Système nerveux

Commandées à sept semaines chez un fournisseur agréé, ou nées de lignées génétiquement modifiées comparées à leurs contrôles de portée, 1 940 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever peau, cerveau, moelle épinière, rate et ganglions rachidiens. Le dos est dépilé puis exposé vingt minutes aux ultraviolets sous anesthésie, et la sensibilité mécanique de la zone brûlée est mesurée dix minutes par jour sur animal éveillé. Une partie subit l'ablation des glandes surrénales sous anesthésie profonde à l'âge de quatre semaines, d'autres reçoivent du LPS pour déclencher une inflammation aiguë, de la toxine diphtérique ou du tamoxifène jusqu'à trois fois par semaine. Le porteur affirme que ces interactions entre système nerveux et système immunitaire ne peuvent pas encore être modélisées in vitro ou in silico, tout en annonçant l'emploi de cocultures de neurones et de cellules immunitaires déjà maîtrisées au laboratoire.

Objectifs

Lors d’un coup de soleil, les cellules immunitaires orchestrent la réparation cutanée. La peau est aussi densément innervée par des neurones sensoriels qui communiquent avec les cellules immunitaires pour optimiser la cicatrisation, puis transmettent les informations vers le cerveau. Nous avons récemment observé qu’une zone particulière du cerveau appelée hypothalamus était sollicité suite aux coups de soleils et induisait la libération de neurohormones, les glucocorticoïdes, aux propriétés anti-inflammatoires. Notre objectif dans ce nouveau projet est de caractériser comment la peau et le cerveau dialoguent pour assurer un processus de cicatrisation optimal. Notre modèle de lésion cutanée aux ultraviolets est idéal pour étudier les échanges entre le système nerveux et le système immunitaire. En effet, il permet de suivre à la fois le processus de cicatrisation et la transmission nerveuse des messages de toucher et de douleur vers la moelle épinière jusqu’au cortex cérébral. Notre équipe a déjà démontré l’importance des neurones sensoriels au cours de la réparation de la peau, cependant, comment le cerveau perçoit les lésions cutanés et y réponds, reste encore mal compris. Ainsi, le projet a pour but de répondre aux objectifs suivants : (1) identifier les étapes clés de la réparation cutanée après lésion chez des souris de type sauvage, et sa perception par le système nerveux périphérique et central. (2) Déterminer les rôles respectifs des neurones sensoriels et de l’hypothalamus dans la réparation cutanée. (3) Déterminer les mécanismes moléculaires, médiés par le cerveau, qui orchestrent la réponse immunitaires de réparation cutanée. Comprendre ces mécanismes nous permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter les pathologies inflammatoires, prévenir les douleurs chroniques et favoriser la régénération tissulaire.

Bénéfices attendus

L’orchestration du processus de régénération tissulaire après lésion, par le système nerveux périphérique et central, reste encore très inexplorée. L’un des avantages majeurs de la neuro-immunologie est d’identifier des cibles pharmacologiques qui pourraient simultanément soigner les pathologies inflammatoires, et prévenir les douleurs qui y sont associées. Outre son aspect fondamental, la compréhension des mécanismes régulateurs sous-jacents, permettrait d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter l’inflammation et favoriser la réparation tissulaire tout en traitant les douleurs associées. Cette approche est particulièrement intéressante pour des personnes souffrant de défaut de cicatrisation telles que les personnes âgées ou bien atteintes de diabète. Nous proposons d’étendre nos résultats précédents à l’étude des interactions bidirectionnelles entre la peau et le cerveau. La douleur et le stress associé à une blessure (invalidité, chirurgie) constituent un problème majeur de santé public. Mieux comprendre comment ces deux processus modulent le système immunitaire au cours de la cicatrisation est primordial pour améliorer à terme le confort des patients, prévenir l’escalade de la douleur vers un stade chronique et approfondir notre compréhension de son mécanisme d’action. A terme, cette étude permettra de développer de nouveaux médicaments pour traiter la douleur inflammatoire tout en minimisant les potentiels effets secondaires.

Procédures

Toutes les souris subiront une anesthésie générale afin de subir une dépilation sur la peau du dos puis une exposition aux ultraviolets pendant 20 minutes de la zone dépilée, toujours sous anesthésie. Nous réaliserons ensuite des études de comportement pour tester l’évolution de la perception de la douleur (mesure de sensibilité mécanique ; 10 min/jour) suite à l’exposition aux ultraviolets sur animaux vigiles. Plusieurs des injections à réaliser (1 min) sont faites en intrapéritonéal, en sous cutané, ou en intradermique, sur animaux vigiles. Des prélèvements sanguins seront faits sur la veine sous-mandibulaire (2 min). Certaines procédures nécessiteront une chirurgie (ablation des glandes surrénales ; 10 min) sous anesthésie profonde (45 min), après laquelle la plaie sera suturée et les souris suivies quotidiennement et traités avec des analgésiques, crème cicatrisante et anti-inflammatoires.

Impact sur les animaux

Les animaux seront amenés à subir une irradiation aux ultraviolets (20 minutes) sur une petite zone de la peau du dos qui pourraient induire une perte de poids (sur 2 jours), des modifications de comportement en plus de l’inflammation cutanée. La procédure pourra aussi provoquer une sensibilité mécanique ainsi qu’un potentiel prurit (démangeaisons) au niveau de la peau irradiée. Les mesures de sensibilité mécanique (5 min.) peuvent engendrer du stress. Toutes ces procédures seront réalisées par un personnel qualifié et expérimenté et tout sera mis en œuvre pour minimiser la nuisance provoquée. Les injections, en intrapéritonéale ou sous cutanée, réalisées sur animaux vigiles peuvent générer un stress de courte durée (5 min.). Les modèles génétiques utilisés ne présentent pas de phénotypes dommageables. L’effet principal des déplétions génétiques que nous réalisons est une diminution de la sensibilité à la douleur chez ces animaux (perte de sensibilité à la chaleur, ou aux stimulations mécaniques). Le suivi de certaines souris impliquera une anesthésie légère à l’isoflurane (5 min.) jusqu’à 3 fois par semaine, ce qui induira du stress à l’animal. De même, certaines méthodes de traçage génétique nécessiteront une injection de tamoxifène jusqu’à 3 fois par semaine. La déplétion de certaines cellules immunitaires nécessitera une injection intrapéritonéale unique de toxine diphtérique. Pour notre approche pharmacologique, les traitements (injection ou application topicale) seront effectués journalièrement pendant 4 jours sous isoflurane et pourront engendrer du stress. La procédure (No3) chirurgicale visant à enlever les glandes adrénales (20 min/souris) nécessitera un traitement pré- et post-opératoire analgésique pour minimiser la douleur et le stress des animaux avant, pendant et après la chirurgie. Les souris traitées au LPS subissent une inflammation aigue pour une période de temps très courte (6 heures) au bout de laquelle les souris seront sacrifiées et analysées. La dose utilisée (100ng/10g) n’induit pas de choc septique. Cependant, il se peut que ces souris subissent une baisse transitoires (45 min.) de leur température corporelle. Nous utiliserons un tapis chauffant (37C) ainsi qu’un milieu enrichi pour prévenir cette hypothermie avant analyse.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures et les organes d'intérêts (peau, DRG, cerveau, moelle épinière, rate, ganglion lymphatique) seront prélevés post mortem pour analyse. Les animaux seront euthanasiés car le prélèvement des différents tissus est indispensable pour étudier le recrutement cellulaire de la réponse inflammatoire au niveau des tissus étudiés.

Remplacement

Le modèle animal (in vivo) est indispensable pour étudier les interactions entre système immunitaire et système nerveux sensoriel. En effet, ce sont des événements progressifs et multifactoriels qui dépendent des interactions tissulaires, cellulaires et moléculaires, localement sur le site inflammatoire mais également à distance dans les ganglions rachidiens de la racine dorsale (DRG) qui innervent la peau. Ces interactions ne peuvent pas encore être modélisées in vitro ou in silico, en particulier l’étude de l’innervation dans un tissu donné. Cependant, pour la recherche de mécanismes d’interaction neurone/cellule immunitaire ou des neuropeptides produits par ces neurones sensoriels, nous veillerons à utiliser dès que possible des techniques ex vivo déjà maîtrisées au laboratoire, telles que la coculture de neurones et de cellules immunitaires.

Réduction

Le plan de nos expériences est construit de manière à limiter le nombre de souris au maximum. Sur la base de nos résultats précédents, pour une différence biologiquement pertinente, nous avons estimé que 10 souris par expérience sont nécessaires : Des groupes de 5 souris seront générés en adéquation avec l’âge, le sexe et le fond génétique contrôle à chaque lignée murine (5 souris dites « test » et 5 souris « contrôles », soit 10 souris par expérience) pour chaque procédure. Chaque expérience sera répétées au moins une fois, soit 20 souris pour chaque condition testée pour répondre aux exigences statistique. Nous utiliserons à la fois des mâles et des femelles dans nos expériences, pour éviter de produire des animaux sans les utiliser. Tous les paramètres quantifiables seront vérifiés (poids, score d’inflammation, comportement) et tous les organes nécessaires à notre étude seront prélevés (peau, rate, et ganglion rachidien de la racine dorsale, moelle épinière et cerveau) afin d’éviter des expériences inutiles. Nous avons choisi de comparer les groupes de souris génétiquement modifiées avec leurs contrôles de portée respectifs et non avec des souris de type sauvage. Le contrôle des paramètres environnementaux et le statut sanitaire des animaux permettront de limiter la variabilité des résultats expérimentaux, et de réduire le nombre d’animaux nécessaire.

Raffinement

Nous avons optimisé le modèle UV dans notre Apafis précédent pour minimiser le stress et la souffrance liée à la lésion tissulaire. Seule une zone tres restreinte de la peau du dos des souris sera exposée aux ultraviolets. Les animaux utilisés dans ce projet sont élevés en groupes sociaux, la présence d’objets permet le raffinement de l’environnement dans des cages standards à toit ouvert (couvercle à filtre) avec de la sciure de bois utilisée comme litière et un accès ad libitum à un bidon d’eau et à un régime alimentaire standard. Nous utilisons alternativement des carrés de ouates pour que les animaux puissent faire un nid, des dômes en cellulose ou des tunnels en carton, qui sont changés chaque semaine. Les élevages sont effectués au sein d’un établissement agréé où 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages. L’état sanitaire et environnemental des animaux est contrôlé tous les jours. Nous avons recours à l’anesthésie/analgésie lors de l’exposition aux UV. Une planification fine des procédures expérimentales est effectuée (disponibilité des locaux d’expérimentation, du matériel, période d’acclimatation d’une semaine minimum des animaux aux pièces d’expérimentation et l’animalerie) pour diminuer le stress des animaux. Notamment lors du test comportemental par Von Frey les animaux seront acclimatés à l’enceinte 30 minutes avant les mesures pour minimiser le stress. Enfin l’établissement des points limites selon les grilles en annexe sera suivi au quotidien (vérification du poids, de la vivacité et de l’état du pelage des animaux) pour decider de continuer l’expérience ou non en fonction des signes vitaux des animaux. Une souris ayant perdu 20% de son poids sera systématiquement euthanasiée. Ces stratégies seront mises en place dans le but de réduire/supprimer la souffrance animale. Les modèles génétiques, ainsi que les déplétions chimiques ne présentent pas de phénotype dommageable. Les procédures incluant une chirurgie suivront un protocole strict pour réduire la souffrance de l’animal avant, pendant et après la chirurgie. Les souris seront maintenues profondément anesthésiées lors de l’opération et des soins pré-(Buprénorphine), per- (lidocaïne localement) et post-opératoires (Buprénorphine) adéquats sont administrés en plus de creme cicatrisante et nourriture humide pour éviter toute carences hydrique/alimentaires). Un tapis chauffant (37C) est utilisé pour éviter toute hypothermie pendant l'anesthésie.

Choix des espèces

Le niveau de similarité entre la souris et l’homme justifie son utilisation. L’état des connaissances actuelles, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation font de la souris le modèle idéal à l’étude des systèmes immunitaires et nerveux. En effet les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires entre la Souris et l’Homme. De plus, l’existence de modèle murins génétiquement modifiés fait de la souris un modèle animal de choix pour étudier ces phénomènes physiologiques. Des souris de 8 à 12 semaines seront utilisées car à ce stade elles ont atteint leur maturité en termes de défenses immunitaires et de développement du système nerveux. Ainsi, les animaux auront été commandés à 7 semaines auprès du fournisseur agréé de manière à ce qu'ils s'acclimatent à notre animalerie pendant au moins une semaine. Pour l’adrénalectomie, des souris de 4 semaines sont utilisées pour leur donner une période de rétablissement de 4 semaines avant induction de la lésion cutanée aux UV et étude de la réparation tissulaire.

Implantées dans le crâne après une heure de neurochirurgie, 360 souris reçoivent des stimulations électriques intracérébrales une à deux fois par semaine, sur animal éveillé, pendant des sessions allant jusqu'à quarante minutes. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec jusqu'à dix injections et vingt prélèvements de sang par animal, et sont hébergées derrière un séparateur qui les isole physiquement de leur congénère pour protéger le système d'enregistrement. Le porteur qualifie l'intensité des stimulations de faible et n'attend une réaction comportementale que dans de rares cas, tout en prévoyant l'administration immédiate de kétamine et de diazépam en cas de crise épileptique. Les dispositifs d'enregistrement n'étant pas amovibles, aucune souris ne sort vivante du projet.

Objectifs

L’objectif aujourd’hui est d’identifier des méthodologies précliniques précoces capables de sélectionner des candidats médicaments sur la base de leur efficacité potentielle chez l’homme. Cela signifie d’appréhender cette problématique par une approche consistant à utiliser les données existantes de la recherche clinique pour construire de nouvelles solutions de recherche préclinique et se baser sur des signes de la maladie dans le cerveau et des tests médicaux utilisables à la fois chez l’animal et chez l’homme. Les activités cérébrales de base sont largement conservées dans l’évolution des mammifères montrant le fort potentiel de transposition de cette méthode du rongeur à l'Homme, et donc l’application chez le rongeur d’observations faites chez le patient et inversement. Dans ce projet, nous étudierons les activités électriques cérébrales chez des animaux. Les différences mises en évidence pourront alors être utilisées pour différents tests médicamenteux afin d’identifier une molécule efficace pour lutter contre la maladie.

Bénéfices attendus

L’optimisation de nouveaux médicaments nécessite d'identifier des signes de la maladie dans le cerveau et des tests transposables entre les études cliniques et précliniques. Ils doivent permettre d’évaluer de façon fiable et robuste l’efficacité des molécules testées. Les activités électriques cérébrales sont largement conservées à travers les mammifères permettant ainsi une transposition fiable entre l’humain et le rongeur. Dans ce projet, nous utiliserons des souris et chercherons à mettre en évidence des spécificités de la maladie qui pourront par la suite être applicable à l'Homme et permettre de tester de nouvelles molécules thérapeutiques. L’identification d’un potentiel nouveau traitement de la maladie d’Alzheimer permettrait d’améliorer les conditions de vie de nombreux patients.

Procédures

L’ensemble des animaux de ce projet vont subir une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. Les animaux sont hébergés après l’implantation dans des cages à deux contenant un séparateur qui favorise le contact olfactif, visuel et auditif mais qui permet de les isoler afin de préserver l’intégrité du système d’enregistrement. Les animaux seront tous soumis à des stimulations intracérébrales répétées de faible intensité qui seront réalisées sur l’animal éveillé une à deux fois par semaine. Chaque session de stimulation durera entre 3 et 40 minutes au maximum. Au préalable de chacune de ces sessions de stimulations, une molécule pharmacologique pourra être administrée à l'ensemble des animaux (injections aigues durant quelques minutes). Pour ces tests pharmacologiques, un maximum de 10 injections sur une période de 5 à 10 semaines seront réalisées. Des prélèvements sanguins sur animal éveillé pourront également être réalisés (20 maximum au total et 15 minutes maximum par animal), tous les animaux du projet sont susceptibles d'être soumis à ces prélèvements.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, une diminution de l’activité locomotrice et une déshydratation passagères pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaître dans les heures suivant l’intervention chirurgicale. Lors de la stimulation cérébrale, malgré l’intensité faible utilisée, une réaction comportementale (immobilité, sursaut, clignement des yeux) pourra être induite dans de rares cas. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tout test de composé sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une perte de tonus musculaire, une somnolence ou à l’inverse une excitation du fait des mécanismes d’action des molécules testées. Le modèle utilisé présente une stagnation de la prise de poids à partir de 10 mois ainsi qu’une surmortalité très modérée propre au modèle non liée au vieillissement.

Devenir

Ce projet implique l’implantation de dispositifs d’enregistrement de signaux électriques du cerveau qui ne sont pas amovibles, les animaux doivent donc être mis à mort à la fin du projet.

Remplacement

Ce projet nécessite l'utilisation de modèles animaux car il étudie des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être représentés par des modèles plus simples (ex. modèle cellulaire ou informatique).

Réduction

Dans le cas des études de test pharmacologique, chaque animal est son propre contrôle et sera utilisé pour tester différents candidats médicaments, permettant de limiter le nombre d’animaux nécessaire par groupe. Ce type de protocole nous permet d’utiliser des tests statistiques de type appariés. Le nombre d’animaux a ainsi été déterminé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité scientifique des expériences menées.

Raffinement

Les souris qui entrent dans ce projet ont au minimum une semaine d’acclimatation à la zone d’hébergement. Une injection d’analgésique sera faite avant la neurochirurgie et sera renouvelée 6 à 8 h après afin de prévenir toute douleur liée à la phase de chirurgie. Après la neurochirurgie, l’état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et les points limites adaptés. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les animaux seront hébergés dans des cages d’hébergement avec enrichissement (coton, maison en carton) pour limiter tout stress dû à l’environnement quotidien. Les stimulations seront interrompues au moindre signe d’inconfort de l’animal (évaluation visuelle comportementale). En cas de survenue d’une crise épileptique : un traitement de kétamine/diazépam sera administré alors immédiatement. Dès l’apparition d’un signe clinique d’alerte (poids, comportement...) nous nous réfèrerons à une grille de cotation interne spécifique permettant de prendre les mesures nécessaires en fonction des points limites identifiés afin de préserver le bien-être animal. L’évaluation est réalisée jusqu’à disparition du signe d’alerte. Lors des injections, une surveillance particulière est portée sur les animaux. Un arbre décisionnel peut être consulté en cas d’altération de l’état général de l’animal après l’injection afin de le soulager.

Choix des espèces

Dans ce projet nous utiliserons des souris. Ces animaux présentent des similarités anatomiques et fonctionnelles avec le cerveau humain et notamment au niveau des activités électriques du cerveau. Ces similarités peuvent être utilisées pour le développement de nouveaux médicaments. La sélection de la souris est aussi basée sur des études précédemment réalisées. Les animaux sont âgés de minimum 3,5 mois puisque nous souhaitons évaluer les modifications des activités électriques chez des animaux adultes. A ce stade, les circuits électriques du cerveau sont matures. Les animaux seront gardés jusqu’à l’âge de 14 mois maximum car le sujet d’étude concerne la maladie d’Alzheimer qui se développe avec le vieillissement.

Toutes tuées pour que leur système nerveux central soit prélevé, 30 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit quarante gavages oro-gastriques, un par jour, sur animal vigile, avec de la roténone, un insecticide que la Commission européenne a interdit en 2008 pour sa toxicité. Le porteur qualifie la dose de "modérée" et "peu impactante sur la qualité de vie des animaux", et n'attend du gavage qu'une irritation transitoire du système digestif. Il s'agit d'une étude pilote de trois ans, dont la fonction déclarée est de mettre le modèle en place pour permettre de futures expériences.

Objectifs

La roténone est un insecticide d’origine naturelle extrait de racines de plantes tropicales. En raison de sa toxicité, la commission européenne a interdit son utilisation en 2008, avec des dérogations jusqu’en 2011. Le lien étroit entre une exposition à la roténone d'origine professionelle (agriculture) et un risque accru de développer une maladie de Parkinson a été formellement établi en 2011. Les examens post mortem réalisés sur des cerveaux de travailleurs exposés à la roténone dans le cadre de leur activité professionnelle ont révélés des lésions caractéristiques de la maladie de Parkinson : perte des neurones dopaminergiques et accumulation de protéines pathologiques. Ainsi, l’exposition expérimentale à la roténone chez la souris est aujourd’hui utilisée non seulement comme modèle de la maladie de Parkinson, mais aussi pour évaluer ses effets potentiels sur les troubles du développement cérébral chez les fœtus exposés in utero. Il existe en effet de fortes présomptions pour une toxicité des polluants environnementaux (incluant les produits phytosanitaires) sur le cerveau en développement. L’objectif de notre étude pilote est d’implémenter le modèle d’exposition expérimentale à la roténone chez la souris par administration directe dans l'estomac. Cette étude pilote, d'une durée de 3 ans, permettra de préparer de futures études portant sur l’effet de la roténone sur les lésions caractéristiques de la maladie, ainsi que sur les effets toxiques neuro-développementaux de la roténone.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de disposer d’un modèle de référence de maladie de Parkinson provoquée par exposition aux produits phytosanitaires. Sur le plan des connaissances scientifiques, le projet produira des données inédites sur des mesures du comportement des souris dans ce modèle de maladie de Parkinson en complément des données biologiques.

Procédures

Les souris sont exposées à la roténone par voie orale via un gavage oro-gastrique quotidien. Le gavage dure 1 minute et est réalisé sur animal vigil. Chaque souris sera soumise à 40 gavages sur l'ensemble de la période d'expérimentation. En fin de protocole, il sera procédé à une chirurgie terminale sous anesthésie en vue du prélèvement du cerveau.

Impact sur les animaux

Le modèle est bien décrit dans la littérature et la dose modérée utilisée est peu impactante sur la qualité de vie des animaux . La procédure de gavage oral, réalisée par un personnel expérimenté, est susceptible d’engendrer une irritation transitoire du système digestif.

Devenir

L'objectif de ce projet est l'étude de l'effet neurotoxique de la roténone, pour ce faire il est nécessaire de mettre à mort les animaux afin de disposer du système nerveux central.

Remplacement

A ce jour, le remplacement complet de ce modèle d’étude n’est pas envisageable. Les mécanismes moléculaires et cellulaires, et leurs interactions, impliqués dans le développement de la pathologie spécifique produit par l'administration de roténone ne sont pas réalisables in vitro. L’étude de ces mécanismes nécessitent l'utilisation de modèles animaux.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet. Le schéma expérimental utilisé considère chaque animal comme son propre contrôle grâce à la répétition des tests et permet ainsi la réduction du nombre d'animaux.

Raffinement

Conformément aux exigences de raffinement, les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie, et seront hébergés dans un environnement enrichi (igloos, nestlets et petites buchettes de bois). Le suivi individuel consiste en une inspection visuelle du comportement et de l’apparence au quotidien. Le suivi individuel est approfondi lors des pesées bi-hebdomadaires. Les points limites concernent la perte de poids, la présence de piloérection accompagnée du dos vouté et l’absence de réaction à la stimulation. L’administration orale de la roténone évite la répétition d’injections intrapéritonéales.

Choix des espèces

Les souris utilisées sont des souris conventionnelles qui permettront la comparaison de nos résultats avec les données de la littérature. Le projet prévoit d’utiliser des souris à l'âge de 5 semaines à l'arrivée au laboratoire. Le protocole d’exposition démarrera lorsque les souris auront 8 semaines, ceci nous permettra de comparer les résultats avec les données de la littérature.

Opérées du crâne dans les deux premiers jours de leur vie, des souris nouveau-nées reçoivent une greffe de cellules nerveuses assemblées en trois dimensions par lévitation acoustique. 312 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. Le porteur indique que la séparation d'avec la mère peut conduire celle-ci à rejeter définitivement ses petits, et qu'un échec de la greffe peut diminuer la capacité de préhension de la patte avant gauche. L'étude pilote annoncée porte sur 120 animaux au maximum, sans que le reste de l'effectif demandé soit détaillé.

Objectifs

Le cortex cérébral est la partie externe du cerveau et est responsable de fonctions complexes telles que la perception sensorielle, la cognition, la génération de commandes motrices volontaires... Il est composé de six couches distinctes, chacune ayant des types spécifiques de neurones et des connexions uniques. Ces couches jouent un rôle crucial dans le traitement de l'information en permettant une organisation et une transmission efficaces des signaux neuronaux à travers différentes régions du cerveau. Le cortex cérébral est souvent affecté en cas de traumatisme crânien en raison de sa position superficielle, cependant les solutions thérapeutiques proposées demeurent limitées. En effet, le cerveau adulte présente une faible capacité d’autoréparation, que ce soit dans la neurogenèse de nouvelles cellules ou de nouvelles connexions projetant sur de longue distance. La transplantation cellulaire offrirait ainsi une stratégie thérapeutique pour les patients en apportant de nouvelles cellules en remplacement de celles perdues suite à une lésion. Différentes technologies sont actuellement utilisées pour procéder à la reconstruction 2D ou 3D de tissus complexes à partir de cellules vivantes. Dans le champ des Neurosciences, de nombreux modèles in vitro sont actuellement en cours de développement. Cependant, l’objectif de ce projet n’est pas d'étudier la thérapie cellulaire par transplantation de cellules fœtales, mais plutôt d’évaluer un éventuel intérêt de la lévitation acoustique comme technique innovante pour améliorer cette thérapie. Des recherches récentes ont montré qu'il est possible, en utilisant la lévitation acoustique, de structurer en 3D des couches de neurones intégrées dans des blocs d’hydrogel. Le but de ce projet est donc de tester la capacité des structures neuronales 3D obtenues par lévitation acoustique à favoriser la restauration des différentes voies neuronales après transplantation dans un modèle murin de traumatisme crânien.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d'étudier l'intérêt de la technique de lévitation acoustique sur la réparation des réseaux neuronaux après transplantation de cellules chez le rongeur. Cette technique permet un positionnement extrêmement précis des cellules, ce qui est essentiel pour cibler des zones spécifiques du cerveau avec une grande exactitude. La lévitation acoustique offre une méthode innovante et potentiellement supérieure pour la manipulation précise et douce des cellules destinées à la thérapie cellulaire, améliorant la précision, la viabilité et l'efficacité de ces interventions thérapeutiques. A plus long terme, les bénéfices attendus de ce projet sont le développement de thérapie chez l'Homme autour la transplantation cellulaire, afin d’améliorer la qualité et la fiabilité des transplantations et ainsi améliorer la prise en charge des patients souffrants de lésions corticales.

Procédures

Sur nouveau-nés anesthésiés : 1 chirurgie craniale pour transplanter des cellules : 1 fois (5 minutes par animal, 312 animaux). Sur animaux vigiles : au maximum une dizaine de pesées par animal, d'une durée d'environ 1 minute (une fois par semaine, sur toute la durée du projet, 312 animaux maximum). Sur animaux anesthésiés (avec antalgie) : 1 chirurgie sans réveil pour le prélèvement du cerveau (5 minutes par animal, 312 animaux).

Impact sur les animaux

La séparation des nouveaux nés avec leur mère, le temps de la chirurgie, peut induire un stress modéré transitoire chez la mère et chez les petits. Cette séparation peut également induire un rejet définitif des petits par la mère. Pendant l’induction de la cryoanesthésie, une sensation de froid transitoire est attendue. Après la chirurgie crânienne, l’effet indésirable attendu est une douleur modérée transitoire atténuée par des antalgiques. Si la greffe est un échec, l’effet potentiellement attendu est une légère diminution de la capacité de préhension de la patte avant gauche. L’acte de pesée sur animal vigile peut induire un léger stress transitoire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet afin de récupérer le cerveau pour des études neuroanatomiques.

Remplacement

La technique d’impression des cellules par lévitation acoustique utilisée dans cette étude aura été testée au préalable in vitro. La différenciation et la survie des cellules seront vérifiées avant de commencer les tests in vivo. Dans ce projet, nous souhaitons étudier la possibilité de la réparation du cerveau lésé sur le plan neuroanatomique. De ce fait, la nécessité de modèles animaux apparait essentielle à l’étude de cette pathologie. Ces approches nécessitent la présence du réseau neuronal qui est uniquement accessible dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. De nos jours, il n’est pas encore possible de modéliser la complexité du cortex cérébral de mammifère in vitro ou in silico, qui nous permettrait d’étudier la reconstruction des noies neuronales.

Réduction

Nous avons réduit au maximum le nombre d'animaux nécessaires en expérimentation tout en s'assurant d'en avoir le nombre suffisant pour avoir une étude interprétable sur le plan statistique. Nous commencerons par réaliser une étude pilote qui consistera à valider les bons paramètres de la technique de lévitation acoustique pour la viabilité du greffon. Nous procéderons avec une démarche pas à pas (par groupe de 6-8 animaux, c’est-à-dire une portée), répétés au maximum 15 fois, soit 120 animaux maximum au total. Si l'étude pilote donne des résultats satisfaisants, une étude comparative utilisant différentes techniques de préparation des neurones à transplanter sera réalisée. Les données de l'étude pilote seront alors exploitées dans cette étude comparative réduisant d'autant le nombre d'animaux utilisés. Si l’étude pilote ne donne pas de résultat satisfaisant, le projet sera arrêté.

Raffinement

Les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (hébergement en groupe dans des locaux adaptés avec enrichissement du milieu adapté à l'espèce : matériel de nidification et tunnel). Les mères seront conditionnées aux manipulations et aux odeurs 7 jours avant la procédure pour éviter le rejet des nouveaux-nés. Lors de la chirurgie nous aurons recours à une anesthésie générale avec une analgésie. Durant toute la procédure, les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (alimentation, apparence, comportement) et des actions seront mises en place en cas de problème(s) observé(s), avec l’utilisation de points limites adaptés et gradés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus utilisée pour les modèles animaux dans le domaine des neurosciences. Les modèles de lésion/transplantation corticale chez le rongeur sont bien référencés et maitrisés. Les animaux seront utilisés au stade postnatal (jusqu'à 2 jours après la naissance). La réalisation de transplantations cérébrales chez les nouveaux-nés de souris présente plusieurs avantages : -Le cerveau des nouveau-nés est beaucoup plus plastique que celui des adultes, ce qui signifie qu'il est plus capable de réorganiser ses circuits neuronaux et d'intégrer les nouvelles cellules -Les nouveau-nés ont souvent une réponse immunitaire moins développée, ce qui réduit le risque de rejet des cellules transplantées par rapport aux adultes dont le système immunitaire est plus mature et réactif -Les cellules souches transplantées chez les nouveau-nés sont plus susceptibles de se différencier en types de cellules appropriés et de former des connexions fonctionnelles beaucoup plus rapidement

Une partie des souris viendra d'autres protocoles de l'animalerie, où elles étaient déjà vouées à la mise à mort. 336 souris au total vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie du crâne d'environ trente minutes pendant laquelle des particules chargées de médicaments et libérables par la lumière sont injectées dans une zone précise du cerveau, puis elle est suivie jusqu'à 28 jours avant d'être tuée. Le porteur affirme que la biocompatibilité de ces particules "ne peut être vérifiée que chez l'animal entier", tout en indiquant n'avoir jamais observé d'effet indésirable sur le comportement ou le tissu cérébral en plusieurs années.

Objectifs

Le projet de recherche dans lequel s'insère le présent projet consiste à développer une nouvelle approche pour la libération contrôlée de molécules dans le cerveau. Pour cela, nous utilisons des particules microscopiques qui contiennent les médicaments souhaités et qui peuvent les libérer à la demande, sous l'action d'une lumière délivrée à une couleur précise. L'objectif à long terme de ce projet est de proposer une nouvelle approche thérapeutique pour plusieurs maladies du cerveau. De nombreuses étapes du projet sont réalisées sans le recours à l'expérimentation animale, en vue de réduire le nombre total d'animaux utilisés. Cependant, la validation de la sécurité biologique de notre technologie nécessite l'utilisation de souris, d'où la présente demande.

Bénéfices attendus

Dans un premier temps, la mise au point de cette technologie permettra à plusieurs équipes de recherche en neurosciences de tester leurs hypothèses de recherche avec une approche pharmacologique plus ciblée que les outils disponibles aujourd'hui. Dans un second temps, ce projet rentrera dans le cadre d'une recherche translationnelle, pour que cette approche pharmacologique soit utilisée pour améliorer la prise en charge thérapeutique de certaines pathologies dont l'origine dans le cerveau est localisée, comme certaines épilepsies, les glioblastomes, les accidents vasculaires cérébraux, ou encore la maladie de Parkinson.

Procédures

Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales de type stéréotaxique (à l'aide d'un atlas anatomique), visant à injecter des médicaments encapsulés dans des zones précises du cerveau. Pour chaque animal, la procédure chirurgicale dure environ 30 min entre le moment où ils sont endormis et le moment où ils se réveillent. Chaque animal ne subira qu'une chirurgie.

Impact sur les animaux

Les chirurgies à réaliser présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opération. Cependant, nous avons maintenant plusieurs années de recul et nous n'avons jamais observé d'effet indésirable chez les animaux injectés avec les particules, que ce soit sur leur comportement, ou sur leur tissu cérébral.

Devenir

Tous les animaux suivront la même procédure, afin de quantifier la biocompatibilité des médicaments encapsulés injectés dans le tissu nerveux, jusqu'à 28 jours après injection. L'issue de la procédure est la mise à mort de l'animal.

Remplacement

Le projet scientifique dans lequel s'insère ce projet prévoit un grand nombre d'expériences utilisant des modèles de culture cellulaire, et ce précisémment en vue de remplacer les modèles animaux. De plus, de nombreuses expériences du projet ont déjà été réalisées en solution ou dans des gels d'agarose, afin de caractériser les propriétés des particules développées pour le projet, sans avoir recours à l'expérimentation animale. Cependant, la biocompatibilité des particules pour le cerveau ne peut être vérifiée que chez l'animal entier, d'où la présente demande d'autorisation.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes, évitant la répétition des expériences. A chaque fois que ce sera possible, nous utiliserons pour nos expériences des animaux déjà présents à l'animalerie, issus d'un autre protocole, et qui ne peuvent plus être utilisés différemment (donc destinés à l'euthanasie). Par ailleurs, des expériences de biocompatiblité ont déjà été réalisées avec un suivi longitudinal, chez des animaux suivis pendant une longue période avec de l'imagerie in vivo. Même si cette approche apporte des réponses essentielles, elle n'est pas suffisante pour quantifier avec précision le devenir des particules dans le cerveau, d'où la nécessité du présent projet.

Raffinement

Dans ce projet, nous appliquerons les conditions d'hébergement optimales pour les animaux, ainsi que les points limites et les points d'arrêts précoces et adaptés, tels que définis par la structure Bien-Etre Animale de l'établissement utilisateur. Ainsi, les souris seront hébergées par 5 avec présence de différents enrichissements et une surveillance quotidienne sera réalisée (comportement général, disponibilité en eau et nourriture). En cas de nécessité, les soins à apporter seront réalisés rapidement, avec sollicitation des vétérinaires du site si besoin. Pour les chirurgies, les soins pré- et pos-opératoires seront appliqués et notifiés. Tout au long du projet, l'anesthésie, l'analgésie et l'euthanasie seront mises en place de façon appropriée par des expérimentateurs formés et expérimentés. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille basée sur des scores de 0 à 3 et seront consignés sur une fiche de scorage. Dans le cas d'un score préoccupant (>9), l'animal sera euthanasié dans les 48h au plus tard si son état ne s'améliore pas malgré les soins délivrés.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille, elles peuvent donc être facilement hébergés à l’animalerie dans de bonnes conditions d’élevage. C'est aussi le modèle le plus couramment utilisé pour les études qui se rapprochent du présent projet. De plus, les outils utilisés (anticorps, microscopes etc.) sont les plus développés (et donc les plus efficients) pour la souris. En outre, nous sommes dans une démarche de ré-utilisation d'animaux déjà présents à l'animalerie pour nos expériences, or l'animal le plus présent dans notre animalerie est de loin la souris (pas de rats ou d'autres animaux actuellement pour notre laboratoire). Nous utiliserons des animaux adultes, car les chirurgies stéréotaxiques sont plus faciles à réaliser chez des animaux déjà adultes. Ainsi, nous utiliserons les animaux entre 8 semaines et 8 mois d'âge.

Tester des molécules antiépileptiques pour le compte de clients suppose une lignée de rats sélectionnés de génération en génération pour faire des crises d'absence. 3 240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un tiers d'entre eux subit une neurochirurgie d'une heure doublée d'une chirurgie abdominale pour la pose de capteurs, puis des enregistrements cérébraux de deux à quatre heures une à deux fois par semaine, des injections pouvant aller jusqu'à deux par jour pendant 28 jours, et un hébergement en cage individuelle après l'implantation. Le porteur chiffre les effectifs d'après "l'activité envisagée de la société dans les 5 prochaines années", l'utilisation réelle dépendant de "la demande".

Objectifs

L’épilepsie représente l’une des atteintes neurologiques les plus prédominantesdans le monde. Il existe différents types d’épilepsies pouvant être catégorisées suivant l’origine de la maladie mais également suivant l’origine cérébrale des décharges épileptiques. Dans ce projet, une forme généralisée d’épilepsie sera étudiée : l’épilepsie-absence. Cette forme d’épilepsie se caractérise par l’apparition de décharges épileptiques généralisées non convulsives associées à une brève interruption de conscience et un arrêt de toute activité. Le développement clinique de nouvelles drogues antiépileptiques requière tout d’abord le test sur des épilepsies pharmaco-résistantes. Puis ces nouvelles molécules doivent ensuite montrer une efficacité sur des épilepsies généralisées de type absence. L’épilepsie-absence a pu être modélisée chez le rat par croisement successif ; Une étude pharmacologique sur ce modèle a montré une sensibilité aux mêmes antiépileptiques que les patients ainsi qu’une aggravation des crises chez le rat avec les mêmes antiépileptiques. Ce modèle, au cours des années, est devenu un modèle de référence pour évaluer les effets soignants et éventuellement aggravants de nouvelles molécules en développement. Le but de se projet est d'identifier les nouvelles molécules pouvant soigner l'épilepsie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure sélection et validation de nouveaux médicaments contre l'épilepsie et d’optimiser les chances de succès lors des phases cliniques.

Procédures

Environ 1/3 des animaux de ce projet vont subir : - une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. - une chirurgie abdominale (en simultané avec la neurochirugie) pour le placement de capteur - la pose de dispositif sous cutané sous anesthésie générale (1/4 heure) - des enregistrements une à deux fois par semaine pendant 2 à 4 heures. - Lors de ces enregistrements des traitements pharmacologiques en courte durée seront administrés (injections aigues durant quelques minutes), Une période de repos de 2 jours minimum sera respectée entre 2 sessions (en fonction du delais possible d'admission des candidats médicaments). Lors des tests pharmacologiques en administration de longue durée (chronique), les injections pourront être réalisées jusqu’à deux fois par jour, sur une durée maximum de 28 jours. - des prélèvements sanguins pourront être faits.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, une diminution de l'activité locomotrice et une deshydratation passagère pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaitre dans les heures suivant l'intervention chirurgicale. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tous tests de composés sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une perte de tonus musculaire, une somnolence ou à l'inverse une excitation dûe au fait des mécanismes d'action des molécules testées. Les animaux sont hébergés en cage individuelle (portoir ventilé) après l'implantation des dispositifs d'enregistrement ce qui engendre un isolement social.

Devenir

Il sera nécessaire de vérifier l’exposition aux molécules testées et une caractérisation histologique des tissus de tous les animaux engagés dans ce projet. Pour se faire la mise à mort des animaux en fin de chaque porcédure est nécessaire

Remplacement

Cette étude nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle vise à étudier des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être représentés par des modèles plus simples (ex. modèle cellulaire ou computationnel). Pour toute demande de mise sur le marché, et quel que soit le pays de vente ciblé, il est indispensable pour les industries pharmaceutiques de prouver l’innocuité et l’efficacité d’une molécule. Avant de réaliser des essais cliniques, des tests in vitro et in vivo sont nécessaires. Les mécanismes d’apparition, puis de mise en place des troubles neurologiques, sont encore peu connus et nécessitent des explorations supplémentaires. Cette étude nécessite donc l'utilisation de modèles animaux car elle cible des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être récapitulés par des modèles plus simples (ex. culture de neurones).

Réduction

Ce nombre d’animaux a été déterminé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en gardant un nombre suffisant pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées. De plus, les animaux sont traités en plan d'étude croisé (tous les animaux reçoivent toutes les molécules avec à chaque fois une vérification de l’EEG avant une nouvelle administration - chaque animal est son propre contrôle). Chaque animal possède deux voies d’enregistrements permettant ainsi de réaliser les enregistrements même si un canal d’enregistrement devient inexploitable. Pour la procédure 1, nous pouvons l’estimer à 60 lots sur 5 ans (1 lot par mois). Un maximum de 14 rats par lot est prévu. Ce nombre permet d’obtenir une bonne fiabilité des résultats et une puissance statistique suffisante pour conclure sur l’efficacité du composé testé. Pour la procédure 2, nous planifions l’utilisation de 120 lots (2x60) de 20 rats sur 5 ans pour les dosages pharmacocinétiques. Un lot représente un dosage sur un plan d’étude croisé. Les animaux pouvant être testés sur 2 plans d’etude croisé, ce nombre de lots reflète l’activité envisagée de la société dans les 5 prochaines années, soit 2400 animaux. Ce nombre d’animaux est un nombre maximal, l’utilisation dépendra de la demande.

Raffinement

Dès réception, les animaux s'acclimatent 1 semaine à leur environnement. Une injection d’analgésique sera faite avant la procédure chirurgicale et sera renouvelée 6 à 8 heures après la première injection (0.05 mg/kg, i.p). Les chirurgies se déroulent sous anesthésie générale volatile. L'état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et définissant les points limites adaptés. Cela permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les animaux seront hébergés dans des cages individuelles avec enrichissement. Il sera proposé aux animaux, 1 fois par semaine pendant 30 minutes, un temps de regroupement et de sociabilisation au sein d'une enceinte contenant différents enrichissements (= cours de récréation). Les animaux sont rassemblés dans une enceinte fermée avec litière et divers enrichissements, leur permettant une liberté de mouvement plus grande et une interaction entre congénères. Des points limite ont été définis et une prise en charge de la douleur avec utilisation d’analgésique sera effectué en cas de besoin.

Choix des espèces

Les modèles animaux sont indispensables pour avancer dans la compréhension des épilepsies. La lignée de rats utilisée a été développée en sélectionnant des lignées de rats naturellement épileptiques, qui présentent le même type d’anomalies comportementales et cérébrale que l’humain. Les activités neurologiques, visibles lors des enregistrements cérébraux ont des similitudes avec ceux observés chez les patients souffrant d’épilepsie-absence : début et fin abruptes, oscillations rapides et régulières. Les modifications comportementales sont similaires à celles d’un humain pendant une crise absence : brève rupture de contact se traduisant par une activité motrice figée et une fixité du regard. Les tests pharmacologiques montrent les sensibilités aux mêmes drogues. Des animaux adultes sont utilisés (âge minimum de 2 mois). Pour que les implantations des électrodes et leur fixation sur la boite crânienne se fasse sans douleur, il faut que la structure osseuse soit mature, c’est-à-dire que l’animal ait fini sa croissance osseuse. De plus, les crises apparaissent à partir de l’âge de 30 jours post-natal et sont stables et bien établies à partir de 2 mois d’âge.

Une injection dans l'orbite de l'œil sous anesthésie, un jeûne de 24 heures, 48 heures d'hébergement individuel, puis deux séries de tests comportementaux sur deux semaines pour mesurer des troubles moteurs, cognitifs et anxieux. 318 souris passent par ce protocole, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le modèle porte une modification de la protéine Huntingtine, et le porteur annonce qu'il ne devrait provoquer ni point limite ni mort prématurée, tout en prévoyant la mise à mort de tout animal perdant plus de 20 % de son poids. Une chirurgie terminale clôt le parcours, le temps de prélever le cerveau et d'autres organes conservés pour des expériences ultérieures.

Objectifs

La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative rare d’origine génétique pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Afin de pouvoir répondre à des questions fondamentales sur les mécanismes de cette maladie, un nouveau modèle a été développé afin de pouvoir étudier une modification de la protéine Huntingtine. Cette modification contribue au phénomène de neurodégénérescence et à la mortalité des neurones dans la maladie de Huntington. L'objectif de ce projet est de comprendre pourquoi et par quels moyens cette modification est toxique.

Bénéfices attendus

La technique utilisée dans ce nouveau modèle pour recréer cette modification de la protéine Huntingtine a déjà été validée sur des cellules en culture. Les résultats prometteurs obtenus sur des cellules en culture doivent désormais être testés et adaptés dans une étude animale. Ce projet a pour but de comprendre ce mécanisme de modification de la protéine Huntingtine et permettra à terme de développer des thérapies afin de retarder la progression de la maladie et/ou d’empêcher l’apparition des symptômes chez les patients atteints par la maladie de Huntington.

Procédures

Au cours de leur vie, les animaux recevront une injection rétro-orbitale sous anesthésie (durée de l'injection = 30 secondes) puis effectueront au maximum deux séries de tests comportementaux pendant une durée maximale de deux semaines. L'objectif de ces tests comportementaux est de comprendre comment la modification de la protéine Huntingtine engendre des problèmes moteurs, cognitif et anxieux. Enfin, une chirurgie terminale sous anesthésie sera pratiquée pour le prélèvement d'organes.

Impact sur les animaux

Selon la littérature et des résultats préliminaires, la modification génétique du modèle murin utilisé dans ce projet ne devrait pas entraîner l'apparition de points limites ni de mort prématurée. Cependant, plusieurs effets indésirables peuvent être identifiés : 1) un stress léger lors de la manipulation des animaux afin de les anesthésier une seule fois pendant 5 minutes et de leur administrer un composé permettant de modifier la protéine Huntingtine (durée de l'administration = 30 secondes); 2) un stress modéré lors de la mise à jeun de 24h et 3) un stress modéré lors de l'hébergement individuel des animaux pendant une durée de 48h.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin des procédures. Leurs tissus cérébraux ainsi que d'autres organes clés dans la maladie de Huntington seront prélevés et conservés afin de réaliser des expériences ultérieurement.

Remplacement

Le projet traitant de réseaux neuronaux complets, il est impossible de remplacer le modèle animal vivant par des cultures cellulaires ou des simulations informatiques.

Réduction

Le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe afin d'obtenir des résultats statistiquement analysables et interprétables. Des résultats sur cellules en culture ont déjà validé ce modèle ce qui a permis de réduire le nombre d'animaux testés dans ce projet. Dans une démarche de réduction, les souris utilisées vont permettrent de faire plusieurs études et de répondre à différentes questions fondamentales. De plus, à la fin de l'étude, plusieurs organes clés dans la maladie de Huntington seront prélevés. Ceci permettra d’obtenir du matériel biologique précieux sans devoir générer des animaux supplémentaires.

Raffinement

Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal et aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez ces animaux. L’état de santé des animaux sera surveillé conformément à la réglementation par l’apparition de stress/douleur selon les critères de base (poil hérissé, faible activité, arrêt du toilettage). De plus, bien que la procédure soit peu invasive et très rapide (5min), des points limites suffisamment précoces et spécifiquement adaptés à ce projet tels qu'une perte de poids supérieure à 20%, un gonflement de l'oeil suite à l'injection ou tout autres signes de traumatisme seront mis en place. En présence de l'un de ces points limites, nous appliquerons une procédure d'arrêt des souffrances.

Choix des espèces

Compte tenu de la similarité de l'anatomie du cerveau avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude de la maladie de Huntington. Le modèle murin utilisé ici permet de comprendre le rôle de la protéine responsable de cette maladie et de ses interactions au niveau d’un organisme entier. Les symptômes neurodégénératifs se développant dans la majorité des cas à l’âge adulte chez l’Homme, les tests comportementaux seront réalisés entre 4 et 7 mois une fois que le réseau neuronal des animaux est mature.