Système cardiaque
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Etude collaborative de l’impact de l’insuffisance cardiaque sur la sévérité du Covid 19 et de l’efficacité de son traitement chez la souris (EU2/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Rendues insuffisantes cardiaques par une chirurgie de cent dix minutes dans un premier établissement, puis transportées vers un second, 92 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles y reçoivent un traitement ou un placebo par voie orale, puis une suspension de SARS-CoV-2 dans le nez, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Ce qui est fait pendant l'opération de cent dix minutes n'est jamais précisé, alors que le RNT annonce un infarctus du myocarde et une insuffisance cardiaque installée, et qu'il affirme qu'aucun effet indésirable n'est attendu des échographies des huit semaines suivantes. Sur le remplacement, le porteur conclut à la "nécessité" de réaliser l'étude in vivo, aucune approche in vitro ne reproduisant selon lui l'ensemble d'un processus d'infection.
Objectifs
Les coronavirus sont une grande famille de virus qui provoquent des maladies allant du simple rhume à des maladies respiratoires très graves. Au 2 février 2022, sur un total de plus de 376 millions d'infections liées au coronavirus (COVID-19) dans le monde, 5,6 millions sont décédées à ce jour, dont plus de 128 000 en France. 73% des victimes du coronavirus en France avaient 75 ans ou plus. Le type le plus courant de maladie associée entraînant la mort après une infection par le coronavirus SRAS-Cov-2 est la maladie cardiaque. En effet, près d’un tiers des personnes décédées du Covid-19 souffraient de maladies cardiovasculaires, dont l'insuffisance cardiaque était majoritaire. Les maladies cardiovasculaires préexistantes ont été proposées pour identifier les patients à risque plus élevé de résultats indésirables de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), mais les preuves existantes sont contradictoires. Ainsi, il n'est pas clair si les maladies cardiovasculaires préexistantes sont indépendamment des facteurs prédictifs importants de COVID-19 sévère et encore plus importants pour le succès du traitement. Il a été montré que les maladies cardiovasculaires préexistantes entraînent une inflammation accrue et un risque de lésion myocardique lors de l'infection chez la souris, ce qui est cohérent avec les observations chez l'Homme. Une autre stratégie est l'induction de maladies cardiovasculaires, comme proposé dans ce projet. Dans ce contexte, l'objectif du projet est de tirer parti de la complémentarité des centres de recherche nationaux pour évaluer les effets des maladies cardiaques sur la sévérité de l'infection par le Covid19 et l'efficacité des thérapeutiques antivirales dans les conditions cardiovasculaires à l'aide d'un outil préclinique murin. Chronologiquement, un premier établissement de recherche va générer des animaux insuffisants cardiaques (avec les mêmes atteintes que celles développées chez les patients), puis dans un deuxième temps, un autre établissement de recherche va étudier les effets des traitements et de l’infection par le COVID-19 chez cette population de souris.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet se situent à différents niveaux : 1) Répondre au besoin de recherche sur la compréhension des mécanismes de la maladie grave dans la population touchée par le COVID-19, 2) Élaborer la preuve de concept pour offrir de nouveaux modèles expérimentaux plus proche de la clinique, 3) Délivrer un service basé sur des expertises complémentaires, en évitant de dupliquer investissements et expérimentations, 4) Évaluer l'impact de l'infection du covid-19 chez les patients souffrants de maladies cardiovasculaires. Il reste encore beaucoup à apprendre sur le rôle des maladies cardiovasculaires dans le COVID-19 humain, et les modèles animaux atteints de maladies cardiovasculaires sont fondamentaux pour déterminer le rôle de l'infection par rapport aux maladies cardiovasculaires dans la gravité de la maladie. Ces efforts peuvent également conduire à la conception et évaluation de thérapies antivirales, anti-inflammatoires et vaccinales spécifiques contre le COVID-19 sévère qui fonctionnent le mieux dans le contexte de conditions médicales particulières.
Procédures
Au sein de l’établissement EU1, chaque animal sera soumis sous anesthésie à : 1) une échographie cardiaque préopératoire (20 min), 2) une procédure chirurgicale (110 minutes), 3) une échographie cardiaque à 8 semaines (20 min). 4) envoi des animaux à l’établissement partenaire. Au sein de l’établissement EU 2 , chaque animal sera soumis sous anesthésie à : 1) une administration du traitement ou du placebo par voie orale (20 min), 2) une administration intranasale d’une suspension virale (20 min), 3) des prélèvements d’organes pour des études d’infection virale (30 min).
Impact sur les animaux
Les souris subiront un infarctus du myocarde et des symptômes d’insuffisance cardiaque conséquente à la maladie. Nous nous attendons à un cœur plus gros et un remplissage du cœur diminué, raison de l’étude. Aucun effet indésirable n’est attendu en réponse aux examens échographiques (non invasifs) sur la période considérées (8 semaines). Les animaux insuffisants cardiaques seront ensuite envoyés vers l’EU 2 par un transporteur agréé. Aucune perte n’a été notée jusqu’à ce jour, et une procédure est en place pour limiter le stress des animaux. Les souris subiront aussi une infection avec le virus SarsCov2 et des symptômes de la maladie. Sous anesthésie, les souris subiront des injections intranasales pour tester l’efficacité des traitements contre les effets du covid-19, finalité de l’étude.
Devenir
A la fin des procédures expérimentales décrites ci-dessus, les animaux seront mis à mort pour les prélèvements des organes.
Remplacement
Notre étude ayant pour but d'établir une nouvelle stratégie d’étude du Covid-19 en association à différentes maladies cardiovasculaires et d'évaluer son impact à long terme sur l’efficacité de traitement contre la maladie virale, il apparait ainsi pertinent d'effectuer ces analyses sur l'animal entier et non sur des modèles in vitro. Il n’y a pas de méthode sans l’utilisation de modèle animal permettant d’atteindre l’objectif visé de cette étude. À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de façon satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans un processus d’infection de l’initiation au développement de la pathologie et au suivi de la réponse immune.
Réduction
Les groupes d’animaux ont été réduits au minimum de telle manière que les échantillons récupérés (n=5) soient suffisamment nombreux et donc représentatifs du groupe, afin que les données récoltées soient robustes statistiquement. En effet, si les groupes sont constitués de trop peu d’individus, la puissance statistique des données sera trop faible pour en tirer une conclusion fiable, ce qui impliquerait de répéter l’expérience et donc d’impliquer de nouveaux animaux. Il en va de même pour les animaux utilisés pour le suivi et la survie (n=13). De plus, dans cette étude, un groupe « témoin » (groupe 2, voir Annexe 1) ne portant pas de maladie cardiovasculaire est impliqué (constitué du même nombre d’animaux que le groupe 1 « test » soit n=36), et pourra être utilisé comme contrôle pour plusieurs prestations. Cela permettra de réduire grandement le nombre d’animaux utilisés sur le long terme dans les recherches. Le nombre utilisé pour ces expériences est de 6 animaux par génotype et par lot expérimental afin d’avoir des données statistiques robustes et de limiter le nombre d’expérience.
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupe de 5 pour éviter le stress de l’isolement et les cages seront systématiquement enrichies par l’ajout de plusieurs éléments, notamment de la nourriture hydratée dès que nécessaire pour pallier toute perte de poids et/ou déshydratation durant leur hébergement. Les souris en expérimentations seront observées quotidiennement par le personnel formé et qualifié en charge de l’expérimentation. L’utilisation de grille de score journalier permettra de définir les soins à mettre en œuvre aux premiers signes de souffrance chez les souris sur la base de points limite définis. Selon le cas, le vétérinaire référent et le chef de projet sont prévenus pour décider, soit de soins/analgésie adaptés et compatibles avec le projet, soit de la mise à mort précoce de l'animal. L’expérimentation est optimisée en amont par le choix de modèle utilisé, la planification de protocole pour éviter le stress et mise en place des points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure comme décrits ci-dessus. Le raffinement est également mis en place pendant l’expérimentation et il concerne les méthodes et les procédures des soins adéquats pendant et après l’infection ; l’anesthésie/analgésie et les procédures d’euthanasie appropriées.
Choix des espèces
La physiologie et la génétique de la souris étant « proches » de celles de l’Homme, nous avons choisi de réaliser l’ensemble de nos expériences chez cette espèce animale. Notre objectif principal est de comprendre l’effet des comorbidités à la susceptibilité à l’infection avec Sars Cov 2. Un modèle murin donnera non seulement des informations clés sur la physiopathologie du Covid19, mais servira également de plateforme d'évaluation préclinique à haut débit pour identifier des antiviraux et des vaccins performants, essentiels pour les essais humains en aval. Les nombreux travaux et les publications ont validé l’utilisation de modèle de la souris étant adapté pour comprendre et avancer la pathologie de COVID19. À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de façon satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans un procès d’infection de l’initiation au développement de la pathologie et au suivie de la réponse immune. Ces différents arguments soulignent la nécessité de réaliser notre étude in vivo avec des modèles de souris. Il n’y pas de méthode sans l’utilisation de modèle animal permettant d’atteindre l’objectif visé de cette étude. Nous prévoyons d’utiliser des animaux âgés de 8 à 12 semaines. Il s'agit ici d'un âge moyen le plus souvent utilisé pour les études dans le domaine dans la littérature.
Prélèvement de sang pour la caractérisation d’animaux congéniques CD45.1 et CD45.1/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Immobilisées vigiles, la tête bloquée, piquées perpendiculairement à la veine mandibulaire pour deux ou trois gouttes de sang, 750 souris subissent une procédure d'un niveau de souffrance léger. Le prélèvement dure de cinq à vingt secondes et sert à vérifier des marqueurs de surface sur les cellules sanguines, pour trier des souris destinées à des greffes de moelle osseuse. Le porteur indique qu'environ 187 individus, ceux dont le génotype ne présente pas d'intérêt, seront mis à mort. Les 563 autres restent en vie, 60 pour maintenir la lignée et 503 pour alimenter des expérimentations ultérieures.
Objectifs
Production d’animaux congéniques utilisés dans des expériences de greffes de moelle osseuse pour l’étude de l’hématopoïèse normale et cancéreuse. La caractérisation génétique de ces animaux congéniques est réalisée par l’analyse de marqueurs spécifiques à la surface des cellules sanguines.
Bénéfices attendus
La caractérisation génétique des souris permet d’optimiser la gestion de l’élevage et de produire les animaux nécessaires pour les projets scientifiques pour l'étude de l'hématopoïèse normale et leucémique. La compréhension de ces mécanismes permet de développer des traitements thérapeutiques pour les leucémies humaines.
Procédures
Un seul prélèvement sanguin sera effectué à la veine mandibulaire comme suit. 750 souris vigiles sont immobilisées par une contention de base en s’assurant que la tête est bien immobilisée. Puis la veine mandibulaire est piquée perpendiculairement avec une aiguille. 2-3 gouttes de sang sont prélevées directement dans un tube de prélèvement. Le prélèvement dure entre 5 et 20 secondes. Puis une légère pression pour arrêter le saignement est effectuée avec un papier absorbant.
Impact sur les animaux
L’effet indésirable est la nuisance du prélèvement sanguin unique qui génère un stress et une douleur légère.
Devenir
Parmi les animaux de génotypes utiles soit 75% des souris correspondant à environ 563 animaux, 60 souris utiles seront replacées pour le maintien de la lignée et 503 souris seront utilisées pour les expérimentations en utilisation continue. Les animaux de génotype inutile seront mis à mort soit environ 25% des souris correspondant à environ 187 animaux.
Remplacement
Le prélèvement sanguin pour génotypage ne peut-être remplacer par un autre prélèvement car seules les cellules sanguines expriment le marqueur permettant de génotypage ces souris. Les souris de cet élevage sont générées et utilisées pour réaliser des expériences de greffes de cellules souches afin de tester leurs fonctions dans un individu à long terme (au moins 6 mois). A ma connaissance aucun système de culture in vitro, in silico ou ex-vivo ne permet de tester la fonction à long terme des cellules souches hématopoïétiques dans des conditions physiologiques identiques à celles d’un individu vivant (sans biais, ni stresse cellulaire pouvant altérer la fonction de dormance de ces cellules).
Réduction
Nous allons produire un nombre d’animaux en lien avec nos besoins (environ 150 animaux par an). Le nombre de cages de croissements pour générer les souris nécessaires à nos projets scientifiques est réduit au minimum requis.
Raffinement
Pour réduire au minimum les nuisances liées aux prélèvements sanguins ceux-ci seront réalisés par un technicien animalier employant une méthodologie éprouvée, rapide, précise et standardisée. Pour rétablir la volémie des animaux vigils prélevés en sang, le même volume d'une solution saline physiologique (NaCl 0,9%) sera injectée à ces animaux en sous-cutané.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux modèles de choix facilement modifiables génétiquement et pour lesquels nous disposons d’un grand nombre d’outils moléculaires (ex : Anticorps, cytokines…) et permettant l’étude des cellules hématopoïétiques. Les animaux seront caractérisés le plus tôt possible vers l'âge de 4-5 semaines.
Etude du rôle de l’endothéline dans la calcification valvulaire aortique
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les rats subissent trois chirurgies, une ligature de l'artère du rein gauche à J1, l'ablation du rein droit à J8 et la pose d'une mini-pompe à J38, encadrées d'un prélèvement sanguin à J37 puis d'une IRM et d'une échocardiographie en semaine 12. 108 rats Sprague-Dawley mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. L'insuffisance rénale ainsi provoquée s'accompagne, si le modèle fonctionne, d'une anémie, d'une hypertrophie et d'une fibrose du cœur et d'une baisse de la fonction ventriculaire, avec 25 % de mortalité annoncée. Le porteur espère à long terme un traitement du rétrécissement aortique et vérifie d'abord une hypothèse sur un récepteur de l'endothéline.
Objectifs
Le rétrécissement aortique est une pathologie fréquente qui touche environ 2% de la population de plus de 65 ans. Cette maladie se caractérise par une calcification des tissus et une diminution de la surface valvulaire empêchant l’éjection du sang. Au stade final de la maladie, il en résulte des symptômes à type de dyspnée, insuffisance cardiaque à l’origine d’une importante morbi-mortalité cardiovasculaire. Hors, il n’existe actuellement aucun traitement médical permettant de stopper le développement des calcifications valvulaires. La seule issue thérapeutique consiste en une intervention. Quelques études suggèrent l’implication de la voie de l’endothéline dans le rétrécissement aortique et ex vivo qu’un blocage du récepteur de l'endothéline B augmentait les calcifications et qu’à l’inverse, une stimulation diminuait les calcifications . La stimulation du récepteur de l'endothéline B pourrait donc être une potentielle cible thérapeutique à l’avenir. L’objectif de cette expérimentation est donc de vérifier sur un modèle animal de calcification valvulaire ces premiers résultats et de s’assurer de l’absence d’effets secondaires de cette modulation de la voie de l’endothéline.
Bénéfices attendus
Le rétrécissement aortique est une pathologie qui représente un véritable enjeu de santé publique. Il s’agit en effet de la valvulopathie la plus fréquente dans les pays occidentaux avec une prévalence de 2% des sujets de 65 ans et plus et 10% des sujets de 80 ans et plus . Les symptômes apparaissent au stade du rétrécissement aortique serré et sont le plus souvent invalidant à type de dyspnée amenant à des hospitalisations. Actuellement le seul traitement consiste est une intervention, soit par voie chirurgicale, soit par voie percutanée. Dans les deux cas, le remplacement de la valve par une prothèse valvulaire n’est pas dénué de risque (accident vasculaire cérébral, implantation de pacemaker, troubles du rythme). Même si certaines publications anciennes ont suggéré un rôle de l’endothéline dans les calcifications valvulaires aortiques, cela n’a toujours pas été confirmé et les mécanismes impliqués n’ont toujours pas été expliqués. Notre projet pourrait donc permettre : 1)A court terme, de répondre à une question scientifique en cours et confirmer le potentiel rôle de l’endothéline dans le développement du rétrécissement aortique. La compréhension des mécanismes impliqués pourrait également ouvrir la voie à d’autres idées de recherche dans des domaines variés. En effet, la voie de l’endothéline est notamment étudiée en oncologie et en neurologie . 2) A long terme, cette étude pourrait également permettre la conception d’un traitement médical du rétrécissement aortique. Cela pourrait éviter à de nombreux patients d’arriver au stade symptomatique de la maladie et donc éviter des hospitalisations et des interventions.
Procédures
Les animaux de la procédure subiront trois chirurgies dans un premier temps une ligature de l'artére rénale du rein gauche à J1 de l'étude puis une ablation totale du rein droit au J8 de l'étude et enfin une pose de mini pompe à J38. Des prélèvements sanguins seront effectués à J37 sur tous les animaux sous-anesthésie gazeuse pour randomiser nos groupes en fonction du dossage de la créatine. L'analyse des effets fonctionnels (IRM : semaine 12 et échocardiographie cardiaque : semaine 12 et J38 ) sera effectué sous anesthésie avec une durée de 10 minutes/rat.
Impact sur les animaux
La procédure est classée sévère. La chirurgie visant à induire une un modèle animal de calcification valvulaire afin d’étudier l’impact de la modulation du récepteur de l’endothéline B dans le développement du rétrécissement valvulaire aortique. Pour cela les animaux subiront une néphrectomie qui sera réalisée en deux temps avec une ligature de l’artère rénale gauche à J1 et une ablation du rein droite à J8 (avec une durée de chaque intervention de 20 minutes). De manière certaine, les animaux, après néphrectomie (Sténose) du rein gauche des 5/6ème (procédure classée sévère) et néphrectomie totale rein droit développeront une insuffisance rénale Chronique (IRC). Nous nous attendons, si notre modèle fonctionne, insuffisance rénale chronique associé avec une anémie, une hypertrophie cardiaque, une fibrose cardiaque et une diminution de la fonction systolique et diastolique du ventricule gauche. Le taux de mortalité lors de la réalisation de ce modele est de 25%. Tous les animaux subiront plusieurs anesthésies gazeuse et une anesthésie par injection lors de IRM (durée 40 minutes) et de la mise à mort.
Devenir
A la fin de la procédure les animaux seront mis à mort puisqu'il est nécessaire de récupérrer la valve aortique et le coeur pour analyse des calcifications présentes.
Remplacement
Dans ce projet d’étude, des expérimentations in vitro et ex vivo sur des cellules valvulaires ont déjà été faites antérieurement. Cependant, le modèle in vivo ne peut pas être remplacé car il permettra d’étudier l’effet systémique des modulateurs de la voie de l’endothéline au-delà des cellules valvulaires ainsi que la tolérance des agents pharmacologiques sur un organisme vivant. Il s’agit d’une étape indispensable si l’on souhaite développer par la suite un médicament chez l’homme.
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude nous réaliserons séquentiellement des mesures non-invasives de la fonction cardiaque (échographie, IRM) puis une analyse histologique. Nous avons également mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements au moment de la mise à mort. De plus, nous avons réalisé des tests statistiques appropriés pour calculer le nombre de rats nécessaire.
Raffinement
Tout au long de l’étude, les animaux seront nourris ad libitum et hébergés en groupes sociaux stables dans des portoirs conventionnés au nombre maximum de 4 par cage avec de l’enrichissement (Tunel,Kraft Paper). Les animaux seront maintenus avec un environnement controlé et stabilisé (température de 21°C , hydrométrie à 55% et luminosité à 100lux avec une durée de cycle de lumière normal soit 12h/12h). Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des rats sera maintenue avant le début du protocole. Les conditions de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Ainsi, un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée du protocole expérimental, ce qui permettra de déceler un éventuel signe de souffrance. Notre grille d’évaluation des point limites pour le bien être animal est utilisé quand un animal présente un état de mal être ou de souffrance, il est exclu de l'étude et euthanasié en fonction de son score et de la discussion avec les membres de la structure chargée du bien être animale. Pendant la chirugie, nous injectons une solution saline en sous- cûtanée pour maintenir l'hydratation de nos animaux. En post- opératoire une injection de glucose à 5% en IP est réalisée en ainsi qu'un ajout dans la cage de nourriture gélifiée qui aide l'animal à mieux se nourrir. Un traitement analgésique à l’aide de xylazine (10 mg/kg) en préopératoire et de buprénorphine (0.5 mg/kg) en pré et post-opératoire est réalisé suivi d'une injection toutes les 8h pendant 24h qui suivent l’opération. Nous allons dans ce projet utiliser des rats mâles, ce qui diminuera les variations dans les réponses immunitaires, et permettra une meilleure comparaison entre nos modèles.
Choix des espèces
Le choix du rats sprague dawley males se justifie par l’expérience du laboratoire à la fois pour la chirurgie de la néphrectomie mais également pour l’étude des fonctions cardiaque par échocardiographie et IRM. Par ailleurs, le rapprochement des espèces humaines et des rongeurs sur le plan phylogénétique rend pertinent le choix de cette espèce en garantissant une bonne extrapolation des résultats chez l’homme. Nous utiliserons que des mâles pour notre études pour diminuer les variations dans les réponses immunitaires, et permettra une meilleure comparaison entre nos modèles. Nous utiliserons des rats adultes car cette pathologie survient chez des humains adultes (pathologies non existante chez les enfants).
Développement et caractérisation de nanoémulsions de fénoldopam dans la polykystose rénale autosomique dominante – NANO-PKD
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 16
Six prélèvements sanguins pour chaque rat, trois pour chaque souris, tous réalisés sous anesthésie gazeuse. 16 rats Wistar et 40 souris vont être utilisés, tous tués six heures après le dernier prélèvement pour récupérer leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objectif tient en une mesure de cinétique sanguine sur une nanoémulsion de fénoldopam, molécule candidate contre les complications vasculaires de la polykystose rénale. Le porteur mentionne parmi les effets attendus l'exérèse du rein gauche et un gavage, deux actes absents de sa description des procédures, et justifie le recours aux animaux en une seule phrase.
Objectifs
La polykystose rénale autosomique dominante (PKRAD) est une maladie rénale héréditaire ayant une prévalence estimée à 4 sujets sur 10 000 en Europe.1 Dans la PKRAD, le développement de kystes rénaux altère progressivement la fonction rénale aboutissant à une insuffisance rénale terminale chez 1/3 des patients qui représentent 10% des dialysés et des transplantés. Ces patients développent précocement une hypertension artérielle et des complications cardiovasculaires avec une fréquence beaucoup plus élevée que dans la population
Bénéfices attendus
Malheureusement, les effets centraux de la rotigotine restent un frein à son utilisation dans la PKRAD et donc à l’évaluation de cette stratégie pharmacologique sur la structure et la fonction rénale à long terme. Une molécule plus intéressante au plan pharmacologique est le fénoldopam (FENO) qui est un agoniste spécifique des récepteurs DR1 et DR5 ne franchissant pas la barrière hémato-encéphalique. Cette molécule est notamment utilisée aux USA pour la prise en charge des crises hypertensives ou des hypertensions post-opératoires. A ce jour, le FENO est uniquement administré sous forme intraveineuse du fait de son métabolisme rapide et de sa faible demi-vie. Afin d’évaluer dans notre unité l’intérêt du FENO dans la PKRAD, celui-ci a été administré de façon chronique au moyen de mini-pompes chez des souris invalidées pour la polycystine-1 spécifiquement au niveau endothélial (VE-Cadh/Pkd1fl/fl). Celui-ci a permis de restaurer la dilatation-débit dépendante d’artères mésentériques isolées et de prévenir l’augmentation de la pression artérielle induite par la déficience en polycystine-1 endothéliale (Hamzaoui M et al. Hypertension 2022). L’ensemble de ces travaux montre que la stimulation des récepteurs dopaminergiques D1-like constitue une nouvelle approche thérapeutique d’intérêt pour la prise en charge des complications vasculaires de la PKRAD. Dans la mesure où les mécanismes de mécanotransduction sont communs, cette approche pourrait être également intéressante pour ralentir le déclin de la fonction rénale chez ces patients. Cependant, il n’existe actuellement aucun agoniste dopaminergique des récepteurs D1-like ayant des propriétés pharmacocinétiques permettant une utilisation par voie orale pour le traitement de la PKRAD.
Procédures
Des prélèvements sanguins seront effectués 6 fois sur les rats lors de la pharmacocinétique et 3 fois chez la souris . Tout les prélement serons réalisé sous-anesthésie gazeuse (isoflurane 2 %) de courte durée.
Impact sur les animaux
Les prélèvements sanguins et le traitement avec l'inhibiteur pharmacologique de Ezh2, ainsi que l’exérèse du rein gauche pourront occasionner des effets secondaire. Les effets indésirables suite au prélèvement de sanguin sont de la fatigue chez les animaux et le gavage peut induire une petite prostration de l'animal
Devenir
Tout les animaux après le dernier temps de prélèvement au temps 6h serons mis à mort dans les deux procédures pour la récupération des organes et l'analyse des tissus .
Remplacement
Les expériences in vivo ne peuvent pas être remplacées par des études in vitro car nous avons pour but dans cette étude de mettre au point une cinétique sur un produit pharmacologique
Réduction
Nous avons également mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses ex-vivo au moment de la mise à mort. De plus, nous avons réalisé des tests statistiques appropriés pour calculer le nombre de souris nécessaires
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans des conditions optimales d’hébergement en petits groupes sociaux stables (n=4 pour les rat et n=5 pour les souris ) par cage, dans un environnement stabilisé (température 21°C, hygrométrie 55%, luminosité 100 lux, durée du cycle de lumière (12h/12h)). Tout au long de l’étude, les animaux sont nourris ad libitum et hébergés dans des portoirs ventilés avec de l’enrichissement (plaque de cellulose vierge, tunel, papier krafs et maison en carton). Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des souris sera maintenue avant tout début de protocole pour les rats . Des points limites adaptés, une stratégie d’anesthésie et d'analgésie seront mis en place avec un suivi quotidien du bien-être animal. Les animaux seront manipulés régulièrement par les mêmes expérimentateurs pour tendre à une habituation, et nous appliqueront une grille d’évaluation du bien-être animal séparément pour chaque individu (Annexe I).
Choix des espèces
Le choix du rat Wistar pour les premières analyses se justifie par la probabilité importante d’obtenir des prélèvements permettant une analyse pharmacocinétique détaillée afin de réaliser une translation optimale vers l’étude chez les souris transgéniques. Le choix de la souris pour les analyses complémentaires se justifie par l’abondante littérature, sur l’expérience du laboratoire et sur la possibilité de recourir aux animaux transgéniques pour approfondir les résultats du travail (modèle de souris invalidées pour le gène codant la protéine d’intérêt). Afin de permettre une étude pharmacocinétique chez des animaux adultes, avec la possibilité de recueils sanguins suffisants, le poids des animaux sera : -Rats Wistar (N=16) : 400g -Souris C57Bl6J (N=40): 20g
Création d’un nouveau modèle d’hypertension pulmonaire thromboembolique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Soumises à une ligature de l'artère pulmonaire droite pour provoquer une hypertension pulmonaire, 94 souris adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère ou sans réveil, toutes tuées à l'issue pour l'analyse du cœur et des poumons. Pour une partie d'entre elles, la ligature passe par une ouverture du sternum sous anesthésie. Les autres sont opérées par thoracotomie puis réveillées, passent une échocardiographie 28 jours plus tard et subissent enfin une seconde ouverture du thorax, par le sternum, dont elles ne se réveillent pas. Le projet doit transposer à la souris une méthode d'induction mise au point chez le rat, pour disposer des outils transgéniques propres à cette espèce. Le porteur décrit, d'après ses expériences chez le rat, une hypertension "cliniquement asymptomatique" et sans surmortalité, pour un projet dont une partie des procédures est classée en souffrance sévère.
Objectifs
L’hypertension pulmonaire thromboembolique chronique (HTP-TEC) est une maladie cardio-pulmonaire sévère. Elle est caractérisée par une augmentation anormale de la pression artérielle pulmonaire moyenne (PAPm) au-dessus de 25 mmHg au repos. Cette élévation de la PAP aboutie à une hypertrophie cardiaque droite puis à une insuffisance cardiaque. L’HTP-TEC est due à une obstruction des grosses artères pulmonaires suite à la mauvaise résolution d'un caillot de sang (embolie pulmonaire). L’embolie pulmonaire est une maladie fréquente. En France, au moins 35,000 cas sont traités chaque année. Chez 1 à 3% des survivants, la persistance d’une obstruction artérielle pulmonaire cicatricielle associée à des anomalies des petits vaisseaux pulmonaires peut conduire à une HTP-TEC. La plupart du temps, l'HTP-TEC se soigne bien, avec un acte chirurgical qui vise à retirer le matériel qui obstrue les vaisseaux bouchées (thromboendarectomie). Cependant, dans certain cas, l'augmentation du flux sanguin dans les territoires non obstrués conduit à une altération des petits vaisseaux pulmonaires distaux (inférieurs à 500µm de diamètre) non "débouchables" par la chirurgie. Le modèle le plus pertinent d'HTP-TEC actuel est un modèle d'embolisation pulmonaire par de la colle biologique chez le cochon. Ce modèle de gros animal est difficilement reproductible par des équipes non expertes et ne permet pas de tester à grandes échelles les traitements qui sont excessivement onéreux. Un nouveau modèle chez la souris permettra de mieux comprendre comment se mettent en place les lésions distales d'HTP-TEC et comment soigner cette pathologie. En effet, les patients deviennent symptomatiques (essoufflement à l'effort) et ne sont diagnostiqués que dans les stades terminaux de la maladie. ll n'est donc pas possible de disséquer l'histoire naturelle du développement des lésions pulmonaires chez l'homme. C'est pour cette raison que nous travaillerons avec un modèle animal de cette maladie finalement assez fréquente mais mal comprise et mal traitée en dehors du traitement chirurgical. Développer un modèle d'HTP-TEC chez la souris est donc un enjeu majeur pour augmenter la survie des malades.
Bénéfices attendus
L’hypertension pulmonaire thromboembolique chronique (HTP-TEC) représente un défi majeur de santé publique, entraînant un handicap significatif, une insuffisance cardiaque et un risque accru de mortalité en l'absence de traitement. Cette forme grave de maladie vasculaire pulmonaire est souvent méconnue, ce qui entraîne des retards dans le diagnostic et expose les patients à un risque élevé de décès prématuré. À court terme, notre projet vise à établir un modèle expérimental d'HTP-TEC chez une espèce animale pour laquelle une panoplie d'outils génétiques et scientifiques ont déjà été développés et validés. À long terme, l'objectif principal de ce projet est d'améliorer la prise en charge des patients atteints d'HTP-TEC. En développant un modèle animal pertinent de cette maladie, nous espérons mieux comprendre ses mécanismes sous-jacents et identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce faisant, nous visons à réduire la morbidité et la mortalité associées à l'HTP-TEC et à améliorer la qualité de vie des patients affectés.
Procédures
Pour une partie des animaux, une hypertension pulmonaire sera induite par ligature de l’artère pulmonaire droite (chirurgie thoracique avec sternotomie, durée de l’acte chirurgical : 40 minutes maximum) sous anesthésie et analgésie. Pour une seconde partie des animaux, une ligature de l’artère pulmonaire droite est réalisée via une thoracotomie (20 minutes), puis les animaux sont réveillés. Ils sont soumis à un examen échocardiographique non invasif 28 jours post-ligature (10-20 minutes sous anesthésie gazeuse) puis sont soumis à une chirurgie terminale via sternotomie sous anesthésie et analgésie (20minutes) sans réveil avec mise à mort subséquente.
Impact sur les animaux
Dans les expériences que nous avons réalisées chez le rat, l’hypertension pulmonaire qui se développe chez nos animaux est cliniquement asymptomatique (hypertension pulmonaire modérée au niveau hémodynamique, sans insuffisance cardiaque), n’entraînant pas de surmortalité, ni d’effets indésirables sur les animaux sur la période considérée (aiguë ou 4 semaines). Les souris sont soumises à une chirurgie (sous anesthésie) qui est un acte douloureux et seront prises en charge par ailleurs. Une partie des animaux sera soumise à une échocardiographie sous anesthésie, qui est une procédure non invasive et non douloureuse.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin d’expérimentation pour permettre l’analyse (moléculaire, cellulaire et histologique) du cœur et des poumons (nécessité de prélever les organes).
Remplacement
L'objectif de recherche est d'étudier et comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de l’hypertension pulmonaire. Le recours à des animaux est indispensable et se justifie par la nécessité d'étudier la fonction ventriculaire droite, la réactivité vasculaire, l'histologie pulmonaire dans un contexte physiologique et pathologique. Ce projet se justifie également par l'impossibilité de simuler ex vivo la mise en place d'une hypertension pulmonaire puis d'une altération cardiaque droite chez l'humain qui est un processus multifactoriel complexe.
Réduction
En fin d’expérimentation, les tissus prélevés (cœur et poumons) seront stockés pour une utilisation directe mais aussi ultérieure, pour des études mécanistiques plus poussées. Des expériences de biochimie et biologie moléculaire à partir des différents tissus collectés et des études sur cellules isolées seront effectuées. Des calculs de puissance ont permis de déterminer les effectifs minimums nécessaires à l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Le nombre total de souris utilisés sera de 94 sur l'ensemble de l'étude en combinant plusieurs approches expérimentales par différents expérimentateurs sur le même animal.
Raffinement
Toutes les procédures seront pratiquées sous anesthésie générale et couverture analgésique adaptées aux actes pratiqués. Des points limites spécifiques ont également été mis en place. De la nourriture et de l’eau sous forme gélifiée seront disposés sur la litière de la cage pour permettre un accès facilité à la nourriture et à la boisson.
Choix des espèces
Nous avons développé chez le rat ce modèle qui mime les conditions hémodynamiques et les lésions vasculaires pulmonaires rencontrées dans la pathologie humaine. Pour aller plus loin dans l’étude de la pathologie (mécanistique), les modèles transgéniques constituent un outil puissant, car ils peuvent être utilisés efficacement pour tester des interventions conçues contre des voies et des processus moléculaires particuliers impliqués dans la maladie. Or la majorité de ces outils ne sont disponibles que chez la souris. C’est pourquoi, nous voulons transposer ce nouveau modèle chez cette espèce. Nous utiliserons des souris adultes (8-20 semaines) pour reproduire les caractéristiques démographiques de la pathologie étudiée et faciliter l’approche chirurgicale (en comparaison aux souris juvéniles).
Etude des modèles d’ischémie cérébrale retardée après hémorragie sous-arachnoïdienne à l’aide de l’échographie super-résolue
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
Cathéter posé sous anesthésie générale, injections de sang ou d'un agent vasoconstricteur, séances d'imagerie par ultrasons : 198 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue de chaque procédure. Le porteur annonce des douleurs et un mal-être liés à l'inflammation provoquée par ces injections, une gêne au point d'incision et une perte de masse corporelle. Il s'agit de mettre au point une échographie super-résolue capable de détecter tôt le vasospasme après une hémorragie sous-arachnoïdienne chez les patients. Sur l'effectif, il écrit qu'il est difficile de l'estimer avec exactitude et l'évalue à 10 animaux pour valider la technique, sans expliquer comment on arrive aux 198 souris déclarées.
Objectifs
L’hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) correspond à une issue de sang dans les espaces sous-arachnoïdiens du cerveau et figure parmi les premières causes d’admission en réanimation. L’impact socio-économique de cette pathologie est majeur puisqu’elle touche des sujets jeunes dont un tiers des survivants conservent des séquelles neurologiques. Le principal facteur associé à l’importance du handicap post-HSA est la survenue d’une ischémie cérébrale retardée (ICR). Or, à ce jour, en dépit de plusieurs décennies de recherche, aucun diagnostic précoce testée chez l’homme a pu empêcher l’incidence de l’ICR. Nous souhaitons développer et utiliser l’échographie super-résolue pour diagnostiquer l’ICR chez l’homme après une phase de développement chez l’animal. La technique de Microscopie par Localisation Ultrasonore (ULM en anglais) a été inventée en 2010 et a fait l’objet d’une récente revue de la littérature. Cette technique consiste à tracer à l’échelle du micromètre le parcours d’un agent de contraste ultrasonore approuvé en clinique qui consiste en une solution de bulles injectables et restreintes au domaine vasculaire. L’ULM a ainsi pu cartographier la structure vasculaire à l’échelle des pré-capillaires chez l’animal et a aussi été utilisé depuis chez l’homme. L'objectif du projet est de développer un outil d'imagerie par échographie 3D ultra-résolu, qui permettrait d’identifier de manière précoce le vasospasme (un des facteurs impliqués dans l’IRC) ainsi que les troubles de perfusion intracrânienne post-hémorrhagie afin de pouvoir diagnostiquer l’ICR. Cette nouvelle technique sera évaluée dans quatre modèles précliniques différents de HSA (deux de vasospasme avec l’injection d'un agent vasoconstricteur) et deux modèles d'hémorragie sous-arachnoidienne. Le but serait de pouvoir rendre plus accessible et précoce le diagnostic de l’ICR ainsi que permettre la localisation précise de vasospasmes et les troubles de perfusion vasculaires cérébrales grâce à l'imagerie ultrasonore, couplée à une injection d'un agent de contraste non radioactif et biocompatible.
Bénéfices attendus
L'objectif du projet étant de proposer un modèle de détection précoce de troubles de perfusion, vasospasme et ICR par une modalité d'imagerie plus accessible, les bénéfices attendus seraient : - De proposer un agent de contraste peu coûteux, biocompatible, non radioactif et donc avec moins de risques sanitaires et accessibles à plus de patients, qui pourraient être exclus des méthodes d'imagerie habituelles. - De proposer une technique d'imagerie novatrice, qui pourrait être mise à chevet du patient et nécessitant moins d'infrastructures spécifiques, qui pourrait être portable, en plus d'être moins coûteuse et accessible à plus de patients que les méthodes d'imagerie habituelles, comme l’imagerie à resonance magnétique.
Procédures
Les animaux seront soumis à des inductions d'anesthésie gazeuse, à des poses de cathéter sous anesthésie générale, à des injections intraveineuses et des injections d’agent vasoconstricteur ou de sang.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables étant susceptibles d'apparaître chez les animaux seraient : - De mal supporter la concentration de microbulles nécessaires. - Une gêne possible au niveau de l'incision (démangeaison ou douleurs les premiers jours). - Une gêne possible au niveau du site d'insertion du cathéter. -Des douleurs et un mal-être des souris liés à l'inflammation provoqués par les injections d'agent vasoconstricteur ou sang. - Une perte de masse corporelle liée à l'anesthésie générale. - Des douleurs post-opératoires possibles au niveau du point d'incision.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure. Cependant un degré de sévérité a été estimé pour chaque procédure au lieu de les classer toutes en "sans réveil" car les animaux seront amenés à être réveillés au sein des procédures. De plus, il a été choisi de classer les procédures selon un degré de sévérité afin d'adapter le raffinement (analgésie, conditions per-opératoires ...).
Remplacement
Dans ce projet, il n'est pas possible de remplacer le modèle animal, il s'agit d'étudier un modèle in vivo avec tous les mécanismes vasculaires et tissulaires physiopathologiques associés, survenant lors d'une hémorragie sous-arachnoïdienne / vasospasme. L'imagerie de la perfusion vasculaire cérébrale ne peut être réalisée autrement que par un modèle in vivo.
Réduction
Il est difficile d'estimer avec exactitude le nombre d'animaux nécessaires à ce projet. Il n'est pas possible d'avoir une idée de taille d'effet puisque l'on ne comparera pas des réponses à des traitements. Pour la mise au points des modèles de vasospasme, nous avons estimé des concentrations qui semblent être cohérentes avec ce qui est décrit dans la littérature. Pour la partie du projet ou on cherche le diagnostic d’ICR par ULM l'idée sera de valider la robustesse et la reproductibilité de l'agent de contraste et la méthode développé en le comparant à l’imagerie à résonance magnétique et le doppler. Nous estimons le nombre d'animaux nécessaires à 10, afin de valider cette technique malgré les différentes variations possibles liées à la physiologie des animaux.
Raffinement
Les souris sont surveillées quotidiennement par du personnel qualifié. Une attention particulière est accordée à l'état général, l'évolution de la masse corporelle, ainsi qu'au comportement de chaque animal. Les animaux auront le temps de s'acclimater à la nouvelle animalerie après leur réception auprès du fournisseur pendant une semaine, puis seront habitués à la manipulation chaque jour pendant une semaine avant le début du protocole. Cela permettra de limiter le stress lié à l'expérimentateur, et à apprendre aux souris à coopérer. Les souris vivront en groupe dans des cages enrichies (coton, kraft et maisonnette en papier) afin de respecter leur mode de vie. Après chaque anesthésie, les souris bénéficieront de croquettes humides dans une coupelle au sol afin de favoriser la prise de nourriture et l'hydratation. Durant chaque chirurgie, les souris seront analgésiées, et sous anesthésie locale au niveau de l'incision de la peau et de la zone d'insertion du cathéter. Une application d'anesthésiant est également prévue sur les sutures pour éviter les démangeaisons ou les douleurs post-opératoires éventuelles. Un gel oculaire sera appliqué sur les yeux lors de chaque anesthésie afin d'éviter le dessèchement oculaire. Le réveil postopératoire se fera dans une enceinte post opératoire dédiée à cet effet avec une température optimale pour les animaux ne régulant plus leur température corporelle avec de l'eau et de la nourriture, jusqu'à ce que les animaux retrouvent une bonne mobilité. Concernant l'application des points limites, les animaux seront mis à mort immédiatement dans l'une des situations suivantes : - Signes de douleurs indexés sur le Grimace-Scale Souris ; -Absence de réaction ; - Animal inactif dans sa cage ; - Complications chirurgicales inattendues; - Perte de poids; - Ré ouverture de l'incision de la peau.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des pathologies neurovasculaires. L’anatomie et la physiologie de la circulation sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’Homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour permettre la localisation précise de vasospasmes et les troubles de perfusion vasculaires cérébrales. Nous utiliserons des souris adultes en rapport avec l’âge des animaux utilisés dans les études précédentes. Les souris seront de jeunes adultes. Le projet est réalisé avec de jeunes adultes afin de rester cohérent avec l'âge des souris couramment employées lors de protocoles d'étude de hémorrhagie sous-arachnoidienne (qui touche des patients jeunes) et d'optimiser la reproductibilité du protocole. Enfin, les souris ne doivent pas être trop âgées afin de pouvoir réaliser les acquisitions en imagerie ultrasonore. En effet, le crâne s'épaississant avec l'âge, il serait difficile d'imager le tissu cérébral chez des souris trop âgées.
Caractérisation de l’épuisement hématopoîétique dans un modèle de drépanocytose
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Exposées quatre-vingt-dix secondes à des rayons X, greffées avec des cellules sanguines, puis soumises à sept prélèvements de sang sous anesthésie espacés de deux semaines, 26 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur décrit l'irradiation, les transplantations, les prises de sang et l'anesthésie comme des nuisances, et ajoute que les pesées peuvent être source d'angoisse. L'objectif déclaré porte sur les mécanismes des défauts de production des cellules du sang dans la drépanocytose. Les bénéfices annoncés, un "nouvel arsenal thérapeutique" dans un futur proche, relèvent d'un programme plus large, quand la caractérisation du système hématopoïétique de ces 26 souris exige leur mise à mort.
Objectifs
L’objectif de notre étude est l’évaluation des mécanismes cellulaires et moléculaires associés aux défauts d’hématopoïèse et d’érythropoïèse dans le cadre de la drépanocytose.
Bénéfices attendus
Nous espérons que cette étude nous permettra de mieux clarifier les mécanismes physiopathologiques associés à la drépanocytose afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Ce programme s’inscrit dans un projet plus global qui devrait permettre également d’identifier les mécanismes d’action et l’efficacité de candidats médicaments afin d’offrir dans un futur proche un nouvel arsenal thérapeutique dans la prise en charge de la drépanocytose.
Procédures
L’ensemble des animaux subira une exposition à des rayonnement X (90sec), une transplantation de cellules sanguines et une série de 7 prélèvements sanguins sous anesthésie (3min) tous espacés de 2 semaines.
Impact sur les animaux
Les transplantations, l’irradiation, les prélèvements sanguins et l'anesthésie constitueront une nuisance pour les animaux. L'ensemble des manipulations, ainsi que les pesées peuvent être source d'angoisse.
Devenir
Les 26 souris impliquées dans ce projet feront l’objet d’une caractérisation de leur système hématopoïétique qui nécessitera leur mise à mort.
Remplacement
Les nombreux partenaires (cellulaires et moléculaires) des processus dynamiques d’hematopoïèse, et d’éyrthropoïèse nécessitent une approche expérimentale in vivo car il n’existe pas à ce jour de système suffisamment fiable pour mimer cette complexité biologique.
Réduction
En nous appuyant sur un test d'effectif, nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet, à savoir de déterminer s’il y a ou pas un épuisement des cellules souches hématopoïétiques dans le contexte pathologique d’une drépanocytose. Ce calcul d’effectif sera réalisé sur la base d’une expérience pilote qui implique elle-même un nombre minimum d'individus déterminé sur la base de données de la littérature. La comparaison des différentes conditions expérimentales se fera par des tests statistiques adaptés à ces petits effectifs.
Raffinement
Le suivi du développement hématopoïétique transplanté se fera par des mesures utilisant un procédé peu invasif à partir de prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie. Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvèlement d’air : 15 volumes/heure; éclairage artificiel : 12h jour/12h nuit). Afin de respecter leur instinct grégaire, les souris seront stabulées par petits groupes de 3 à 5 dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de copeaux de bois compactés, de coton et de dômes en carton. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l'apport d'un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.
Choix des espèces
Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proches de l’homme pour sa physiologie. Les données bibliographiques démontrent que le modèle murin est le plus adapté pour adresser les questions relatives à l’hématopoïèse, à l’erythropoïèse et à la thrombose. En effet les caractéristiques moléculaires des cellules hématopoïétiques murines sont très semblables aux cellules hématopoïétique humaines. Nous utiliserons des souris de 8-9 semaines qui ont un age compatible avec l’exposition à l’irradiation nécessaire à déplétion hématopoïétique.
Caractérisation d’une maladie inflammatoire de la peau déclenchée par la déficience d’un inhibiteur de protéase à sérine chez les la souris.
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
Des souriceaux de sept jours sont séparés de leur mère et de son lait pendant six heures, maintenus à 37 °C. 2 256 souris vont être utilisées, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et l'autre un niveau modéré, toutes tuées pour le prélèvement des tissus. Les animaux déficients naissent avec des moustaches désorganisées et une peau qui desquame, l'atteinte culminant vers le septième jour, et subissent quatre à cinq injections dans l'abdomen, une biopsie de la queue au sevrage et un prélèvement de sang. Le porteur reconnaît qu'un calcul statistique du nombre d'animaux est difficile, et fonde l'effectif de 2 256 sur la littérature.
Objectifs
Les maladies inflammatoires de la peau sont très répandues dans les pays développés et les stratégies de traitement efficaces font défaut en raison du manque de compréhension des mécanismes pathogènes sous-jacents. Parmi ces maladies, les plus courantes, telles que la dermatite atopique, le psoriasis et la rosacée, ont une étiologie complexe. Il existe également des maladies monogéniques rares qui peuvent donner un aperçu des maladies inflammatoires cutanées courantes. L’une de ces maladies est le syndrome de Netherton, causé par des mutations dans un gène d'intérêt montrant que sa dérégulation peut être impliquée dans des maladies inflammatoires cutanée courantes. Il a été montré qu'une déficience génétique d’un inhibiteur de protéases déclenche une inflammation cutanée moins sévère et à résolution spontanée chez la souris. L'objectif de ce projet est de caractériser cette inflammation cutanée spontané ainsi que le rôle de cet inhibiteur dans cette inflammation.
Bénéfices attendus
A court terme les résultats de cette étude permettront de caractériser le phénotype inflammatoire déclenché par la déficience en un inhibiteur de protéase chez les souris. A long terme, le nouvel aperçu physiopathologique fourni par les résultats de ce projet sera utile pour le développement de nouvelles stratégies pour le traitement de certaines pathologies inflammatoires.
Procédures
Injection en intra péritonèale sur souris vigiles : 4 à 5 injections en fonction de la procèdure, durée du geste : 30 secondes. Application de crème antibiotiques sur la peau sur souris vigiles : 3 applications, durée du geste : 30secondes. Prélèvement de sang sur souris anesthésiées : 1 prélèvement durée : environ 2 minutes. Incubation 6 heures à 37°C (température corporelle de la mère).
Impact sur les animaux
Des observations préliminaires montrent un schéma caractéristique de retard de croissance de la fourrure et de desquamation de la peau qui culmine environ 7 jours après la naissance et s'améliore progressivement avec l'âge. À la naissance, les souris déficientes peuvent présenter des moustaches désorganisées ainsi des défauts de la barrière cutanée qui déclenchent une inflammation cutanée. Tous les animaux subiront un prélèvement de biopsie de queue lors du sevrage (procédure 1) pouvant occasionner de la douleur. Les animaux soumis à une anesthésie gazeuse lors de la procédure 2 subiront un stress inhérent à cet acte. L'absence de la mère ainsi que du lait maternel pendant 6h lors de la procédure 3 induira un stress au petit souriceaux âgés de 7 jours. Les souriceaux soumis au procédures 4 et 6 pourront également être soumis à des douleurs lors des injections en intra péritonéal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour prélèvement et analyse des tissus
Remplacement
L’utilisation d’animaux est nécessaire pour ce projet car nous évaluons l'impact de la perturbation des voies de signalisation dans des types cellulaires distincts dans un contexte où les autres types cellulaires de l'organisme restent inchangés. Ces études ne peuvent donc pas être réalisées in vitro (Evaluations phenotypiques, analyse de l’intégrité de la barrière épithéliale, analyse de sang).
Réduction
De nombreux paramétres de natures variées sont à prendre en compte dans cette étude (obention des bons génotypes, numeration sanguine, dosage sur plasma, imuno histo chimie) ce qui rend difficile tout calculs statistiques concernant le nombres minimum d animaux requis. Pour cela nous nous somme basés sur les études reportées dans la litérature utilisant les mêmes approches expérimentales. En évaluant plusieurs paramètres chez les mêmes animaux, nous évitons les duplications.
Raffinement
Afin de prévenir au maximum la souffrance et l’angoisse infligée aux animaux, les procédures se dérouleront avec une surveillance quotidienne par des animaliers. Des points limites ont été établis dans les différentes procédures, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Les prélèvements de sang se feront sous anesthésie (à différents âges) afin de prévenir toute souffrance chez l’animal et les prélèvements de biopsie de queue seront réalisés au moment du sevrage via des petit fragment d’environ 1-2 millimètres afin d’occasionner le moins de douleur possible.
Choix des espèces
L'étude des pathologies humaines est souvent limitée par l'absence de modèle animal. Les souris sont de bons modèles car ce sont des mammifères suffisamment proches de l'espèce humaine. De plus elles se prêtent particulièrement à des manipulations génétiques. Par exemple : Les souris chimériques que nous avons créées, nous permettent d'aborder spécifiquement le rôle d'un inhibiteur de protéase à sérine dans le developpement post natal jusqu’à la souris adulte. Pour l’élevage les souris seront utilisées de la naissance jusqu’à l’âge adulte. Pour les modèles expérimentaux, la caractérisation de l’inflammation cutanée sera évaluée au cours du temps entre le 1er jour de vie jusqu’à 70 jours de vie post-natale. L’inflammation étant bien plus marqué en début de vie.
Altérations myocardiques localisées à l’origine de la mort subite d’origine cardiaque chez le porc
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
194 cochons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et chacun passe sous anesthésie générale pour deux IRM d'environ 2 heures, deux cartographies électriques du cœur d'environ 1 h 30, la création d'un infarctus, puis le prélèvement de son cœur, au cours duquel il est tué. Les secondes séances d'IRM et de cartographie ont lieu à son retour, après un délai suivant l'infarctus que le porteur ne précise pas, et 140 d'entre eux reçoivent aussi un boîtier de télémétrie implanté. L'infarctus peut provoquer une insuffisance cardiaque ou une fibrillation ventriculaire, et les réveils une désorientation et une apathie. Le porteur annonce que le projet "devrait permettre" de prévenir la mort subite par des défibrillateurs implantables ou des traitements anti-arythmiques. La création de l'infarctus concerne les 194 cochons, mais la répartition fournie, 54 par ischémie-reperfusion et 48 par occlusion progressive, n'en couvre que 102.
Objectifs
Les principaux objectifs du projet sont de comprendre les mécanismes cellulaires et tissulaires impliqués dans les troubles électriques à l’origine de la mort subite cardiaque (SCD), et d’identifier les sujets à risque en caractérisant les signaux électriques cardiaques directement liés à ces anomalies en les détectant de manière non invasive à la surface du corps. Notre objectif est donc d’identifier des marqueurs électriques directement à la surface du corps de manière non-invasive afin d’améliorer la qualité de vie.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre la prévention de la mort subite cardiaque par des défibrillateurs implantables ou des traitements anti-arythmiques.
Procédures
Imagerie non invasive IRM : sous anesthésie générale concerne 194 animaux ; 2 fois pour chaque animal : avant la création de l’infarctus et au moment du retour de l’animal avant le prélèvement durée environ 2h par examen. Cartographie de contact : sous anesthésie générale concerne 194 animaux ; 2 fois pour chaque animal : avant la création de l’infarctus et au moment du retour de l’animal avant le prélèvement durée environ 1h30 par examen. Implantation du boitier de télémétrie : sous anesthésie générale concerne 140 animaux ; juste une fois avant la création de l’infarctus durée environ 1h par implantation. Création d’un infarctus : sous anesthésie générale concerne 194 animaux ; juste une fois, environ 2h pour chaque création. concerne 54 cochons qui auront un infarctus créé par ischémie reperfusion et 48 cochons par occlusion progressive. Prélèvement simple du cœur : sous anesthésie générale, concerne 194 animaux ; 1 fois pour chaque animal car le prélèvement entrainera la mise à mort de l’animal, durée environ 30 min par prélèvement.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables éventuels peuvent être liés aux anesthésies (hypothermie) réalisées aux différentes phases du projet notamment lors du réveil de l'animal (désorientation, apathie). La création de l’infarctus pourra également entraîner des effets indésirables au niveau cardiovasculaire tels que l’insuffisance cardiaque ou la fibrillation ventriculaire. De plus, des saignements pourraient apparaitre aux sites d’introduction des cathéters au niveau de la patte avant (pour la perfusion de médicaments et d’agents de contraste) et au niveau de la veine fémorale (guide pour la cartographie de contact).
Devenir
Afin de prélever le cœur et d’effectuer des études fonctionnelles (cartographie optique) et structurales ex vivo (histologie, micro-scanner, etc.), qui nous permettront de mieux comprendre les caractéristiques électrophysiologies de l’infarctus, l'ensemble des animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Le REMPLACEMENT des animaux n’est actuellement pas possible. En effet, l'étude des mécanismes physiologiques complexes dans leur globalité nécessite d’avoir recours à un modèle animal et il n'existe pas à ce jour de modèle de modélisation pour répondre aux objectifs.
Réduction
Une attention sera portée à la REDUCTION du nombre de ces animaux utilisés dans les projets de réaffectation (mutualisation avec d’autres projets). Dans cet objectif de réduction, nous ferons également en sorte que chaque animal soit son propre contrôle dès que cela sera possible.
Raffinement
Le RAFFINEMENT du projet et le respect du bien-être animal reposent sur plusieurs mesures : - les animaux sont hébergés dans des locaux agréés et bénéficient de surveillance et soins quotidiens dispensés par du personnel compétent et soucieux du bien-être animal - les animaux sont habitués au personnel animalier afin de limiter tout stress - les animaux sont hébergés en groupes sociaux ce qui leur permet d’exprimer des comportements naturels. Ils disposent d’enrichissements adaptés (Kong, balles, jouets en caoutchouc durs mastiquables...) - toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale (mise en œuvre et surveillée par du personnel dédié) et une analgésie adaptée est systématiquement mise en place - des critères d’alerte précis sont surveillés; si l’animal présente un signe d’appel, des mesures adaptées sont mises en place immédiatement (ajout d’analgésique par exemple). À chaque cas clinique inquiétant, un examen vétérinaire approfondi est mis en place à la suite duquel peut être envisagé un traitement médical, des examens complémentaires ou le cas échéant, la demande de l’euthanasie de l’animal.
Choix des espèces
Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme (mouton, porc, chèvre, chien), le porc a été retenu car (i) les équipes qui possèdent une très grande expérience sur la création du modèle d’infarctus avec cette espèce (ii) ce modèle animal est bien décrit et caractérisé et constitue donc une référence dans la communauté scientifique ; (iii) le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ce modèle animal. Les porcs seront utilisés à partir de 25kg car à ce stade ils possèdent des caractéristiques fonctionnelles et structurelles très proches de celle de l’Homme.
Implication de la signalisation Wnt dans l’apparition de trouble cognitifs vasculaires et les maladies neurodégénératives.(UE2/3 chronobiotron)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
472 souris privées du récepteur aux LDL vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune soumise à un régime enrichi en cholestérol pendant deux à cinq mois et à une IRM de deux heures et demie. Jusqu'à 260 d'entre elles reçoivent six à dix injections dans la veine de la queue ou dans l'abdomen, geste qui peut entraîner une nécrose au point de piqûre. Le porteur annonce des œdèmes de la face et des membres en fin de régime, une insuffisance cardiaque possible et une prostration, chaque animal atteignant un de ces seuils étant tué et ses organes prélevés. Le bénéfice avancé, une meilleure prise en charge des patients atteints de démence vasculaire, est renvoyé au long terme et conditionné à des résultats concluants.
Objectifs
Les maladies neurodégénératives sont des maladies qui affectent le cerveau. Les plus connues sont la maladie d’Alzheimer ou de Parkinson. Il en existe de nombreuses autres comme une maladie connue sous le nom de Niemann-Pick qui est dû à l’accumulation de cholestérol directement dans les cellules du cerveau. Cette accumulation de cholestérol a également été montrée dans la maladie d’Alzheimer. Ce cholestérol, peut également s’accumuler dans les parois des vaisseaux sanguins qui irriguent le cerveau, formant des lésions d’athérosclérose qui empêchent une bonne oxygénation des neurones et aboutit à une altération du fonctionnement cognitif : la démence vasculaire. L’objectif de ce projet est l’identification des mécanismes par lesquels des protéines spécifiquent régulent le taux de cholestérol dans la cellules. Nous étudierons comment ces proteines sont impliquées dans l’apparition des altérations cognitives, morphologique du cerveau et métaboliques liées à la démence vasculaire et aux maladies neurodégénératives.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une connaissance fine de la survenue des phénomènes de démence vasculaires liés aux dépôts de cholestérol dans les artères et de déterminer si l’injection d’anticorps anti-proteine X (confidentiel) est en mesure de prévenir ou diminuer la gravité de ces atteintes cérébrales et cardiovasculaires. A long terme, si les résultats obtenus sont concluants, cette études permettra une meilleur prise en charge des patients atteint de démence vasculaire et autres maladies neurodégénératives liées à une perturbation du métabolisme du cholestérol.
Procédures
Les animaux seront soumis à un régime riche en cholestérol pendant 2 mois ou 5 mois. Certains animaux (au maximun 260) seront soumis à 6 injections (protocole de 2 mois de régime) ou 10 injections (protocole de 5 mois de régime) dans la veine caudale (processus de 10 minutes environ) ou intrapéritonéale (2 minutes environ). Les animaux pourront subir un stress léger lors des manipulations. Les animaux seront soumis également à une IRM (durée 2 à 2,5H).
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent développer des oedème faciaux et des membres en toute fin de la période de régime proathérogène. Un stress engendré par les injections à la queue ou intrapéritonéale et lors de l'anesthésie finale en IP. L'injection à la queue peut potentiellement entrainer une nécrose au point d'injection. Le traitement (en début de régime et après traitement avec les anticorps) peut potentiellement entraîner une perte de poids.
Devenir
Les animaux soumis à un régime riche en cholestérol et traité par anticorps seront euthanasiés pour prélever les organes à des fins de caractérisation histologiques et biochimiques et ainsi répondre aux objectifs de l'étude.
Remplacement
ll n'est pas encore possible de nos jours de modéliser les processus cognitifs de façon assez fiable et complète dans un modèle in silico des pathologies étudiées. Il est donc nécessaire de recourir à des modèles animaux dont on analyse la relation entre la neuropathologie, la connectivité cérébrale et les performances cognitives. Pour le projet concernant la démence vasculaire, l’athérosclérose est un phénomène multifactoriel qui ne peut être totalement décrit par un modèle cellulaire et nous devons intégrer les facteurs présents in vivo qui sont responsables de la survenue de cette pathologie.
Réduction
Si nous obtenons des résultats significatif avant la fin de l'étude, nous n’utiliserons pas le nombre total d’animaux demandé (472 animaux sur 5 ans au total). Nous utiliserons également nos souris SmWnt5a, SmLRP1 afin de faire des cultures de cellules musculaires de vaisseaux sanguins et de cellules cardiaques, dans le but d’identifier les mécanismes cellulaires par lesquels Wnt5a protège de l’accumulation du cholestérol. La partie « culture de cellules » permettra de limiter le nombre d’animaux nécessaire à notre étude, car nous utiliserons peu d'animaux pour mettre en culture les cellules musculaires lisse, alors que cette même étude mécanistique In vivo nécessiterait un plus grand nombre d'animaux. Pour chaque étude, la taille des groupes a été déterminée mathématiquement et les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques pour mettre en évidence le rôle de la protéine wnt5 dans les troubles cognitifs vasculaires et les maladies neurodégénératives.
Raffinement
Nous mettrons en place différents points limites dans notre expérimentation pour atténuer autant que faire se peut la gêne de nos animaux liée au régime riche en cholestérol : ces points limites sont définis en tenant compte de l’aspect et du comportement des animaux au cours du régime (oedèmes dû à l’insuffisance cardiaque qui peut s’installer, prostration). Le suivi de l’état des animaux sera quotidien et les animaux seront soumis à une inspection visuelle. Dès qu'un animal atteint un des points limites, il sera euthanasié et ces organes prélevés pour étude.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus utilisée pour les délétions de gènes (souris Knock Out conditionnel ou non). Nous utilisons un modèle de souris génétiquement modifiée sur un fond génétique C57BL/6J, LDL-/- (Low Density Lipoprotein). Ces souris sont KO pour le récepteur aux LDL afin d’accélérer la formation de lésions d’athérosclérose lorsqu’elles sont soumises à un régime riche en cholestérol (paigen). Ce fond génétique n’a aucun impact sur la longévité ou le bien être des souris hors régime paigen. Pour les groupes avec un régime standard ou proathérogène de type paigen pendant 2 à 5 mois, nous utiliserons des souris adulte de 3 mois, afin de déterminer l‘évolution de la maladie sur les plans histologique, biochimique et fonctionnelle (IRM ) et cognitif (Arène ouverte). Les souris de 3 mois ont atteint leur taille et poids adulte, ce qui permet une meilleur reproductibilité des résultats.
Pharmacothérapies pour améliorer la structure-fonction artérielle dans des conditions physiopathologiques liées à des altérations des fibres élastiques (2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
2 475 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 383 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et chacune passe neuf séances de quinze minutes de mesure de pression artérielle par manchon à la queue. Un tiers subit quatorze jours d'hypoxie intermittente, avec perte de poids et baisse de la prise alimentaire les premiers jours. Les deux autres tiers portent une délétion du gène de l'élastine ou de la fibrilline-1 qui altère leurs vaisseaux dès la naissance et peut conduire à des sténoses ou des anévrismes, et une partie est hébergée jusqu'à 24 mois pour l'étude du vieillissement, isolée quand les congénères meurent de vieillesse. Le porteur annonce que ces travaux permettront de proposer la stratégie thérapeutique la plus appropriée pour trois maladies humaines. Les organes vitaux, eux, sont prélevés sur chaque souris au cours d'une procédure sans réveil.
Objectifs
L'élasticité des grosses artères est essentielle pour permettre une perfusion correcte des tissus. Les fibres élastiques, responsables de l'élasticité artérielle, sont composées à 90% d'élastine (Eln) et à 10% de microfibrilles riches en fibrilline-1 (Fbn1), et ne sont produites que jusqu'à la fin de l'adolescence, ne faisant ensuite que fonctionner tout en se dégradant (avec perte d'élasticité artérielle) jusqu'à la fin de la vie. Cette dégradation de l'élasticité artérielle a des conséquences délétères majeures sur la fonction cardiaque, la pression et la circulation sanguines, et la perfusion des organes. C'est ce qui advient au cours du vieillissement normal, mais aussi dans les maladies génétiques liées à l'organisation anormale des fibres élastiques : syndrome de Williams-Beuren (rétrécissements artérielles dûs à la déficience en Eln) et syndrome de Marfan (anévrismes dûs à la déficience en Fbn1). Des études récentes ont également montré que l'altération des fibres élastiques et les dysfonctions artérielles correspondantes (dont la rigidification artérielle) sont associées à l'hypoxie intermittente générée par le syndrome d'apnée obstructive du sommeil, qui concerne 10-20% de la population générale et jusqu'à 30-50% des personnes âgées. Il a préalablement été démontré que 3 traitements pharmacologiques, administrés à des souris, peuvent, dans des situations fixées, protéger et/ou restaurer la production des fibres élastiques et diminuer la rigidité artérielle. Ces 3 traitements n'ayant jusqu'alors pas été appliqués dans les mêmes situations pathologiques, ce projet propose de comparer de manière systématique chez les mêmes souris l'efficacité des 3 traitements, dans trois modèles pathologiques présents au laboratoire, en fonction du sexe et de l'âge. Le but ultime est de proposer le traitement le plus efficace pour chacune des trois pathologies, chez les patients humains. Le projet sera mené dans 2 établissements utilisateurs qui apporteront chacun l'accès à des techniques spécifiques différentes.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche est motivé par l'importance en santé publique de la dégradation des fibres élastiques artérielles dans différentes situations physiopathologiques comme le vieillissement, la déficience génétique du gène de l'élastine ou de la fibrilline-1, ou l'hypoxie intermittente causée par le syndrome d'apnée du sommeil. Ceci conduit à des dysfonctions artérielles et à l'hypertrophie et l'insuffisance cardiaques induites, couplée à une hémodynamique altérée, une mauvaise perfusion et une dysfonction des organes. La réparation des fibres élastiques dégradées est donc un enjeu thérapeutique majeur. La littérature fait état de nombreux travaux à ce sujet (plusieurs milliers, motsclefs: elastic fiber artery), montrant l'intérêt général pour comprendre les mécanismes et améliorer ou restaurer l'élasticité artérielle. Les résultats obtenus sur ces modèles de souris permettront de vérifier et de comparer les efficacités des trois traitements pharmacologiques dans le maintien ou l'amélioration de l'élasticité artérielle et des paramètres physiologiques associés chez des animaux modèles de 3 pathologies humaines. Suivant la pathologie, le traitement le plus efficace pourra s'avérer ne pas être le même, et nos résultats permettront donc de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique la plus appropriée chez les patients atteints par chacune de ces trois affections.
Procédures
1/3 des animaux seront exposés à la normoxie ou à l'hypoxie durant 14 jours avant leur mise à mort. Les autres animaux (2/3) ont un gène délété qui altère, dès la naissance, la plasticité et l'élasticité de leurs vaisseaux : 1/3 des animaux seront déficients pour le gène de l'élastine ou seront les animaux témoins de ceux-ci, et 1/3 des animaux seront déficients pour le gène de la fibrilline-1 ou seront les animaux témoins de ceux-ci. Dans chacun de ces 3 groupes d'animaux, les effets de 3 traitements pharmacologiques seront étudiés : un premier tiers des animaux de chaque groupe sera traité durant 3 mois avant la fin de l'étude par le premier traitement pharmacologique (dans l'eau de boisson), un deuxième tiers des animaux de chaque groupe sera traité durant 3 mois avant la fin de l'étude par le deuxième traitement pharmacologique (dans l'eau de boisson), et le dernier tiers des animaux de chaque groupe sera injecté dans la veine de la queue 3 fois à 5 jours d'intervalle juste avant la fin de l'expérimentation avec le troisième traitement pharmacologique ou du sérum physiologique (durée de l'injection 30 secondes). Tous les animaux seront soumis à des mesures de pression artérielle vigile (3 fois par jours pendant 3 jours, à raison de 15 minutes par session), non-invasives, par sphygmomanométrie à la queue (tail-cuff). La fonction cardiaque et aortique sera mesurée une fois, en fin de protocole, par échographie sous anesthésie gazeuse d'une durée moyenne de 30 minutes. A la fin de l'ensemble des procédures, des prélèvements d'organes seront réalisés sous anesthésie et analgésie, entrainant la mort des animaux. Ces organes seront utilisés par la suite dans des expériences de physiologie, de biochimie, d'histologie et de biologie moléculaire, et pour réaliser des cultures de cellules musculaires lisses vasculaires. De plus, les animaux mis en vieillissement pour former les groupes des souris âgées de 24 mois auront, par conséquent, un hébergement de longue durée. Les expériences d'échographie sur animal anesthésié seront réalisées dans l'EU2 ; toutes les autres expériences seront réalisées dans l'EU1, porteur principal du projet.
Impact sur les animaux
La mesure sur animal éveillé de la pression artérielle peut induire un léger stress. Les animaux en hébergement longue durée pour du vieillissement pourraient se retrouver isolés si leurs congénères venaient à mourir de vieillesse. La mise en hypoxie des animaux entraine une perte de poids les premiers jours le temps de l'adaptation à la restriction d'air de façon récurrente et répétée et une diminuation de leur prise alimentaire. Les animaux génétiquement modifiés ont une perte l'élasticité et de plasticité de leur vaisseaux pouvant conduire à des sténoses ou à des anévrismes. L'administration des traitements testés devraient limiter les effets délétaires de l'hypoxie ou celles induites par les modifications génétiques, voire améliorer la plasticité et l'élasticité vasculaire.
Devenir
Tous les animaux se verront appliquer un prélèvement d'organes vitaux terminal au cours d'une procédure sans réveil. Aucun animal ne restera donc en vie à la fin des procédures expérimentales. Ces prélèvements d'organes permettront des études d'artériographie de pression, d'histologie classique ou en microscopie synchrotron, de biologie moléculaire (expression des gènes et protéines liés aux fibres élastiques) et, concernant l'aorte, pour généréer des primocultures de cellules musculaires lisses vasculaires.
Remplacement
Remplacer : la mécanique et la réactivité vasculaires reposent sur une interaction fonctionnelle des systèmes nerveux et vasculaires, ainsi qu'une interaction entre les signaux circulants et les différents types cellulaires vasculaires, aussi bien que sur l'interaction entre les différents types de cellules vasculaires structurées de manière très précise dans la paroi, nécessitant forcément une approche in vivo. Aucune méthode alternative ne peut donc se substituer à l’utilisation des animaux pour la réalisation de notre projet car il requiert une approche intégrée.
Réduction
Réduire : Sur la base des résultats de nos expériences publiées antérieurement et du niveau de dispersion des données constaté chez les souris, le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats : 12 animaux par groupe chez les adultes (16 par groupe à mettre en vieillissement pour obtenir 12 animaux agés, du fait du taux de décès spontané avant 24 mois) sont prévus mais le maximum de procédures expérimentales non-sévères seront réalisées sur tous les animaux, ce qui permet de ne pas devoir recourir à des groupes d'animaux séparés/additionnels pour réaliser des procédures différentes, sauf nécessité absolue due à l'impossibilité de réaliser de multiples études de physiologie sur différents organes vivants en même temps. Aussi, nous aurons besoin de constituer des groupes témoins non-traités pour chaque traitement, sans pouvoir les mutualiser de manière générale. Cependant, deux des traitements pharmacologiques étant tous deux simplement ajoutés à l'eau de boisson des animaux, nous constituerons des groupes témoins mutualisés pour ces deux traitements (animaux buvant de l'eau de boisson normale), ce qui permettra une réduction sensible du nombre d'animaux utilisés. Après la réalisation des procédures in vivo et l'euthanasie des animaux, nous allons collecter les organes et tissus de ces mêmes animaux pour les utiliser au cours des études ex vivo et in vitro post-mortem, rationnalisant encore ainsi le nombre des animaux utilisés. Enfin, un certain nombre d'expériences de signalisation cellulaire seront menées sur des primocultures de cellules musculaires lisses vasculaires issues de nos souris, ce qui permettra de réduire encore le nombre des animaux nécessaires pour atteindre nos objectifs.
Raffinement
Une attention générale sera portée à la qualité des méthodes d'anesthésie et d'analgésie des animaux. De plus, une surveillance attentive sera réalisée pendant l'hébergement et lors de la réalisation des procédures expérimentales afin d'évaluer en permanence les nuisances subies (douleur, stress, ...), de façon à pouvoir appliquer immédiatement un renforcement analgésique et/ou anesthésique si nécessaire et faire en sorte que ces nuisances soient absentes ou réduites à leur niveau minimum. Les conditions de l'hébergement de longue durée des animaux en vieillissement, seront particulièrement surveillées afin de limiter au maximum les risques de décès spontané liés à l'âge. L'organisation des cages sera optimisée (mise en place d’enrichissement supplémentaire pour les animaux âgés en situation d’isolement, croquettes mouillées au sol dans les cages pour les animaux âgés). Les conditions d'expérimentation seront aussi optimisées pour le confort des animaux, avec habituation à la contention (mesures de pression artérielle) et gel oculaire appliqué lors d'anesthésies longues (échographie). Des points limites prédictifs et précoces, gradés précis et adaptés, ainsi que des critères d'arrêt, sont définis, et un arbre décisionnel mis en place, permettant aux personnels de décider des actions à réaliser pour le bien-être des souris et l'application des points limites et critères d'arrêt définis. Les expérimentateurs et soigneurs seront formés pour appliquer ces procédures et règles de protection du bien-être animal, conformément à la règlementation. Aussi, les lignées de souris génétiquement déficientes pour l'élastine ou la fibrilline-1 sont à phénotype dommageable car les individus homozygotes meurent quelques jours ou semaines après la naissance. Les animaux homozygotes n'étant pas un objet de notre étude, ils ne seront pas produits, en n'effectuant que des croisements d'animaux de type sauvages avec des animaux hétérozygotes. En raison d'une mortalité intra-utérine partielle des animauxhétérozygotes pour l'élastine, les mères seront particulièrement surveillées en période périnatale (deux fois par jour au lieu d'une) de façon à détecter au plus vite tout problème et appliquer les mesures de soin ou critères d'arrêt définis. Le transport des animaux entre les 2 EU est fait par un expérimentateur compétent, en cage d'hébergement standard, temporairement occultée, avec eau, croquettes et enrichissement.
Choix des espèces
Nos travaux évalueront l'efficacité réparatrice de trois traitements pharmacologiques sur les fibres élastiques artérielles altérées dans des situations physiopathologiques existant chez l'Homme (déficits génétiques responsables des syndromes de Williams-Beuren et de Marfan, et hypoxie intermittente due à l'apnée obstructive du sommeil), en fonction de l'âge et du sexe. Notre étude concerne la physiologie cardiovasculaire et les fibres élastiques artérielles altérées dans des situations physiopathologiques existant chez l'Homme. Des modèles alternatifs d’animaux de classes phylogénétiques inférieures (drosophile, zebrafish, c-elegans) utilisés parfois en recherche fondamentale ne sont pas pertinents pour les questions scientifiques abordées dans ce projet. Les souris sont le modèle de référence utilisé en recherche fondamentale dans ce domaine, ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec nos résultats antérieurs et avec la littérature. Les souris utilisées dans le cadre de ce protocole sont âgées de 6 mois (jeunes adultes) et de 24 mois (âgées), ce qui correspond aux âges ciblés pour une vérification optimale des potentialités thérapeutiques des trois traitements pharmacologiques sur nos modèles murins physiopathologiques.
Effets de l’hyperglycémie sur la O-GlcNacylation de la eNOS au niveau vasculaire : effets protecteurs des polyphénols de pomme
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une injection de streptozotocine dans l'abdomen pour faire monter le sucre sanguin, quarante-huit heures d'attente, trois gavages d'eau ou de molécules extraites de la pomme, puis une anesthésie pour mesurer la réaction des vaisseaux. 100 rats Wistar vont être utilisés ainsi, tous tués à l'issue pour prélever leurs artères, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié seulement reçoit la streptozotocine, l'autre servant de comparaison, et le porteur attend de l'expérience une piste nutritionnelle contre les atteintes vasculaires du diabète. Il retient le rat parce qu'il fournit assez de tissu pour plusieurs dosages, ce qu'il compte comme une façon de limiter le nombre d'individus utilisés.
Objectifs
Ce projet aura pour objectif d’évaluer les effets de de l’augmentation du glucose sanguin sur la fonction vasculaire ainsi que les eventuels effets protecteurs de la consommation concommitante de molécules de pomme qui sont reconnus pour leur action bloquante sur les transporteurs du glucose. Nous chercherons donc dans un premier temps à voir l'effet du glucose sur les modifications de la protéine qui régule la fonction vasculaire et évaluer si l'ajout de bloqueurs des transporteurs du glucose permettent de réverser ces modifications.
Bénéfices attendus
Le projet doit apporter une meilleure connaissance des mécanismes de dysfonction vasculaire associée à une forte concentration de sucre dans le sang. L’étude de l’implication des mécanismes de modulation de la dysfoncion vasculaire médiée par l’augmentation de la concentration de glucose dans le sang permettra de mieux appréhender les altérations de ces tissus dans des pathologies telles que le diabète. Enfin l’utilisation de molécules de pomme permettra d’évaluer l’implication des différents transporteurs du glucose et d’éventuellement mettre en avant une stratégie nutritionnelle efficiente pour limiter les altérations liées au glucose
Procédures
La moitié des animaux recevra une injection intrapéritonéale de Streptozotocine (molécule permettant d’induire une hausse du glucose sanguin), 48 heures avant l'évaluation de la fonction vasculaire ou les prélèvements post-mortem. Les animaux avec une forte concentration de glucose dans le sang (streptozotocine) ou non seront soumis à une supplémentation orale aigue (3 traitements oraux) en eau ou en molécules issues des pommes. Une anesthésie sera réalisée et associée à une injection d’analgésique afin de réaliser des doses-réponses de molécules ayant un effet relaxant vasculaire.
Impact sur les animaux
L'induction d'une hausse de la concentration de glucose dans le sang par injection intra-péritonéale de Streptozotocine est une procédure pouvant entrainer des douleurs faibles au site d'injection. Suite à cette injection les animaux seront placés sous surveillance durant 2 heures puis seront surveillés quotidiennement. La supplémentation par voie orale (gavage) ainsi que l’induction de l’anesthésie gazeuse pouvant être source de stress ou de douleurs modérées pour l’animal, les animaux seront habitués au gavage par un manipulateur expérimenté.
Devenir
Afin de pouvoir évaluer les effets des différents transporteurs du glucose, nous devons réaliser des analyses sur les tissus des artères des animaux inclus ce qui nécessite la mise à mort des 100 rats Wistar en fin de procédure.
Remplacement
Ce projet visant à évaluer les effets du glucose sur les modifications des protéines vasculaires fait l’objet de différentes expérimentations. Des expérimentations in-vitro sont actuellement conduites pour évaluer les mécanismes de ces voies de signalisation. Par ailleurs, les études in-vitro nous ont permis d’évaluer l’intérêt de l’utilisation des 2 molécules de pomme que sont la phlorizine et la phlorétine dans la limitation des effets délétères liés au glucose. Cependant la balance entre les différentes modifications protéiques au niveau vasculaire est complexe et l’évaluation de l’effet de stratégies nutritionnelles nécessite l’utilisation de modèle in-vivo afin d’évaluer l’influence de ces différentes conditions. L’intégration d’expérimentations animales apparait donc comme nécessaire afin de compléter ce projet de recherche.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire afin de réaliser les mesures de réactivité vasculaire in-vivo tout en s’assurant de la répétabilité du résultat. Pour cela un nombre minimum de 10 animaux par condition apparait comme nécessaire. Des groupes doivent être conduits pour l’évaluations de nos différentes conditions sur la fonction vasculaire et d’autre groupes sont nécessaires pour quantifier les modifications protéiques au niveau de ces mêmes tissus.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés durant 7 jours après leur arriver à l’animalerie avant toute procédure. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les rats sont hébergés en cages de 3 individus avec un enrichissement du milieu (tubes, coton, bâtons à ronger). La nourriture est standard ad libitum et un accès à de l’eau fraiche. La température et l’hygrométrie sont contrôlées. Les animaux sont visités quotidiennement par un personnel formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une fiche intégrant les différents points limites. Afin d’éviter toute douleur, les prélévements seront réalisés sous anesthésie associée à une analgésie.
Choix des espèces
Le rat est un modèle pertinent pour l’étude du système cardiovasculaire. De plus son utilisation permet d’obtenir des quantités de tissu suffisantes pour la réalisation de plusieurs dosages biochimiques permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux nécessaires. Afin d'éviter des modifications liées au développement des animaux, les animaux seront utilisés à un stade mature (rats de 12 semaines) pour être représentatif d’une population adulte