Système cardiaque

260 souris vont être utilisées, chacune passant onze échographies cardiaques sous anesthésie entre deux et sept mois, et 120 d'entre elles recevant en plus 75 gavages, un tous les deux jours pendant cinq mois. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à sept mois, le cœur prélevé lors d'une chirurgie terminale. La lignée utilisée développe à partir de quatre mois une cardiomyopathie dilatée qui évolue en insuffisance cardiaque, avec une cyphose, environ 20 % de perte de poids et une espérance de vie réduite. Le porteur écrit que la complémentation alimentaire testée "ne provoque aucune nuisance" et devrait plutôt être bénéfique, sur des animaux dont la maladie est justement ce qui les rend utiles.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de comprendre la contribution d’une voie de signalisation moléculaire à la pathogenèse de la cardiomyopathie dilatée (CMD) et d’identifier de potentielles cibles thérapeutiques. La CMD se caractérise par une dilatation du ventricule gauche, une réduction de la fonction systolique possiblement associée des arythmies. Malgré l'efficacité des traitements classiques de l'insuffisance cardiaque, la CMD présente un taux élevé d'hospitalisations qui impose une charge financière aux systèmes de santé, liée à l’implantation de stimulateurs cardiaques et/ou des procédures de transplantation. Il est donc nécessaire de poursuivre l’étude des mécanismes physiopathologiques pour identifier des cibles thérapeutiques actionnables afin d’arrêter ou inverser le cours de cette maladie cardiaque. Plusieurs études ont montrées que la modulation la voie de signalisation moléculaire étudiée à l’aide de petites molécules présentent un intérêt croissant pour le traitement de la CMD. Si un nombre important de ces études expliquent les effets bénéfiques par l’activation de voies cellulaires connues, peu d'entre elles ont exploré l'impact de cette voie de signalisation dans la CMD. Des recherches complémentaires sont nécessaires pour comprendre dans quelle mesure cette voie de signalisation moléculaire étudiée joue joue un rôle dans le développement de la CMD. Nous proposons d’identifier l’ensemble des protéines impliquées dans cette voie de signalisation dans le cœur d’un model murin de CDM, d’identifier les protéines d’intérêt et d’étudier le rôle de ces protéines dans la CDM. Pour y parvenir, nous administrerons des molécules régulatrices de cette voie de signalisation par gavage ou injection intraveineuse. La fonction cardiaque des animaux sera évaluée en échographie. Apres traitement nous procèderons à l’analyse protéomique, biochimique et moléculaire des cœurs extrait des animaux traités.

Bénéfices attendus

Le bénéfice premier de cette étude est de mettre en évidence un nouveau mécanisme de signalisation moléculaire impliqué dans le développement de la cardiomyopathie dilatée. L’identification de ce nouveau mécanisme ouvrira la voix à de nouvelles perspectives thérapeutiques qui seront étudiées à la suite de ce projet. La cardiomyopathie dilatée à une incidence estimée supérieure à 1 pour 2500 individus, les principales causes de mortalité de la CMD proviennent d’insuffisance cardiaque (70 pourcent) et d’arythmies (30 pourcent). Le développement de nouvelles approches thérapeutiques est donc d’un intérêt majeur en matière de politique de santé publique.

Procédures

Evaluation de la fonction cardiaque en échographie. 260 animaux de l’âge de 2 à 7 mois tout les quinze jours sur animal anesthésié. Soit 11 échographies par animal. Chaque échographie dure environ 5 minutes. Traitement par gavage. 120 animaux de l’âge de 2 à 7 mois tous les deux jours sur animal vigil. Soit 75 gavages par animal. Chaque gavage dure environ 30 secondes. Injection intra péritonéales. 164 animaux à l’âge de 7 mois sur animal vigil. Soit une fois par animal. Une injection dure environ 30 secondes. Injection intraveineuse. 160 animaux, une fois à l’âge de 3-5 jours sur animal vigil. Soit une fois par animal. Une injection dure environ 30 secondes. Chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie: 164 animaux à l’âge de 7 mois. Soit une fois par animal. Une chirugie dure environ 10 minutes.

Impact sur les animaux

Le modèle murin de cardiomyopathie à un phénotype dommageable qui débute à 4 mois avec l’apparition progressive d’une cardiomyopathie dilatée d’abord légère et qui évolue vers 7 mois en insuffisance cardiaque. Cette progression de l’atteinte cardiaque est corrélée à une atteinte progressive et moins sévère des muscles squelettique, l’apparition d’une cyphose légère et une perte de poids d’environ 20 pour cent par rapport au poids de l’animale à 4 mois. Ce phénotype réduit l’espérance de vie des animaux. Le régime alimentaire des animaux sera complémenté par un composé impliqué dans la voie de signalisation moléculaire d’intérêt. Cette complémentation ne provoque aucune nuisances ou d’effets indésirables sur les animaux à long terme et devrait plutôt avoir un effet bénéfique. Toutefois, la méthode de délivrance par gavage peut générer un stress et une légère irritation au niveau de l’œsophage. Les injections nécessaires à ce projet peuvent générées un stress et une légère douleur lors de l’injection intraveineuse et en post injection pendant quelques jours.

Devenir

L'ensemble des animaux (260) sera euthanasié pour prélèvements d'organes. Le prélèvement des organes et notamment le cœur est indispensable pour effectuer les analyses nécessaires pour répondre à la question scientifique abordée dans ce projet.

Remplacement

Les cardiomyocytes adultes ayant atteint un état de différenciation terminale ne se divise pas. Il est par conséquent impossible d’en dériver une lignée cellulaire stable. Les cardiomyocytes adultes se conservent en culture primaire que quelques jours et ne peuvent pas être transfecté par des agents de transfection non viraux. D'autre part, aucun modèle d'expression in vitro ne reproduit les conditions physiologiques spécifiques du cardiomyocyte (expression de protéines spécifiques dans des domaines cellulaires spécifiques). Bien qu’il existe des lignées cellulaires derivée de cellules souches, celles ci ne récapitulent la physiologie d’un cœur que partiellement. Elles seront toutefois utilisées pour tester certaine de nos hypothèses qui ne nécessitent pas de modèle animal.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous utiliserons les contrôles les mieux adaptés et nous n'utiliserons que des préparations virales dont le titre aura été évalué afin d'utiliser la dose minimum efficace dans la transduction in vivo. Nous utiliserons les données acquises sur tous les animaux : mâles et femelles, sauvages et mutés. Les fonds génétiques des souris sauvages et transgéniques sont identiques. La lignée mutée produisant exclusivement des animaux homozygotes mutés, les animaux sauvages seront achetés auprès d’un fournisseur agréé. Le fait d'injecter les virus chez des souriceaux entre 3 et 5 jours de vie nous permettra d'exploiter toutes les naissances, quel que soit le jour de la semaine où elles surviennent du fait des accouplements continus (pas d'injection le week-end) et ne pas faire naître d'animaux non nécessaires au projet. Pour n’utiliser que le nombre d’animaux nécessaire à ce projet, nous avons recourt au service d’un biostatisticien pour nous épauler dans l’élaboration de notre plan expérimental. Au total nous utiliserons 260 animaux.

Raffinement

Les animaux seront observés tous les jours par les membres qualifiés de l'animalerie et tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne responsable du projet. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, 6 par cage maximum pour les cages après sevrage, jusqu'à 15 (souriceaux et reproducteur) pour les cages de reproduction. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire au maximum toute douleur, souffrance ou angoisse que pourraient subir les animaux: enrichissement du milieu (lanières de papier Kraft, maisons en carton), acclimatation d'une semaine avant toute manipulation, hébergement en groupe, formation technique des utilisateurs. Les points limites seront évalués régulièrement. Si un animal dépasse ces points limites, il sera euthanasié. Afin de prévenir au maximum l’irritation liée au gavage, nous utilisons des sondes de gavage en plastique souple dont la longueur et le diamètre sont adaptés à la morphologie de l’animale. Afin de réduire au maximum la douleur chez les animaux utilisés, nous privilégierons les injecterons par voie systémique afin d’éviter une chirurgie cardiaque lourde. Dans le but de limiter au maximum le nombre de manipulations réalisées sur les souriceaux, leur stress ainsi que celui de leur mère pour favoriser leur survie, nous identifierons par tatouage les souriceaux injectés. Pendant tout le temps que durera l'injection d'une portée, les souriceaux seront séparés de leur mère et gardés ensemble dans un peu de litière provenant de leur cage, puis ils seront rendus ensemble à leur mère en les déposant hors du nid. Nous vérifierons qu'ils sont bien repris en charge par la mère et ramenés au nid. Les caractéristiques physiologiques cardiaques de la maladie seront évaluées par des méthodes non invasives. Un protocole d’anesthésie/analgésie est mis en place pour tous les animaux impliqués dans la procédure de chirurgie sans réveil.

Choix des espèces

La souris est l’animal choisi pour ce projet en raison des similitudes de son système cardiovasculaire avec celui des humains et de l’existence d’une lignée génétiquement modifiée portant la mutation d'intérêt responsable à l’état homozygote de cardiomyopathie dilatée chez l’humain. Cette mutation est aussi présente dans notre modèle cellulaire de cardiomyocyte dérivés de cellules souches, ce qui rend comparable les résultats obtenus dans les deux modèles d’études. De plus, la souris est le modèle animal le plus utilisé dans ce champ de recherche, permettant ainsi des comparaisons avec d’autres études ou d’utiliser les résultats d’autres études afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons des souris à différents stade de la progression de la pathologie étudiée (3, 5, et 7 mois) afin d’avoir une analyse complète du phénomène. De plus nous utiliserons des souriceaux pour l’injection de molécules d’intérêts. Cela présente l’avantage de diffuser ces molécules à l’ensemble des organes de l’animal, de limiter la réponse immunitaire et d’éviter un acte chirurgical lourd dans le cas de l’utilisation d’animaux plus âgés.

Cinq séances hebdomadaires de neurostimulation par ultrasons, doublées d'une électromyographie, puis dix minutes d'échographie cérébrale avec agent de contraste et d'imagerie photoacoustique : 320 souris et 320 rats mâles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tués après la cinquième semaine. Le projet compare des sondes ultrasonores pour trouver la configuration la plus efficace, l'espoir déclaré étant de stimuler le cerveau "sans générer de lésions". Le groupe témoin reçoit de la cocaïne, dont le porteur indique qu'elle peut provoquer des troubles locomoteurs, une modification de la prise alimentaire et une hausse de l'anxiété. La pose d'un cathéter et la suture de la peau du crâne apparaissent seulement dans la liste des douleurs attendues, sans figurer dans la description des procédures.

Objectifs

Dans le cadre de cette étude nous souhaitons évaluer différentes sondes ultrasonores pour réaliser une stimulation ultrasonore non-invasive, précise et efficace chez la souris et le rat.

Bénéfices attendus

Nous espérons trouver une configuration de sondes et paramètres ultrasonores donnant le plus d'efficacité de stimulation cérébrale, sans générer de lésions.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs interventions comme la neurostimulation ultrasonore, pour une durée de 5 minutes, répétee 5 fois à raison de 1 fois par semaine. L'electromyographie sera réalisée en parallèle de cette neurostimulation avec la même durée et fréquence. Une échographie cérébrale avec agents de contraste ainsi qu'une imagerie photoacoustique seront réalisées successivement après la neurostimulation pendant 10 minutes et en suivant la même fréquence de 1 fois par semaine pendant 5 semaines. Enfin, l'injection de puces d'identification sera effectuée une fois pour une durée de 2 minutes.

Impact sur les animaux

Parmi les nuisances ou effets indésirables, il est possible que l'animal ait des douleurs au réveil suite à la pose du cathéter. Une gêne peut aussi être ressentie après l'apposition de la sonde ultrasonore de stimulation. Il est aussi possible que la suture de la peau sur le crâne soit douloureuse. L'injection de cocaïne au groupe contrôle afin de vérifier la capacité de l'imagerie ultrasonore d'observer les modifications vasculaires peut induire des problèmes locomoteurs, une modification de la prise de nourriture et une augmentation de l'anxiété des animaux.

Devenir

Nous conservons les animaux en vie jusqu'à la 5ème semaine de traitement par neurostimulation ultrasonore. Après les dernières imageries échographique et photoacoustiques, les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Dans une première approche expérimentale, nous avons mis en place et validé un dispositif expérimental permettant la stimulation ultrasonore. Dans la continuité de ce projet, nous souhaitons évaluer différentes sondes ultrasonores pour réaliser une stimulation ultrasonore précise et efficace chez la souris et le rat. Par conséquent, à cette étape du projet, le modèle animal ne peut être substitué par un autre modèle d'étude in-vitro ou in-silico.

Réduction

Sur la base de nos études antérieures et en raison des variables mesurées, notre étude nécessite 320 souris et 320 rats. Les groupes contrôles et expérimentaux seront constitués de 8 animaux. Nous réaliserons une étude statistique pour déterminer si les effets de la neurostimulation induisent une modification significative des variables mesurées.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe de 8 pour les souris et par 2 pour les rats en présence d'un ou plusieurs objets d'enrichissement. L'ensemble des stimulations et imagerie sur animaux endormis seront faites sous anesthésie gazeuse pour réduire les douleurs des animaux. Des points limites adaptés à chaque intervention seront suivis au cours du temps.

Choix des espèces

Le choix de ces deux espèces se justifie pour l'analogie des zones cérébrales et de la neurobiologie entre le rongeur et l'humain. Certains aspects de la stimulation ultrasonore chez la souris et le rat ont également été validés dans la littérature. Des animaux de sexe mâle seront utilisées afin d’éviter toute altération des résultats par le cycle menstruel femelle. Les souris BALB/cByJRj et les rats Sprague-Dawley seront adultes (âgées de 9 semaines) à J0 de l'expérimentation afin de comparer les effets d’une stimulation ultrasonore chez des animaux dont le phénotype comportemental est stabilisé (période neuro-développementale terminée).

225 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux cents d'entre elles reçoivent sous la peau un implant de tissu biologique, opération de dix minutes sous anesthésie, puis subissent une micro-incision de la queue pour un prélèvement de sang au moment où l'implant leur est retiré, avant d'être tuées. Les 25 restantes, écartées parce qu'elles n'ont pas le génotype recherché, sont laissées en vie et réutilisées dans d'autres protocoles en cours. Le projet cherche à savoir si le blocage d'une enzyme freine la calcification des bioprothèses valvulaires, et le porteur affirme devoir le vérifier "in vivo, dans un système biologique entier", après des résultats non publiés obtenus en culture cellulaire.

Objectifs

Le rétrécissement aortique calcifié (RAC) est la valvulopathie la plus fréquente dans les pays occidentaux et sa prévalence augmente avec l’âge. Il n’y a aujourd’hui pas de traitements pour traiter le développement du RAC. En plus du remplacement valvulaire aortique (RVA), les recommandations de prise en charge des patients ayant un RAC incluent aussi l’implantation d’une prothèse biologique dans la valve aortique par voie percutanée (TAVI). Concernant ces prothèses, il a été observé des cas de recalcification et peu d’étude existent sur la durabilité des prothèses au-delà de 5 ans. Nous avons précédemment identifié, en travaillant sur des modèles cellulaires, une cible thérapeutique appelée Ezh2 (Enhancer Zeste Homologue 2), qui agit sur les phénomènes inflammatoires et de calcification dans le RAC. Nous souhaitons au travers de cette étude démontrer son rôle dans les processus inflammatoires associés à la dégénérescence de bioprothèse valvulaire aortique.

Bénéfices attendus

Démontrer l'intérêt thérapeutique du ciblage de l'enzyme épigénétique EZH2 (Enhancer zest homolog 2) par une meilleure compréhension de son rôle dans les processus inflammatoire associés à la dégénerescence des bioprothèses valvulaire aortique.

Procédures

1. implantation de tissus biologiques en sous cutanée chez un modèle de souris sous une anesthésie gazeuse et sous couverture analgésique adaptée suivant le poids de la souris 40 minutes avant opération chirurgicale. Le temps nécessaire à l'implantation des tissus biologique en sous cutanée est de 10 minutes par souris 2. Chaque souris (n=200) subira un prélèvement sanguin par micro-incision de la queue au moment de l'extraction des implants. La couverture analgésique obtenue dure 6 heures et la durée d'injection de l’analgésique est de 2 à 3 secondes.

Impact sur les animaux

Les prélèvements sanguins (classe légère), les administrations d’analgésique (classe légère) et le traitement avec l'inhibiteur pharmacologique de Ezh2 (classe légère), pourront occasionner des effets secondaires. L’implantation de tissus biologiques en sous cutanée est une procédure de classe modérée pouvant occasionner une douleur modérée post-opératoire et une gêne au niveau des zones implantées.

Devenir

Tous les animaux inclus dans la procédure (n=200) seront mis à mort. Les implants seront prélevés pour les explorations ex vivo. Les 25 animaux n’ayant pas le génotype d’intérêt et n'ayant donc pas été inclus dans la procédure seront laissés en vie et réutilisés pour d’autres protocoles en cours.

Remplacement

Des résultats non publiés de notre laboratoire ont montré que le ciblage, in vitro, de l’enzyme épigénétique Ezh2 dans les cellules inflammatoires permettait une réduction des phénomènes inflammatoires participant au développement des calcifications de la valve aortique. Dans cette étude nous voulons évaluer, in vivo, dans un système biologique entier, l'effet du ciblage spécifique d'Ezh2 sur les processus inflammatoires associés à la dégénérescence de bioprothèse valvulaire aortique.

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude nous avons mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses ex vivo durant la procédure et au moment de la mise à mort. Le choix des inhibiteurs pharmacologiques de Ezh2 est issu d'expériences préalablement réalisées dans des modèles de RAC in vitro. A l'aide du logiciel G*power version 3.1.9.7 qui s'appuie sur la variabilité statistique des résultats obtenus le nombre d'animaux nécessaire est ajusté. Des animaux des deux sexes seront utilisés dans nos procédures afin de s'affranchir d'un effet du genre et d'utiliser l'intégralité des animaux OGM produits dans notre animalerie. Une stratégie de reproduction adaptée et associée à une analyse du génotype de chaque animal nous permettra de nous limiter à l'unique production d'animaux pour les procédures expérimentales. Afin d'éviter la production d'animaux servant au maintien de la lignée OGM dans notre animalerie, une stratégie de cryopréservation de sperme sera mise en place.

Raffinement

Pour raffiner, les animaux seront hébergés sur portoirs ventilés et dans des cages en plaques de cellulose vierge et maisons en carton. Nous avons déterminé des points limites adaptés grâce à notre grille de score qui s’appuie sur le comportement de l'animal, son apparence et des signes cliniques spécifiques. De plus, nous adopterons une stratégie de réhydratation par injection en sous-cutanée de sérum physiologique à 37°C, et en cas de besoin, une injection de glucose par voie intrapéritonéale. Un traitement analgésique en pré et postopératoire, sera administré, soit immédiatement après l'implantation ou une fois par jour sur les 48h qui suivent l’implantation. Si un des points limites est atteint ou si la somme des paramètres de suivi atteint un score entre 10 et 14, la méthode de mise à mort prévue est la dislocation cervicale. Un suivi quotidien du bien-être animal sera mis en place.

Choix des espèces

La souris a l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des outils biologiques, l’utilisation d’animaux pour lesquels un gène est invalidé de manière spécifique dans différents types cellulaires comme cela est le cas dans cette demande concernant la délétion de Ezh2 dans les cellules myéloïdes, qui ne sont parfois pas accessibles pour le rat (modèle développé au sein de notre laboratoire). Ces modèles sont particulièrement intéressants pour mieux comprendre les mécanismes de la pathologie. Dans notre laboratoire nous avons, depuis de nombreuses années, une excellente expérience des évaluations fonctionnelles et structurelles cardiaques in vivo ainsi que ex vivo chez la souris. La souche de souris (C57Bl/6j) sera utilisée dans cette étude Nous allons inclure des animaux adultes de 12 semaines. La taille des souris à cet âge permet une implantation facilitée des prothèses .