère au moment de l’incision. La procédure d’ovariectomie donne lieu à des douleurs post-opératoires. L’administration sous-cutanée de progestérone peut entrainer une légère douleur au point de piqure. Les souris-stimulus utilisées pour les expériences de comportement peuvent subir une légère douleur au point de piqure lors de l’anesthésie par voie IP.

Devenir

souris euthanasiées pour prélèvement de tissus et dosages biologiques (total : 336).

Remplacement

Il s'agit d'un projet comportant des analyses comportementales et des mesures de paramètres physiologiques : il n'est pas possible de le développer par des méthodes alternatives et/ou substitutives.

Réduction

Les effectifs (total : 346 femelles) ont été calculés au plus juste afin de pouvoir obtenir une analyse statistique significative le cas échéant, compte tenu de la variabilité interindividuelle. Les analyses statistiques seront effectuées à l'aide de tests pertinents. Cohorte 1 : 4 groupes de 8 femelles, expériences répétées 3 fois soit un total de 96 femelles Cohorte 2 : 4 groupes de 10 femelles, expériences répétées 3 fois pour l’étude des modifications protéiques et 4 groupes de 10 femelles, expériences répétées 3 fois pour l’étude des modifications des acides nucléiques, soit un total de 240 femelles. A ces deux cohortes expérimentales, s’ajoute un groupe supplémentaire constitué de femelles-stimuli (femelles ovariectomisées et supplémentées en œstradiol et progestérone) nécessaires au test de préférence olfactive : 10 femelles. Les procédures de comportement sexuel et de préférence olfactive nécessitent d'utiliser des mâles intacts : ce sont des mâles qui ne subissent aucune contrainte ; ils n’ont donc pas été inclus dans le décompte des animaux.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des locaux ad hoc, respectant la Directive 2010/63/UE. Les animaux sont surveillés quotidiennement et tout signe de mal-être est immédiatement signalé aux responsables du projet qui prennent la décision sur leur devenir, en accord avec le vétérinaire référent si nécessaire. Dès leur arrivée, les animaux sont manipulés régulièrement. La durée du jeûne lors des tests de glycémie a été réduite afin de limiter l’hypoglycémie. Pour les animaux subissant une procédure chirurgicale, des points limites adaptés permettent de gérer la douleur post-opératoire.

Choix des espèces

La souris est le modèle choisi pour ces études : c'est un des modèles les mieux caractérisés pour les études métaboliques et il existe de nombreux outils biotechniques disponibles pour ce modèle animal (anticorps, lignées transgéniques...). Cela permet ainsi de comparer les résultats obtenus avec la littérature et d'affiner nos hypothèses de travail. Il s’agit d’une étude chez l’adulte.

504 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles de sclérose latérale amyotrophique et de démence fronto-temporale par mutation de la protéine FUS, elles reçoivent des gavages et passent des tests moteurs et cognitifs répétés à quatre, huit, douze et seize mois, puis un examen des muscles sous anesthésie en fin de procédure. Le porteur indique que le gavage peut provoquer des fausses routes suivies d'une mise à mort immédiate, et prévoit la mort de toutes les souris pour analyser leurs tissus. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité comportementale et structurelle du système nerveux nécessaire à l'étude.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la démence fronto temporale (DFT) sont deux maladies neurodégénératives incurables encore mal comprises à ce jour. Nous avons dans notre laboratoire un modèle de souris qui mime ces maladies en reproduisant la mutation d’une protéine mutée (la protéine FUS) chez les patients. Après avoir valider notre nouveau modèle (objectif 1), nous voulons analyser l’effet de la mutation de FUS aussi bien sur la perte des neurones dans le temps (objectif 2) que son impact à l’échelle comportementale (objectif 3)..

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, un seul traitement est proposé aux patients atteints de SLA. Il s’agit du Riluzole, dont l’efficacité est très faible puisqu’il ne permet d’augmenter la durée de vie des patients que de quelques mois. Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes en œuvre dans le développement et la progression de la SLA et de la DFT afin d’élaborer de nouvelles stratégies thérapeutiques qui pourraient aider à la mise en place de nouveaux traitements.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une procédure d’administration par gavage à raison d’un gavage par jour, d’une durée maximale de 1 minute, durant une période de 5 jours. Les animaux suivront des tests moteurs (3 session de 3 minutes maximum, entrecoupées de phases de repos de 5 minutes) et des tests cognitifs. Le premier test dure 5 minutes, le second est composé de 4 sessions 5 minutes (entrecoupées de 8 minutes). Un troisième test est réalisé sur une période de 4 jours consécutifs, à raison de 4 essais par jour (durant maximum 1 minute chacun). Un quatrième sera réalisé sur une nuit et enfin le cinquième, sur une période de 5 jours, à raison d’un essai unique de 10 minutes par jour. Nous réaliserons ces différents tests de manière successive, en respectant des pauses d’un moins un jour entre chacun aux âges de 4 mois, 8 mois, 12 mois et 16 mois. L’examen du fonctionnement des muscles (EMG) durera environ 20 minutes et sera réalisée en fin de procédure, sur les souris endormies afin d’éviter toute souffrance.

Impact sur les animaux

Nous pourrions observer chez les souris traitées des fausses routes liées à l’administration du traitement par gavage mais aussi des signes de stress liés à la contention obligatoire pour réaliser ce geste de gavage. Nous pourrions également observer un léger stress causé par la passation des tests comportementaux. Nous avons mis en place des points précis et spécifique à chacun de ses risques pour sortir les animaux de la procédure en cas de besoin. Ainsi, après l’administration par gavage du traitement, nous réaliserons une évaluation scorée de l’état de la souris en remplissant la grille présentée en annexe 7. Nous évaluerons les items suivants (+ 1 point / - 1 point) : Prise/perte de poids, poils propres/sales, interaction/isolement, déplacement/prostration, respiration normale/sifflement. Si la somme des points est comprise entre 3 et 5, la souris sera replacée dans sa cage sans surveillance particulière, si la somme est comprise entre 1 et 3 points, nous demanderons un avis vétérinaire, si la somme est inférieure à 1, la souris sera mise à mort. En cas de fausse route, l’animal sera mis à mort immédiatement.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à l’issue des procédures car nous avons besoin d’étudier les tissus prélevés afin d’étudier les impacts au niveau microscopique (moléculaire, cellulaire et biologique) de notre intervention.

Remplacement

Ce projet a pour but de déterminer si le changement de la localisation de la protéine FUS dans la cellule (qui sort du noyau pour aller dans le cytoplasme chez les patients souffrant de SLA et de DFT) entraine 1) une perte des neurones dans le temps et 2) des troubles cognitifs et moteurs. Pour répondre à ces questions, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal qui récapitule à la fois la complexité comportementale (des comportementaux sociaux, des processus cognitifs) mais aussi celle structurelle du système nerveux (les différents intervenants cellulaires retrouvés dans le système nerveux central) que l’on retrouve chez les patients atteints de ces maladies. Les modèles cellulaires ne nous permettraient de réaliser des études comportementales ni de reproduire cette complexité structurelle.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires à la bonne réalisation de ce projet a été calculé, d’après nos travaux préliminaires, de manière à obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Par ailleurs, pour limiter le nombre total d’animaux générés, nous proposons ici de réaliser les études sur les muscles sur les mêmes animaux que ceux prévus pour réaliser les expériences histologiques et moléculaires. Pour limiter le nombre total d’animaux générés et améliorer nos connaissances de la maladie, nous proposons d’utiliser les mâles et les femelles. Par ailleurs, nous avons décidé de réaliser une première étude afin de valider les groupes expérimentaux et potentiellement réduite le nombre de groupes contrôles que nous utiliserons. Si cette étude pilote est validée sur ces deux aspects, nous pourrons réduire de plus de la moitié les animaux nécessaires à la réalisation de ce projet.

Raffinement

L’enrichissement de l’environnement des animaux (bâtonnets à ronger, coton compressé pour faire des nids, maisons de carton blanc), le maintien des interactions sociales (les souris sont gardées à plusieurs par cage tout au long de leur vie) et la surveillance quotidienne des animaux permettront d’assurer de leur bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Nous avons établi des points-limites clairs afin de pouvoir soustraire l’animal à la souffrance si nécessaire. Les expérimentateurs en charge sont formés à chaque procédure et nous avons une très bonne connaissance du modèle utilisé. Nous pourrons ainsi facilement déceler un éventuel comportement anormal. Toutes les approches expérimentales que nous souhaitons utiliser dans ce projet sont couramment réalisées dans notre laboratoire, ce qui limite fortement les risques de perte de tissus pour des raisons purement techniques. Par ailleurs, la procédure d’étude du muscle sera réalisée sous anesthésie gazeuse afin de réduire toute souffrance de l’animal et de réduire le stress lié à la manipulation.

Choix des espèces

Les modèles de souris transgéniques sont les plus appropriés à notre étude car ils présentent le niveau de complexité structurelle du cerveau et de la moelle épinière adéquat, une séquence de notre gène d’intérêt (Fus) bien concernée d’un point de vue phylogénétique et des capacités cognitives et motrices qui nous permettent d’évaluer des troubles retrouvés chez les patients. Les études seront réalisées sur des souris adultes (début de l’expérience à 2 moi et fin prévue à 17 mois) car les patients souffrant de SLA liée à FUS présentent très rarement des formes juvéniles. Nous avons décidé d’étudier aussi bien les femelles que les mâles car les deux maladies qui nous intéressent touchent de la même manière les hommes et les femmes.

1 664 ombles chevaliers vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier les effets d'un toxique issu des particules d'usure de pneu et d'une hausse de température. Les poissons sont exposés dès les premiers stades de vie à la molécule 6PPD-quinone par balnéation, puis filmés par groupes de cinq pour mesurer leur activité et leur vitesse de nage. Le porteur indique attendre une mortalité d'environ 10 % liée à la température et une hausse supplémentaire liée au toxique, et tue tous les individus, ces stades précoces étant jugés les plus sensibles. Il affirme que le modèle poisson n'est "pas remplaçable ni substituable" pour cette question.

Objectifs

Les lacs péri-alpins tiennent une place particulière en raison de leur réserve en eau douce, et des nombreux services écosystémiques rendus. Néanmoins, ces derniers constituent également une zone importante de stockage des micro-plastiques, dont la majorité serait des résidus de pneus dus à un intense trafic routier. Une étude a mis en évidence une forte contamination du lac Léman aux micro-plastiques dont 60% sont des particules de pneus (TWP pour tire wear particles). La connaissance des impacts de ces micro-plastiques sur la faune aquatique reste encore parcellaire, en particulier sur les poissons. Quelques études ont porté sur les produits issus de la dégradation de la gomme des pneus et de ses additifs, dont beaucoup sont toxiques pour les poissons. En effet, les 2/3 des TWP et autres débris déposés sur la route peuvent ruisseler avec la pluie. La molécule 6PPD-quinone (6PPD-Q), dont la source principale dans les milieux aquatiques provient du lessivage des particules de pneus à partir des routes, est connue pour sa forte toxicité pour les organismes piscicoles et sa présence en quantité non négligeable (jusqu’au mg/L) dans l’eau de ruissellement de chaussée. Elle a récemment été identifiée comme responsable du « syndrome de mortalité par ruissellement urbain » chez le saumon coho adulte et semble particulièrement toxique pour les salmonidés. Le mode d'action précis de la 6PPD-Q est toutefois encore inconnu sur les stade embryo-larvaire, même s’il semble être lié à une perturbation de la barrière hémato-encéphalique. Les effets de la 6 PPD-Q sur les premiers stades de vie de ces salmonidés sont encore indéterminés à notre connaissance. Les effets sont connus chez les larves de zebra fish, ou cette molécule n’entraine pas d’augmentation de la mortalité mais à des effets neurotoxiques et entraine de nombreuses malformations cardiaques. A ce titre, nous nous proposons d’explorer les effets de cette molécule sur les premiers stades de vie de l’omble chevalier qui est un salmonidé vivant dans les lacs péri-alpins. De plus, l’omble chevalier est un bon candidat pour ce projet car il possède un temps de vie embryolarvaire long (4-5 mois), connu et maitrisé par le laboratoire. De plus, l’étude de l'impact d'une molécule toxique est classiquement analysée au stade juvénile, stade qui permet plus facilement de mettre en évidence des effets sur la mortalité, le développement, effets tératogènes.

Bénéfices attendus

Ce projet vise donc à produire des connaissances et un seuil de toxicité des effets de la contamination à la 6PPD-Q durant premiers stades de vie de l’Omble Chevalier, salmonidé vivant dans les lacs peri-alpins dans un contexte de réchauffement climatique.

Procédures

Les animaux feront l’objet de prise vidéos pour l’observation de leur comportement lors des stades d’alimentation exogéne (750 DPF) et juvénile (840 DPF). Ainsi, les animaux seront testés par groupe de 5, ils seront acclimatés durant 2h dans le système expérimental et seront filmés à l’aide d’une webcam connectée à un ordinateur placé hors de la salle de test (afin de ne pas déranger les poissons durant le test) durant 10 minutes. Ces tests permettent d’évaluer différents comportements, tels que l’activité, la vitesse de nage, grâce à un logiciel de suivi vidéo. Ainsi, la prise de vidéo ne devrait impliquer qu’un léger stress du au changement de bac.

Impact sur les animaux

Compte tenu du peu de connaissance de l’impact de la 6PPD-Q sur les poissons non modèle aux stades embryolarvaires, nous pouvons supposer que les effets devraient être modérés car les doses de 6PPD-Q testées sont des doses environnementales. La seule étude à notre connaissance portant sur les premiers stades de vie a été réalisée sur les larves de zebra fish, où peu de mortalité (2.26% de mortalité à 1ng/L et 7.5% de mortalité à 10ng/L) pour les concentrations testées dans ce projet. De plus, pour les animaux incubés à 8,5°C nous pouvons nous attendre, au vue de la littérature, à une hausse de la mortalité de 10%.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation car d’après la littérature, les premiers stades de vie sont les plus sensibles aux molécules toxiques ainsi il sera inutile de poursuivre les expérimentations au-delà des stades de développements cruciaux choisis.

Remplacement

Le modèle animal ne peut pas être remplacé pour répondre à la problématique posée (règle des 3 R : Remplacement) étant donné le peu de connaissance sur les premiers stades de vie de poisson et en particulier sur les salmonidés qui semble particulièrement sensible à la 6PPDQ. Ainsi, le modèle poisson est pertinent pour cette étude car il n’est pas remplaçable ni substituable.

Réduction

mixtes (GLM). L’effectif de 60 individus par temps de prélèvement est un minimum pour avoir la quantité de matière nécessaire à nos analyses, mais également pour prendre en compte la variabilité interindividuelle, tout en limitant au maximum le nombre d’individus mis à mort (Règle des 3 R : Réduction). 1 440 individus seront utilisés et mis à mort (60 individus prélevés par temps de prélèvement * 2 conditions thermiques) * 6 conditionnements (témoin eau 0ng/l, témoin éthanol 1.5ng/l stade 200 DPF puis eau claire, 1.5ng/l avec balnéation de la 6PPD-Q durant le développement embryo-larvaire, 3ng/l stade 200 DPF puis eau claire ; 3ng/l avec balnéation de la 6PPD-Q durant le stade embryo-larvaire) * 2 stades de développement (740 DPF et 820 DPF) = 1 440 individus. Au total pour l’expérimentation, nous aurons besoins de 1 440 individus pour les mesures morphologiques et comportementales. Nous pouvons prévoir une mortalité maximum au cours de l’expérimentation d’environ 10% dû à la hausse de température durant le développement embryo-larvaire . Ainsi, 1584 (1440+1440*0,1) individus seront utilisés pour l’effet température. Si nous nous basons sur la seule étude de toxicité de la 6 PPD-Q réalisée au stade larvaire sur les larves de zébra fish à nos concentrations nous pouvons nous attendre à avoir de faible hausse de mortalité (2.26% de mortalité à 1ng/L et 7.5% de mortalité à 10ng/L) , les expérimentations sur l’omble chevalier adultes à nos doses ne montrent pas de mortalité , nous pouvons nous attendre à une hausse de 5% en raison de son affinité présumé pour les salmonidés. Ainsi, 1664 (1584+1584*0,05) individus seront utilisés au cours de l’étude

Raffinement

L’eau sera renouvelée au 2/5 (soit 16 L) tous les 2 jours à partir du commencement du nourrissage soit à 700 DPF pour éviter une accumulation de déchets métaboliques, favorable aux pics azotés et à la survenue de pathogènes. Les animaux seront visités au minimum 1 fois par jour durant la semaine et une fois durant les weekends, une surveillance rapprochée sera mise en place en cas de perturbation (hausse de la mortalité, sous-alimentation). De plus, dans chaque bassin, des galets seront installées pour permettre aux alevins de se cacher (règle des 3 R : Raffinement). Un couvercle sera également mis sur les bacs afin d’éviter tout stress dû à la lumière, les stades embryo-larvaire vivant dans des gravières à 50m de fond. Les animaux seront nourris ad libitum pendant toute la durée de l’expérience à partir de 700 DPF.

Choix des espèces

L'omble chevalier est une espèce sentinelle du changement climatique des lacs alpins qui sont concernés par une forte pollution aux particules de pneu (responsable de 60% de molécules plastiques présente dans le lac léman). Ainsi, cette espéce est à la fois exposé aux particules plastiques et à la hausse des températures dans nos lacs alpins et péri-alpins. De plus, les stades embryonaires choisis pour cette étude sont connus pour être plus sensibles aux polluants.

160 anguilles européennes vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avant d'être relâchées dans le milieu naturel. Chaque individu est capturé, anesthésié, puis équipé par chirurgie d'un émetteur acoustique et d'une marque RFID implantés sous la peau avec un à trois points de suture, pour suivre en télémétrie la migration de dévalaison en lagune. Le porteur indique que le stress de la capture et du marquage peut retarder la migration, et écarte les individus déjà blessés ou en mauvais état sanitaire. Il affirme qu'il est "indispensable" d'étudier des anguilles sauvages capturées dans le milieu, l'espèce étant présentée comme menacée d'extinction.

Objectifs

Ce projet a pour objectif (i) de mieux connaître la dynamique de dévalaison à l'intérieur d'un système lagunaire, (ii) d'étudier la diversité des comportements migratoires et (iii) d'évaluer le succès de deux projets de restauration de la continuité hydrobiologique.

Bénéfices attendus

L'analyse des détections enregistrées par les stations d'écoute fixes et mobiles permettront de : i) S'assurer du bon déroulé de l'opération de marquage et de la survie des individus, -ii) Etudier le comportement des individus relâchés après l'opération de marquage : sont-ils immédiatement mobiles ou non ? - iii) Etudier comportements migratoires des individus : est-ce qu'ils dévalent tous ou certains remontent-ils au contraire le cours d'eau ? -iv) Connaître à quel moment les individus prennent la direction de la mer -v) Evaluer combien d'individus parmi ceux qui ont été détectés partis des bassins amont parviennent jusqu'aux portes de la mer - vi) Estimer la durée nécessaire pour les individus de parcourir la distance entre l'embouchure des bassins et les portes de la mer -vii) Evaluer si les voies de connexion restaurées sont utilisées par les anguilles pour rejoindre la mer -ix) Mieux connaître la diversité des comportements de dévalaison. Les résultats obtenus pourront éventuellement permettre de formuler des préconisations pour la gestion des ouvrages de connexion, afin d'optimiser le retour en mer des anguilles.

Procédures

Capture dans un vereux (nasse) : relève toutes les 24h approximativement. Facultatif : Si trop de captures, mise en couve jusqu'à 3 jours maximum. Stabulation dans un bac obscur et aéré : de 5 min à 4h Bain anesthésiant: 5 à 15 min Injection analgésique : 2 s Marquage avec une fermeture de la plaie à l'aide de 1 à 3 points de suture : 2 à 5 min Phase de réveil sous surveillance : de 10 à 30 min Stabulation avant relâcher : de 5 min à 2h

Impact sur les animaux

Le stress de la capture et du marquage est susceptible de retarder la migration des individus.

Devenir

L’ensemble des animaux sera remis en liberté à la suite de leur marquage, ce qui est primordial pour répondre à l’objectif de l’étude.

Remplacement

L’étude portant sur le comportement de poissons en milieu naturel, l’expérimentation doit être réalisée avec des individus capturés dans le milieu, et ne peut donc s’affranchir de l’emploi de poissons sauvages.

Réduction

Le milieu étudié présentant des densités d'anguilles élevées, il est nécessaire de suivre un maximum d'individus afin de pouvoir obtenir des résultats robustes et représentatifs de l'ensemble des deux sous-populations ciblées. De plus, au niveau des embouchures des bassins ciblés, des individus peuvent se faire éventuellement prédater par des silures. Et entre l'embouchure des bassins ciblés et les portes de la mer, les anguilles peuvent être prélevées par les pêcheurs professionnels ou la prédation aviaire. Par conséquent, un nombre suffisamment élevé d'individus doivent être marqués pour optimiser les probabilités d'avoir suffisamment d'individus qui parviennent jusqu'aux sorties de l'hydrosystème du Vaccarès. Dans le cadre de cette étude pilote, un total de 40 individus par bassin et par saison de dévalaison (octobre à mai), soit un total de 80 pour une année de suivi, et 160 si deux années de suivi sont réalisées, seront marqués. Le choix de ce nombre est un compromis entre avoir suffisamment d'individus pour obtenir des résultats robustes (n>>30 par bassin et par saison de suivi) et avoir suffisamment de moyens financiers pour y parvenir (coût des marques acoustiques relativement élevées >400€). Si les retours d'expérience sont favorables, un déploiement à plus grande échelle sera éventuellement envisagé.

Raffinement

Un individu qui présente des marques externes de blessures prononcées (souvent d'origine de prédateurs aviaires) ou d'autres signes d'état sanitaire dégradé (kystes, parasites, opacité des yeux, etc.) ne sera pas utilisé dans le cadre de cette procédure. Le marquage des individus s'effectue sous anesthésie et analgésie pour limiter au maximum la douleur. Un individu qui présente un comportement anormal lors de son anesthésie: des signaux d'hyperventilation ou de tremblements sera immédiatement placé dans le bac de réveil et ne sera donc pas traité. Les bacs de stabulation seront noirs, de manière à favoriser l'obscurité et diminuer le stress des individus pendant les phases de stabulation (avant leur traitement et pendant la phase de réveil). La densité des individus par bac sera limitée à 40kg/L. Et les bacs seront brassés par des aérateurs pour favoriser le brassage et l'oxygénation de l'eau. Les bacs seront placés à l'ombre pour éviter que l'eau se réchauffe excessivement. Une fois un individu marqué, il pourra être détecté en continu à plusieurs points de passage, aux points de sorties des bassins ciblées ainsi qu'aux portes de la mer, de manière continue. Ces suivis télémétriques (RFID et acoustique) constituent un moyen de raffiner le suivi en capture-marquage-recapture, puisqu'il permet de suivre à distance le déplacement d'individus marqués (de recapturer leur signalement) sans avoir à les manipuler à nouveau.

Choix des espèces

L’anguille européenne est une espèce migratrice amphihaline catadrome qui présente un cycle de vie unique, et qui est actuellement menacée d'extinction. Afin de mieux comprendre ses déplacements et en particulier de mettre en place des dispositions pour optimiser son retour en mer, il est indispensable d’étudier des individus de cette espèce. Dans le cadre de cette étude, uniquement des anguilles femelles argentées de plus de 50 cm, ayant un poids suffisamment important (>400g) pour supporter l’implantation de transpondeurs sans affecter leurs constantes vitales, seront utilisées. L'implantation de transpondeurs correspond à un lestage total de 5.1g dans l'air, avec une marque RFID de 23 mm de long qui pèse 0.6 g et un émetteur acoustique de 9mm de diamètre qui pèse 4.5g dans l'air (et 2.7g dans l'eau). L’impact des implants est négligeable lorsque leur masse est inférieure à 2.5% de celle du poisson, ce qui se vérifie ici.