Système cardiaque
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Validation de la sécurité et de l’efficacité d’un mode d’application rapide et dynamique des ultrasons focalisés pour le traitement d’occlusion des veines superficielles et profondes
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Jusqu'à seize zones de tir par membre, sur chacune des quatre pattes : 30 brebis vont être utilisées pour valider un protocole d'ultrasons focalisés destiné au traitement des varices. Dix-huit sont opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Douze subissent deux séances de traitement d'une à trois heures dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, puis sont tuées trente à quatre-vingt-dix jours plus tard pour prélever les veines traitées, le porteur signalant des brûlures cutanées légères et une boiterie possible. Il indique avoir écarté le lapin, dont les veines seraient trop petites, et le cochon, dont la peau se prêterait mal à la propagation des ultrasons, la brebis offrant une saphène latérale à la bonne profondeur.
Objectifs
La technologie des ultrasons focalisés permet de détruire des veines pathologiques sans incision. Une sonde émet des ultrasons qui traversent la peau et se concentrent sur le tissu à traiter où ils induisent un échauffement local important. Le geste est guidé en temps réel par échographie. Dans ce contexte, le but de cette étude est de valider l’efficacité et la sécurité des paramètres de traitement avant passage sur l’homme pour le traitement des varices. Un protocole de traitement est déjà appliqué en clinique actuellement et l’objectif de cette étude est de proposer un protocole permettant un traitement plus rapide tout en traitant un plus grand nombre de veines : - Les veines plus superficielles (jusqu’à 6 mm sous la peau alors qu’il est aujourd’hui possible de ne traiter des veines qui sont au maximum à 9 mm sous la peau). Lors des traitements de ces veines superficielles, il existe un risque important de créer des dommages entre la peau et la veine traitée. - Les veines plus profondes (jusqu’à 36 mm sous la peau). Il est nécessaire pour proposer un nouveau protocole de traitement de vérifier que celui-ci est efficace et qu’il ne présente pas de risques pour le patient notamment de risques de brulure de peau ou de dommages périveineux. Les objectifs de l’étude sont donc de : • Vérifier que le traitement est efficace lorsqu’on traite des veines ; • Vérifier que le traitement n’engendre pas de dommages périveineux lors d’un traitement ; • Vérifier que le traitement ne crée pas de brulures de peau. Des traitements aigus et des traitements avec réveil de l’animal puis mise à mort 30 à 90 jours après traitement seront réalisés pour constater les effets du traitement après une période d’activité de l’animal.
Bénéfices attendus
Le bénéfice pour les êtres humains serait à long terme de proposer un traitement non invasif permettant de traiter les varices avec une durée de traitement comparable à celle proposée par les techniques invasives déjà existantes. De plus il sera possible d’élargir les critères d’éligibité au traitement avec les ultrasons focalisés à haute intensité donc de traiter plus de patients sans avoir besoin d’effectuer de chirurgie ou d’incision sur la peau des patients. A court terme, l’étude permet à de mieux comprendre l’utilisation d’ultrasons focalisés à haute intensité notamment lors de traitement de veines superficielles. Plusieurs paramètres comme la fréquence des ultrasons, l’enveloppe du signal utilisé seront étudiés et les impacts des changements sur ces paramètres pourront être directement étudiés, le tout permettant de mieux comprendre les ondes avec lesquelles les opérateurs travaillent. Il sera ainsi possible de modifier ces paramètres jusqu’à obtenir le traitement le plus efficace.
Procédures
Les animaux sont soumis à un traitement avec des ondes ultrasonores focalilsées sous anesthésie générale pendant 1 à 3 heures, une seule fois pour 18 animaux et 2 fois pour 12 animaux.
Impact sur les animaux
Les manipulations des animaux peuvent induire du stress lié à l'approche, la contention des animaux et à l'administration de médicaments par voie intra-musculaire. Les effets indésirables pouvant apparaitre après un traitement de la veine sont des brûlures légères de la peau non systématique.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de l'étude en raison de la nature des prélèvements à effectuer pour analyse.
Remplacement
Plusieurs alternatives sont mises en place pour remplacer les animaux dans les procédures de tests. L’alternative non animale disponible est la simulation numérique, elle constitue la première approche dans une étude et permet de connaitre les premières caractéristiques des améliorations proposées sur les procédures de traitement. Or il existe des incertitudes importantes (propriété des tissus connues avec une précision insuffisante, dynamique du flux sanguin, lien peu documenté entre température, temps d’exposition et dommages biologiques…) qui ne permettent pas de réaliser l’ensemble de l’étude sur ces simulations. En effet, la simulation numérique ne permet pas d’effectuer des simulations thermiques suffisamment précises. D’autre part, avec les paramètres envisagés, il est possible que les tirs engendrent des effets indésirables au niveau de la peau qui ne peuvent pas être simulés. Une partie des expérimentations sur animaux vivants a été remplacée par la réalisation d’expériences ex-vivo. Ceci nous permet d’avoir des premières connaissances sur les tailles et la localisation des lésions qui vont être obtenues. Par ailleurs, le tissu utilisé est homogène. On ne peut pas évaluer les risques sur la peau d’un animal et il ne présente pas de vascularisation nécessaire pour évaluer les performances de l’impulsion d’ultrasons focalisés à haute intensité étudiée. Sont également mises en place des recherches sur une nouvelle technique pour remplacer l’expérience de la sécurité à la peau avec un phantom. L'idée est d'utiliser des papiers sensibles à la température pour représenter les champs acoustiques des têtes de traitement utilisées. Il sera alors possible de connaitre les endroits où la sonde de traitement ultrasonore chauffe le plus et de déterminer une limite acceptable qui ne brule pas la peau grâce à cette méthode. Dans cette étude, nous chercherons à valider cette nouvelle approche pour remplacer au maximum le nombre d’animaux nécessaires sur la partie sécurité à la peau.
Réduction
Les études réalisées visent à évaluer deux grands axes d’étude, la sécurité à la peau et les performances de la nouvelle procédure de traitement. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, les deux objectifs vont être étudiés sur deux zones différentes du corps de l’animal. Le maximum d’emplacements sur chacun des membres de la brebis pour évaluer la sécurité à la peau sera utilisé (jusqu’à 16 zones par membre). Enfin on prélevera les veines traitées de la brebis après chaque étude pour garder des preuves précliniques dans l’objectif de réduire le nombre de brebis nécessaires. Le nombre d’animaux nécessaires pour cette étude est de 30. Chaque lot de brebis comporte 3 brebis soit 6 veines. Ce nombre a été déterminé par des tests statistiques.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes sociaux de 3 à 6 animaux dans des boxes collectifs dans les conditions standards. Les enrichissements consistent en du foin distribué à volonté, des granulés distribués au sol et la mise à disposition de pierres à sel. Une période d’acclimatation de 5-7 jours est respectée et mise à profit afin d'habituer les brebis à la présence de l’Homme et à la manipulation lors de la distribution de nourriture et les changes de litière. Les animaux seront anesthésiés sur l’ensemble du traitement avec les ultrasons focalisés à haute intensité ce qui permettra une absence totale de douleur et de réduire le stress des manipulations. Si des signes de douleur sont perçus pendant le traitement, l’administration d’analgésique sera réalisée par voie intraveineuse. Les brebis sont surveillées tous les jours après le traitement pour d’éventuels signes de boiterie ou de changement de la peau. En cas de douleurs post traitement (repérées par une légère boiterie), les animaux recevront des analgésiques pendant quelques jours). Des points limites précis et spécifiques ont été déterminés et seront appliqués.
Choix des espèces
D’après notre expérience préclinique, la brebis constitue le meilleur modèle pour ces études. Ses veines ont un calibre suffisant (diamètre supérieur à la taille d’une lésion engendrée par un pulse délivré par notre système) et la saphène latérale est à une profondeur accessible par notre dispositif. De même les nerfs fibulaire et tibial sont à la bonne profondeur sous la peau à l’endroit où le nerf sciatique se divise. Par comparaison, les veines de lapin sont trop petites et la composition de la peau du cochon n’est pas favorable à la bonne propagation des ultrasons à la fréquence ultrasonore d’étude Nous utiliserons des animaux adultes pour disposer des plus grandes zones de tir possible et de la latitude nécessaire à l’étude des profondeurs de traitement (au moins 3 cm de profondeur sous la peau, pour les tirs les plus profonds).
Effet des doses faibles à modérées de rayonnements ionisants gamma sur le développement à long terme de pathologies cardiovasculaire (coeur/poumon) et troubles du rythme associé chez la souris âgée 3/3
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Irradiées au rayonnement gamma sur le corps entier à l'âge de 15 mois, transportées entre trois établissements, 375 souris subissent des échographies mensuelles sous anesthésie, des courses sur tapis, des mesures de pression à la queue en tube de contention, une stimulation transœsophagienne et une ouverture du thorax sans réveil. Les procédures vont d'un niveau de souffrance modéré à sévère, et toutes les souris sont tuées pour prélever cœur et poumons. Le projet vise à alimenter les normes de radioprotection en simulant l'exposition de personnes âgées vivant en territoire contaminé après un accident nucléaire. Le porteur écrit que l'irradiation "n'entraine ni douleur ni brulure" et que l'hypertension induite "sera indolore", dans le même texte où il signale un risque d'hémorragie lors de la chirurgie thoracique et un arrêt cardiaque possible sous anesthésie.
Objectifs
La présente demande concerne un projet préalablement autorisé pour lequel nous devons effectuer une étape nécessitant une expertise spécifique non disponible en interne. Aucun animal supplémentaire n'est donc ajouté ici par rapport au projet principal déjà autorisé. Actuellement, des résultats préliminaires ont mis en évidence un effet des doses faibles à modérées (inférieur ou égal à 500mGy) sur le développement d’arythmies atypiques à long terme et également l’observation d’un remodelage des vaisseaux pulmonaires. Il parait alors intéressant de vérifier le rôle du système nerveux sympathique et de l’hypertension artérielle pulmonaire sur la physiologie et le maintien de la fonction cardiaque. L’impact de l’âge au moment de l’irradiation sera évalué à partir de la dose 100mGy pour laquelle il y a le début de développement de maladies cardiovasculaires et également des troubles du rythme dans le contexte de l’exposition faible. L’objectif de ce projet sera d’évaluer la potentialisation ou non de l’âge sur un modèle expérimental d’exposition externe unique aux rayonnements gamma corps entier. Les effets des doses faibles à modérées de rayonnements ionisants gamma à long terme sur le coeur et les vaisseaux du poumon seront évalués afin d’apporter des réponses très attendues quant aux questions des effets biologiques pouvant induire des pathologies non-cancéreuses comme les pathologies cardiovasculaires pour permettre d’alimenter le système de radioprotection. En mimant une exposition à des doses faibles à modérées, ce projet sera complémentaire aux études épidémiologiques et permettra d’apporter des réponses notamment dans les gammes de doses où les études épidémiologiques manquent de puissance statistique. Ce projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’obtenir de nouvelles connaissances d’un point de vue mécanistique sur l’impact de l’âge au moment de l’exposition et les effets à long terme d’une exposition de doses faibles à modérées sur le système vasculaire (pulmonaire et cardiaque), le système nerveux sympathique cardiaque et sur le développement de troubles du rythme radio-induite afin d’améliorer et d’actualiser les connaissances et participer à la détermination des normes en radioprotection pour des institutions du domaine de la radioprotection.
Procédures
Tous les animaux seront transportés pendant 5 min de l’EU1 à l’EU2. Certains animaux seront exposés aux rayonnements gamma (EU2) pendant 3 min à 1h. L’irradiation aux doses utilisées dans le projet n’entraine ni douleur ni brulure que ce soit pendant l’irradiation ou après. Seules des modulations d’expression des protéines et une légère diminution de la fonction cardiaque ont été observées à long terme, sans conséquence clinique pour les animaux. Tous les animaux seront transportés pendant 5 min de l’EU2 à l’EU1. Certains animaux subiront des échographies (20 min) effectuées sous anesthésie (EU1) avant, 5 jours après irradiation puis tous les mois jusqu’au transport vers l’EU3. Certains animaux seront soumis à deux expériences de course sur tapis (EU1) pendant 10 min suivies d’une échographie d’environ 6 min qui seront réalisées à une semaine d’intervalle par rapport à l’échographie cardiaque. Les animaux auront donc 2 fois 2 anesthésies à une semaine d’intervalle. Pour ces animaux, la pression artérielle sera aussi mesurée à la queue (EU1) sur animaux vigiles (procédure indolore de 10 min) après accoutumance à la contention pendant 5 jours ce qui permet de limiter autant que possible le stress de la manipulation. Les animaux seront placés 10 minutes, 1 fois par jour pendant 5 jours dans un tube à contention. Cette mesure sera prise 5 fois : 1 fois par mois à une semaine d’intervalle avec les échocardiographies. L'hypertension induite dans les modèles utilisés n'est pas très forte et sera indolore pour les animaux. Ces souris seront ensuite transportées (30 min) vers l’EU3 et une semaine d’acclimatation sera réalisée. Ils seront anesthésiés et analgésiés à 4 jours d’intervalle une fois pour des stimulations transoesophagiennes de 5 min (EU3) et une fois pour la prise de pression artérielle pulmonaire, procédure chirurgicale sans réveil (EU3). Tous les animaux subiront un prélèvement de sang effectué sous anesthésie/analgésie avant l’euthanasie par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
L’irradiation à de faibles doses n’entraine pas de douleur ni de brulure aux animaux, seules des modulations d’expression protéique et une légère diminution de la fonction cardiaque a été observée à long terme. L'hypertension induite dans les modèles utilisés n'est pas très forte et sera indolore pour les animaux. Néanmoins un stress (peur ou détresse) des animaux est possible lors de la mise en boite d’irradiation (375 animaux) et lors des mesures de de pression artérielle (125 animaux) même s’il y a habituation au tube à contention. Les procédures avec aiguille (375 animaux) peuvent potentiellement conduire à une douleur, à une peur et à des infections. Le transport animaux (375 animaux) entre les sites peut engendrer une peur temporaire et un stress thermique de courte durée. Les animaux subiront certains actes chirurgicaux qui pourront entrainer de la douleur palliée par une administration préalable d’analgésique. Lors de la procédure chirurgicale sans réveil, il peut y avoir une hémorragie. Ces actes chirurgicaux sont réalisés sous anesthésie et seront suivis de l’euthanasie de l’animal, sans qu’il ne reprenne conscience. L’anesthésie peut aussi entrainer un arrêt cardiaque.
Devenir
A la fin de la procédure toutes les souris seront euthanasiées pour prélever des organes (coeur et poumons) qui permettront une analyse histologique complétant les analyses fonctionnelles réalisées sur tous les animaux de ce projet.
Remplacement
Pour mimer l’exposition corps entier de résidents âgés vivants en zone contaminée après un accident nucléaire par exemple celui de Tchernobyl, il est nécessaire d’avoir recours à une exposition externe à des doses faibles de rayonnements ionisants gamma (imitant les rayonnements ionisants du CS137) sur un modèle intégré (cardiomyocytes et fibres nerveuses). De plus, les études in vitro présentent des limites pour l’évaluation des mécanismes au niveau cellulaire après une exposition à des doses faibles à modérées et ne permettent pas d’identifier des processus physiologique et/ou physiopathologique comme la régulation de la pression artérielle ne peuvent être évalués qu'in vivo, tout comme l’évaluation de la fonction cardiaque, c'est pourquoi ce projet nécessite des modèles murins. Néanmoins pour une partie du projet, dès que possible, les voies et les molécules impliquées seront étudiées in vitro sur des cellules en culture. Néanmoins, il est très difficile d’obtenir des cellules de provenant de souris âgées et de maintenir ces cultures cellulaires au-delà de 3 semaines dû au vieillissement cellulaire et aux cycles limités des cellules.
Réduction
Au total, 375 animaux seront utilisés dans ce projet. Le nombre de 25 animaux par groupe a été établi avec l’utilisation d’outils statistiques permettant d’optimiser la puissance de l’étude et avec notre expérience concernant ce type d'analyses et ces modèles murins pour être au minimum. De plus on considère une mortalité possible due à la longévité des souris âgées pour nos groupes qui seront gardés pendant 3 mois post-irradiation, on constituera des groupes de 25 animaux pour obtenir un nombre d’animaux suffisant pour nos analyses statistiques. Si nous n’observons pas de mortalité tous les animaux seront pris en compte pour nos résultats.
Raffinement
Les volumes injectés sont les plus petits possibles en accord avec le poids de l’animal. Les animaux sont pesés en début de procédure et avant la chirurgie. Un analgésique est administré en sous cutané pour atténuer la douleur de l’ouverture du thorax. Lors des différents protocoles, un arrêt cardiaque durant l’anesthésie sera traité par massage cardiaque. La profondeur de l'anesthésie sera vérifiée en testant l'absence de réflexe de retrait de la patte (après pincement). Les infections ou blessures éventuelles seront traitées localement par application d’antiseptique, crème antibiotique ou par administration d’antibiotique. Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec eau et nourriture ad libitum. La température et l’hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés à plusieurs et le milieu est enrichi avec des lanières de papier, morceau de bois et maison en carton. En cas de bagarres, les animaux pourront être isolés. Les souris seront suivies de façon hebdomadaire. Elles seront pesées régulièrement une fois par mois. Tout signe de prostration de l’animal, de blessures importantes dues aux bagarres entrainera l’euthanasie anticipée. Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne sera effectuée par les zootechniciens et hebdomadaire par le porteur de projet. Le transport des animaux (entre EU1 et EU3) se fera dans un véhicule climatisé et les animaux seront placés dans des boites de transport avec litière et gel hydrique. La durée de transport srea de 30 min. Si avant ou après le transport un animal montre des signes de souffrance (locomotion, isolement, apparence) lié, il sera euthanasié. Les EU1 et EU2 étant dans le même bâtiment, le transport se fera dans des boites de transport avec litière.
Choix des espèces
Ce projet vise à déterminer l’impact de l’âge sur le développement de pathologies cardiovasculaires (hypertension artérielles pulmonaire, cardiomyopathies) et également des troubles du rythme cardiaque chez des souris irradiées en corps entier avec des rayonnements gamma à faible dose et ce afin de mimer des effets secondaires à long terme de l’exposition des personnes âgées en territoire contaminé post accident nucléaire. Les souris seront âgées de 15 mois au moment de l’irradiation car ça correspond au début de la vieillesse chez la souris. Des souris C57BL/6 males âgés seront utilisées pour ce projet afin de pouvoir comparer avec les études déjà effectuées sur des souris mâles jeunes. Il est prévu par la suite d'évaluer les effets de l'irradiation faible dose sur des souris femelles jeunes et âgées.
Evaluations quantitative et morphologique de la moelle osseuse chez la souris C57BL/6J
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Souche de laboratoire la plus répandue, la souris C57BL/6J fait ici l'objet d'une description de référence de sa propre moelle osseuse. 20 souris vont être utilisées, opérées sous anesthésie gazeuse et tuées avant tout réveil. L'intervention se limite à une injection analgésique sur animal éveillé puis à une laparotomie, vingt minutes au plus séparant le début de l'anesthésie de la mise à mort. Le porteur écrit que l'étude "demande la disponibilité de sang frais et de moelle osseuse, ce qui n'est possible qu'en utilisant des animaux vivants", et les souris sont tuées dès la fin du prélèvement, pour constituer une base de données servant à comparer d'autres souches.
Objectifs
L’évaluation de la moelle osseuse est cruciale dans la compréhension des maladies hématologiques et osseuses ainsi que dans le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Cependant celle-ci reste souvent limitée chez la souris à un immunophénotypage cellulaire sur suspension liquide fémorale sans évaluation morphologique exhaustive
Bénéfices attendus
L’ensemble de ces résultats fournira une base de données sur la distribution des types cellulaires médullaires dans un myélogramme et dans un prélèvement histologique de fémur chez la souris C57BL/6J qui sera utile dans les études de comparaison de ces variables dans d’autres souches de souris.
Procédures
- Injection sous-cutanée unique (analgésie) sur animal vigile: unique injection - durée: 4 secondes - Laparotomie sous anesthésie générale gazeuse puis mise à mort sans réveil - 20 minutes par animal au maximum entre le début de l'anesthésie et l'euthanasie.
Impact sur les animaux
Stress engendré par l'entrée dans la boîte à induction. Euthanasie sous anesthésie générale.
Devenir
mise à mort dès la fin du prélèvement sanguin.
Remplacement
L'étude demande la disponibilité de sang frais et de moelle osseuse, ce qui n'est possible qu'en utilisant des animaux vivants.
Réduction
Seulement 20 souris sont utilisées (nombre minimal pour établir des médianes et intervalles min-max)
Raffinement
Toute la procédure sera réalisée sous anesthésie générale volatile associée à une analgésie pré chirurgicale. Les cages d'hébergement sont placées sur portoir ventilé. Les souris ont de l'eau et de la nourriture à volonté ainsi que des dômes en cellulose, des tunnels en polycarbonate (rouges) ainsi que des lanières de peuplier compactées. Les portoirs sont situés dans une pièce dont la température ambiante, le niveau sonore et le degré d'humidité sont contrôlés.
Choix des espèces
L'étude porte sur la caractérisation de la souche de souris la plus commune en laboratoire qui justifie le choix d'individus de cette souche. Animaux adultes 9-10 semaines. Le stade adulte est choisi car l'étude porte sur la caractérisation de la souris C57 adulte.
Etude du flux autophagique dans un modèle murin d’insuffisance cardiaque d’origine génétique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Sectionnées à l'extrémité de la queue entre sept et dix jours pour le génotypage, puis soumises entre deux et cinq mois à une à quatre échographies cardiaques de dix minutes sous anesthésie gazeuse, 137 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 60 d'entre elles et modéré pour 77. Certaines subissent ensuite deux jeûnes de vingt-quatre heures séparés par deux heures d'accès à la nourriture, d'autres un gavage ou une injection intrapéritonéale. Quatre heures après cette injection, elles sont tuées. Le cœur et parfois les muscles des pattes sont alors prélevés, sur des animaux porteurs d'une mutation qui provoque chez eux une insuffisance cardiaque.
Objectifs
La cardiomyopathie dilatée (CMD) humaine est une maladie grave conduisant à l’insuffisance cardiaque (IC) et est la première cause de transplantation cardiaque. Les apports récents de la génétique ont permis l’identification de nombreuses causes génétiques de cette maladie. L’hétérogénéité génétique est très importante avec environ 30 gènes et de multiples mutations essentiellement privées impliqués à ce jour. Ces découvertes n’ont cependant pas été accompagnée, le plus souvent, de l’étude des mécanismes physiopathologiques. Dans cette pathologie à forte composante génétique les traitements restent avant tout symptomatiques, et non curatifs, et la compréhension des voies physiopathologiques apparaît indispensable pour avancer vers l’identification de cibles thérapeutiques potentielles. Nous avons, au laboratoire, identifié un gène portant des mutations responsables de CMD et fait développer par un prestataire un modèle de souris dans lequel nous avons introduit une mutation identifiée chez un patient. Ce modèle reproduit la maladie, avec le développement d’une insuffisance cardiaque dès les premières semaines de vie des animaux pour les cas les plus précoces. Les objectifs du projet visent à caractériser aux niveaux moléculaires et cellulaires les conséquences de la mutation dans ce modèle murin. Cela permettra une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques à l’origine de la maladie et servira à la mise en place de nouvelles thérapies.
Bénéfices attendus
La cardiomyopathie dilatée humaine (CMD) est une maladie grave conduisant à l'insuffisance cardiaque et est la première cause de transplantation cardiaque. La prévalence de la CMD est estimée à environ 1 cas pour 2500-3000 personnes, estimation qui peut varier avec l'âge, le sexe, les facteurs environnementaux et la génétique des individus. Ce projet permettra d’avancer dans la compréhension des mécanismes conduisant à la cardiomyopathies dilatée associée à des mutations du gène d'intérêt et ainsi révéler d’éventuelles cibles thérapeutiques appartenant aux voies de régulation de la protéostasie.
Procédures
Selon la procédure: Certains animaux seront soumis à 1 à 4 échographies cardiaques d'une durée de 10 minutes chacune sous anesthésie gazeuse (âges 2 à 5 mois). Les animaux seront soumis à l’âge de 2 ou 3 mois à une injection (petit volume de solution) suivie de leur euthanasie après 4 heures. Certains animaux seront soumis à l’âge de 2 ou 3 mois à un jeûne de 2 fois 24h séparées par un accès libre pendant 2h à la nourriture (procédure de synchronisation du jeûne) puis à une injection (petit volume de solution) suivie de leur euthanasie après 4 heures. Certains animaux seront soumis à une contention et un gavage qui dure au maximum 10 secondes en 1 seule fois ; ou à une contention et l’injection suivies du massage de la zone d’injection qui dure au maximum 20 secondes en 1 seule fois. Les animaux sont génotypé après section instantanée de l'extrémité de la queue à l'age de 7 à 10 jours.
Impact sur les animaux
Les nuisances découlant des procédures sont, 1/ L'utilisation de lignées transgéniques qui nécessite l’identification génétique des animaux réalisée par un seul prélèvement à l’extrémité́ caudale ce qui peut être source de stress et d’une douleur de courte durée, 2/ Stress lié à la contention lors de la phase d’anesthésie gazeuse lors de l’échographie ainsi que les risques anesthésiques (stress thermique, détresse respiratoire, etc.) durant les échographies, 3/ Pour les animaux subissant une injection intrapéritonéale, nuisance liée à douleur et au stress de l’injection elle-même 4/ Pour tous les animaux devant être pesés manipulation par l’expérimentateur et contrainte spatiale de courte durée, et enfin 5/Les challenge métaboliques un stress et une douleur de courte durée en raison des administrations et des quelques prélèvements d’une goutte de sang ainsi que des effets physiologiques tels qu’une hypo- ou une hyperglycémie durant quelques heures 6/ une nuisance liée au gavage (irritation, stress de manipulation, risque de fausse-route) est possible. 7/ Les animaux utilisés peuvent avoir un phénotype entrainant une insuffisance cardiaque
Devenir
les procédures sont toutes suivies de l'euthanasie des animaux pour pouvoir collecter le tissus d'intérêt (ici le coeur et parfois les muscles des jambes).
Remplacement
Les maladies cardiaques d’origine génétique sont difficiles à modéliser dans des systèmes ex-vivo ou en culture cellulaire. Les cardiomyocytes sont des cellules qui n'existent pas en lignées. Nous disposons des procédures d'établissement de Cardiomyocytes issus d'iPS (des cellules pluripotentes capables de donner tous les types cellulaires de l'organisme in vitro) et utilisons également ce modèle. Cependant, ces cellules ne permettent pas de remplacer le recours aux animaux en particulier pour les analyses physiopathologiques nécessitant l’intégration des signaux neuro-humoraux et mécaniques comme pour les pathologies cardiaques.
Réduction
Les modèles cellulaires seront cependant utilisés quand cela sera adapté, pour valider les observations fonctionnelles, moléculaires et cellulaires du modèle murin et cela dans le but de limiter le recours à de plus nombreux animaux. Le nombre d’animaux requis est réduit en limitant la taille des groupes et en utilisant une approche statistique non-paramétrique (indiquée pour les petits effectifs) tout en maintenant une puissance statistique nécessaire. Dans le but de limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, les procédures ne seront réalisées que sur les souris mâles d’un seul génotype quand cela est adapté, qui présentent le phénotype d’insuffisance le plus précoce. Le phénotype des animaux issus d’un croisement de notre lignée, porteuse d’une mutation d'intérêt, avec une lignée porteuse d’une mutation pathologique d'un autre gène n’est pas connu. Ainsi une étude pilote sera effectuée sur quelques animaux afin de déterminer les conditions optimales de l’expérimentation en observant les phénotypes cardiaque et musculaire de la lignée hybride nouvelle ainsi qu’en fixant la variable d’âge d’observation et l’éventuelle atteinte du point limite de fonction cardiaque. 137 animaux seront utilisés au total dans ce projet.
Raffinement
Il s’agit de fournir aux animaux un environnement enrichi avec du coton et des caches en carton. Les animaux ne restent pas seuls dans les cages. Les cages sont nettoyées une fois par semaine. Les procédures proposées dans ce projet restent peu douloureuses et parcimonieuses (une seule injection /échocardiographies pour l’étude pilote uniquement). L’injection (solution saline ou chloroquine, insuline) est unique et réalisée par du personnel expérimenté et le jeûne est réalisé avec un accès constant à l’eau. Les animaux seront euthanasiés à la fin de chacune des procédures et les tissus collectés pour maximiser l’information analysable à partir de chaque animal inclus dans le protocole. La procédure d’échocardiographie est non invasive et le bien-être des animaux, en particulier en relation avec l’éventuelle dégradation de leur fonction cardiaque, sera surveillé. La procédure d’échographie permettant le suivi de la fonction cardiaque est indolore puisque réalisée sous anesthésie légère respiratoire et sur plaque chauffante pour éviter l’hypothermie. L’utilisation des contrôles identiques aux deux protocoles de stimulation sera choisie si les résultats du pilote indiquent cette possibilité. Les points limites entrainants l’arrêt de l’expérimentation sont précisés pour chaque procédure.
Choix des espèces
La souris a été choisie dans le cadre de ce projet puisqu’il s’agit de réaliser un croisement de lignées préexistantes pour produire un hybride de deux anomalies génétiques. Le recours à cette espèce est lié au fait que nous possédons déjà des informations sur des lignées développant une cardiomyopathie dilatée en relation avec l'atteinte génétique du gène d'intérêt, qui permettront des comparaisons, un approfondissement des connaissances et d'éventuelles généralisations sur les mécanismes de la pathogénèse. La génétique du modèle souris est bien connue ainsi que la maitrise des techniques de modification des gènes utilisé dans ce projet. Les procédures seront réalisées sur des animaux âgés de 2 mois à 5 mois. A ces âges, le phénotype pathologique est présent mais l’insuffisance cardiaque reste à un stade modéré, ce qui permettra la mise en place des différentes expériences sans souffrance animale anticipée.
Comparaison de plusieurs méthodes de préservation des greffons cardiaques après explantation chez un modèle porcin, avec ou sans pré-traitement à la colchicine.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Aucun porc n'est réveillé, le protocole exigeant le prélèvement du cœur. 42 porcs de trois mois vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie profonde, tués par l'injection d'une solution froide et riche en potassium qui ralentit puis arrête leur cœur, après ouverture du thorax. Le cœur prélevé est ensuite conservé soit au froid statique à 4 °C, soit sous machine de perfusion oxygénée, avec ou sans prétraitement à la colchicine, pour comparer les lésions inflammatoires de la microcirculation. Le porteur écrit qu'en dehors du stress de la prémédication aucune nuisance supplémentaire n'est prévue, et annonce que la technique pourra être utilisée en médecine humaine si la démonstration aboutit.
Objectifs
La transplantation cardiaque reste la méthode de référence du traitement de l’insuffisance cardiaque avancée mais souffre de pénurie de greffons. Les méthodes de conservation des greffons au moment de l’explantation sont primordiales pour éviter le développement de lésions inflammatoires au niveau de la microcirculation. En effet, ces lésions sont en partie responsables de la défaillance primaire du greffon cardiaque transplanté, responsable d’une mortalité non négligeable en clinique humaine. Dans le cadre de notre projet sur un modèle de gros animal, nous avons deux objectifs : 1) comparer plusieurs méthodes et montrer que la conservation du greffon cardiaque sous machine de perfusion oxygénée induit moins de phénomènes inflammatoires que le coeur explanté et conservé comme classiquement au froid statique à 4°C ; 2) confirmer que la colchicine, qui possède un effet cardioprotecteur après un évènement coronarien aigu, atténue ces lésions dans les deux modèles de conservation du greffon.
Bénéfices attendus
Pour soigner l'insuffisance cadiaque, les patients nécessitent de greffons préservés le plus longtemps et dans les meilleurs conditions possibles pour éviter des complications pouvant aller jusqu'à la mort. Grâce à ce projet, si nous démontrons d'une part que la préservation du greffon par machine de perfusion ex vivo donne de meilleurs résultats que la conservation froide statique sur les paramètres inflammatoires, et d'autre part que la qualité de préservation se maintient au moins 6 heures, dépassant largement les temps limités d'ischémie froide, alors cette technique pourra être utilisée en médecine humaine. De plus, si nous montrons que la colchicine a un effet protecteur sur les lésions avec les deux méthodes de conservation, alors elle sera un outil supplémentaire pour améliorer la qualité des transplantations.
Procédures
L'animal sera anesthésié profondément avant la réalisation de la chirurgie permettant l'accès au coeur et l'injection d'une solution de cardioplégie destinée à ralentir puis arrêter les battements cardiaques. Dès que le coeur sera arrêté, il sera prélevé et conditionné selon les techniques choisies.
Impact sur les animaux
Le protocole prévoit la mise à mort de l'animal par ralentissement puis arrêt cardiaque par l'injection d'une solution froide et riche en potassium (solution de cardioplégie) nécessitant l'ouverture du thorax. En dehors des contraintes liées à la préparation de l'animal (stress au moment de la prémédication), aucune nuisance supplémentaire n'est prévue puisqu'il s'agit d'une procédure sans réveil, au cours de laquelle la gestion de la douleur et de l'anesthésie seront rigoureusement surveillées.
Devenir
Aucun animal ne sera réveillé, le protocole nécessitant le prélèvement du coeur.
Remplacement
Il n'existe pas à ce jour de modèles alternatifs au modèle animal pour étudier le métabolisme myocardique en conditions physiologiques. Ce métabolisme ne peut actuellement pas être étudié par simulation numérique, ni à partir d'un modèle mathématique. De même, la perfusion d'organes ex vivo reposent sur l'utilisation d'un organe et non d'un tissu ou d'une culture cellulaire (pas d'alternative in silico ou in vitro) ; il est donc nécessaire dans notre approche d’utiliser un coeur prélevé sur un système vivant et battant. Par ailleurs, seul un modèle sur le gros animal permet d'extrapoler facilement les résultats à l'homme dont le système cardiovasculaire est proche sur le plan physiologique et métabolique.
Réduction
Le nombre d'animaux a été calculé afin de pouvoir réaliser les tests de comparaisons statistiques entre les groupes. Nous utiliserons des modèles d'analyse de la variance pour nos analyses statistiques. Au total 42 animaux seront utilisés pour cette étude afin de mettre en évidence une diminution significative entre les groupes. L'analyse statistique sera réalisée avec un logiciel spécialisé.
Raffinement
Une seule procédure expérimentale sans réveil est prévue dans ce protocole. Au delà des conditions règlementaires et habituelles d'hébergement et de respect du bien-être des animaux, la maîtrise des conditions de préparation et d'anesthésie des animaux évitera toute nuisance supplémentaire. La douleur au cours de la procédure sera contrôlée et prévenue par un morphinique avant l'ouverture du thorax. Par la suite, l'injection d'une solution visant à arrêter le coeur (cardioplégie) entraînera la mise à mort sans souffrance de l'animal.
Choix des espèces
Le porc présente une physiologie circulatoire proche de celle de l'Homme (fréquence et débit cardiaque identiques). La modélisation chirurgicale est facilitée par l'usage du gros animal. Cette convergence permet une adaptation optimale de l'espèce aux expérimentations et limitera au minimum le nombre d'animaux testés (moins d'échec technique). Les animaux sont choisis au terme du post-sevrage à l'âge de 3 mois, pour des raisons techniques d'une part (poids entre 35-40 kg) et pour des raisons de coût d'autre part. En effet, à ce stade de développement les diamètres de vaisseaux correspondent à ceux de l’humain et permettent donc de réaliser l'étude dans de bonnes conditions, et de prélèver des quantités suffisantes d'échantillons ex-vivo.
Projet pilote : Evaluation de régimes optimums pour le développement des comorbidités associées à un syndrome métabolique dans un modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
840 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune maintenue sept, huit, seize ou vingt-quatre semaines sous un régime enrichi en graisse, en cholestérol ou en fructose destiné à lui faire développer une obésité, une résistance à l'insuline, une stéatose du foie et une athérosclérose. Les femelles gestantes sont isolées cinq jours avant la mise bas et soumises au même régime, ce qui expose aussi les fœtus. Après une mise à jeun et deux tests métaboliques, les souris sont anesthésiées puis tuées pour le prélèvement de sang et d'organes. Ce projet pilote sert à choisir la lignée et le régime des études à venir, et le porteur annonce qu'il réduira le nombre d'animaux, sans qu'aucun calcul d'effectif ne soit donné pour ces 840 souris.
Objectifs
Ce projet est une étude pilote qui a pour objectifs de : 1) Déterminer le modèle murin génétiquement modifié le plus adapté dans le cadre de projets de recherche étudiant l’impact de l’altération du métabolisme des lipides dans les maladies cardio-métaboliques associées à l’obésité : athérosclérose, troubles du rythme cardiaque, maladies du foie non alcoolique (stéatose, stéatohépatite et fibrose hépatique), résistance à l’insuline et diabète. En effet, les souris non génétiquement modifiées soumises à un régime riche en graisse ou en cholestérol ne développent pas l’ensemble du spectre des maladies observées chez l’Homme de manière spontanée. Pour cela il est nécessaire d’utiliser des souris dont le métabolisme des lipoprotéines, les transporteurs circulants de lipides, a été modifié pour se rapprocher de celui trouvé chez l’Homme. Cette étude pilote a pour but de valider quelle serait la meilleure lignée à utiliser pour permettre de répondre aux questions scientifiques du projet. 2) Déterminer le régime optimum qui permettrait d’étudier les différents aspects des maladies cardio-métaboliques associées à l’obésité pour ces modèles. Ceci permettra de valider le choix de la lignée à utiliser, mais également de faciliter les échanges de données et donc de diminuer le nombre total d’animaux requis pour les différents aspects du projet..
Bénéfices attendus
Ce projet pilote permettra de sélectionner l’association régime/ génotype la plus adaptée pour répondre à différents objectifs scientifiques. Il permettra d’harmoniser les régimes et le modèle murin et de réduire le nombre d’animaux in fine. A plus long terme, le projet d’étude qui pourra être lancé permettra d’étudier les mécanismes associés à l’émergence de l’athérosclérose liés aux troubles métaboliques. De plus, ce projet permettra également de conforter l’hypothèse d’une programmation périnatale du développement de l’athérosclérose à l’âge adulte. L’ensemble de ces données permettra d’identifier et de stratifier des populations humaines potentiellement à risque et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Tous les animaux impliqués dans ce projet (cohorte adulte et cohorte « développement » avec femelles gestantes et allaitantes) seront mis sous un régime riche en graisse et ou en fructose, et ou en cholestérol pour des durées variables (7, 8, 16 ou 24 semaines). La cohorte de souris adulte sera soumise à un prélèvement faible de sang sous anesthésie (moins de 10 min) avant la mise sous régime riche. Après le régime riche en graisse, les souris seront mises à jeun et rapidement évaluées sur le plan métabolique (moins de 2 h), incluant un faible prélèvement de sang afin de mesurer le sucre dans le sang suite à une administration de glucose ou d’insuline. Les souris seront ensuite anesthésiées avant une euthanasie, afin de permettre les prélèvements de sang et d’organes nécessaires pour réaliser les analyses poussées requises pour ce projet.
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes de la cohorte « développement » seront en hébergement individuel pendant 5 jours avant la mise-bas afin de préparer leur nid et assurer une alimentation comparable de leurs souriceaux, ce qui diminuera leurs interactions sociales pendant cette période. Elles seront exposées à un régime riche en graisse plus ou moins cholestérol plus ou moins fructose, ce qui pourrait générer un inconfort pour elles et le développement des fœtus. A partir de 8 semaines, les souris de la cohorte adulte seront exposées à des régimes riches en graisse plus ou moins cholestérol et plus ou moins fructose ou saccharose pendant 8,16 ou 24 semaines afin d’induire une obésité et les désordres métaboliques associés : altération du métabolisme lipidique, insulino-résistance, etc. Ceci pourrait induire un inconfort. De plus, les souris seront soumises à deux tests d’évaluation du métabolisme qui inclus une mise à jeun et de très petits volumes de prélèvement de sang.
Devenir
Les souris impliquées dans les expériences seront euthanasiées à la fin de la période de maintien prévue et les tissus récupérés. L’euthanasie est en effet requise afin de réaliser les dosages moléculaires et anatomiques fins, sans induire plus d’inconforts aux animaux.
Remplacement
Le dialogue inter-organes (cœur-foie, foie-vaisseaux sanguins, foie-tissus adipeux …) impliqué dans les maladies cardio-métaboliques, et entre les différents types cellulaires (macrophages/hépatocytes ou adipocytes) au sein d’un organe, est particulièrement complexe et ne permet pas leurs études in vitro dans des cultures cellulaires ou organotypiques. Ainsi l’impact global d’un stress lipidique induit par un régime peut être différent en fonction du tissu ou des cellules observées. D’autre part, il faut prendre en considération le concept que l’altération d’une fonction cellulaire (par exemple des macrophages) dans un environnement tissulaire spécifique peut avoir un écho profond dans des tissus/organes plus distants. La réalisation du projet ne peut donc s’envisager qu’à l’échelle de l’organisme entier afin d’avoir une approche globale et intégrée des mécanismes impliqués.
Réduction
Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Les études bibliographiques préalables ont permis de réduire le nombre de lignées potentiellement intéressantes pour le projet à 2 lignées qui seront testées en séquentielle, la seconde n’étant produite qu’en cas d’échec avec la 1ère. De même, le choix préalable des régimes a pu être réduit au maximum afin d’induire les altérations cardio-métaboliques souhaitées tout en évitant les biais. La sensibilité à l’émergence des maladies métaboliques présente une différence sexuelle importante. Il convient donc de caractériser finement les animaux des deux sexes ainsi que les mécanismes impliqués, en accord avec les recommandations des sociétés savantes internationales et des comités éditoriaux des journaux scientifiques .
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Les animaux seront manipulés avec douceur, par du personnel formés et compétents, qui sera vigilant en cas de réaction comportementale excessive, ou de mal-être. Les animaux sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation. L’enrichissement des cages sera renforcé pour les femelles gestantes et allaitantes qui seront en hébergement individuel avec leurs petits, avec minimum de la frisure de papier kraft et un bâton à ronger.
Choix des espèces
L’objectif de ce projet est de valider les conditions nutritionnelles qui permettent de programmer le développement d’une athérosclérose suite à une exposition périnatale. L’étude chez l’adulte permettra de d’associer le développement de maladies cardiovasculaires au régime alimentaire périnatale, mais sans éliminer l’impact du vieillissement. L’étude chez les souriceaux âgés de 10 jours quand ceux-ci sont strictement nourris au lait maternel permettra d’estimer si ce lien existe dès ce stade précoce, et ainsi de valider l’hypothèse d’une transmission maternelle. Ceci a également une importance pour la santé humaine car des hausses sensibles de la pression artérielle ont été observées chez des pré-adolescents avec un historique fœtal (retard de croissance, prématurité).
Etude de différentes molécules et stratégies de traitement sur des modèles d’insuffisance cardiaque chez le rongeur
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rats : 3600
Soumis à une chirurgie cardiaque de vingt à cinquante minutes, ou à seize semaines de nourriture riche en graisse et d'eau sucrée, 3 600 souris et 3 600 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, tous tués à l'issue pour le prélèvement de leurs organes. Après l'induction de l'insuffisance cardiaque viennent jusqu'à dix séances d'imagerie sous anesthésie, un prélèvement sanguin par semaine pendant seize semaines, des administrations quotidiennes pendant douze semaines, la pose de micropompes et une prise de pression sans réveil. Le porteur annonce des arrêts cardiaques possibles pendant les chirurgies, un risque de péritonite après les injections répétées dans l'abdomen et une irritation de l'œsophage après les administrations orales répétées. Le choix des espèces tient à leur commodité, la souris pour l'homogénéité des résultats et la fiabilité de la transgénèse, le rat parce que son épicarde se réactive et fournit une quantité de cellules jugée pertinente.
Objectifs
L’insuffisance cardiaque (IC) reste à l’heure actuelle l’une des causes principales d’atteinte de la fonction cardiaque et représente une problématique de santé publique majeure. En effet, l’IC touche environ 64.3 millions de personnes dans le monde et sa prévalence est amenée à augmenter dans les années à venir. Malgré l’amélioration de la prise en charge clinique, la mortalité à 5 ans reste élevée (environ 50pourcents). L’IC se caractérise par la mise en place progressive d’un panel de phénomènes cellulaires et moléculaires altérant la fonction et la structure du cœur. L’IC peut trouver sa source d’une multitude de contextes pathologiques tels que l’infarctus du myocarde (obstruction de l’irrigation coronarienne, provoquant une ischémie du myocarde), l’hypertension artérielle ou de maladies métaboliques (obésité et diabète par exemple). L’ensemble de ces pathologies associées sont-elles aussi en progression dans la population, avec pour exemple la prévalence de l’obésité et du diabète de type II, qui atteindra plus d’1.5 milliard de personnes en 2025. Dans ce contexte, il est alors nécessaire d’accélérer la recherche autour de l’identification du potentiel thérapeutique de candidats médicaments. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les effets protecteurs de divers composés pharmacologiques et stratégies thérapeutiques associées sur la mise en place de modèles précliniques d’IC chez la souris et le rat, mimant les formes observées chez l’Homme dans un contexte d’infarctus du myocarde, d’hypertension artérielle et de maladies métaboliques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’impact de différentes stratégies thérapeutiques avec des candidats médicaments sur la mise en place de diverses formes d’insuffisance cardiaque et de leurs conséquences structuro-fonctionnelles sur le cœur. L’issue de ce projet sera donc l’identification précliniques de nouveaux actifs thérapeutiques.
Procédures
Les animaux pourront être soumis aux interventions suivantes : -chirurgie cardiaque sur animal anesthésié et analgésié (1xanimal, durée : 20 à 50minutes) OU alimentation riche en gras ou eau glucosée via eau de boisson sur animal vigil (au maximum : en continu pendant 16 semaines). Après l'induction des modèles par les techniques précédemment listées, tous les animaux peuvent être soumis aux explorations suivantes : -administration de traitement par différentes voies (orale, intrapéritonéale) sur animal vigil (au maximum : 1xjour pendant 12 semaines, durée : 1minute) OU administration de traitement par voie intraveineuse sur animal anesthésié (1xanimal, durée : 1minute) OU -microchirurgie pour installation de micropompes sous anesthésie et analgésie (1xanimal, durée : 5minutes) -imagerie du coeur sur animal anesthésié (au maximum : 10xanimal, durée 20minutes) -challenge métabolique qui nécessite une administration par voie orale, une injection intrapéritonéale puis des prélèvements sanguins de faible volume sur animal vigil (au maximum : 1xmois pendant 4 mois, durée : 2h) -prélèvements sanguins sur animal vigil (au maximum : 1xsemaine pendant 16 semaines, durée : 1minute) -test d'effort cardiaque par une injection en intraveineuse et un suivi par imagerie du coeur sur animal anesthésié (1xanimal, durée : 20minutes) -prise de pression sur animal analgésié et anesthésié (1x animal, durée : 10minutes, sans réveil).
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés peuvent présenter un phénotype dommageable : ces phénotypes peuvent être associés à un diabète de type II, une obésite, de la stéatose hépatique et de l'hypertension systémique conduisant à des problèmes cardiovasculaires. Les régimes alimentaires spéciaux pourront entraîner une prise de poids pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. Les chirurgies peuvent induire des difficultés post-opératoire comme des douleurs, une mauvaise cicatrisation mais aussi des arrêts cardiaques. Les anesthésies pourront engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardiorespiratoire. Les injections pourront induire un stress et une douleur de courte durée aux animaux. Les injections répétées en intrapéritonéales peuvent induire un risque de péritonite. Les administrations répétées par voie per os peuvent induire une irritation de l'oesophage. Les injections intraveineuses pourront induire une irritation à la zone d'injection. Les challenges métaboliques induisent un stress et une douleur de courte durée en raison des administrations et des quelques prélèvements d’une goutte de sang ainsi que des effets physiologiques tels qu’une hypo- ou une hyperglycémie durant quelques heures. Les prélèvements sanguins pourront induire une douleur de courte durée aux animaux ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie.
Devenir
Afin de compléter toutes les données scientifiques récoltées lors de ce projet, des analyses devront être réalisées sur les organes prélevés. C'est pourquoi tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure.
Remplacement
Le but du projet est d'étudier différentes molécules et stratégies de traitement sur des modèles d’insuffisance cardiaque. Ce projet doit être réalisé à l'échelle de l'organisme, il est donc nécessaire d'utiliser des modèles expérimentaux proches de la pathologie ciblée. les modèles rats et souris présentés dans ce projet, permettent de reproduire des insuffisances cardiaques dans les différentes conditions retrouvées en santé humaine. C'est pourquoi les modèles rongeurs sont pertinents pour ce projet et ne peuvent pas être remplacés.
Réduction
7200 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Les molécules qui seront inclues dans ce projet auront déjà été testées in silico (simulation par ordinateur) et in vitro (milieu artificiel : test en tube à essai ou plaque de culture) afin de tester leur efficacité, la concentration optimale et leur toxicité dans ces modèles. Ces tests en amont, permettent de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress en apportant des soins adaptés. Tout sera mis en oeuvre pour limiter au maximum les nuisances. Pour les injections, les volumes injectés seront réduits au minimum. Quand l'acte technique le nécessite, les animaux seront sous anesthésie. Les chirurgies sont réalisées par des spécialistes sous anesthésie et analgésie pour garantir le bien être des animaux. L'analgésie est poursuivie en post-opératoire et des croquettes humidifiées seront disposées au fond de la cage pendant 1 semaine. Les animaux sont manipulés par du personnel formé et compétent dans des pièces dédiées à chaque type d'intervention. La surveillance attentive quotidienne sera accompagnée de points limites définis.
Choix des espèces
La souris est l’animal le plus approprié ce projet. La souris permet de garantir l’homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications cardiaques dans un espace de temps raisonnable. De plus, la souris est l'espèce pour laquelle la technologie de transgénèse est la plus fiable et la mieux établie ce permet d'avoir des modèles fiables. Le rat est utilisé dans le projet de l'insuffisance cardiaque, il a été montré dans des études antérieures que l'épicarde se réactive dans ce modèle fournissant une quantité de cellules pertinente. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte. A partir de 7 semaines chez le rat et de 8 semaines chez la souris et jusqu'à 6 mois maximum. Ces âges permettent de pouvoir réaliser les chirurgies sur les animaux ou d'avoir le phénotype en place.
Etude des effets protecteurs de peptides mimétiques dans un modèle d’accident vasculaire cérébral (AVC) chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
64 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune subissant deux anesthésies successives pour poser puis retirer un monofilament dans une artère cérébrale, puis vingt heures de surveillance seule en cage. L'occlusion provoque un accident vasculaire cérébral, et le porteur liste un déficit locomoteur avec rotation, un risque modéré d'hémorragie, une hypothermie, des difficultés à s'alimenter et un fort risque de mortalité lié à la double anesthésie. Toutes sont tuées par perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde, pour des marquages immunohistochimiques. Les deux peptides testés sont déjà en cours de validation clinique chez des patients hypertriglycéridémiques, et le porteur qualifie pourtant les tests chez la souris d'étape "indispensable" au développement préclinique.
Objectifs
L’objectif du projet est de tester les effets protecteurs de deux peptides mimétiques (D6PV et 5ASM) dans un modèle d’accident vasculaire cérébral (AVC) chez la souris. Par rapport aux protéines dont ils sont issus, les peptides mimétiques présentent l’avantage d’être facilement synthétisables et de contenir des modifications chimiques au niveau de leurs acides aminés qui les rendent non-immunogènes. Les peptides D6PV et 5ASM correspondent à des fragments d’apolipoprotéines humaines et présentent des propriétés hypolipémiantes, antidiabétiques, anti-inflammatoires, et vasculo-protectrices in vitro et in vivo. Leurs effets potentiellement protecteurs dans le cadre des complications vasculaires cérébrales n’est pas connu. Nous voulons montrer que ces deux peptides réduisent la taille et les complications hémorrhagiques d’un AVC in vivo. Leurs effets potentiellement protecteurs dans le cadre des complications vasculaires cérébrales n’est pas connu.
Bénéfices attendus
Les peptides que nous allons tester ici sont actuellement en cours de validation clinique pour traiter des patients hypertriglycéridémiques. Ces études ont aussi montré que ces peptides ont en outre des propriétés antiathérothrombotiques et vasculo-protectrices au niveau du muscle cardiaque suite à un infarctus provoqué chez la souris. Notre projet vise à établir que ces peptides seront également bénéfiques pour le traitement de l’AVC ischémique. Si, comme nous l’espérons, les résultats de l’étude que nous proposons sont positifs, ces deux peptides pourront être positionnés comme candidats médicaments pour prévenir la sévérité et les complications d’un AVC ischémique chez l’homme. Les tests in vivo que nous projetons de faire sont ainsi une étape indispensable au développement pré clinique de ces deux peptides.
Procédures
Un prélèvement sanguin par ponction caudale (100μL max, durée 1min). Insertion du monofilament et retrait sous anesthésie (2 x 10min). Perfusion intracardiaque au paraphormaldéhyde (4%) à la fin du projet.
Impact sur les animaux
Un prélèvement sanguin par ponction caudale (100μL max): risque d’hématome et stress chez l’animal. Double Anesthésie : fort risque de mortalité. Conservation du monofilament : Déficit locomoteur (rotation) Isolement des animaux : peut générer un stress chez l’animal. Chirurgie vasculaire : risque modéré d’hémorragie. Hypothermie. Difficulté à s’alimenter post AVC.
Devenir
La totalité des animaux du projet (n=64 ; 4 groupes de souris) sera gardée en vie pour la perfusion. A la fin du projet, les tissus de la totalité des animaux (n=64 ; 4groupes de souris) seront récupérés pour des marquages immunohistochimiques.
Remplacement
Il n’existe pas aujourd’hui de modèle in-vitro qui reflète la complexité cellulaire du cerveau. Cependant dans un souci de remplacement, nous réaliserons toutes les expériences portant sur l’étude des mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels ces peptides protègent la barrière hémato-encéphalique sur des cellules endothéliales cérébro-vasculaires en culture (test in -vitro). L’utilisation de souris est cependant absolument nécessaire pour prendre en compte le contexte physiopathologique d’un AVC ischémique. Le modèle MCAO est en place au laboratoire
Réduction
Des études antérieures conduites au laboratoire ont déjà permis d'établir la durée de l’ischémie. Les expérimentateurs locaux ont de plus l’expertise des procédures chirurgicales. Nous avons également réalisé une analyse de puissance, nous indiquant que la taille minimale du groupe d'individus pour obtenir une puissance statistique d'au moins 0.8, avec un alpha de 0.05 est de 16 souris par groupe x 4 groupes soit 64 souris au total. Ces deux paramètres permettent la réduction au minimum du nombre d’animaux requis.
Raffinement
La phase d’induction de l’anesthésie est réalisée sous isoflurane, ainsi qu’une injection de buprénorphine La phase de maintien de l’anesthésie sera réalisée sous isoflurane. Lors de la ponction caudale une pression sera réalisée afin d’éviter le risque d’hématome. L’injection des peptides au moment de la reperfusion permet d’apporter un raffinement au protocole expérimental en diminuant le nombre des gestes interventionnels. Chaque animal sera observé en continu au cours de la procédure et pendant l’heure qui suit la chirurgie, en particulier son comportement, son activité et sa posture (s’il est prostré), son pelage (s’il est hérissé, s’il y a une perte de poils), sa respiration (si le rythme est rapide ou saccadé), et les mouvements qu’il effectue, pour détecter tout signe de souffrance. En cas de tels signes, nous augmenterons la dose d’analgésique buprénorphine. Si cela ne suffit pas et qu’une souris est en décubitus latéral avec une détresse respiratoire, elle sera euthanasiée par dislocation cervicale. Durant la phase de surveillance de 20 heures, chaque animal sera isolé dans une cage propre contenant les éléments d’enrichissement afin d’éviter toute blessure. Il bénéficiera d’une lampe chauffante pour maintenir sa température, ainsi qu’un accès facilité à la nourriture (directement dans la cage) et à l’eau (biberon avec bec allongé). L’environnement sera enrichi afin de limiter le stress et l’anxiété des animaux (abris en polycarbonate de couleur rouge leur offrant un abri obscur et permettant leur surveillance, croquettes d'alimentation préalablement hydratées afin de faciliter leur assimilation).
Choix des espèces
La souris représente une espèce validée dans ces modèles d’ischémie cérébrale, permettant de plus l’évaluation standardisée de l’étendue et de la sévérité de l’AVC. Il existe aussi une similarité du réseau vasculaire cérébral avec l’anatomie humaine (polygone de Willis). De plus, l’utilisation de souris du même âge, sur fond génétique C57BL/6 permet de limiter au minimum les variations inter-individuelles et de réduire la variabilité des résultats et donc le nombre d’animaux à utiliser. Les souris sont de plus idéales pour cette étude, car l’ensemble des procédures proposées (MCAO) a été établi dans ce modèle animal. Les souris seront utilisées à un âge compris entre 8 et 12 semaines, un âge correspondant au stade adulte pour un poids de 25g en moyenne. La taille du monofilament est calibrée pour réaliser le MCAO sur des souris de cette taille.
Etude des désordres biochimiques vasculaires lors d’une Hypertension Pulmonaire induite par les maladies Métaboliques dans un modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
3 570 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 120 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune passant jusqu'à cinq jours consécutifs en tube de contention pour la mesure de sa tension artérielle. L'équipe leur injecte du tamoxifène cinq jours d'affilée, puis les met sous régime gras pendant six semaines à quatre mois, avec jusqu'à quatre jeûnes de quinze heures et des tests de réponse au glucose. Certaines subissent un infarctus provoqué par chirurgie, d'autres un cathétérisme du ventricule droit sous anesthésie en acte final. Le porteur signale que le tamoxifène peut provoquer une inflammation chronique du péritoine, que l'hypertension pulmonaire induite peut aller jusqu'à l'arrêt cardio-respiratoire, et qu'au-delà des poumons, cible du projet, le mésentère et le rein seront prélevés pour une étude annexe.
Objectifs
L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie rare et très grave qui entraine une insuffisance cardiaque droite nécessitant à terme une transplantation cœur-poumon. Cette pathologie est caractérisée en particulier par une multiplication des cellules formant la paroi des vaisseaux (cellules endothéliales et cellules musculaires lisses vasculaires) ce qui diminue leur lumière et participe à l’hypertension pulmonaire. Les mécanismes impliqués dans ce remodelage artériel ne sont pas élucidés. Des études récentes montrent une forte corrélation entre le déclenchement, la gravité de l'HTAP et les troubles métaboliques. Nous nous proposons de décrypter ces mécanismes par l'étude chronologique de l'installation de l'HTAP en utilisant un modèle murin de syndrome métabolique par l'utilisation d'un régime alimentaire gras.
Bénéfices attendus
Nous espérons apporter par cette étude une compréhension fine des mécanismes physiologiques et cellulaires, non seulement du développement de l'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) non familiale, mais en plus des effets locaux lié à l'obésité et au syndrome métabolique sur les vaisseaux sanguins pulmonaires. Et cela tant au niveau physiologique que cellulaire et moléculaire. En outre nous pensons aussi développer sur le plan de la biologie fondamentale, les connaissances sur le fonctionnement et les voies de signalisation des cellules progénitrices (cellules qui ont la capacité de se transformer en différents types de cellules spécialisées). Les nouvelles voies paracrines trouvées pourront à terme être des cibles pharmacologiques pour stopper le développement de l'HTAP afin d'augmenter le pronostic des patients et leur qualité de vie.
Procédures
Certaines souris recevront 1 injection par jour de tamoxifene pendant 5 jours puis 2 semaines après seront mises sous régime normal ou riche en graisse pour 0.5 à 4 mois. Une partie de ces souris seront mises à jeun 15h pour des tests de réponse au glucose et à l’insuline 4 fois maximum et toujours à au moins une semaine d’intervalle. Après le jeûne, elles seront prélevées en vigiles d'une faible quantité de sang sur 2h. Des prises de tension artérielles systémiques (10 min/souris) seront effectuées sur ces souris vigiles (les souris sont dans un tube de contention et la pression est mesurée à la queue à l'aide d'un bracelet similaire à ceux utilisés chez l'Homme), 5 jours consécutifs 1 à 2 fois durant la procédure avec 1 mois d’intervalle. Ces souris subiront une échocardiographie sous anesthésie légère pendant environ 15 min puis 3 jours plus tard une prise de pression dans le ventricule droit sous anesthésie en procédure finale. Certaines souris subiront un infarctus induit par chirurgie d'une durée de 20minutes sous anesthésie et analgésie (pré et post opératoire) puis une échocardiographie après deux semaines sous anesthésie légère. Certaines recevront une injection supplémentaire 3 jours avant l’euthanasie (animal vigil) puis un dernier prélèvement de sang sous anesthésie juste avant l'euthanasie.
Impact sur les animaux
L'injection intrapéritonéale de tamoxifene peut provoquer une inflammation xanthogranulomateuse péritonéale chronique et des dépôts, du côté du diaphragme ou du péritoine, aigus ou chroniques. L'hypertension pulmonaire induite par le régime gras pourrait être sévère induisant dans de rare cas un arrêt cadio-respiratoire. Un stress (peur ou détresse) des animaux est possible lors de l’acclimatation à la prise de pression systémique vigile. L’anesthésie peut induire des effets tels que l’hypothermie, des difficultés respiratoires ou dans les cas les plus critiques un arrêt cardio-respiratoire. La chirurgie peut conduire à des risques anesthésiques (détresse respiratoire, hypothermie, arrêt cardio-respiratoire) mais aussi être source d'hémorragie ou de douleurs post-opératoires ou encore à un risque infectieux.Les procédures d’injection peuvent potentiellement conduire à des infections. L'obésité peut conduire à des difficultés de déplacement, un changement cutané et du pelage mais également à une hypertension ou un diabète. L'insuffisance cardiaque engendre des difficultés de déplacement et d'alimentation les 1ers jours et des arrêts cardiaques. La mise à jeun des animaux peut induire une sensation de faim.
Devenir
La totalité des animaux seront euthanasiés à la fin des actes pour réalisation des prélèvements et analyses.
Remplacement
L'objectif du projet est de mettre en évidence les effets d'un régime gras et de l'obésité sur le développement et l'installation d'une hypertension pulmonaire. Nous étudions les effets du métabolisme systémique sur le remodelage des vaisseaux du poumon. Pour cela, il est nécessaire de conserver l’ensemble des phénomènes intervenants dans la régulation des vaisseaux pulmonaires : inflammatoires (interactions cellules immunes et cellules vasculaires), vasculaires (interactions des cellules vasculaires entre elles), cardiaques (retentissement éventuel d’altérations de la fonction cardiaque gauche), respiratoires (hypoxie locale) et éventuellement nerveux. Cela ne peut être réalisé que par une étude sur organisme entier, nous avons donc choisi un modèle de souris, pour leurs susceptibilités au syndromes métaboliques et du fait de l’existence des lignée transgéniques d’intérêt. Si nous caractérisons les voies biochimiques, leurs mécanismes seront prioritairement étudiés ou sur lignée ou sur cellules différenciées dérivées de cellules souches pluripotentes induites.
Réduction
Au total, 3570 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Bien que ce projet ait pour objet la circulation pulmonaire, la tension artérielle systémique sera mesurée dans tous les groupes et a tous les temps et d'autres organes seront prélevés, comme le mésentère et le rein, pour une étude ancillaire sur le remodelage vasculaire systémique.
Raffinement
Les animaux seront stabulés avec leurs congénères (2 à 6/cage), par fratrie pour les mâles, avec du matériel d'enrichissement : lanières de papier, morceau de bois, maison en carton. Ils seront observés quotidiennement par du personnel compétent et informé des paramètres à contrôler et de façon hebdomadaire par les membres de l’équipe de recherche. Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec eau et nourriture ad libitum. La température et l’hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). La profondeur de l'anesthésie sera vérifiée en testant l'absence de réflexe de retrait de la patte (après pincement). La douleur sera soulagée par l’administration d’analgésique systémique en péri-opératoire et à 12, 24, 36 et 48 h en post-opératoire et pourra être renouvelée en cas de souffrance de l’animal. Les infections éventuelles seront traitées localement par application de crème antibiotique. Après chirurgie cardiaque, La 1ère semaine, les animaux seront nourris avec de la bouillie et l'apport d'eau sera facilité. Des points limites suffisament prédictif ont été définis et seront quotidiennement évalués.
Choix des espèces
Les souris (Mus Musculus) sont un modèle classique à la fois pour l'étude des désordres métaboliques et pour l'étude du développement de l'hypertension artérielle pulmonaire. De plus la lignée nécessaire pour la deuxième procédure n'existe pas dans d'autres espèces animales, à notre connaissance. Les souris seront mises au régime spécial à l’âge de 8-12 semaines, soit le début de l’âge adulte, l'étude ne portant ni sur le développement, ni sur la senescence.
Vectorisation d’acides ribonucléiques circulaires à visée thérapeutique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
370 souris, en grande majorité des femelles de 5 semaines, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue de chaque procédure pour prélever des échantillons. Sous anesthésie générale, elles subissent une chirurgie de 20 minutes dont la nature n'est pas précisée, trois injections dans le derme et une lymphographie, et le porteur indique que les chirurgies et le développement d'un lymphœdème entraîneront des "douleurs modérées". L'équipe teste une nouvelle génération de vecteurs à ARN circulaire, censés prolonger la production de facteurs de croissance lymphatique, contre le lymphœdème qui peut suivre la chirurgie du cancer du sein. Elle a choisi la souris pour rester comparable à ses études précédentes, une autre espèce faisant selon elle "perdre tout le bénéfice des données précédemment obtenues".
Objectifs
Le système lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener à la circulation sanguine au niveau de la veine sous-clavière. Il est impliqué́ dans le transport des graisses et des macromolécules et joue un rôle important dans l’immunité en transportant les cellules de l’inflammation. Le réseau lymphatique est également impliqué dans de nombreuses pathologies telles que le lymphœdème, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde et dans la dissémination métastasique. Le lymphoedème est le résultat d’une obstruction ou d’une perturbation du système lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphœdème est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient après la chirurgie du cancer, cependant aucune thérapie visant la régulation du dysfonctionnement de ce réseau lymphatique n’est proposée. Lors d’une étude récente menée au laboratoire , notre équipe a montré que l’utilisation de lentivecteurs à acides ribonucléiques permettant la production de facteurs lymphangiogéniques permettait d’améliorer la résolution du lymphoedème sur une durée courte. Dans cette étude, nous nous appuierons sur les résultats déjà obtenus par notre équipe et testerons l’efficacité d’une nouvelle génération de vecteurs à acides ribonucléiques développés au laboratoire. Ces nouveaux vecteurs produiront les mêmes facteurs lymphangiogéniques mais basés sur une nouvelle technologie qui permet de produire des lentivecteurs contenant des acides ribonucléiques thérapeutiques circulaires. La particularité des acides ribonucléiques circulaires est d’être beaucoup plus stable que les acides ribonucléiques linéaires utilisés dans nos études précédantes et devraient ainsi permettre une expression prolongée des molécules thérapeutiques. Le bénéfice attendu sera une meilleure efficacité et un effet renforcé par rapport aux résultats obtenus précédemment.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’évaluer l’utilisation de lentivecteurs à acides ribonucléiques circulaires pour la première fois in-vivo et de faire la preuve du concept de leur utilisation. Les données obtenues au cours de ce projet et comparées à celles obtenues dans nos études précédantes visent à démontrer que cette nouvelle génération de vecteurs possède un avantage thérapeutique en permettant une expression prolongée du vecteur et des molécules thérapeutiques produites.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie sous anestésie générale d'une durée d'envion 20 minutes, 3 injections intradermiques lors d'une même anesthésie générale soit une durée d'envion 5 minutes, Une observation du systéme lymphatique par lymphographie sous anesthésie générale pendant environ 20 minutes.
Impact sur les animaux
Les chirurgies ainsi que le développement de lymphœdème vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.
Devenir
Les animaux seront euthanasiée à l'issue de chaque procédure afin de collecter les échantillons nécessaires à l'étude.
Remplacement
Les données relatives à l’expression du vecteur ont été évaluées in-vitro (culture de cellules) mais ne sont pas suffisantes pour évaluer le niveau d’expression et la durée d’expression dans un contexte intégré in-vivo (implication de la réponse immunitaire en particulier). Par ailleurs, Le développement du lymphœdème fait intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche intégrée permettant de comprendre les interactions complexes entre le vecteur et l’hôte (souris). Par ailleurs l’approche in-vivo seule permet d’évaluer le bénéfice thérapeutique des molécules exprimées dans le cadre du lymphoedème et la restauration de la fonction endothéliale lymphatique. Le lymphœdème fait intervenir de nombreux acteurs cellulaires (cellule endothéliale lymphatique, inflammation, tissu adipeux…) ; il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permette de répondre aux questions adressées par ce projet.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre de l’étude et du traitement du lymphœdème après cancer du sein. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement.
Raffinement
Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris afin de pouvoir obtenir des résultats comparables et à mettre en perspective par rapport à ceux obtenus dans nos études précédentes dans lequel le même modèle de souris a été utilisé. L’utilisation d’une autre espèce ferait perdre tout le bénéfice des données précédemment obtenues et ne permettrait pas d’évaluer le bénéfice attendu produit par les nouveaux vecteurs à ARN circulaires Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 12 semaines.
Approche thérapeutique de l’atteinte cardiaque d’un modèle murin de cardiomyopathie
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Pour tester deux molécules censées prévenir les troubles du rythme cardiaque, 288 souris porteuses d'une mutation provoquant une cardiomyopathie dilatée vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit sept gavages, douze échocardiographies sous anesthésie, six électrocardiogrammes sur animal vigile et trois prises de sang, entre l'âge de 28 jours et 7 mois. Le porteur décrit un phénotype qui débute à 4 mois par une cardiomyopathie légère, évolue vers l'insuffisance cardiaque à 7 mois et s'accompagne d'une cyphose et d'une perte de poids d'environ 20 %. Aucun point limite intermédiaire n'interrompt cette évolution, les souris étant mises à mort systématiquement à 7 mois pour prélever leurs organes.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de décès dans le monde avec près de 18 millions de morts chaque année et constituent des facteurs de comorbidité pour de nombreuses autres maladies. Malgré l’amélioration des méthodes de diagnostic, de la prise en charge des personnes et de la prévention sur les facteurs de risques tels que la consommation de tabac, les maladies cardiovasculaires restent un groupe d’affections fortement mortelles. Parmi les maladies cardiovasculaires, les cardiomyopathies sont des atteintes du muscle cardiaque qui causent des dysfonctionnements électriques et/ou mécaniques. Parmi les maladies cardiovasculaires, la cardiomyopathie dilatée se caractérise par une augmentation de la masse du coeur, une dilatation des ventricules et une augmentation de la fibrose interstitielle. Avec une incidence estimée supérieure à 1 pour 2500 individus, les principales causes de mortalité de la cardiomyopathie dilatée sont l’insuffisance cardiaque (70 pour cent) et les arythmies cardiaques (30 pour cent). Le but de ce projet est de tester un traitement pharmacologique préventif des arythmies cardiaques. L'inhibition d’une enzyme impliquée dans développement du cœur, prévient la cardiomyopathie dilatée. Bien que ce traitement ait un effet bénéfique sur le remodelage cardiaque, son impact sur les arythmies et les défauts de conduction reste à étudier. Nous supposons qu'un traitement avec un inhibiteur de lenzyme d'interet agirait à la fois sur les défauts de conductions directs et sur ceux induits par la fibrose. Nous proposons dans ce projet de traiter un modèle murin de cardiomyopathie dilaté avec deux molécules inhibitrices de l'enzyme concernée et d’en étudier l’impact, sur la fonction cardiaque, remodelage et activité électrique, in-vivo. Nous étudierons aussi l’impact du traitement sur les voies de signalisations moléculaires et cellulaires qui participent à l’apparition des défauts de conductions et des arythmies associés la cardiomyopathie dilatée.
Bénéfices attendus
Les données générées par ce projet collaboratif contribueront à une meilleure compréhension de la pathogenèse de la cardiomyopathie dilatée. Ces résultats seront utilisés comme une preuve de principe qui permettra de proposer un essai clinique pour les jeunes patients. Étant donné que la cardiomyopathie dilatée partage de nombreuses caractéristiques communes avec d'autres cardiomyopathies à l'éthologie différente, nos résultats ouvriront des perspectives thérapeutiques pharmacologiques pour traiter celles ci.
Procédures
Les animaux subiront 6 interventions différentes. 1. Un gavage sur une période de 3 semaines. Les molécules thérapeutiques sont diluées dans l’eau de boisson. Elles sont bien tolérées par l’organisme et n’entrainent pas d’effets indésirables à la concentration fixée dans ce protocole. Les animaux seront traités 7 fois, de 28 jours à 49 jours d'âge. Chaque intervention dure une trentaine de seconde. 2. Une échocardiographie sous anesthésie gazeuse. Les animaux seront suivis tous les 15 jours à partir de 2 mois jusqu’a 7 mois, soit un total de 12 échocardiographies par animal. Chaque intervention dure entre 5 et 10 minutes. 3. Un électrocardiogramme sur animaux vigiles. Chaque animal sera évalué de 2 mois à 7 mois tous les mois, soit un total de 6 électrocardiogrammes par animal. Chaque intervention dure entre 2 et 4 minutes. 4. Un électrocardiogramme sous anesthésie gazeuse. L’intervention est réalisée une fois et dure 10 minutes. 5. Un prélèvement sanguin. Les animaux seront prélevés trois fois à un moi d’intervalle. L’intervention dure environ 2 minutes. 6. Une chirurgie sous anesthésie. 50 pourcent des animaux subiront une fois cette chirurgie, soit un prélèvement d’organe sous anesthésie et analgésie. 50 pourcent des animaux subiront une fois ce prélèvement.
Impact sur les animaux
Le phénotype dommageable des souris débute à 4 mois avec l’apparition progressive d’une cardiomyopathie dilatée d’abord légère et qui évolue vers 7 mois en insuffisance cardiaque. Cette progression de l’atteinte cardiaque est corrélée à une atteinte progressive et moins sévère des muscles squelettique de type oxydatif, l’apparition d’une cyphose légère et une perte de poids d’environ 20 pour cent par rapport au poids de l’animale à 4 mois (environ 20g). Ce phénotype réduit l’espérance de vie des animaux. L’ensemble des procédures liées à ce projet peuvent générées un stress lié à la manipulation de l’animal. De plus certaines de ces procédures peuvent engendrées de légères irritations, des lésions et des hémorragies avec risque d’infection. Les procédures avec anesthésie comportent un risque de stress thermique (refroidissement de la température de l’animal) et dans de rares cas de détresse respiratoire. La chirurgie peut induire une douleur et des risques d'infection.
Devenir
Tous les animaux (n = 288) seront euthanasiés pour prélèvement d’organe à 7 mois. Le prélèvement d'organe est indispensable pour étudier les mécanismes moléculaires mis en jeu au cours de l'expérimentation.
Remplacement
Les études précliniques nécessitent une validation sur des modèles animaux qui ne peut pas être remplacée par des modèles cellulaires. De plus, les cardiomyocytes (cellules cardiaques) adultes ayant atteint un état de différenciation terminale ne se divise pas. Il est par conséquent impossible d’en dériver une lignée cellulaire stable. Bien qu’il existe des lignées cellulaires, celles ci ne récapitulent la physiologie d’un cœur que partiellement. Elles seront toutefois utilisées pour tester certaine de nos hypothèses qui ne nécessitent pas de modèle animal. D'autre part, aucun modèle cellulaire ne reproduit les conditions physiologiques spécifiques du cardiomyocyte, ni récapitule dans son ensemble les caractéristiques d’un cœur entier dans son environnement physiologique.
Réduction
Dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous utiliserons les contrôles les mieux adaptés. Nous utiliserons les données acquises sur tous les animaux : mâles et femelles, commerciaux et atteints de cardiomyopathie dilatée. Les fonds génétiques des animaux commerciaux et transgéniques sont identiques. La lignée développant la cardiomyopathie dilatée produisant exclusivement des animaux homozygotes mutés, les animaux commerciaux seront achetés auprès d’un fournisseur agréé. Pour n’utiliser que le nombre d’animaux nécessaire à ce projet (288), nous avons recourt au service d’un biostatisticien pour nous épauler dans l’élaboration de notre plan expérimental.
Raffinement
Les animaux seront observés tous les jours par les membres qualifiés de l'animalerie et tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne responsable du projet. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, 6 par cage maximum. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire au maximum toute douleur, souffrance ou angoisse que pourraient subir les animaux: enrichissement du milieu (lanières de papier Kraft, maisons en carton), acclimatation d'une semaine avant toute manipulation, hébergement en groupe, formation technique des utilisateurs. Afin de diminuer la douleur et le stress des animaux, une analgésie et/ou une anesthésie sera réalisée pour les procédures le nécessitant. L’isolement des animaux est évité au maximum, cependant il est possible que certains animaux se retrouvent isolés de manière imprévue (seul mâle d’une portée, animal arrivé seul d’un fournisseur, agression entre congénères, dernier animal dans la cage…). Dans ce cas, l’animal bénéficiera d’un enrichissement supplémentaire dans sa cage. Le modèle murin de cardiomyopathie à un phénotype dommageable. Le phénotype dommageable débute à 4 mois avec l’apparition progressive d’une cardiomyopathie dilatée d’abord légère et qui évolue vers 7 mois en insuffisance cardiaque. Cette progression de l’atteinte cardiaque est corrélée à une atteinte progressive et moins sévère des muscles squelettique, l’apparition d’une cyphose légère et une perte de poids d’environ 20 pour cent par rapport au poids de l’animale à 4 mois (environ 20g). Ce phénotype réduit l’espérance de vie des animaux. Afin de réduire la contrainte liée au phénotype dommageable, une fiche de scoring est utilisée pour suivre l’évolution du phénotype et les animaux sont mise à mort systématiquement à l’âge de 7 mois.
Choix des espèces
La souris est l’animal choisi pour ce projet en raison des similitudes de son système cardiovasculaire avec celui des humains et de l’existence d’une lignée génétiquement modifiée portant une mutation responsable à l’état homozygote de cardiomyopathie dilatée chez l’humain. De plus, la souris est le modèle animal le plus utilisé dans ce champ de recherche, permettant ainsi des comparaisons avec d’autres études ou d’utiliser les résultats d’autres études afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Pour les traitements, les animaux seront utilisés à 28 jours (âge auquel les animaux passe à une alimentation entièrement solide). Pour obtenir un effet optimum, l’âge de début du traitement doit être le plus précoce possible. Pour l’exploration fonctionnelle du cœur, les animaux sont utilisés entre 2 et 7 mois.
Etude des mécanismes physiopathologiques de l’athérosclérose
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Selon les protocoles, des souris reçoivent un régime enrichi en gras pendant 4, 8 ou 20 semaines, des injections dans l'abdomen tous les deux jours, puis, le jour de leur mise à mort, une prise de sang à la veine mandibulaire sur souris vigile et une perfusion par le cœur. 4 200 souris, dont des souris génétiquement modifiées, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leurs artères. L'équipe étudie l'athérosclérose et le rôle de protéines de la famille PI3K, qu'elle espère proposer comme cibles thérapeutiques. Comme effets néfastes, le porteur cite la seule douleur "légère de courte durée" des piqûres et de la prise de sang. Il dit réduire le nombre de souris "en respectant les contraintes de publication".
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde et sont en croissante progression dans les pays à revenus faibles ou modérés. La principale cause sous-jacente de ces maladies est l'athérosclérose, une pathologie complexe et multifactorielle qui touche principalement les artères de gros et moyens calibres. Cette pathologie consiste en un dépôt de lipide dans la paroi des artères. Elle se développe dès l'enfance mais la progression des lésions augmente avec l'âge et varie selon le mode de vie (alimentation, exrcice physique, stress, tabagisme...) et nos facteurs de risque (diabète, hypertension, obésité). La première étape du développement de la plaque d'athérome est la perte d'intégrité (ou dysfonction) de l'endothélium qui est une barriere entre le sang et paroi artérielle. Cette perte d'intégrité de la barrière endothéliale favorise l'infiltration des lipoprotéines de basses densité (LDL) circulantes dans l'espace sous-endothélial induisant des réponses cellulaires de type inflammatoires et fibroprolifératives à l'origine des lésions athéromateuses. Au cours du temps, cette plaque d'athérome vient obstruer la lumière de l'artère et sa rupture sera responsable des conséquences dramatiques de cette pathologie comme l'infarctus du myocarde ou l'accident vasculaire cérébral. L'objectif de ce projet est donc de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dès l'initiation de cette pathologie jusqu'aux stades tardifs pour évaluer la vulnérabilité de la plaque et proposer de nouvelles cibles thérapeutiques dans ce contexte physiopathologique. Plusieurs travaux de notre équipe ont déjà identifié que des protéines de la famille des phosphoinositides 3-kinase (PI3K) pourraient être des cibles thérapeutiques intéressantes dans ce contexte et nous souhaitons valider leur implication au cours de ce travail.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques qui pourraient être utilisées pour prévenir ou ralentir le développement de l'athérosclérose et diminuer ses conséquences dramatiques sur les maladies cardiovasculaires.
Procédures
Tout ou partie des animaux enrolés dans ce protocole seront soumis à: 1/un régime enrichi en gras pendant 4SEM ou 8 SEM ou 20SEM 2/des injections en intrapéritonéal tous les 2 jours (volume max: 100µl, durée: 30sec) 3/un prélèvement sanguin une seule fois le jour de la mise à mort à la veine mandibulaire sur animal vigile (durée: 1 min) 4/une perfusion intracardiaque une seule fois le jour de la mise à mort (durée: 10min)
Impact sur les animaux
La piqure d'une aiguille tous les 2 jours en intrapéritonéal entraine une douleur légère de courte durée . Le prélèvement sanguin à la veine mandibulaire entraine une douleur légère de courte durée.
Devenir
A l'issu de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort pour analyser par immunofluorescence l'endothélium (pour les étapes initiatrices du développement de l'athérosclérose) ou les dépôts lipidiques signant la présence de plaque d'athérome (pour les stades précoces à plus avancés).
Remplacement
Notre équipe développe des modèles in vitro en 2D et 3D des vaisseaux pour éviter à son maximum la nécessité d'avoir recours à des modèles animaux. Néanmoins, l'athérosclérose est une pathologie multifactorielle qui fait intervenir les cellules de paroi vasculaire mais également les cellules inflammatoires et plusieurs facteurs circulants. Il est encore prématuré de pouvoir complètement modéliser cette pathologie complexe in vitro. Les animaux vivants resprésentent le seul modèle intégré et restent indispensables pour obtenir des résultats fiables sur cette pathologie.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé est réduit à son maximum en respectant les contraintes de publication, sans compromettre les objectifs de l'étude et pour permettre de bonnes analyses statistiques. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés en fonction du design de chaque expérience. Nos études antérieures ont montré que des groupes de 20 animaux sont requis pour obtenir une répartition normale des mesures et des résultats robustes dans notre contexte d'étude. Le choix du groupe témoin sera optimisé pour permettre sa comparaison avec plusieurs groupes expérimentaux et ainsi diminuer l'utilisation inutile d'animaux. Enfin, sur chaque animal le coeur et l'aorte seront simultanément prélevés et les autres tissus de l'animal mis à mort seront proposés aux autres membres de l'équipe et de notre institut de recherche pour permettre d'optimiser au maximum l'utilisation de chaque animal.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cages ventilées, selon les normes de la directive 2010/63/EU, avec un enrichissement dans chaque cage (igloo, batônnets de bois, coton, sizzle nest), et un statut sanitaire SPF contrôlé trimestriellement. Des méthodes alternatives à la préhension par la queue sont utilisées, les procédures de mise à mort sont réalisées sous anesthésie et analgésie. Quelle que soit la procédure utilisée, une observation des animaux en expérimentation est réalisée quotidiennement par du personnel compétent ayant un livret de compétence à jour et formé aux approches de chirurgie. L’état général de l’animal est évalué : prise de nourriture, toilette et mouvements habituels sont considérés comme des signes de bonne santé. La douleur est évaluée par les signes de prostration, de perte d’appétit ou de poids et de mouvements pénibles. Toute altération du bien-être (prostration, perte de poids, piloerection, blessures) des animaux sera évalué en concertation avec la SBEA et le vétérinaire référent pour déterminer les soins ou l'action à appliquer pour réduire le stress, l'angoisse ou la souffrance animale.
Choix des espèces
La souris ets le seul modèle expérimental pour lequel il existe des animaux génétiquement modifiés: 1/ pour les différentes cibles étudiées dans ce projet et 2/permettant de récapituler de façon induite par un régime ou spontanée le développement de l'athérosclérose. De plus cette espèce de rongeur a des propriétés zootechniques (petite taille, un cycle de reproduction court permettant rapidement d’obtenir des générations successives pour les études à long terme) autorisant une mise en œuvre des protocoles expérimentaux de recherche facilitée et maîtrisée par notre équipe de recherche. Cette espèce présente également des paramètres physiologiques proches de l’Homme, la plaçant comme un organisme-modèle de choix pour l'étude des pathologies cardiovasculaires. Pour évaluer l'impact de l'invalidation de nos différentes cibles moléculaires au cours du développement de l'athérosclérose, les animaux utilisés seront agés de 14 SEM (étape initiatrice de l'athérosclérose), 18 SEM (stade précoce du développement de cette pathologie artérielle) ou 30 SEM (stade tardif du développement de cette pathologie artérielle).