Système nerveux

Implantés d'électrodes d'électroencéphalogramme dès l'âge de 14 jours, puis porteurs de mini-pompes osmotiques remplacées chaque mois, 200 rats sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélèvement d'organes. S'y ajoutent trois ponctions lombaires, trois examens par résonance magnétique sous anesthésie et un test de dépression associé à une restriction alimentaire. Il s'agit de tester des esters de cétones et du lactate comme substituts au régime cétogène chez un modèle de déficit en GLUT1, maladie rare dont un quart des patients ne répond pas à ce régime. Le porteur retient le rat plutôt que la souris parce que le modèle murin ne fait pas de crises d'épilepsie et parce que l'imagerie par résonance magnétique gagne en résolution sur un animal plus gros.

Objectifs

La diffusion du glucose à travers les barrières tissulaires est facilitée par une famille de protéines dont le transporteur de glucose de type 1 (GLUT1). Le syndrome de déficience en GLUT1 est un syndrome de défaillance énergétique cérébrale causée par une altération du transport du glucose à travers les barrières du tissu cérébral. Cette maladie rare est caractérisée par une épilepsie pédiatrique résistante aux traitements, un retard de développement et des troubles moteurs complexes. Les patients sont traités efficacement avec des thérapies diététiques cétogènes (régime riche en graisses) qui fournissent un carburant supplémentaire, à savoir des corps cétoniques (composés produits par le foie lors de la dégradation des acides gras), pour le métabolisme énergétique du cerveau. Cette thérapie est inefficace pour 1/4 des patients. Le projet vise à tester l'efficacité de l'apport de nouvelles sources énergétiques : des esters de cétones (permettant une cétose (brulûage des graisses pour produire de l'énergie) thérapeutique plus rapide que le régime cétogène) et le lactate, sur un modèle de rat génétiquement réprimé pour GLUT1.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est une neuroprotection de l'administration des esters de cétones ou du lactate, permettant de s'affranchir du régime cétogène. En effet, ce régime contraignant est souvent mal vécu par les patients. Si ces stratégies s'avèrent neuroprotectrice et peuvent remplacer ce régime, des études plus approfondies pourraient permettre la mise en place d'un protocole d'administration d'esters de cétones ou de lactate, améliorant la qualité de vie de ces patients.

Procédures

Les animaux subiront les interventions suivantes : - biopsie de la queue pour génotypage : 1 fois, 5 min - mise en place du système d'enregistrement EEG, sous anesthésie gazeuse : procédure chirurgicale , réalisée 1 fois, durée 20 min - implantation des mini-pompes osmotiques permettant de délivrer le lactate, sous anesthésie gazeuse : procédure chirurgicale, réalisée 1 fois par mois, 10 min. - injection intrapéritonéale : 2 fois, quelques secondes - ponction lombaire : prélèvement sur animaux anesthésiés , réalisés 3 fois, durée 10 min - prélèvements pour dosages biologiques : 4 fois, quelques secondes - examens par résonance magnétique nucléaire : examen non-invasif sous anesthésie gazeuse , réalisé 3 fois, durée : 45 min. gavage pré-IRM, réalisé 2 fois, durée 30 sec. La neuroprotection sera évaluée au niveau fonctionnel par des tests de comportements moteurs (1 fois, 10 min), de réflexes (3 fois, 5 min) et de mémoire (1 fois, 5 min). La dépression sera évaluée par un test comportemental associé à une restriction alimentaire (1 fois, test sur 4 jours).

Impact sur les animaux

La biopsie de la queue réalisée pour le génotypage entraînera une douleur légère de courte durée. L'implantation des mini-pompes osmotiques pourra entraîner une douleur modérée. Les prélèvements pour les mesures biologiques pourraient entraîner une nuisance légère. Les anesthésies (pose EEG et examens IRM) pourraient induire une détresse cardio-respiratoire, mesurée grâce à un capteur placé sous l'animal, du fait de la variabilité de la sensibilité aux anesthésiques. Une anesthésie prolongée pourrait mener à la déshydratation de l'animal. Suite à l'opération, la plaie suturée pourrait s'infecter ou présenter des difficultés à cicatriser (risque faible). Les différents tests comportementaux pourraient induire stress et anxiété pour les animaux. Lors du test de comportement de dépression, la nécessité d'une restriction alimentaire pourrait entraîner une perte de poids et être une situation angoissante pour les animaux (nuisance modérée).

Devenir

Mise à mort des animaux pour prélèvement d'organes pour une analyse post-mortem (n = 200)

Remplacement

Des modèles cellulaires de déficit en GLUT1 existent, cependant, ces modèles s'affranchissent de la (patho)physiologie de l'organisme entier. Le but final de ce projet de recherche a une envergure translationnelle et nécessite donc une approche intégrative. De ce fait, ce projet nécessitant le fonctionnement du cerveau dans son intégrité afin de tester l'effet neuroprotecteur des molécules et de pouvoir envisager une application rapide chez l'Homme, il n'existe pas de remplacement disponible à notre modèle.

Réduction

Une réduction des animaux est rendue possible par le fait que l'imagerie par résonance magnétique est une technique d'investigation non-invasive qui permet un suivi des animaux ainsi que la réalisation de tests comportementaux, sur les mêmes animaux. Les différences intergroupes seront mises en évidence par des tests statistiques.

Raffinement

Au niveau de l'hébergement, les animaux seront acclimatés à leur arrivée et seront élevés en cage collective, sur une litière en peuplier, caractérisée par un fort pouvoir absorbant et une granulométrie adaptée. L'hébergement sera enrichi d'un nid végétal, du coton et un tunnel en carton. Les animaux seront observés de façon journalière par le zootechnicien et/ou la personne en charge de l'expérimentation. Les chirurgies (implantation des pompes osmotiques, pour le groupe traité avec du lactate et mise en place des systèmes d'enregistrement d'électroencéphalogramme, ponction lombaire) seront réalisées sous anesthésie avec une antalgie adaptée. Les règles d’asepsie seront respectées. Une surveillance accrue, des soins post-opératoires et des mesures de gestion de la douleur seront réalisés. Une évaluation objectivée de l’état des animaux avec l’utilisation de grille d’évaluation/fiche de suivi, suivie de soins en cas de détection de souffrance seront mis en place. Pour les imageries par résonance magnétique sous anesthésie, un monitoring de la respiration sera mené afin de prévenir tout arrêt cardiorespiratoire. Tout au long de l’étude, les points limites adaptés et gradés seront appliqués, avec si nécessaire une prise de décision de mise à mort.

Choix des espèces

Il existe un modèle du syndrome de déficit en GLUT1 chez la souris mais ce modèle en présente pas de crises d'épilepsie. De plus, l'imagerie par résonance magnétique est une technique non-invasive mais qui présente une faible sensibilité : plus les modèles sont gros et meilleure est sa résolution. Le rat est donc un modèle plus approprié que la souris. Les animaux seront utilisés de 14 jours de vie à 125 jours. Les dispositifs d'enregistrement d'électroencéphalogramme seront implantés à 14 jours de vie afin de pouvoir monitorer dès le sevrage les effets des différents traitements. Les animaux seront suivis jusqu'à 125 jours pour mesurer les effets des différents traitements sur le court et le long terme afin d'optimiser le pouvoir translationnel du projet.

Une incision entre l'œil et l'oreille, l'os du crâne dégagé pour poser une sonde laser-Doppler, et l'artère cérébrale moyenne obstruée pour provoquer un accident vasculaire : 186 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent la substance testée pendant les sept jours précédant l'opération, ou au moment où le sang est rétabli. Toutes sont tuées pour récupérer leur sang et leur cerveau. Le porteur écrit que "la chirurgie en soi n'induit pas de douleur ou de souffrance" et ne signale qu'une perte de poids d'environ 10 % dans les 48 heures, pour une intervention qui consiste à provoquer un infarctus cérébral.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) constitue la première cause de handicap acquis chez l’adulte, la deuxième cause de démence et la deuxième cause de mortalité : c’est donc un enjeu majeur de santé publique. Dans 85% des cas, l’AVC est d’origine ischémique, c’est-à-dire qu’il provient de l’occlusion d’une artère cérébrale. Le seul traitement disponible en phase aiguë d’un AVC ischémique (dans les premières heures) consiste à déboucher l’artère occluse (recanalisation) pour restaurer le flux sanguin. A ce jour, il n’y a pas de traitement approuvé pour protéger le tissu cérébral. Cette étude s’inscrit dans le cadre de développement de stratégies neuroprotectrices après un accident vasculaire cérébral ischémique . Notre projet a pour objectif d’évaluer le potentiel thérapeutique et neuroprotecteur d'un traitement par un estrogène naturel modulateur des récepteurs des oestrogènes qui affecte de manière minime les paramètres de coagulation, dans un modèle murin d’accident vasculaire cérébral. Le mode d’action unique de cet estrogène se traduit par un profil bénéfice/risque amélioré par rapport aux autres œstrogènes. Nous évaluerons l’impact du traitement sur le volume de la lésion cérébrale, de la perte des cellules neurales et des troubles neurologiques et moteurs. Nous utiliserons un modèle expérimental d’ischémie cérébrale par occlusion de l’artère cérébrale moyenne suivi de reperfusion .

Bénéfices attendus

Notre projet a pour objectif d’évaluer le potentiel thérapeutique et neuroprotecteur d'un eostrogène naturel dans un contexte d’accident vasculaire cérébral. Cette étude permettra d’apporter de nouvelles connaissances précliniques qui pourront être à la base d’une proposition de nouvelles stratégies neuroprotectrices susceptible de réduire le dommage ischémique cérébral et corriger les déficits neurologiques et moteurs après la survenue d’un accident vasculaire cérébral (AVC).

Procédures

Les souris subiront une chirurgie au niveau du cou qui dure moins de 20 min pour induire une ischémie cérébrale suivie de reperfusion.. Une substance susceptible de réduire les effets délétaires de l'ischémie ou son solvant sont injectés aux souris soit avant la chirurgie pendant 7 jours ( effet neuroprotecteur) soit après la chirurgie à la reperfusion (effet thérapeutique) La chirurgie est pratiquée sous anesthésie générale. Une incision de la peau est effectuée entre l’oeil et l’oreille gauches et l’os ducrâne est dégagé, pour poser une sonde de laser-Doppler sur la boîte crânienne afin de mesurer le débit sanguin cérébral dans le territoire de l’artère cérébrale moyenne. La peau est refermée après la pose de la sonde.

Impact sur les animaux

La chirurgie est pratiquée sous anesthésie générale . La chirurgie en soi n’induit pas de douleur ou de souffrance. Une perte de poids d’environ 10% peut survenir dans les 48h qui suivent la chirurgie.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés pour récupérer le sang et le cerveau afin de faire des analyses.

Remplacement

Ces études nécessitent des expériences in vivo utilisant des animaux. Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d’autres modèles n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants. Le projet a pour but d’étudier l’effet dans le contexte de l’ischémie cérébrale, qui met en jeu des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier (système nerveux, système vasculaire et la connexion entre les organes). Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants. Les AVC ont des impacts au niveau de différentes structures du cerveau ainsi que des conséquences physiologiques sur l’ensemble de l’organisme. Le modèle expérimental d’ischémie cérébrale in vivo permet de reproduire une grande partie des signes cliniques observés chez lles patients après AVC et d’évaluer in vivo les effets sur le cerveau et sur la récupération fonctionnelle (score neurologique, coordination motrice). Actuellement, Il n’existe aucun modèle in silico ou in vitro permettant de mimer les impacts d’un AVC ou d’étudier les effets d’un traitement. Les études in silico ou in vitro ne permettant pas d’étudier l’efficacité d’un traitement visant à limiter la taille des lésions cérébrales et les déficits sensori-moteurs. La souris (mus musculus) est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. La physiopathologie est bien établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable.

Réduction

Le nombre minimal et suffisant d’animaux à utiliser a été déterminé en tenant compte de la sensibilité des techniques utilisées et de la variabilité attendue du modèle sur la base de nos travaux antérieurs et de la littérature. Le nombre d’animaux par série expérimentale a été estimé au plus juste et est réduit au minimum, de façon à mettre en évidence des différences statistiques avec un risque d’erreur moins que 5%, sur la base de notre expérience de ce modèle et de nos études antérieures.. Nous avons optimisé les techniques de façons à évaluer le maximum de paramètres sur les mêmes groupes d’animaux (tests de comportement, taille de l’infarctus, et études immunohistochimiques au niveau du cerveau sont évalués sur les même lots d’animaux.

Raffinement

Les conditions de travail pour l’utilisation des souris ont été raffinées afin de limiter leur angoisse, stress et douleur lors des manipulations. Les expériences sont réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Une attention particulaire est portée pendant la chirurgie en particulier le maintien de la température corporelle grâce à une couverture chauffante. lLs souris sont observées régulièrement (à 6h et quotidiennement après l’ischémie) - les souris sont pesées avant et quotidiennement après ischémie pour évaluer la perte de poids. Tout sera mis en œuvre pour réduire le stress, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées tout le long de l’étude jusqu’à la mise à mort de l’animal. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si après la chirurgie, un dépassement des points limites précédemment fixés est constaté, l’animal sera mis à mort dans des conditions éthiques.

Choix des espèces

La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont bien établis et maitrisés. La souris (mus musculus) est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. La physiopathologie est bien établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. Souris adultes (8-12 semaines) pour lesquels le modèle d’ischémie cérébrale est bien validé

Gavées une fois par jour pendant douze semaines, soumises à des injections intrapéritonéales quotidiennes et à une incision du bout de la queue pour un prélèvement de sang, 5 832 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes. L'objet du projet consiste à reproduire chez la souris des anomalies de comportement et de transit intestinal associées à l'autisme, en administrant des métabolites bactériens à des animaux dès l'âge de quatre semaines. Le porteur annonce des batteries de tests évaluant le comportement social, les comportements répétitifs et l'anxiété, avec des durées allant de quatre minutes trente à soixante-douze heures, sans nommer un seul de ces tests.

Objectifs

Le microbiote intestinal est un partenaire crucial pour la santé humaine. Des études récentes montrent l’existence d’un axe de communication microbiote-intestin-cerveau par lequel le microbiote peut influencer le comportement. L'autisme, avec une prévalence de 1% s'accompagne de troubles comportementaux (déficits d'intéraction sociale, stéréotypies) et de comorbidités (anxiété, dépression, hyperactivité). Aussi les patients autistes ont fréquemment des symptômes gastro-intestinaux (constipation, diarrhée, douleurs abdominales, ballonnements) associés à des altérations des abondances de certaines bactéries de leur microbiote intestinal et des petites molécules qu’elles produisent, les métabolites microbiens. Ces anomalies sont aussi reproduites dans des modèles souris d’autisme. Les causes de l’autisme sont encore méconnues, mais des dérégulations de l’axe cerveau-intestin-microbiote semblent y jouer un rôle. Cela suggère que des thérapies ciblant les bactéries du microbiote ou bien les métabolites qu’elles produisent pourraient être bénéfiques, comme par exemple le transfert de microbiote, les probiotiques et les prébiotiques. Leur efficacité reste cependant à démontrer. Des métabolites issus de la dégradation de l’alimentation par les bactéries du microbiote présentent des niveaux anormalement élevés ou bas dans l'urine, le plasma et les selles de patients autistes. Les bactéries productrices et consommatrices de ces métabolites sont aussi fréquemment dérégulées chez les patients autistes. Dans ce projet de recherche, nous allons identifier parmi ces métabolites microbiens et ces bactéries ceux et celles capables d'induire chez la souris des anomalies comportementales et/ou gastro-intestinales. Aussi, nous identifierons leur mode d'action en utilisant des approches pharmacologiques. Également, nous identifierons des métabolites et des traitements probiotiques capables de restaurer les anomalies du comportement et les troubles gastro-intestinaux dans des modèles d’autisme. Ce projet ouvrira la voie à une meilleure compréhension de l’autisme et à de nouvelles thérapies.

Bénéfices attendus

Cette étude présente un intérêt translationnel car l'étude apportera des connaissances sur les mécanismes physiologiques et neurobiologiques fondamentaux responsables des troubles du spectre de l’autisme et de l’implication du microbiote intestinal. Ce projet permettra de faire avancer les connaissances sur l'étiologie de l'autisme et pourra contribuer à valider pré cliniquement dans des modèles animaux des stratégies thérapeutiques ciblant le microbiote pour les troubles du spectre de l'autisme.

Procédures

• Identification par injection sous-cutanée de puce : durée 10s ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Test de comportements évaluant le phénotype social : durée 4min30s, 10min, 12min, 25min et 72h en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Tests de comportements évaluant les comportements répétitifs : durée 5 à 10min en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Tests de comportements évaluant l’anxiété : durée 5min, 6min et 10min en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Evaluation de la physiologie intestinale : durée 60min, 90min et 6h en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Prélèvement de sang de 100µL après incision de l’extrémité de la queue : durée 10min ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Gavage : durée 5s ; fréquence allant d’une seule fois à une fois par jour pendant 12 semaines en fonction de la procédure. • Injections intrapéritonéales : durée 5s ; fréquence une seule fois à une fois par jour pendant 10 jours en fonction de la procédure. • Anesthésie à l’isoflurane et imagerie sur animal anesthésié : durée 10 min ; fréquence 5 fois sur 48h en fonction de la procédure.

Impact sur les animaux

Ce projet obéit à la règle des 3R. Cependant, certains des traitements proposés pourraient impacter le métabolisme, le comportement et\ou la physiologie intestinale des groupes d’animaux traités par rapport aux groupes témoins. Pour détecter ces changements, un suivi au moins 2 fois par semaine du poids des animaux, de leur consommation en eau et nourriture permettra d’évaluer l’état physiologique global de l’animal en réponse au traitement. Certains des tests comportementaux prévus dans les procédures sont générateurs d’un inconfort faible à moyen mais de courte durée et qui n’induisent pas de signes caractéristiques de mal-être chez la souris (perte de poids, prostration, poil hirsute, absence de toilettage ...). De plus, l’inconfort sera limité à la durée du test. Concernant l’évaluation de la physiologie intestinale, les tests provoqueront un inconfort mais limité à la durée du test. Un prélèvement sanguin sera réalisé lors du test de perméabilité intestinale, cependant un volume faible de sang sera prélevé et l’inconfort sera limité au temps nécessaire au prélèvement. Dans le cas du traitement administré par voie intrapéritonéale, une attention particulière sera portée à l’état du site d’injection (gonflement, rougeur).

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure dans le but de réaliser des prélèvements d'organes pour analyses biologiques, indispensable pour une meilleure comprehension des mécanismes associés à notre contexte d'étude.

Remplacement

La littérature scientifique sur notre sujet a permis de sélectionner les métabolites microbiens, les bactéries et les substances pharmacologiques les plus pertinents, ainsi que les quantités et concentrations utilisées respectant un contexte physiologique. Avant les expérimentations sur l’animal, des expériences in vitro ont été et seront réalisées sur des cultures bactériennes permettant de mieux comprendre leurs mécanismes d’action. Cependant, pour évaluer l'impact du traitement avec des métabolites microbiens, des probiotiques et une substance pharmacologique à l'échelle de l'organisme entier au niveau gastro-intestinal et comportemental, le recours à l'animal sera nécessaire. En effet, l’étude du comportement animal fait intervenir des interactions systémiques entre plusieurs organes et des processus physiologiques intégrés. Notre étude doit donc nécessairement se faire sur l’animal entier car ce n'est pas modélisable in vitro pour l'instant.

Réduction

Pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables, nous utiliserons des tailles d’échantillon garantissant une puissance statistique suffisante pour l’analyse des résultats comportementaux, le nombre de souris ayant été réduit autant que possible. Des calculs réalisés avec un logiciel dédié ont permis de déterminer les effectifs de groupe nécessaires pour observer des effets de taille moyenne avec les tests statistiques les plus pertinents. Les résultats seront analysés avec un logiciel dédié. Un total de 5832 animaux est requis pour ce projet.

Raffinement

Les paramètres suivants basés sur l'expérience de l'expérimentateur seront suivis pour nous permettre d'assurer le suivi du bien-être animal : le poids corporel, l'apparence physique, des signes cliniques objectifs tel qu’un changement de température corporelle suite à une alerte sur un animal, des comportements anormaux ou non provoqués, des réponses comportementales à des stimuli spécifiques ainsi que l'état général du site d'injection et un suivi de l’aspect des fèces indiquant ou non la présence de diarrhée. Nos conditions d’élevage comprennent une stabulation par groupes d'au moins quatre animaux, un enrichissement de l'environnement (coton pour nidifier, maison), ainsi qu'un contrôle strict de la température et de l'humidité. Un suivi quotidien des animaux est également assuré par le personnel animalier et par nous même dans le cadre des expérimentations. La majorité des procédures induiront un inconfort faible et de courte durée, sans causer de dommages. Pour les procédures affectant potentiellement le bien-être des animaux, un suivi basé sur une grille de score pourra être établi et permettra de détecter toute souffrance et de décider de la suite à donner, notamment en appliquant des points limites précoces et adaptés.

Choix des espèces

L'autisme cause des anomalies du comportement handicapantes. Toutes ces anomalies sont modélisables chez la souris à l’aide de batteries de tests de comportement réalisables chez la jeune souris ou l’adulte. Aussi, la physiologie intestinale de la souris (perméabilité, motilité intestinale et colonique) ne peut être appréciée que chez l'animal vivant. Les études précliniques sur l'autisme imposent donc des études in vivo, chez l’animal, afin d'identifier des mécanismes difficilement modélisables in vitro et de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Puisque nous nous intéressons aux conséquences neurodéveloppementales de l’exposition aux métabolites Microbiens, nous préférons travailler dans une fenêtre où le système nerveux est encore capable d’une certaine plasticité (adolescence 4 semaines). Pour les procédures 1 et 2, nous recevrons les animaux à l'âge de 3 semaines, juste après le sevrage. Nous commencerons le traitement dans la 4ème semaine et évaluerons le comportement et le tractus GI après 4 semaines de traitement, soit lorsque les animaux auront entre 8 et 10 semaines. Pour les procédures impliquant un traitement pour restaurer les phénotypes induits par les métabolites microbiens (procédure 3), les animaux seront suivis jusqu'à l'âge de 14-16 semaines.

Les souris chez qui l'isolement en couveuse ou les soins de blessures n'améliorent rien sont tuées. 270 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leur moelle épinière ou pour des enregistrements électrophysiologiques. Chacune subit, à un âge de 12 à 24 jours, une chirurgie d'une heure à une heure trente destinée à faire exprimer des virus porteurs de transgènes dans la corne dorsale de la moelle, et 120 d'entre elles reçoivent en plus trois à cinq injections d'un activateur neuronal. Le projet porte sur les troubles sensoriels de l'autisme, et le porteur annonce des tests de comportement sensitif et cognitif sans préciser lesquels, ainsi qu'un isolement des souris jusqu'à douze heures pendant ces essais.

Objectifs

Le projet vise à caractériser le rôle des neurones inhibiteurs de la moelle épinière dans le développement des troubles sensoriels qui accompagnent les troubles du spectre de l'autisme (TSA), dans le but 1) de mettre en place de nouveaux outils de diagnostic, et 2) de mettre au point et raffiner certains traitements existants.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mieux comprendre le rôle des réseaux spinaux inhibiteurs dans le controle de la transmission des informations mecanosensorielles. Il pourra servir de base au développement de nouvelles approches (médicamenteuses ou non) visant à corriger ou à réduire les déficits mécanosensoriels fréquemment présents chez les individus atteints de TSA. Un bénéfice annexe du projet pourrait résider dans le développement de nouveaux test diagnostics permettant de classer les troubles autistiques et préciser leur sévérité, de façon à mettre en place des stratégies thérapeutiques adaptées.

Procédures

Les animaux (270 au total) subissent une intervention chirurgicale d'une durée comprise entre 1h00 et 1h30 visant à exprimer des virus porteurs de transgènes dans la corne dorsale de la moelle épinière. Une partie des animaux (120) reçoit en outre des injections intrapéritonéales d'une substance pharmacologique (activateur neuronal, entre 3 et 5 injections par animal) avant d'être testés pour leur comportement sensitif et cognitif

Impact sur les animaux

L'injection spinale et/ou corticale de virus requiert une opération chirurgicale. On peut donc s'attendre à observer les effets indésirables classiquement associés aux chirurgie (douleurs post-opératoires, perte de poids, déshydratation, etc). Lors des éssais comportementaux, les animaux sont transitoirement isolés les uns des autres (maximum 12h00), ce qui peut constituer une source de stress.

Devenir

A la fin de chaque procédure tous les animaux seront mis à mort. Chaque expérience se termine par la mise à mort de l'animal, soit pour collecter les tissus (moelle épinière), soit pour des observations histologiques, soit pour des enregistrements électrophysiologiques.

Remplacement

Il n'existe pas à l'heure actuelle de méthode permettant de reconstituer les réseaux neuronaux à partir de cutlures cellulaires. Il n'exitse pas actuellement de modèle permattant de molèliser par des méthodes informatiques tout ou partie de la complexité des réseaux de la moelle épinière. Le projet comporte des expériences de comportement qui ne peuvent être réalisées que dans le cadre d'une expérimentation animale.

Réduction

Afin de ne pas utiliser plus que le nombre minimal d'animaux nécessaire, nous avons estimé, sur la base des études précédentes, le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une signification statistique (stratégie : études antérieures au sein de l'équipe et étude bibliographique). Dans la mesure du possible, les mêmes animaux sont utilisés pour l'ensemble des expériences de comportement.

Raffinement

L'ensemble des mesures suivantes sont mises en œuvre pour réduire l'inconfort des animaux i) Surveillance quotidienne assurée par des expérimentateurs formés à l'expérimentation animale et au bien-être animal. ii) Vérification de l'état de l'animal (avant chaque manipulation) selon les critères généraux ainsi que les signes cliniques spécifiques à la manipulation. iii) Les critères d’évaluation de souffrance sont l’apparence/état général ainsi que le comportement de l’animal. Tout signe de souffrance, douleur, détresse constaté lors de cette observation déclenchera une réponse immédiate et adaptée (mesures conservatoires à privilégier, par exemple : isolement temporaire de l’animal, réchauffement en couveuse, soins des blessures si bagarres entre congénères). Si aucune amélioration n'est constatée après cette intervention l’expérimentateur prendra la décision d’euthanasier l’animal (si nécessaire, en consultation avec le vétérinaire et l’équipe des zootechniciens). iv) Mécanismes d'intégration des nouvelles techniques de raffinement : formation régulière des expérimentateurs, consultation de sites éducatifs tels que NC3R. v) Adaptation des conditions d’hébergement : animaux maintenus dans des cages collectives avec l'enrichissement comprenant des tubes en carton et le matériel pour la nidification.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus pertinent pour étudier cette maladie. + il existe une abondante littérature sur les troubles du spectre de l'autisme chez la souris + le modèle murin Fmr1 présente des symptômes voisins de ceux rencontrés dans le modèle humain de chromosome X fragile + les lignées génétiques nécessaires à ce projet ne sont disponibles que chez la souris Les expériences sont réalisées sur des animaux agés de 12 à 24 jours au momment de la chirurgie, de façon à pouvoir réaliser les enregistrements sur des animaux relativement jeunes, 3 semaines plus tard, lors de la réalisation des enregistrements.

Une canule de fibre optique dépassant de deux millimètres au-dessus du crâne, et le toilettage excessif qui en découle : 9 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. 5 040 d'entre elles subissent deux chirurgies sous anesthésie de 30 à 90 minutes puis six séances d'enregistrement de l'activité de leurs neurones, 4 160 une chirurgie puis cinq jours d'observation de leurs comportements sociaux, et 4 800 des injections intrapéritonéales ou intrathécales. L'objet du projet est le toucher affectif, la caresse légère, et les structures cérébrales qui l'intègrent. Le porteur décrit ces chirurgies comme "extrêmement bien tolérées par les animaux", et justifie la mise à mort de toutes les souris par leur modification génétique et leur infection par des virus, qui interdisent de les replacer.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mettre en évidence les structures responsables de l’intégration du toucher affectif et de définir leurs rôles dans les comportements pro-sociaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires du toucher léger chez la souris. Il aura des répercussions dans deux domaines. En effet, le toucher léger est altéré dans des pathologies humaines (autisme, défaillances cardiovasculaires, etc), et nos données permettront l'identification de cibles pharmacologiques pour corriger ces déficits dans l'espoir de réduire les déficits de comportement social associés. D'autre part, "la stimulation tactile affective" est une approche thérapeutique utilisée dans de nombreux domaines (gestion de la douleur, de l'anxiété, du stress chronique, soins palliatifs, contact parents-enfants, troubles du sommeil, etc..) et notre travail devra permettre de raffiner ces protocoles, et/ou de proposer des approches pharmacologiques pour alléger les symptomes de ces pathologies.

Procédures

Pour les procédures 1 à 6 : Chaque animal sera soumis à deux chirurgie sous anesthésie générale gazeuse (30 à 90 minutes) puis à plusieurs sessions d’enregistrement de l'activité neuronale sur animal vigile (5 fois 10 minutes puis 1 fois 20 minutes) (5040 animaux) Pour les procédures 7 à 9 : Chaque animal sera soumis à une chirurgie sous anesthésie générale gazeuse (30 à 60 minutes), puis à l’observation automatique de leurs comportements sociaux en groupe (5 jours). (4160 animaux) Supplément pour les procédures 2, 5 et 8 : injection de produits par voie intrapéritonéale (2 minutes par animaux) (2400 animaux) Supplément pour les procédures 3, 6 et 9 : injection de produits par voie intrathécale (2 minutes par animaux) (2400 animaux)

Impact sur les animaux

Les actes chirurgicaux nécessaires à ce projet sont des actes chirurgicaux similaire à ceux utilisés par de nombreuses équipes de recherche à travers le monde et extrêmement bien tolérées par les animaux. Nous prévoyons cependant que des effets indésirables liés à ces chirurgies peuvent créer un stress dut à l’opération chirurgicale, des douleurs post-opératoires (qui sont prise en charge pharmacologiquement) ainsi qu’une gêne dut à la présence d’une canule de fibre optique dépassant de 2mm au-dessus du crane. Le stress et les douleurs peuvent entrainer une légère perte de poids qui sera monitorée. La gêne occasionnée par la présence de la fibre optique peut entrainer un toilettage excessif qui sera lui aussi évalué. Nous considérons que ces effets indésirables peuvent durer 1 semaine au maximum apres la chirurgie.

Devenir

Tous les animaux utilisés étants génétiquement modifiés et/ou infectés par des virus génétiquement modifiés eux aussi, il nous est impossible de replacer ou de faire adopter ces animaux. Ils seront donc mis à mort à la fin de chaque procédure. Des prélèvements histologiques seront effectués sur chaque animaux pour confirmer les résultats

Remplacement

La perception du toucher est un phénomène appréhendé par l’organisme conscient, et lui seul, en particulier sa dimension émotionnelle. Il n’existe pas de modèles in-vitro ou de modèles mathématiques permettant de modéliser la représentation du toucher pouvant mimer une émotion, en dehors des animaux de laboratoire. De plus, la variété des techniques de modifications génétiques chez la souris permet d'identifier et de cibler spécifiquement des mécanismes moléculaires ou cellulaires à un niveau où l’expérimentation humaine n’atteint pas ce niveau de résolution. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques

Réduction

Chez l’homme, la dimension émotionnelle du toucher est un paramètre confondant, qui rend difficile la constitution de petites cohortes homogènes. À l’inverse, les modèles animaux sont homogènes et fournissent des résultats reproductibles. Ceci permet d'établir avec précision le nombre d'animaux nécessaire à la validation des hypothèses de travail par des tests de puissance statistique. Nous exploitons au mieux nos enlevages, puisque nous étudions mâles et femelles, et que nous étudions la majorité des génotypes produits. Ce projet propose d’utiliser plusieurs approches afin d’atteindre le même objectif, mais dès les premiers résultats prémilitaires obtenus, il sera possible de juger laquelle de ces approches est la plus efficace et donc de réduire le nombre de procédures qu’au modèle le plus efficace (viral contre génétique par exemple). De meme, ce projet propose d’aller investiguer dans plusieurs régions du cerveau et il est fort possible que certaines d’entre elles ne répondent pas nos attentes et seront donc éliminées dès les premiers résultats obtenus, réduisant encore le nombre d’animaux utilisé. Les nombres d'animaux nécessaires aux différentes procédures ont été déterminés en utilisant un logiciel libre de calcul de puissance statistique en le nourrissant des données issues d'une analyse rétrospective des résultats obtenus en utilisant les mêmes techniques par notre groupe et pas d'autre groupes à travers le monde.

Raffinement

Nos procédures requièrent que tous nos animaux soient suivis dès leur naissance. Ceci permettra de s’assurer du bien-être des animaux tout au long de leur vie en suivant certains paramètres définis par une fiche et grille de suivi clinique au minimum trois fois par semaine (en annexe). Cette fiche de suivi permet de déceler rapidement des signes précoces d’éventuelle douleur et ou détresse (points limites). Pour aider à la prise de décision, cette fiche contient plusieurs critères d’évaluation permettant de déterminer un score qui permet à l’expérimentateur de prendre la décision adaptée pour mettre en place rapidement des mesures visant à éviter ou réduire cette souffrance, et si nécessaire, l’arrêt des souffrances par mise à mort. Ce suivi tout au long de la vie par les expérimentateurs permettra aussi de réduire le stress des animaux qui y seront habitué. Cela augmentera aussi la qualité et la reproductibilité des résultats, et donc in fine diminuera le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. Les tests comportementaux présents dans cette saisine n’utilisent pas d’environnements considérés comme stressant ou anxiogènes et laissent une liberté d’action maximale à l’animal en le laissant choisir de lui-même d’interagir ou non avec des textures ou un congénère, tout en limitant ce temps d’expérimentation à 20 minutes par individus. Toutes les manipulations, pharmacologiques ou génétiques, ont pour but d’améliorer les relations sociales des individus et donc d’améliorer les conditions de vie des animaux, et cela, très tôt après leurs naissances. Les cages d’hébergement sont toutes enrichies avec des boules des cotons et des maisons en plexiglass rouge. Toutes les douleurs opératoires et postopératoires seront prises en compte avec une prise en charge pharmacologique adaptée.

Choix des espèces

Le projet utilise la souris, car c’est le modèle mammifère de référence pour la technique de modification génique. Le projet scientifique vise à utiliser la puissance de la génétique chez la souris pour étudier le rôle des gènes essentielles dans la perception et l’intégration sensorielle normale et pathologique Notre projet vise à moduler différentes voies neuronales durant les étapes tardive du développement neuronal qui ont lieu apres la naissance et durant l'adolescence pour en observer les conséquences à l'état adulte. Par conséquent, nous manipulerons les animaux dès la naissance et jusqu'à l'âge adulte.

3 780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection sous la peau du crâne par semaine pendant quatre semaines, passe des tests cognitifs, puis subit une ponction du liquide céphalo-rachidien avant d'être tué par exsanguination. Une partie du protocole porte sur des souriceaux de sept jours, que la manipulation expose au rejet par leur mère, à la mort par hypothermie ou au cannibalisme, effets que le porteur qualifie de rares et sporadiques. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne capture la complexité d'un "organisme entier" et écarte la drosophile, C. elegans et le poisson zèbre, dont la barrière cérébrale diffère trop de celle des mammifères.

Objectifs

Récemment, certaines zones barrières du cerveau, ont été identifiées comme des interfaces de communication active entre la périphérie et le cerveau, plutôt que comme des tissus barrières. De plus, des découvertes récentes ont identifié des canaux ouverts dans l'os du crâne, les cellules immunitaires présentes dans la moelle osseuse peuvent accéder au cerveau en cas de maladie ou d'infection, tandis qu'en bonne santé elles atteignent le cerveau et de là libèrent des facteurs solubles qui peuvent façonner le cerveau à distance. Les troubles du spectre autistique et la schizophrénie sont considérés comme neurodéveloppementaux. La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative mortelle associée au vieillissement, qui touche 30 à 50 % des personnes de plus de 85 ans. Pour les maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives, certains traitements existent, mais leur efficacité est limitée et de nouvelles approches thérapeutiques sont nécessaires de toute urgence. Des recherches récentes suggèrent unanimement que la dérégulation du système immunitaire est au centre de la pathologie. Les signaux inflammatoires dans le cerveau atteint de la maladie d’Alzheimer devraient donc influencer l’activité de la moelle osseuse. En effet, des travaux antérieurs et préliminaires ont montré que le processus de production de cellules immunitaires et d’autres propriétés du tissu de la moelle osseuse sont altérés dans la maladie d’Alzheimer, mais il n’est pas certain que cela soit vrai pour la moelle osseuse crânienne. De plus, nous savons que les signaux immunitaires dérivés de la moelle osseuse via le cerveau peuvent influencer l’activité cérébrale chez les adultes, mais on comprend moins bien si ces signaux contribuent au développement du cerveau. Notre objectif est d’étudier comment la moelle osseuse crânienne est altérée dans la maladie d’Alzheimer et au cours du développement, et si des changements dans dans la moelle osseuse pourraient modifier le développement cérébral ou la progression de la trajectoire de la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Cette analyse permettra d’identifier des facteurs produits par la moelle osseuse du crâne et potentiellement impliqués dans la modulation du développement et du fonctionnement du cerveau dans les cerveaux sains et atteints de la Maladie d’Alzheimer (MA). À court terme, cette étude fournira des connaissances fondamentales sur un nouveau canal de communication cerveau-immunité. Explorer les frontières cérébrales dans cette direction est très important car l’accès des médicaments courants au cerveau est souvent altéré, car de nombreux médicaments ne traversent pas la barrière hémato-encéphalique. Ces dernières années, nous avons observé d’énormes progrès dans le développement de médicaments pour les maladies cardiovasculaires, les maladies immunologiques et le cancer, mais peu de progrès ont été réalisés en neurologie, en partie à cause de cet obstacle. Par conséquent, la compréhension des voies alternatives vers le cerveau est un défi majeur en neurologie. Plus précisément, à long terme, ces recherches pourraient conduire au développement de nouvelles approches pharmacologiques qui réguleraient cette voie de communication cerveau-immunité pour lutter contre la Maladie d’Alzheimer (MA) ou prévenir le risque d’autisme.

Procédures

Dans la procédure 1, les souris seront soumises à une injection sous-cutanée sur le dessus du crâne sous anesthésie gazeuse, une fois par semaine pendant 4 semaines. Ensuite, les souris seront testées pour leur capacité cognitive (sans stress ni douleur) pendant une semaine. Enfin, les souris recevront une injection intrapéritonéale 16h plus tard, une injection d'anesthésie et d'un analgésique. Sous analgésie profonde et anesthésie totale, les souris seront soumises à une injection intrapéritonéale, à un prélèvement de liquide céphalorachidien et seront mises à mort par exsanguination (élimination du sang). Dans la procédure 2, des souris âgées de 7 jours seront soumises à une injection sous-cutanée sur le dessus du crâne sous anesthésie gazeuse. Suite à l’injection, les souris âgées de 15 ou 21 jours recevront une injection d'anesthésie et d'un analgésique. Sous analgésie profonde et anesthésie totale, les souris seront soumises à une injection intrapéritonéale, à un prélèvement de liquide céphalorachidien. Les souris adultes après une injection sous-cutanée sur le dessus du crâne seront testées pour leur comportement (pas de stress ni de douleur) dans un délai de deux semaines. Apres, les souris recevront une injection d'anesthésie et d'un analgésique. Sous analgésie profonde et anesthésie totale, les souris seront soumises à une injection intrapéritonéale, à un prélèvement de liquide céphalorachidien.

Impact sur les animaux

Les injections et l'anesthésie peuvent provoquer une légère douleur et un stress temporaire. Nous ne prévoyons pas d'effets négatifs supplémentaires résultant de ces manipulations ou de la nature des substances injectées. Dans de rares cas, les souriceaux après manipulation sont rejetés par la mère et ils peuvent mourir d'hypothermie. Dans des cas sporadiques, une séparation temporaire peut provoquer un stress chez la mère entraînant un cannibalisme chez les souriceaux. De plus, la manipulation des animaux pendant les tests comportementaux peut provoquer un léger stress et un inconfort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour la dissection des tissus afin de répondre aux questions scientifiques posées dans cette proposition.

Remplacement

Notre objectif est d'étudier comment les cellules situées dans la moelle crânienne agissent sur le cerveau, dans le développement et dans un modèle de maladie d’alzheimer (MA). La niche de la moelle crânienne est un organe complexe composé de vaisseaux sanguins, de nerfs et de tissu stromal englobant différents types de fibroblastes, d'adipocytes et de cellules immunitaires de l'ensemble de l'arbre hématopoïétique. Notre question est de savoir comment ces cellules et leurs produits atteignent le cerveau et modulent sa fonction. Il n'existe pas de modèle in vitro ou ex vivo qui capture la complexité d'un organisme ou d'un tissu avec ses composants endothéliaux, stromaux, immunitaires et neuronaux. Des animaux plus simples tels que la drosophile, C. elegans ou le poisson zèbre ne peuvent pas non plus être utilisés car la physiologie de la barrière cérébrale de ces animaux est très différente de celle des mammifères. De plus, l'indicateur le plus fiable de la gravité de la maladie dans les modèles de MA (et les patients) est la mesure de leur capacité cognitive, et pour les modèles de troubles du spectre autistique (TSA) - comportement social, les paramètres ne peuvent pas être testés dans des modèles non animaux.

Réduction

Nous souhaitons étudier les interactions entre le crâne, la moelle osseuse et le cerveau dans les maladies neurodégénératives et le développement. Les quantités d'animaux utilisées pour réaliser notre projet sont établies en tenant compte de notre expérience antérieure et de tests statistiques. Seuls 10 microlitres du liquide à analyser ( liquide cephalo rachidien (LCR)) peuvent être collectés dans le cerveau d'une souris, ce qui ne permet qu'un seul type d'analyse. Un seul échantillon de crâne et des méninges uniques ne peuvent être utilisés que pour une seule analyse à la fois, mais le cerveau peut être conservé (de plusieurs façons) et utilisé pour plusieurs tests. Nous prévoyons pour chaque groupe, 14 animaux à analyser ; le sexe des animaux peut influencer les phénotypes observés, des mâles et des femelles seront inclus (7 mâles et 7 femelles). Des expériences seront réalisées en triples pour obtenir des résultats solides. Selon le nombre de groupes comparés, avec une puissance de 80% et un risque alpha de 5% : - 4 groupes comparés (sains vs. alzheimer et traités vs. contrôle) : les effectifs proposés (7 individus par groupe) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.

Raffinement

Les procédures décrites sont conçues pour minimiser l'inconfort des animaux. Le suivi des animaux, selon une liste de signes cliniques et des points limites spécifiques et précoces. Dès l’apparition d’un signe clinique, nous multiplierons l’enrichissement (plus de coton, un igloo) et, le cas échéant, nous chaufferons les cages avec des chaufferettes si l’animal montre des signes d’hypothermie. Des aides alimentaires (type gel hydrique) et une réhydratation sous-cutanée avec de la solution saline seront mises en place au besoin. Si un animal atteint le score limite, il sera mis à mort. Des injections sous-cutanées (sous la peau) sur le dessus du crâne seront effectuées sous anesthésie générale et sur un tapis chauffant sur lequel les animaux seront maintenus pendant la procédure et jusqu'à leur réveil pour minimiser l'inconfort.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus utilisée en laboratoire pour l’étude des fonctions cognitives. De nombreux anticorps dirigés contre des épitopes murins et permettant l’analyse par imagerie et/ou la déplétion de certains types cellulaires sont également disponibles. L’ensemble de ces avantages permet, en utilisant ce modèle, de répondre rapidement aux questions scientifiques posées. Ce modèle permet de travailler avec la meilleure efficacité́ possible tout en offrant une représentation certes imparfaite mais néanmoins proche de la physiologie humaine. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 2 à 9 mois. Au cours du développement typique de la maladie de type Alzheimer chez les souris, les premiers signes de pathologie sont la formation de plaques bêta-amyloïdes dans le cerveau, clairement visibles au microscope, qui se développent à 3 mois, ainsi que des différences comportementales dans les capacités d'apprentissage et de mémoire, que nous mesurons dans des tests comportementaux. Cet âge peut varier légèrement en fonction de l'animal et du sexe (les femelles développent généralement la maladie plus lentement que les mâles dans ce modèle). Pour capturer ces fenêtres de progression de la pathologie, des injections sous-cutanées pour manipuler le crâne seront administrées aux animaux à l'âge de 3 à 6 ou de 6 à 9 mois et des échantillons seront prélevés à 4, 6 ou 9 mois. Nous injecterons aussi des souris le 7e jour postnatal (P.7) pour pouvoir capturer la fenêtre de développement de la croissance et du recâblage intenses du cerveau, qui se produit vers entre le 10eme et le 20eme jour postnatal. Nous analyserons les cerveaux aux âges entre le 15eme et le 21eme jour postnatal pour capturer tous les changements que la manipulation aurait pu imposer au cerveau et analyserons le comportement des souris adultes après la manipulation pour voir si cela a eu des effets à long terme.

400 souris vont être utilisées dans le second volet d'un même projet, chacune passant par une ou deux neurochirurgies de deux heures à deux heures trente, puis par vingt jours de contrôle alimentaire et soixante essais comportementaux quotidiens. Le niveau de souffrance déclaré est modéré, et toutes sont tuées à l'issue pour l'examen de leur cerveau. Le premier volet mobilise 400 autres souris dans les mêmes conditions, ce qui porte l'ensemble à 800 animaux pour une même question. Les retombées cliniques évoquées, l'éclairage de troubles moteurs et perceptifs, restent au conditionnel, quand les lésions cérébrales et la restriction alimentaire, elles, sont programmées.

Objectifs

La prise de décision perceptuelle est le processus par lequel les informations sensorielles entrantes sont intégrées par le cerveau afin de guider le comportement de l’individu en produisant une réponse motrice appropriée. Chez les rongeurs, il apparaît de plus en plus clairement que cette intégration sensori-motrice fait intervenir deux zones cérébrales clés. La première zone est la partie du cerveau qui reçoit les informations sensorielles provenant des moustaches. La deuxième zone est la partie qui va planifier et organiser les mouvements. Elle est impliquée dans la sélection et l’exécution des commandes motrices. La première zone quant à elle constitue un système sensoriel important pour les rongeurs permettant de collecter les informations sensorielles de l’environnement. Les rongeurs ont en effet développé un système sensoriel complexe et utilisent de préférence leurs moustaches pour explorer leur environnement tactile immédiat. Pourtant, on ne sait toujours pas à ce jour comment ces deux zones cérébrales interagissent pour assurer une prise de décision adaptée en réponse à la perception de l’environnement. Par ailleurs, la plupart de nos connaissances proviennent d'études utilisant des tâches comportementales peu naturelles (avec immobilisation de la tête de l’animal par exemple). De plus le rôle de ces zones cibles et de leur interaction dans des conditions qui reproduisent ce qui se passe dans la nature de façon éthologiques reste à ce jour inconnu. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs différents.

Bénéfices attendus

Ce projet est avant tout un projet de science fondamentale. Il vise à comprendre au niveau cellulaire les principes de l’intégration des informations sensorielle et motrice qui permettent l’adaptation de la prise de décision en réponse à la perception de l’environnement. Tout cela dans un contexte environnemental le plus éthologique possible. Au-delà de cet aspect fondamental, le projet vise à explorer des problématiques que l’on retrouve en clinique. En effet, l'accent mis sur la prise de décision au cours d’une tâche ayant une vraie valeur éthologique dans un environnement naturel est central dans les neurosciences cognitives modernes, en particulier pour la recherche sur les primates humains et non humains. En outre, l'incapacité à résoudre la tâche comportementale proposée est une caractéristique frappante de plusieurs troubles moteurs et perceptifs. Le projet est donc particulièrement bien placé pour dessiner les bases d'études plus appliquées, en reliant notamment les techniques de neurosciences les plus récentes aux processus cognitifs essentiels. Enfin, le projet est à la pointe de nombreuses techniques expérimentales, allant de modèles comportementaux innovants à la neuroanatomie avancée et l’étude des signaux électriques générés par l'activité des neurones pendant la prise de décision.

Procédures

Les animaux seront d’abord acclimatés à leur hébergement dans le premier établissement utilisateurs pendant 2 jours. Puis les animaux seront soumis à une neurochirurgie lésionnelle et/ou implantatoire de sondes. Ces chirurgies se feront sous anesthésie et dureront chacune entre 2h et 2h30. 75 animaux auront une chirurgie lésionnelle, 150 animaux auront une chirurgie implantatoire, et 100 animaux auront ces deux chirurgies (lésionnelle et implantatoire). 75 animaux auront une injection de solution saline pour servir de contrôle. Un intervalle de 10 jours sera respecté entre chaque chirurgie lorsqu'il est nécessaire de faire une chirurgie lésionnelle puis de faire une chirurgie implantatoire. Après 10 jours de récupération et de surveillance post-opératoire, les animaux seront déplacés dans le deuxième établissement utilisateurs puis acclimatés à leur nouvelle animalerie pendant 10 jours. Ensuite, les animaux seront soumis à un contrôle alimentaire qui durera une vingtaine de jours. Pendant ces 20 jours les animaux auront l’étape de comportement avec 3 phases : l’habituation (5 jours), l’apprentissage (5 jours) et le contrôle (5 jours). Pour la phase d’habituation les animaux auront des essais durant 30 minutes. Pendant la phase d’habituation et de contrôle, les animaux auront 60 essais par jour ce qui représentera environ 2 heures par jour. Les animaux seront hébergés de façon individuel après la chirurgie pour éviter tout arrachement des sondes.

Impact sur les animaux

Le projet peut induire des effets indésirables sur les animaux, listés ci-dessus. ● Le risque de douleur durant la chirurgie. ● Le risque de douleur aiguë lié à la récupération post-opératoire. ● Le risque d’infection des implants. ● Le risque de stress lié à l’hébergement individuel après la chirurgie. ● Le contrôle des apports caloriques en régulant la quantité de nourriture disponible, nécessaire à l’exécution de la tâche comportementale, sera limitée pour atteindre une réduction maximale à 85% de leur poids initial.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issu des procédures. La mise à mort des animaux sera nécessaire pour réaliser des contrôles d’immunohistochimie sur les cerveaux.

Remplacement

Par définition, les mécanismes neuronaux de la prise de décision perceptuelle ne peuvent être étudiés que chez des animaux vigiles confrontés à une situation de choix. Cela est d’autant plus vrai dans le cadre d’expérimentation avec une forte valeur éthologique ajoutée. Dès lors, aucun des modèles in vitro ne peut être utilisé ici.

Réduction

Les techniques expérimentales utilisées ici permettent de façon intrinsèque de réduire dramatiquement le nombre d'animaux utilisés, avec une qualité de mise en pratique assurant la reproductibilité des expérimentations entre les laboratoires. Par ailleurs, afin de limiter le nombre d’expériences et donc d’animaux, la taille de nos groupes expérimentaux est définie par l’utilisation de tests statistiques.

Raffinement

Une grille de notation sur le comportement de construction du nid chez la souris sera réalisée comme un indicateur du bien-être. En effet, lors de stress, de douleur ou de mal être chez la souris la construction des nids est affectée. Cette évaluation permettra d’alerter ou d’identifier un mal-être ou une douleur éventuelle lorsque la qualité du nid est altérée. Elle permettra également de témoigner d’un bien-être lorsque le nid est de bonne qualité. Les animaux sont hébergés et manipulés dans le cycle jour/nuit inversé correspondant à leur phase d’éveil/sommeil. En effet, les souris sont des animaux nocturnes. Pour respecter leur rythme de vie et les manipuler lorsqu’ils sont réveillés, le jour ils seront donc dans l’obscurité avec lumière rouge (non visible pour eux) et la nuit hébérgés avec de la lumière. Les tests comportementaux sont ainsi réalisés lors des phases actives des souris et elles ne sont pas dérangées lors de leurs phases inactives. Les résultats avec des souris en cycle jour/nuit inversé seront plus pertinents sur le plan éthologique et fourniront des données plus fiables si elles sont menées pendant la phase nocturne, alors que les souris sont normalement éveillées et actives. Les tests comportementaux ont également été raffinés pour étudier des comportements de prise de décision éthologique (qui existent effectivement dans la nature) dans des conditions quasi-naturelles au sein même du laboratoire. Le projet comprend des chirurgies qui se feront sous anesthésie générale avec une couverture antalgique qui agira dès le réveil de l’animal et qui sera maintenue si l’animal montre des signes de souffrance. La procédure d’anesthésie a été raffinée et permet d'être rapidement inversée par l’injection d’une solution de réveil, permettant ainsi d’éviter au maximum les problèmes et inconforts liés à une anesthésie pharmacologique. Les procédures de chirurgie ont été raffinées grâce à la cartographie du cerveau permettant des injections précises ciblant seulement les structures d’intérêt, permettant ainsi de réduire considérablement les effets secondaires liés à des injections peu spécifiques. Les animaux, bien que hébergés de façon individuelle, auront un contact olfactif et visuel avec leurs congénères. Ils auront un enrichissement important (nid, maison, tunnel, bâtonnets à ronger) et seront manipulés/habitués quotidiennement par le même expérimentateur. Des points limites spécifiques suffisamment précoces seront définis.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Le projet sera réalisé sur des animaux de 8 semaines ce qui correspond chez cette espèce à l’âge jeune adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stables le temps de nos protocoles, et la taille du cerveau est homogène, garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection.