Système nerveux
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Atténuation des souvenirs aversifs éthologiques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 8
Exposées sans contact à un rat prédateur ou à un congénère agressif, soumises à des chocs électriques aux pattes, à une contention prolongée, à une séance de nage ou à dix jours d'isolement, 1 660 souris et 8 rats seront tous tués, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Certaines subissent en plus jusqu'à trois chirurgies cérébrales, ou une ligature du nerf sciatique provoquant une douleur chronique pendant trente jours. Les huit rats ne sont pas étudiés, ils servent de stimulus de peur, et une souche de souris est choisie pour son agressivité. Le porteur affirme que les fonctions visées, mémoire et peur, rendent l'animal vivant "incontournable".
Objectifs
L’objectif de ce projet est d'étudier les circuits neuronaux sous-jacents à l’atténuation de souvenirs traumatiques. Cela est important parce que les expériences traumatisantes génèrent de souvenirs très intenses qui souvent dégénérer en e trouble de stress post-traumatique. Malgré la fréquence élevée de ce trouble, les traitements disponibles sont pas très efficaces, ce qui indique que c’est nécessaire de mieux comprendre les mécanismes neuronaux sous-jacents à l'atténuation de la mémoire traumatique. Dans cette étude on va étudier l’atténuation de souvenirs traumatiques induits par l'exposition à des menaces naturelles, comme l’exposition à un prédateur ou à un congénère agressif. Cela nous permettra d’identifier les réseaux de neurones et les mécanismes neurophysiologiques nécessaires au bon fonctionnement de ce phénomène d’atténuation. Ce travail pourra contribuer au développement de stratégies thérapeutiques pour soulager les individus affectés par le trouble de stress post-traumatique chez lesquels l’extinction des souvenirs traumatiques est déficitaire.
Bénéfices attendus
Cette étude aidera à comprendre comment le cerveau peut se remettre de souvenirs traumatisants et atténuer les fortes réponses émotives qui y sont associées. Ce qui est unique dans ce projet, c'est qu'il modélisera cela en utilisant les souvenirs naturels de peur des souris résultant d’une exposition à un prédateur ou à un congénère agressif. Cela modélise avec plus de précision que les études classiques la complexité des traumatismes rencontrés en clinique. Ce faisant, notre projet permettra d'étudier les déficiences neurales à l'origine des déficits d'extinction et, à terme, de développer des cibles pour une thérapie spécifique dirigée contre le syndrome de stress post- traumatique.
Procédures
Notre projet implique des chirurgies cérébrales (la procédure chirurgicale dure au maximum 45 minutes. Temps de récupération post-chirurgicale complète max 5 jours ; les souris subiront un maximum de trois interventions chirurgicales espacées d'au moins une semaine). Certains souris subiront aussi des stress physiques (stimulation électrique aux pattes provoquant la peur (3 min), ligature du nerf sciatique provoquant une douleur chronique (max 30 jours) et/ou psychologiques d’une durée de maximum 10 minutes (contention prolongée, exposition sans contact à un prédateur, exposition à un congénère agressif, séance de nage). Enfin certains animaux seront isolés pour maximum 10 jours.
Impact sur les animaux
- Extinction éthologique: Isolement (max 10 jours, modéré) + exposition sans contact à un Prédateur/exposition à un congénère agressif/exposition à un stimulation électrique 0,8 mA, 2 secondes, 3 fois (modéré)= total modéré - Extinction éthologique (modéré) + 1 chirurgie stéréotaxique (modéré) = total sévère - Extinction éthologique (modéré)+ 3 chirurgie stéréotaxique (modéré) = total sévère - Extinction éthologique (modéré) + contention prolongée (moderé)+ séance de nage (moderé) = total sévère - Extinction éthologique (modéré) + ligature du nerf sciatique provoquant une douleur chronique (sévère)= total sévère La méthode de génotypage et d'identification pour totes les souris est fait par poinçonnage auriculaire.
Devenir
La mise à mort est prévue pour tous les souris expérimentales afin de prélever les cerveaux pour l'analyse biologique. Les souris CD1 et les rats seront mises à mort à la fin de chaque procédure (ils ne peuvent pas être conservée d’une procédure à l’autre parce que le délai entre les procédures nécessaire pour analyse des données est trop long).
Remplacement
Du fait des du sujet de ce projet, qui est de comprendre de fonctionnes complexes du cerveaux comme la mémoire et la peur, l’utilisation d’animaux vivants reste incontournable. En effet, à l’heure actuelle, il n'existe pas de méthodes substitutives qui prévoit pas l’utilise d’animaux vivantes pour obtenir des données sur ces processus mentale, bien trop complexes pour envisager toute simulation informatique. Le modèle souris est idéal du fait de la proximité fonctionnelle entre son système nerveux central et celui de l’humain quant à ses capacités à créer des souvenirs émotionnels simples (auxquels nous nous intéressons, type conditionnement pavlovien) et de sa petite taille. Ceci explique également l’impossibilité d’utiliser des modèles animaux invertébrés, trop éloignés de l’humain pour raisonnablement étudier une réponse émotionnelle à un souvenir ainsi que trop éloignés dans la configuration du système nerveux central, critique à notre étude inter-régions.
Réduction
Nous allons utiliser le moins d'animaux possible tout en obtenant des résultats biologiquement et statistiquement significatifs pour notre projet. Nous utilisons des calculs statistiques pour déterminer combien d'animaux sont nécessaires, en nous basant sur des données déjà disponibles dans des études similaires. Toutes les procédures expérimentales ont été perfectionnées afin d’obtenir des taux de réussites les plus élevés possibles, par le biais par exemple : De la mise en place de techniques chirurgicales communes et du partage des connaissances de “savoir- faire”. D’une veille technologique et d’une régulière mise à jour des équipements. De l’utilisation d'animaux qui sont pas à corriger. Cela nous permet de produire le nombre exact d’animaux nécessaires aux procédures expérimentales sans avoir à éliminer les animaux superflus. Enfin, nous avons réalisé des études pilotes basées sur l'analogie avec la littérature qui ont permis d'estimer le nombre d'animaux nécessaires pour chaque expérimentation avec le logiciel G*Power en considérant un α = 0.05 et Puissance = 0.95 (la taille de l'effet a été calculée pour chaque type d’expérience).
Raffinement
Les tests comportementaux que nous proposons sont particulièrement sensibles au niveau de stress des souris. Nous portons donc une attention particulière au bien-être des souris à la fois dans les conditions d'hébergement (enrichissement des cages : maison, matériel de nidification, bâtonnet en bois à ronger)) et dans la conception des tests expérimentaux (réduction de la douleur et de l'angoisse infligée à son minimum nécessaire pour produire les comportements recherchés). Les protocoles de chirurgie utilisés répondent aux meilleurs standards de l’anesthésiologie et de la prise en charge de la douleur. L’hypothermie induite lors de ces protocoles est contrée par l’utilisation d’un tapis chauffant spécialement conçu. Les conditions de réveil sont particulièrement surveillées. Les animaux seront régulièrement manipulés afin de les familiariser aux expérimentateurs. Des points limites adaptés et précoces nous permettront également de réagir de manière anticipée à toute dégradation superflue du bien-être de nos animaux.
Choix des espèces
Les comportements que nous souhaitons étudier sont trop complexes pour justifier de l’utilisation d’espèces non mammifères (drosophile, poisson-zèbre, etc.). De même, les méthodes alternatives qui prevoiyent pas l’utilise d’animaux vivantes ne sont pas assez développées pour modéliser ni la mémoire, ni le fonctionnement du cerveau à si grande échelle. Par ailleurs, eu égard au nombre d’animaux requis, les rongeurs (et plus particulièrement les souris) s’imposent de par la facilité et la stabilité de leur élevage. La souris a également été préférée au rat pour deux principales raisons : -La littérature relative à la mémoire, incluant tous nos précédents travaux, est bien plus riche chez la souris que chez le rat. -Notre équipe est déjà formée sur la souris, notamment pour la réalisation des chirurgies. Ne pas changer de modèle nous permettra de conserver ce savoir-faire, et ainsi de ne pas sacrifier d’animaux supplémentaires pour adapter les chirurgies à un nouveau modèle animal. Enfin, la souris constitue un excellent modèle pour l’étude des conséquences du stress d’un point de vue physiologique, comportemental ou cellulaire. Les mécanismes moléculaires du stress ainsi que les propriétés neuronales de ces rongeurs au niveau des structures sous-corticales étudiées sont très proches de ceux du cerveau humain. Cela nous permettra de réaliser des études dont l’impact sera important pour la compréhension de l’atténuation des souvenirs aversifs, et ainsi de pouvoir mieux cibler les approches thérapeutiques. Dans cette étude, des rats vont également être utilisé. Ces rats sont utilisés comme stimulus aversif envers nos souris expérimentales et non directement comme sujets étudiés. Pour cette raison, le nombre de rats utilisés dans cette étude est extrêmement limité (
Etude d’un nouveau traitement contre les douleurs chroniques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 624
Pour tester des candidats médicaments contre la douleur chronique, 3 835 souris et 624 rats sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, tous tués à l'issue. Le porteur inflige des atteintes du nerf sciatique, une incision de la voûte plantaire ou la ligature d'un nerf lombaire, et précise qu'aucune médication antalgique systématique ne sera appliquée puisque la douleur constitue le paramètre étudié. Les animaux qui perdent plus de 15 % de leur poids, qui présentent une paralysie de la patte opérée ou qui se blessent entre eux sont tués sans délai. Aucun placement ni aucune mise en liberté n'est prévu, la mise à mort servant, selon lui, à ne pas prolonger la douleur provoquée.
Objectifs
Une douleur qui dure plus de trois mois est définie comme chronique et en tant que telle représente un des problèmes de santé publique les plus importants dans les pays développés. Les douleurs chroniques affectent environ 20% de la population adulte, et sont pour la plupart résistantes aux traitements thérapeutiques actuels. De plus, l'utilisation de la morphine, molécule de référence pour le traitement de la douleur, est limitée en raison de l'apparition d'effets secondaires et de phénomènes de tolérance. Nous avons démontré que l’activation d’un récepteur neuronale spécifique est nécessaire et suffisant pour générer expérimentalement une douleur neuropathique (douleur liées aux nerfs) chez les rongeurs. Plus important encore, nous avons montré que, lorsque l’état de douleur neuropathique était installé, l'inhibition de ce récepteur suffisait à annuler les symptômes douloureux. De plus, nos découvertes récentes étendent le champ d’application aux maladies douloureuses pouvant être traitées avec des opioïdes (épargne morphinique) et élargissent le champ d’application des inhibiteurs de ce récepteur aux douleurs inflammatoires (DI). Ces résultats ont été publiés et fait l’objet de plusieurs brevets. Dans ce projet, l'implication de ce récepteur, nouvelle cible innovante dans les douleurs chroniques, sera étudiée. De façon plus précise, les effets de nouveaux antidouleur, des inhibiteurs de ce récepteur, seront générés et explorés dans des modèles d'étude des différents types de douleurs chroniques.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but, dans un premier temps, de compléter nos connaissances sur l’intégration de l’information douloureuse et son maintien, ainsi que d’amener de nouvelles clés à la compréhension des mécanismes autour de la douleur chronique. Ce travail, mené depuis maintenant plusieurs années, nous a déjà permis de mettre en avant un acteur essentiel dans les douleurs neuropathiques périphériques, mais surtout une cible potentielle pour de nouveaux composés thérapeutique. Le manque évident de traitement aux douleurs neuropathiques agit comme motivateur principal à ces travaux de recherche. Au vue de l’avancée de cet étude, il convient maintenant de développer nos composés antagonistes (bloqueur) au récepteur découvert et de tester leur efficacité sur les différents modèles de douleur (à la fois neuropathique et inflammatoire) dans le but d’avancer des candidats pré-cliniques pour le traitement des douleurs chroniques et réaliser ensuite des études cliniques chez l’homme.
Procédures
Les animaux pourront être soumis à 5 types de procédures chirurgicales différentes, induisant des douleurs neuropathiques ou inflammatoires. Les trois premières induisent des douleurs neuropathiques chez la souris et portent atteinte au nerf sciatique de manières différentes en fonction de la procédure, ces interventions durent entre 5 et 10 minutes et se font sur animaux anesthésiés par inhalation. La quatrième se fait également sur la souris et induit une douleur inflammatoire par une simple incision de la voûte plantaire, cette intervention dure 5 minutes et se fait sur animaux anesthésiés par inhalation. La cinquième se fait sur le rat et induit une douleur neuropathique par ligation (léger nœud) d'un nerf partant de la moelle épinière au niveau lombaire, cette intervention dure entre 15 et 20 minutes et se fait sur animaux anesthésiés par inhalation. Les prèlevements submandibulaires et de la veine caudale se feront sur animaux endormis et anesthésiés et durent approximativement 2 à 3 minutes.
Impact sur les animaux
La douleur étant le paramètre étudié, aucune médication antalgique ou analgésique systématique ne sera appliquée. D’autre part, des tests de toxicologie in vitro sont systématiquement réalisés sur nos composés avant tout test sur l’animal pour assurer la sûreté de nos produits. Aucun des composés déjà testés n’ont montré de problème de toxicologie, ni l’apparition d’effets secondaires sur l’animal. De ce fait, la douleur induite par nos différents modèles sera la seule nuisance pour les animaux. En cas de troubles comportementaux (perte de poids rapide supérieure à 15%, paralysie de la patte opérée, pilo-érection) suite à la chirurgie, les animaux seront euthanasiés sans délai afin d’éviter la mort par inanition. En cas de lésions dues à des attaques entre les animaux, ceux-ci seront séparés et/ou le milieu enrichi par ajout d’igloo. Si les attaques continuent et/ou les lésions sont trop importantes ou douloureuses pour l’animal, celui-ci sera euthanasié sans délai.
Devenir
La douleur chronique étant étudiée, et donc induite, chez ces animaux, le devenir de ceux-ci en fin de procédure expérimentale sera systématiquement la mise à mort afin de ne pas prolonger inutilement la douleur. Aucun placement ou mise en liberté n’est donc prévu pour ce projet.
Remplacement
A ce jour, il n'y a pas de modèles non animaux permettant d'étudier les mécanismes du système nerveux impliqués dans la transition entre douleur aiguë (court terme) et douleur chronique (long terme). Les effets pharmacologiques des molécules utilisées sur la chronicisation douloureuse, l'analgésie et l'état émotionnel, doivent être évalués au travers de systèmes intégrés par différents tests comportementaux, qui viennent appuyer et confirmer les données obtenues par des approches cellulaires. Il est donc indispensable d'avoir recours à des investigations sur l'animal afin de proposer des alternatives thérapeutiques pour une amélioration de la prise en charge de la douleur. La souris et le rat étant des mammifères dont la physiopathologie est proche de l'Homme, ces espèces seront utilisées dans le cadre du projet.
Réduction
Une stratégie par étape/boucle sera mise en place afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés de manière rationnelle et efficace pour l’obtention de 2 candidats médicaments. Ainsi tous les antagonistes générés ne seront pas testés sur chacune des procédures, seulement les deux candidats médicaments devront être testés sur l’ensemble des procédures, ce qui réduit drastiquement le nombre d’animaux utilisés. Le nombre de rats et de souris par lot a été déterminé sur la base d’expérimentations précédentes réalisées. Ce nombre a été confirmé par le calcul de puissance via une analyse a priori à l’aide d’un logiciel. Le calcul de puissance à 80% indique un nombre de 8 rats par groupe pour observer une différence de 20% entre les animaux contrôles et les animaux traités. Pour les souris, le calcul de puissance à 80% indique un nombre de 13 souris par groupe pour observer une différence de 20% entre les animaux contrôles et les animaux traités.
Raffinement
Précédent chaque expérimentation, une habituation de minimum une semaine est réalisée au cours de laquelle les animaux sont placés dans la pièce expérimentale pendant minimum 1h et exposés aux différents tests sans application du stimulus nociceptif. Cela permet aux animaux de s’habituer à l’environnement et à l'expérimentateur limitant ainsi l’impact du stress (angoisse) lié à la procédure expérimentale. En outre, les rats seront soumis à une habituation supplémentaire d’une semaine au cours de laquelle l’expérimentateur manipulera chaque rat individuellement. Cette période d’habituation leur permettra de s’acclimater uniquement à l’expérimentateur et aux différentes contentions réalisées par celui-ci durant l’expérimentation. Ces périodes d’habituation sont fondamentales afin d’assurer une reproductibilité des tests nociceptifs et donc de limiter l’hétérogénéité des animaux, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, afin de limiter la douleur chez les animaux, toute expérience est limitée dans le temps (maximum 1 mois après la lésion). Afin de limiter la douleur pendant les procédures expérimentales, tout acte opératoire sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Par ailleurs, les animaux sont gardés en cage collective (10 souris/cage) dans une animalerie dans laquelle la température et l'hygrométrie sont contrôlées. Les locaux sont en légère surpression, les cages possèdent des couvercles filtrants, et les animaux bénéficient d'un enrichissement du milieu (copeaux, igloos en plastique, bâtonnets de cellulose). Un suivi de l’animal sera également mis en place afin de déterminer les points limites les plus précoces. Une fois par semaine seront relevés : le poids de l’animal, l’aspect de son pelage, ses comportements ainsi que sa vitesse de respiration. Un score pré-établi associé à chacun de ces paramètres nous permettra de determiner si la fréquence de ce suivi devra être augmenté ou si l’animal devra être euthanasié afin d’éviter des souffrances trop importantes.
Choix des espèces
La souris et le rat étant des mammifères dont la physiopathologie est proche de l'Homme, ces espèces seront utilisées dans le cadre du projet. Les souris utilisées seront adultes et auront entre 6 et 12 semaines afin que les animaux ne soient ni en croissance ni en phase de vieillissement. Les rats seront utilisés entre 5 et 6 semaines pour les mêmes raisons citées ci-dessus.
Étude de la synthèse des protéines neuronales chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une biopsie de la queue et deux à quatre injections intrapéritonéales avant analyse post-mortem, pour vérifier des invalidations géniques touchant la fabrication des protéines de surface des neurones. Le porteur qualifie ce travail d'étude pilote portant sur un nombre "relativement restreint" d'animaux, et l'un de ses objectifs affichés consiste à vérifier que ces invalidations ne provoquent pas de phénotype dommageable. La description des gestes infligés tient en une ligne, et les retombées annoncées pour les maladies humaines restent lointaines.
Objectifs
Le développement et la fonction des neurones requiert la genèse de nombreuses protéines de surface qui permettent aux neurones de percevoir et d’interagir avec leur environnement. Nos travaux précédents montrent que des étapes spécifiques de la maturation des protéines ne sont pas nécessaires pour la production de protéines de surface fonctionnelles par les neurones, contrastant avec d’autres types cellulaires où ces étapes sont requises. Les mécanismes cellulaires sous-jaccents sont cependant encore mal caractérisés. Des études étendues de ces processus ont été réalisées dans des modèles de culture cellulaire à l’aide d’agents pharmacologiques. Nous souhaitons maintenant généraliser ces résultats en utilisant des modèles d’invalidation génique chez la souris. Notre projet a pour but de valider cette approche par des analyses post mortem et de vérifier l’absence de phénotypes dommageables provoqués par ces invalidations géniques. Ces étapes de maturation sont modulées dans de nombreuses maladies neurologiques ou psychatriques. Ce projet de recherche fondamentalle permettra de mieux comprendre les bases cellulaires de ces variations, contribuant ainsi in fine à l’identification de nouveaux biomarqueurs ou de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les expériences réalisées nous permettront de préciser le rôle d’étapes importantes de la synthèse des protéines de surface des neurones, un mécanisme cellulaire fondamental, apportant des informations manquantes sur les causes responsables des dérégulations de ce processus qui sont observées dans de nombreuses maladies humaines sévères et actuellement non ou difficilement traitables.
Procédures
injections intrapéritonéales (entre 2 et 4) ou sous-cutanées (1) (gestes de 1-2 minutes)
Impact sur les animaux
Douleurs de quelques secondes lors des injections IP et de la biopsie de la queue.
Devenir
Les expériences prévues impliquent toutes une analyze post mortem des échantillons.
Remplacement
Les études qui seront réalisées font suite à des études étendues de ces processus dans des systèmes de culture cellulaire. Il est maintenant essentiel d’étudier ces mécanismes in vivo dans des neurones intégrés dans leur environnement tissulaire complexe pour étudier plus avant leur rôle physiopathologique.
Réduction
Nous réalisons ici une étude pilote sur un nombre relativement restreint d’animaux qui nous permettrons de tester la faisabilité d’expériences projetées dans des modèles de neuropathologies. Le nombre de souris requis a été estimé sur la base de nos travaux précédents et d’études comparables pour avoir des résultats statistiquement valides après analyse a posteriori.
Raffinement
Les résultats de cette étude pilote nous permettront d’optimiser nos procédures pour des analyses futures plus étendues. Les souris seront élevées en groupes sociaux dans des cages comprenant du matériel de nidification. Un personnel formé au bien-être animal surveille les animaux tous les jours. L’apparition de signes de stress ou de douleur sera attentivement suivie et la poursuite des expériences déterminées en fonction d’une évaluation régulière de points limites appropriés. Des anesthésiques et analgésiques seront utilisés pour prévenir la douleur des animaux.
Choix des espèces
La souris a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux. Les souris présentent un système nerveux suffisamment développé pour permettre une extrapolation des résultats à l’espèce humaine. Une autre raison pour utiliser la souris est la possibilité de manipuler de types précis de cellules chez des animaux transgéniques. Les animaux seront utilisés entre 2 semaines (stade le plus approprié pour le genotypage) et 6 mois de vie (stade suffisant pour le suivi longitudinal efficace de nos expériences avec des souris adultes).
Effet de l’enrichissement de l’environnement et de l’activité physique sur une maladie du cerveau EU1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour mesurer les effets de l'enrichissement du milieu et de l'exercice sur un modèle murin de maladie d'Alzheimer, 480 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour prélèvements post-mortem. L'étude des bienfaits de l'environnement passe par un isolement en cage individuelle de trois mois pour 240 d'entre elles, et par 33 jours d'isolement pour les tests comportementaux, que le porteur reconnaît générateurs de stress. Un de ces tests place les souris dans une eau à 22 °C quatre fois par jour pendant six jours, avec risque d'hypothermie transitoire. Le porteur affirme qu'aucune alternative cellulaire ne convient et que seul l'animal entier permet ce travail.
Objectifs
L’environnement, tel que l’augmentation des activités sociales, de la nouveauté et de l’activité physique, influence positivement l’expression des gènes nécessaires à la plasticité neuronale dans le cerveau. Cela est possible grâce à des mécanismes appelés épigénétiques, c’est à dire qu’ils permettent l’adaptation des programmes génétiques. L’objectif de ce projet vise à établir ces régulations génétiques/épigénétiques à l’échelle de tout le génome, c’est à dire de doser tous les gènes qui seront changés par les conditions d’hébergement, et leur régulation au sein même du génome, ainsi que ceux qui seront relargués dans le sang. Pour ce faire, nous utilisons un modèle animal (souris) de maladie du cerveau. Une fois les transcrits identifiés dans le sang, ils pourraient servir de biomarqueurs pour faire valoir de l’efficacité d’un hébergement enrichi (environnement ou exercice physique). De plus, ces études seront menées de façon cellule-spécifique (cellules neuronales et non neuronales) car toutes les cellules ne répondent pas de la même façon à l’environnement. Ce projet questionne les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents aux effets bénéfiques de ces changements d’environnement, leur efficacité au niveau cognitif (évaluations comportementales) et les modifications structurelles et fonctionnelles qu’ils induisent sur le cerveau (imagerie). Le projet sera mené sur des souris mâles et des souris femelles.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu de ces études est l'obtention de données claires démontrant si des (et quelles) modifications épigénétiques et programmes génétiques sous-tendent les effets bénéfiques de l’environnement enrichi et de l’exercice physique dans un modèle de maladie du cerveau aussi répandu que la maladie d’Alzheimer. De plus, cette étude apportera des réponses concrètes sur les mécanismes d’action impactés par l’environnement et l’exercice sur le plan comportemental, cellulaire et moléculaire : formation de la mémoire à long terme dans l’hippocampe et le cortex frontal, transcription des gènes dans l’hippocampe, formation d’épine dendritiques dans l’hippocampe, impact sur les différentes structures cérébrales. En apportant des bases mécanistiques, ces études permettront d’étayer les connaissances plus fondamentales de l’effet bénéfique de l’environnement et leur implication en santé humaine. Ces études apporteront des bénéfices en santé humaine car elles dévoileront des pistes et des preuves de concept pour la mise en place de stratégies de prévention. En fournissant des informations sur les mécanismes moléculaires/cellulaires, dépendants du sexe et de l'âge, qui sous-tendent les interventions non pharmacologiques telles que l'environnement enrichi et l’exercice physqiue dans les principales régions cérébrales affectées par la maladie d’Alzheimer, nos données offriront de nouvelles opportunités pour la personnalisation de la médecine et leur mise en place aux stades les plus précoces. Ce projet devrait in fine permettre un traçage biologique (dans le sang) visant à utiliser des stratégies thérapeutiques nouvelles, ou combinatoires soutenant des stratégies non pharmacologiques (épi-médicaments ou thérapies basées sur l'ARN). Ces études permettront aussi de mieux comprendre la maladie d’Alzheimer, son développement et sa progression dans les modèles animaux, qui pourront être ensuite rapportés/étudiés chez l’Homme. Enfin, ce projet comprend les analyses conjointes sur les souris mâles et femelles. Les taux de prévalence de la maladie d'Alzheimer varient en fonction de l'âge mais aussi du sexe, les femmes représentant deux tiers des patients atteints. En apportant une analyse complète (cognitif, moléculaire, imagerie cérébrale) des différences entre mâles et femelles, ce projet apportera donc un bénéfice sur la compréhension de mécanismes pouvant être spécifiquement liés au sexe.
Procédures
240 animaux vigiles seront hébergés en cage isolée avec dispositif de nidification pendant 3 mois (de 6 à 9 mois), 120 bénéficieront d’une roue d’activité sur laquelle ils pourront tourner, cette roue sera bloquée pour les 120 autres animaux. Comportement réalisé sur 160 animaux vigiles sur une période de 33 jours/animal, période durant laquelle les animaux sont hébergés en cage individuelle pour tester différents aspects comportementaux et mnésiques (en moyenne 15 minutes par jour) sur 13 jours environ avec des phases de repos de 3 jours entre les tests. Les souris transgéniques modèle de maladie développent des déficits mnésiques à l’âge de 9 mois.
Impact sur les animaux
L’isolement des congénères nécessaire pendant les tests comportementaux (33 jours) et pendant l’hébergement en cage d’exercice, ainsi que et leurs contrôles (3 mois) peut générer un stress. Dans un des tests comportementaux, les animaux sont placés dans l’eau à 22°C pendant un temps inférieur à une minute (4 fois/jour pendant 6 jours), ce qui peut produire un stress thermique ainsi qu’une hypothermie transitoire. Les études de comportement pourront induire du stress aux animaux.
Devenir
Tous les animaux (480) seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvements et analyses post-mortem.
Remplacement
Dans la mesure où nos travaux portent sur les caractérisations comportementales et moléculaires suite à un changement des conditions environnementales (hébergement spécifique), il n’est pas possible de recourir à un autre type de modèle d’étude qu’à celui de l’animal entier. Nous ne pouvons pas utiliser d’alternative cellulaire. Notons que les modèles murins (souris) récapitulent les symptômes majeurs de la maladie (déficit de mémoire) et restent ainsi des outils uniques pour l'étude des mécanismes physiopathologiques, la validation de cibles thérapeutiques et la réalisation de tests précliniques.
Réduction
Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux pour permettre des analyses statistiques sur des groupes incluant mâles et femelles, soit 20 souris/groupe (10 mâles et 10 femelles) pour le comportement et l’imagerie cérébrale, et 6 souris/groupe (soit 3 mâles et 3 femelles) ainsi que 4 souris/groupe (soit 2 mâles et 2 femelles) pour les approches moléculaires. L’efficacité de chaque type d’hébergement sera effectuée à l’aide de tests statistiques adaptés. Les calculs fait tiennent compte de la variabilité interindividuelle. Ainsi, pour toutes nos analyses, nous utiliserons à la fois des animaux mâles et femelles dans nos expériences de manière à ne pas biaiser nos résultats, et les sexe ratios seront conservés entre les différents groupes.
Raffinement
Pour appliquer le principe de raffinement, un enrichissement environnemental est apporté dans les cages standards ainsi que dans les cages à roue : dispositif de nidification (certifié contact alimentaire) chaque semaine. Les changes seront opérés par les animaliers à l’aide de tunnels (polycarbonate transparent), permettant de réduire le stress des animaux, notamment efficace chez les souris (raffinement d’hébergement). Dans le cas d’hébergement en cage isolé (cages à roue et comportement), plusieurs cages (3 au minimum) seront maintenues côte à côte sur les rayonnages des racks de stabulation. Des points limites prédictifs sont mis en place pour limiter la souffrance : les souris sont observées lors de la visite journalière, et une surveillance plus détaillée des souris se fait tous les 15 jours (observation visuelle de l’aspect général, posture). Les souris sont habituées à la manipulation par l’expérimentateur pour réduire le stress lié à la manipulation lors des tests comportementaux. Les animaux sont testés dès le début de l’apparition des déficiences mnésiques afin de réduire le temps d’hébergement des animaux en animalerie. Les procédures incluant une perfusion sur cœur battant sous anesthésie profonde ou un prélèvement sanguin terminal sont réalisées sous anethésie additionnée d’une couverture analgésique locale. Pendant la semaine qui suit, le suivi quotidien est renforcé.
Choix des espèces
Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des maladies du cerveau ayant une origine génétique. En effet, les maladies du cerveau que nous étudions dans ce projet apparaissent à l’âge adulte (40-50 ans) lorsque ce sont des formes génétiques. Elles apparaissent plus tardivement, quand leur origine n’est pas connue, le vieillissement étant un facteur de risque majeur de ces pathologies. Ainsi, les animaux étudiés seront testés à l'âge de 9 mois, nos études antérieures ayant montré que cela correspond au moment où les premiers signes de déficits mnésiques apparaissent dans ce modèle. De plus, ces modèles permettent de répondre à la question posée car les souris possèdent des structures neuro-anatomiques comparables à celles du cerveau humain.
Test de faisabilité de l’imagerie par résonnance magnétique avec manganèse chez l’ovin
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soumis à deux ou trois anesthésies en une semaine, à des injections dans la veine jugulaire et à cinq ou six prises de sang, neuf moutons seront tous tués, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur cale une technique d'IRM au manganèse sur le cerveau ovin et injecte un composé qu'il reconnaît neurotoxique à forte dose chez l'humain, en jugeant la toxicité aiguë "très peu probable" chez les ruminants. Les cerveaux sont prélevés après la mise à mort pour être réanalysés à plus haut champ. Parmi les bénéfices annoncés figure l'appui de futurs appels à projet.
Objectifs
L’objectif est de mettre en place la technique d’Imagerie par Résonnance Magnétique du manganèse in vivo à l'échelle du cerveau entier chez l’ovin. Les propriétés paramagnétiques du manganèse (Mn2+) permettent son utilisation comme agent de contraste pour l'IRM (MEMRI : IRM du ManganEse). C’est un composé qui pénètre et s'accumule dans les neurones actifs, donc sa concentration intracellulaire est le reflet direct de l'activité neuronale. Cette technique permet de visualiser les changements structurels et fonctionnels en réponse à des stimulis. La dynamique du Mn2+ (biodisponibilité, pharmacocinétique) dépend de l'espèce, il est donc nécessaire de réaliser des mises au point sur le cerveau d’ovin pour lequel aucune étude n’est disponible dans la littérature.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de définir la dose minimale de Mn2+ nécessaire pour l’obtention du meilleur contraste en IRM MEMRI. Il permettra également de se placer dans la fenêtre temporelle la plus favorable pour l’acquisition d’un contraste optimum. Les mises au point des conditions de dose et temps dans cette expérimentation préliminaire bénéficieront à des appels à projet ultérieurs.
Procédures
Les animaux de la procédure 1 subiront 2 anesthésies à 10 jours d'intervalle pour passage à l'IRM. La première durera 1 heure, la 2ème 6 heures. Ils recevront également une injection intra-péritonéale (durée totale contention comprise d'une minute). Ils subiront 2 injections par voie intraveineuse à la jugulaire pour induire les anesthésies, ainsi que 6 prises de sang vigiles (durée totale contention comprise d'une minute). Les animaux de la procédure 2 subiront 3 anesthésies réparties sur 7 jours pour passage à l'IRM. Chaque anesthésie durera 1 heure 30. Ils recevront également une injection intra-péritonéale sous anesthésie. Ils subiront 3 injections par voie intraveineuse à la jugulaire pour induire les anesthésies, ainsi que 5 prises de sang vigiles (durée totale contention comprise d'une minute).
Impact sur les animaux
Bien qu’il soit un élément nécessaire au bon fonctionnement de l’organisme, le manganèse est cependant neurotoxique à forte dose. Chez l’homme, il provoque maux de tête, insomnies, pertes de mémoire, instabilité émotionnelle, dystonie, tremblements, troubles du langage et des troubles de la marche. Selon la littérature, les cas de toxicité aigüe au manganèse chez les ruminants sont très peu probables. Nous n’attendons donc pas d’effets indésirables suite à l’injection de Mn2+, mais les animaux seront surveillés étroitement après l'injection. Pour chaque anesthésie les animaux pourront subir un stress lors de la manipulation. Un hématome peut apparaître lors de l’induction de l’anesthésie par voie intraveineuse, ou après les prises de sang à la veine jugulaire.
Devenir
A la suite des acquisitions, tous les animaux seront mis à mort toujours sous anesthésie générale, car leurs cerveaux seront prélevés et ré-analysés ex-vivo par IRM à plus haut champ.
Remplacement
Cette étude d‘imagerie cérébrale permettant de déterminer la dose minimale de Mn2+ et la fenêtre d’acquisition optimum pour obtenir le meilleur contraste ne peut être réalisée qu’in vivo. Il est en effet impossible d’étudier ou de reproduire ces expériences in vitro et encore moins in silico. Ce projet est un prérequis pour développer l’approche d’imagerie MEMRI qui permettra, ultérieurement, de mettre en place des projets longitudinaux, avec des nombres restreints d’animaux expérimentaux.
Réduction
Ce projet concerne 9 animaux expérimentaux maximum, qui seront utilisés pour tester trois doses de Mn2+ et déterminer la fenêtre d’observation optimale de l’activité cérebrale par IRM MEMRI. Pour cette expérience pilote, nous avons besoin de déterminer la dose minimale qui nous permet d’acquérir des images IRM informatives, et pour cela nous ne disposons que de quelques données dans la littérature sur les rongeurs uniquement. Par conséquent, il nous faut tester plusieurs doses. De la même manière, nous n’avons aucune donnée sur la biodisponibilité du manganèse dans l’organisme d’ovin et donc nous ne connaissons pas la cinétique de disponibilité du manganèse dans le cerveau.
Raffinement
Les animaux expérimentaux feront l’objet d’une surveillance accrue dans la période qui suivra l’administration de Mn2+ jusqu’à l’anesthésie pour l’imagerie. Au cours de cette période, l’apparition de tremblements, les difficultés de déplacement, la prise alimentaire seront particulièrement surveillés. Nous serons attentifs à la survenue de signes de mal être (position des oreilles, port de la tête, prostration). Dans le cas où de tels signes apparaitraient, un traitement analgésique sera administré. Pendant toute la durée de l’expérimentation, les animaux expérimentaux seront maintenus en groupe au sein d'un environnement social stable, dans des conditions adaptées aux herbivores, litière de paille et foin ad libitum. Ils seront manipulés dans le calme par des agents expérimentés. Ils arriveront la veille de l’anesthésie, et seront mis à jeun avant l’intervention, avec abreuvement adlibitum. Les brebis seront maintenues sous oxygène à la fin de la première anesthésie pour améliorer la qualité et la rapidité du réveil. Dès que l’animal présentera les premiers signes de déglutition ou de clignement des paupières, il sera extubé.
Choix des espèces
Nous souhaitons développer la technique de l’IRM réhaussé par le manganèse (MEMRI) chez l’ovin adulte pour plus tard étudier les mécanismes de plasticité cérébrale associés aux changement de photopériode chez cette espèce saisonnée. La dynamique du Mn2+ dépendant de l'espèce, il est donc nécessaire de réaliser des mises au point sur le cerveau d’ovin pour lequel aucune étude n’est disponible dans la littérature. Nous utiliserons des adultes pubères, de sexe indifférent.
Effets d’un médicament anti-rejet de greffe sur la sensibilité colique
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. Elles reçoivent un immunosuppresseur par sonde orale à sept reprises, sont pesées dix-sept fois, puis subissent un test de distension colorectale de 40 minutes avant d'être tuées pour prélèvement d'organes. Le porteur annonce comme effets attendus une perte de poids, de la diarrhée, du sang dans les selles et des douleurs digestives, l'objectif étant justement de provoquer ces troubles pour mesurer la sensibilité du colon. Il indique que les études in vitro ne reproduisent pas la complexité du tube digestif et des tissus qui l'entourent.
Objectifs
La transplantation d’organe est un traitement de choix pour certaines pathologies chroniques. La greffe améliore la qualité de vie et la survie des patients. Ces dernières années, l’augmentation de la survie du greffon est attribuée à l’utilisation des traitements immunosuppresseurs afin d'éviter tout rejet. Cependant l'utilisation des immunosuppresseurs peut provoquer de nombreux effets indésirables. Une meilleure gestion de ces effets pourrait contribuer à l’amélioration de la qualité de vie des transplantés. L'acide mycophénolique (MPA) est l'un des médicaments immunosuppresseurs les plus utilisés dans les transplantations d'organes solides, comme le rein ou le foie. Le traitement au MPA est associé à des effets indésirables, parmi lesquels les troubles gastro-intestinaux constituent une préoccupation majeure. En effet, plus de 30 % des patients présentent des effets indésirables gastro-intestinaux. La seule option thérapeutique actuelle consiste en une réduction de la dose ou de la fréquence d'administration, ou à un remplacement par d’autres molécules moins efficaces, ce qui augmente le risque de rejet de greffe. Le MPA est responsable d’altérations du microbiote intestinal, appelées dysbiose. Le microbiote intestinal, qui est constitué de microorganismes comme des bactéries, est nécessaire au processus de digestion et, à travers la production d’acides gras à chaine courte (AGCC) particuliers, il protège la paroi intestinale. Notre objectif est de confirmer le développement d'effets indésirables gastro-intestinaux suite à l'aministration de MPA chez la souris, principalement au iveau de la sensibilité colique, afin de pouvoir par la suite proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour lutter contre une entéropathie modérée provoquée par le MPA chez la souris.
Bénéfices attendus
Le MPA est l’immunosuppresseur le plus utilisé pour éviter le rejet de greffes d’organes solides. L’entéropathie induite par le MPA touche aujourd’hui plus de 30% des patients transplantés : sont proposés à ces patients une diminution de la dose de MPA ou une substitution de cet immunosuppresseur par une autre classe thérapeutique moins efficace sur le maintien et la tolérance de la greffe. L'étude de la sensibilité colique pourrait permettre de proposer de nouvelles approches thératpeutiques pour soulager ces patients.
Procédures
- Préhension pour pesée (animal vigile, tous les animaux, moins de 30 secondes par animal, 17 fois par animal) - Contention pour habituation à l’administration par voie orale à l’aide d’une canule (animal vigile, tous les animaux, moins de 1 minute par animal, 9 fois par animal) - Administration par voie orale à l’aide d’une canule (animal vigile, tous les animaux, moins de 1 minute par animal, 7 fois par animal) - Prélèvement sanguin (animal anesthésié, tous les animaux, moins de 1 minute par animal, 1 fois par animal) Les modes d’administration utilisés (administration par voie orale à l’aide d’une canule) ont été décrites dans la littérature pour ces molécules, et sont reconnues efficaces. Enfin, en fin de précédure 2, les souris subiront un dernier test (40 min par souris sur l'ensemble des souris), le test de distension colorectale, afin d'évaluer leur sensibilité colique avant d'être mis à mort à la suite de ce test de distension colorectale.
Impact sur les animaux
Des effets indésirables sont attendus pour les animaux traités à l’immunosuppresseur comme une perte de poids, de la diarrhée, la présence de sang dans les selles, des douleurs digestives et des altérations du comportement.
Devenir
A l'issu de l'ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements d'organes.
Remplacement
L’utilisation de cellules in vitro a permis de démontrer certains effets intéressants du médicament immunosuppresseur MPA et des AGCC. Cependant, les études in vitro ne permettent pas actuellement de reproduire la complexité du tube digestif et des tissus qui l’entourent. Or les effets globaux du MPA et des AGCC, s’ils existent, résulteront de l’interaction du médicament et des AGCC avec différentes cellules au sein de différents tissus et organes. A ce stade des travaux, les études in vitro doivent être complétée par des études sur l’animal afin d’apporter la preuve définitive de l’effet protecteur des AGCC vis-à-vis de l’entéropathie induite par le traitement immunosuppresseur chez les greffés.
Réduction
Dans le but de réduction du nombre d’animaux, le projet comprend 2 étapes : une étude pilote pour déterminer la dose de MPA à utiliser et l’étude à proprement parler des AGCC sur l’entéropathie induite par le MPA. Cette stratégie en deux étapes permet de limiter le nombre d’animaux utilisés dans l’étude de l’effet des AGCC. De plus, un test statistique dit puissance a été réalisé afin de déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser pour avoir des résultats exploitables. Enfin, des tests statistiques seront réalisés pour analyser les données.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à l’espèce et qui respectent leur bien-être : densité animale, température, hygrométrie contrôlées, présence d’enrichissement, eau et nourriture à volonté. Les animaux seront habitués aux expérimentateurs et aux manipulations. L’état général des animaux sera surveillé quotidiennement, voire deux ou trois fois par jour si l’état le nécessite. La douleur sera abrégée sans délai via l’administration d’antalgique dérivé de la morphine, ou si l’état le justifie, l’animal sera euthanasié. Les personnes qui manipuleront et observeront les souris sont expérimentées.
Choix des espèces
La souris est un modèle de référence pour l’étude des entéropathies que l’Homme développe. Les animaux utilisés seront des souris adultes d’un poids moyen de 24-26 g âgées de 8-10 semaines au début du projet. A ce stade de développement les souris présentent des caractéristiques physiologiques stables. De plus, ce stade de développement est celui utilisé dans les publications de référence pour le projet.
Etude histologique de l’évolution de l’ataxie de Friedreich sur les ganglions de la racine dorsale
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour étudier l'ataxie de Friedreich, 400 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance allant de léger à sévère, toutes tuées par perfusion intracardiaque afin de prélever leurs ganglions rachidiens. Le porteur indique que les souris porteuses de la mutation développent progressivement des signes de la maladie humaine, et fixe une grille de score, tremblements, hypolocomotion, dos voûté, perte de poids de plus de 10 %, au-delà de laquelle il les met à mort. La description des gestes infligés tient en une phrase, alors que la souffrance déclarée atteint le niveau sévère. Il affirme qu'aucune culture cellulaire ni modèle in silico ne permet d'étudier les cellules satellites gliales, "encore trop peu connues".
Objectifs
L’ataxie de Friedreich est une maladie neurodégénérative d’origine génétique. Elle est causée par une mutation du gène de la frataxine conduisant à une expression réduite de la protéine frataxine et à un dysfonctionnement des neurones présents dans des ganglions nerveux situés le long de la colonne vertébrale. Ces neurones sont recouverts de cellules satellites gliales qui contribuent à leur bon fonctionnement. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les rôles des neurones et des cellules satellites gliales dans le développement de l’ataxie de Friedreich. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris permettant d’induire la baisse d’expression de la frataxine uniquement dans les neurones des ganglions touchés par la maladie. La procédure sera optimisée afin de respecter les devoirs de Réduction et Raffinement et pour assurer l'absence de douleur. La surveillance continue de l'animal permettra d'arrêter la procédure expérimentale lorsque l'animal montre des signes d’anxiété. La procédure vise à optimiser le confort des animaux et réduire le nombre d'animaux.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de comprendre le rôle respectif des neurones proprioceptifs et des cellules satellites gliales dans le développement de l’ataxie de Friedreich, et de déterminer si les cellules satellites gliales peuvent constituer des cibles thérapeutiques potentielles.
Procédures
Les souris subiront une perfusion intracardiaque sous anesthésie chimique.
Impact sur les animaux
Dans notre étude, les animaux sont porteurs de la mutation de la frataxine seulement dans les neurones proprioceptifs vont progressivement développer certains des signes de la maladie humaine. Ils nécessiteront un suivi particulier et si une aggravation de leur état est observée, la procédure sera arrêtée pour ces animaux.
Devenir
A l'issue de la procédure 1, les animaux sont gardés en vie afin d'être inclus dans la procédure 2. En effet, la procédure 1 permet de produire les animaux utilisés dans la procédure 2. A l'issue de la procédure 2, les animaux seront mis à mort soit par perfusion intracardiaque précédée d’une anesthésie/analgésie chimique afin de prélever les ganglions rachidiens dorsaux et d’étudier au niveau cellulaire et moléculaire ces ganglions.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. L’utilisation de cultures de cellules satellites gliales ou de co-cultures neurones-cellules satellites gliales ne permet pas une étude physiopathologique des interactions propriocepteurs-cellules satellites gliales : les cultures induisent des altérations morphologiques et physiologiques majeures des propriocepteurs et des cellules satellites gliales ne reproduisant pas les mécanismes physiopathologiques existant in vivo. Il n’existe pas, dans notre domaine, d’alternatives satisfaisantes aux méthodes expérimentales proposées dans ce projet (expériences ex vivo et in vivo sur l’animal). Par ailleurs, aucun modèle in silico n'existe pour étudier les cellules satellites gliales, encore trop peu connues.
Réduction
Compte tenu de la littérature et de notre expérience, les expériences décrites nécessitent un minimum de 5 animaux. Nous utiliserons les tests statistiques appropriés pour analyser nos données. Les t-tests seront utilisés pour évaluer si deux groupes diffèrent l’un de l’autre. Les tests ANOVA seront utilisés pour réaliser des comparaisons multiples entre les différents groupes expérimentaux (plus de 2 groupes). Ces tests nécessitent d’avoir un nombre minimum d’animaux pour atteindre les seuils statistiques de significativité en fonction des expériences réalisées. De plus, les croisements et les lots seront optimisés selon les génotypes et les sexes afin d’avoir le plus d’animaux expérimentaux avec le bon génotype et avec une représentation homogène des sexes.
Raffinement
Les animaux seront placés dans des cages, en communauté de 2 à 5. L’eau, la nourriture et du matériel de nidification, seront placés dans chacune des cages. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité par du personnel qualifié, afin d’assurer un bien-être optimal, tout au long de l’étude. Les animaux seront suivis quotidiennement par les mêmes expérimentateurs afin de réduire leur stress au maximum. Dès l’apparition des symptômes sensorimoteurs, même mineurs, les animaux seront nourris avec de la nourriture humide au sol pour faciliter leurs apports en nutriments et en eau. Une surveillance quotidienne des points-limites (apparence, comportement, signes cliniques) et un suivi du poids hebdomadaire sera mis en place. Les points limites suivants seront évalués : 1. Apparence de l’animal : 0=normale ; 1=manque de toilettage ; 2=poil ébouriffé, dos voûté, prostration ; 2. Comportement (tenant compte des symptômes attendus): 0=normal ; 1=fort tremblement, hypolocomotion; 2=manque d’alimentation/déshydratation ; 3. Poids : 0= perte de poids comprise entre 0 et 5% ; 1=perte de poids comprise entre 5 et 10% ; 2=perte de poids de plus de 10%. Si un animal atteint le score de 2 pour un des paramètres ou si le score total est supérieur à 3, l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle standard pour l'étude des fonctions et dysfonctions du système nerveux des mammifères. L'anatomie, la morphologie cellulaire, la biochimie et la physiologie du système nerveux de la souris sont bien caractérisés. Il existe une vaste littérature sur le comportement sensorimoteur et sensoriel de la souris. De plus, la possibilité d’utiliser des souris génétiquement modifiées est un grand avantage pour les études physiologiques car les gènes codant certaines protéines peuvent être manipulés (activés, inactivités, surexprimés) ou des transgènes exprimés chez ces animaux afin d’aider à mieux comprendre certains mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans les maladies neurodégénératives. Des souris adolescentes, jeunes adultes allant de 3,5 à 15,5 semaines seront utilisées afin de suivre l’évolution de la pathologie.
Impact du blocage de l’interaction du tPA avec les récepteurs NMDA dans la pathologie de l’Accident Vasculaire Cérébrale (AVC).
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
Soumises à une biopsie de la queue puis à l'induction d'un AVC ischémique ou hémorragique, 2 000 souris seront toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Le porteur décrit des pertes de poids, des douleurs post-opératoires et des déficits fonctionnels ou cognitifs, avec mise à mort au-delà de 20 % du poids perdu ou d'un score supérieur à 7 sur l'échelle de grimace de la souris. Un groupe de 640 animaux cumule l'AVC provoqué et un diabète de type 1 servant de facteur de comorbidité. Le porteur affirme que ces procédures ont un caractère de "stricte nécessité" et qu'aucune méthode sans animaux vivants n'apporterait le même niveau d'information.
Objectifs
Le tPA est une sérine protéase principalement connue pour être synthétisée par les cellules endothéliales, puis libérée dans la circulation sanguine pour intervenir dans la fibrinolyse grâce à sa capacité à activer le plasminogène en plasmine. Ces propriétés font que le tPA est utilisé comme traitement pharmacologique de la phase aigüe des AVC ischémiques. Le tPA est également considéré comme un neuromodulateur au sein du système nerveux central (SNC). Il est produit par les neurones, les cellules gliales et les cellules endothéliales. Il est impliqué dans de nombreux processus physiologiques dont le développement cérébral, la plasticité synaptique, ainsi que dans des processus d’apprentissage et de mémoire. Grâce à ses différents domaines, le tPA interagit avec différents récepteurs tels que les N-methyl-D-aspartate (NMDAR). Cette interaction était impliquée dans certains processus physiologiques tels que la plasticité synaptique, la corticogenèse et pathologiques (AVC, sclérose en plaques/SEP, inflammation). Afin de mieux comprendre le rôle spécifique de cette interaction et de pouvoir élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à celle-ci, nous avons généré, avec la clinique de la souris une nouvelle souche de souris. La spécificité de cette nouvelle souche est une mutation entrainant le blocage de l’interaction tPA/NMDAR. Ainsi, l’objectif de ce projet est tout d’abord, d’évaluer l’impact du tPA endogène ou l’inhibition de son interaction avec le récepteur NMDA sur les lésions cérébrales, la réponse inflammatoire et la récupération fonctionnelle dans des modèles murins d’AVC ischémique ou hémorragique. De plus, il s’agit de démontrer l'effet ainsi que le potentiel thérapeutique de l’administration d’un anticorps monoclonal (le Glunomab®) dans ces modèles murins.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles ou appliquées menées pour différentes pathologies où cette interaction joue un rôle crucial (AVC, SEP et processus inflammatoires). En effet, une meilleure compréhension de cette interaction permettra de développer des stratégies thérapeutiques adéquates, permettant d’envisager d’améliorer les performances de patients dans ces différentes pathologiques.
Procédures
Biopsie de queue faite vers 6 jours pour chaque animal (n=2000). Procédure 1 (n=640) : Modèle d’AVC. Procédure 2 (n=640) : Modèle d’AVC. Procédure 3 (n=640) : Modèle d’AVC accompagné d’un facteur de comorbidité (diabète de type 1). - J0 : Induction de l‘AVC +/- Traitements à 20 minutes ou 4 heures. -J0+6h : Evaluation de l’inflammation cérébrale par IRM. - J+1, J+5 : Evaluation du devenir cérébral (lésions, transformations hémorragiques, perméabilisation) post-AVC par IRM. - J+1, J+3, J+5 : Etude de la récupération fonctionnelle des animaux. Procédure 4 (n=80) : Modèle d’AVC hémorragique. - J0 : Induction de l‘AVC hémorragique. - J+1, J+3 : Evaluation du volume de lésion hémorragique et de l’œdème, post-AVC par IRM. - J+1, J+3, J+5 : Etude de la récupération fonctionnelle des animaux.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les rongeurs seraient pour toutes les procédures : Biopsie de la queue (douleur légère de courte durée), une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification du traceurs injectés de l'intégrité anatomique et vasculaire du SNC.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies humaines). Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'aisance des expérimentateurs (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse. L’ensemble des échantillons collectés permettra également un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. De plus, des méthodes d’études non invasives telle que l’IRM sont utilisées dans ce projet afin de faire un suivi longitudinal des animaux, permettant de recueillir de nombreuses données sans augmenter le nombre d’animaux. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux sont hébergés dans des cages standards aux normes européennes. Le bien-être des animaux est contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permettra de détecter tous signes cliniques de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi : 5 souris par cage, coton, paillettes, petite maison. Les animaux seront également pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 20% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs (comme les seringues et aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques). Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Les animaux recevront également une anesthésie locale sur la peau au niveau de l'artère cérébrale moyenne (ACM). Les yeux des souris seront couverts afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation. Après chirurgie, les souris disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du neurodéveloppement, les AVC, les modèles de SEP et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques, les souris KI-L178A déficientes pour le site d’interaction du tPA sur la sous-unité GluN1 du NMDAR. Ce modèle transgénique ne peut être réalisé que chez la souris (Mus musculus). Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 6-12 semaines seront nécessaires.
Formation à la maitrise d’un modèle animal ayant pour objectif de comprendre le rôle du système cholinergique sur la mémoire à court-terme
- Enseignement supérieur
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées à l'issue parce qu'elles ont reçu une injection de scopolamine, 130 souris sont utilisées dans un travail pratique étudiant, dans des procédures d'un niveau de souffrance déclaré léger. Le test est décrit avec précision, quatre séances d'habituation puis une phase de reconnaissance d'objets, et l'injection abdominale de scopolamine altère volontairement leur mémoire pendant environ cinq heures. Le projet ne vise aucune production de connaissances, il renouvelle l'autorisation d'un cours qui forme 24 étudiants par an, à raison de deux souris par binôme. Le porteur affirme que la formation aux gestes reste "essentielle" tant que l'expérimentation sur rongeurs sera autorisée, argument qui fait reposer la justification sur le maintien de la pratique elle-même.
Objectifs
Ce projet rentre dans le cadre des Travaux Pratiques d’un cours s’adressant à des étudiants anglophones. L’objectif du cours est de représenter un axe d’apprentissage important pour la compréhension par de futurs neurobiologistes du rôle des neuromédiateurs et en particulier celui du système cholinergique dans la mémoire et les processus cognitifs. Il s’agit d’un renouvellement d’autorisation pour un cours ayant fait ses preuves et dont le protocole est conçu de manière à pouvoir être géré selon les infrastructures disponibles et accessibles, tout en formant annuellement 24 étudiants.
Bénéfices attendus
Ce projet éducatif représente un axe d’apprentissage important pour la compréhension par de futurs neurobiologistes du rôle des neuromédiateurs dans les comportementaux et les tâches de mémoire. En Neurobiologie, les modèles animaux sont utilisés lorsqu’aucune alternative n’est disponible. Par exemple, des biopsies cérébrales ne peuvent pas être envisageables contrairement à d’autres tissus. Les modèles animaux permettent d’étudier un processus spontané ou induit, présentant un ou plusieurs aspects communs avec un phénomène équivalent chez l’humain. Ceci est de fait particulièrement utile en Neurobiologie et dans le cadre de maladies psychiatriques, dégénératives ou neurodéveloppementales. Il est donc important dans le cadre d’une formation d’étudiants au domaine des Neurosciences d’aborder ces aspects et de les initier aux expérimentations sur animaux. C’est aussi la possibilité de les sensibiliser directement aux aspects éthiques liés à l’expérimentation animale par un enseignement très adapté et très encadré.
Procédures
Les animaux sont soumis à un test comportemental de reconnaissance d’objet permettant à la souris de se mouvoir librement et d’explorer un nouvel environnement. Les animaux sont habitués à leur environnement pour éviter tout impact sur leur activité exploratoire. Cette phase d’habituation (H1-4) comporte 4 sessions, à un rythme de 2 sessions par jour (H1: souris groupées pendant 30 minutes ; H2-H3 : souris seules,10 minutes chacune ; H4 souris seules,10 minutes chacune, avec présentation objet). S’ensuit une phase d’exposition à des objets identiques de 3 sessions avec intervalle inter-session de 5 minutes puis une phase de test (T1 :souris individuelle, 5 minutes ; T2 souris individuelle, 5 minutes, 2 objets, ancien et nouveau) et enfin un test de reconnaissance de 5 minute, 10 minutes après la phase prcédente. La seconde intervention est une injection intrapéritonéale unique et de quelques secondes sur animal adulte vigile réalisée par l’enseignant.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus peuvent être une peur et un léger stress physique de très courte durée avec un léger dommage comportemental totalement réversible et temporaire (5 heures environ). Ce dommage comportemental réside dans les capacités naturelles de la souris à reconnaitre des objets et se définit par une légère capacité mnésique momentanément altérée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni adoptés car injectés avec de la scopolamine.
Remplacement
Dans le cadre du cours, l’analyse du système nerveux et de son implication dans des petites tâches comportementales très basiques est aussi réalisée à partir d’un modèle chez la drosophile. Toutefois les informations apportées ne peuvent être qu’un tout petit complément à celles obtenues chez le mammifère. En effet, le cerveau de la drosophile est petit pour uniquement 100000 neurones au total et son organisation est très particulière : les corps cellulaires des neurones sont massés à la périphérie, tandis que les projections axonales et dendritiques se regroupent au centre. Ce n’est pas du tout le cas du cerveau de la souris. La qualité des études comportementales et l’apprentissage ne peut donc être équivalent. Aucune méthode alternative ne pourra remplacer l’animal dans ce projet. Des enseignements par vidéos sont également utilisés lorsque possible mais sans altérer la qualité d’apprentissage. Tant que l’expérimentation sur rongeurs sera autorisée en recherche, la formation des étudiants aux gestes réalisés eux-mêmes est essentielle.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit à son minimum pour les 24 étudiants répartis en 12 binômes (26 animaux au total, 2 animaux par binôme et deux supplémentaires pour la démonstration par les enseignants). Ce projet pourrait utiliser des animaux surnuméraires d'une activité d'élevage sous la condition d’obtention des souris pour la date précise de l’enseignement.
Raffinement
Tous les efforts techniques sont mis en œuvre pour minimiser au maximum toute douleur et tout inconfort de l’animal. Le bien-être de l’animal sera évalué selon une grille mise en place par la structure du bien-être de l’animal. La qualité des études comportementales en dépend également. Des mesures spécifiques comprendront : une surveillance accrue des animaux, des phases répétées d’habituation en amont de l’expérience, une prise en charge de la surveillance et du déroulement des expériences par un enseignant expérimenté de longue date. Les phases d’habituation seront réalisées entre les souris d’une même cage pour permettre de conserver leur environnement familier. Il n’y a pas de souffrance attendue avec grille de points limites. En cas de problème comportemental inattendu, il sera immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
En Neurobiologie, les modèles animaux sont utilisés lorsqu’aucune alternative n’est disponible. Par exemple chez l’homme, des biopsies cérébrales ne peuvent pas être envisageables contrairement à d’autres tissus. Les modèles animaux permettent d’étudier un processus spontané ou induit, présentant un ou plusieurs aspects communs avec un phénomène équivalent chez l’humain. Ceci est de fait particulièrement utile en Neurobiologie et notamment dans le cadre de maladies dégénératives. Il est donc important dans le cadre d’une formation d’étudiants au domaine des Neurosciences d’aborder ces aspects et de les initier aux expérimentations sur animaux. C’est aussi la possibilité de les sensibiliser directement aux aspects éthiques liés à l’expérimentation animale par un enseignement très adapté. Le modèle murin est le plus adapté pour illustrer les concepts à enseigner. Les animaux sont utilisés adultes (12 semaines). Ce stade est justifié par la nécessité d’avoir un cerveau mature.
Récupération locomotrice après des lésions médullaires chez le rat nouveau-né.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tous tués à l'issue, 231 rats subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère commencées dès les premiers jours de vie. 144 d'entre eux sont opérés de la moelle épinière pendant 45 minutes au maximum, ce qui leur fait perdre l'usage des membres postérieurs, puis reçoivent deux injections quotidiennes pendant cinq jours et une injection par jour d'expérimentation entre le cinquième et le vingt-et-unième jour. Le porteur indique que le stress lié à la paralysie est limité par le maternage et que la prise de poids se normalise après quatre jours. Les tests comportementaux annoncés parmi les moyens réunis pour le projet ne sont pas détaillés, et le porteur affirme qu'aucune approche in vitro ou in silico ne peut modéliser la complexité d'un "organisme entier".
Objectifs
L’objectif principal de ce projet que nous souhaitons atteindre au cours des 5 années à venir est d’établir s’il est possible, et optimiser, le développement de la locomotion à la suite d’une lésion de la moelle épinière survenant au stade néonatal chez le rat. Le choix de la mise en place du projet au laboratoire à cet instant est le fruit d'un travail préparatoire qui a consisté à réunir l'ensemble des moyens matériels (chirurgicaux, tests comportementaux etc.) et l'expertise nécessaire à sa réalisation. En regard de l'absence d'outils non invasifs permettant chez l'homme l'exploration des phénomènes physiopathologiques que nous souhaitons étudier, et du manque de connaissances nécessaires à l'établissement d'outils de modélisation des lésions de la moelle épinière, notre projet ne peut s'abstenir de l'utilisation du modèle animal. Le choix du rat est objectivé par des niveaux de récupérations post-lésionnelles proches de l'humain. Au cours des cinq années, nous utiliserons au maximum 231 rats, chaque groupe expérimental étant constitué de 12 animaux, chiffre qui prend en compte les contraintes statistiques et la nature des expériences/analyses réalisées. Chaque expérience sera lancée dans un premier temps sur un nombre restreint d'animaux afin d'évaluer la pertinence de poursuivre la série expérimentale. Par ailleurs, dans le souci de réduire au maximum le nombre d’animaux dans les projets à venir, nous enrichirons une banque de tissu à partir des animaux utilisés dans ce projet.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux appréhender les risques, durant la période périnatale, d’une lésion de la moelle épinière et de développer des protocoles expérimentaux permettant de réactiver les réseaux locomoteurs sous-lésionnels.
Procédures
Les animaux (n = 144) seront soumis à des lésions de la moelle épinière, la durée de l'intervention est au maximum de 45 minutes. Ils recevront également deux injections quotidiennes (un analgésique et un anti-inflammatoire) durant les 5 jours de suivi post-opératoire et une injection sous-cutanée le jour des expérimentations, qui seront quotidiennes entre le jour postnatal 5 et postnatal 21. Enfin tous les animaux recevront une injection d'un analgésique suivi 30 minutes plus tard par l'injection d'un anesthésique le jour de leur euthanasie.
Impact sur les animaux
Les lésions de moelle épinière vont induire une perte de mobilité des membres postérieurs chez les nouveau-nés dont les conséquences en terme de stress notamment physique seront limitées du fait du maternage de la mère et du traitement préventif post-opératoire. Les douleurs inhérantes à l'intervention chirurgicale seront prévenues par la mise en place d'un traitement post-opératoire analgésique et anti-inflammatoire. Les animaux nouveau-nés ayant subi une lésion auront également une prise de poids réduite durant les 4 premiers jours suivant la lésion entrainant un stress physique supplémentaire, cependant leur poids se normalisera les jours suivants, l'alimentation étant assuré par la mère la perte de mobilité n'entraine pas réellement de difficulté pour se nourrir à moyen terme et la récupération fonctionnelle spontanée permet aux animaux de récupérer un niveau de mobilité suffisant pour se nourrir seuls après le sevrage.
Devenir
Tous les animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés à la fin des expériences.
Remplacement
Il n’y a au jour d’aujourd’hui aucunes méthodes alternatives nous permettant d’aborder notre projet sans passer par l’étude de modèles animaux, que ce soit les approches in vitro, ou in silico, qui ne peuvent pas reproduire, ou modéliser la complexité d’un organisme entier.
Réduction
Nous prévoyons d’utiliser le nombre minimal de rats nécessaire pour obtenir des analyses statistiques fiables et cohérentes, nombre dépendant de la technique utilisée. En outre animaux mâles et femelles seront utilisés.
Raffinement
Nos animaux seront hébergées dans une animalerie conventionnelle, au sein de laquelle le bien-être et la santé des animaux sont suivis quotidiennement, permettant de détecter toute anomalie physique ou comportementale potentiellement révélatrice de signes cliniques. Les conditions de stabulations (température hygrométrie, cages, nourriture, litière, enrichissement) sont adaptées au modèle rat. Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Un soin particulier sera accordé à l’observation des animaux, de plus, des traitements appropriés (anesthésie, anti-douleur) sont utilisés pour pallier la douleur associée aux opérations chirurgicales. Pour identifier les dommages et contraintes subis par l’animal, nous avons définis une fiche de suivi du bien-être animal permettant d'établir des points limites adaptés à l'état de l'animal et permettant la mise en oeuvre de traitements rapides et adaptés. L’ensemble des procédures est encadré et mis en œuvre par du personnel dument formé et habilité aux méthodologies utilisées et au bien-être animal.
Choix des espèces
Le choix du rat comme modèle expérimental est motivé par: 1) l'absence de récupération spontanée d'une activité locomotrice en dessous d'une lésion complète de la moelle épinière observée chez le rat qui est extrêmement proche de la physiopathologie humaine; 2) le fait que le rat, notamment la souche non-consanguine Sprague-Dawley, est un animal docile, facile à manipuler, ayant une bonne qualité maternelle, et résistant aux infections d'une façon générale, ce qui est un plus certain pour la réalisation de projets tels que le notre qui incluent un volet chirurgical associé à un aspect développemental; 3) la possibilité de réaliser des lésions spinales chez le très jeune animal sans risque majeur d'augmenter les niveaux de mortalité, sans risque d'abandon de la mère (pré-conditionnée au cours de la gestation) au retour dans la portée à la suite d'une chirurgie. Les animaux seront utilisés des tous premiers stades néonataux à l'âge adulte. La raison principale est que notre projet propose d'étudier l'impact et les conséquences d'une lésion spinale en fonction du stade développemental au cours duquel elle survient. En effet le degré de plasticité, et probablement la nature des phénomènes plastiques, du système nerveux évolue au cours du temps, ce qui implique que les possibilités de récupération post-traumatique, et/ou les modalités en permettant l'émergence varient avec l'âge. Ainsi la récupération locomotrice après une lésion de la moelle épinière chez le jeune animal est supérieure à celle rapportée chez l'adulte.
I. Développement d’une méthode de transfert de thérapies au cerveau par ultrasons
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
32 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse de leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une séquence d'ultrasons destinée à ouvrir temporairement la barrière qui protège le cerveau, une injection intraveineuse par cathéter posé dans la veine de la queue, et des séances d'imagerie sous anesthésie de deux heures répétées jusqu'à deux fois par semaine. Le porteur indique que l'ouverture de cette barrière provoque de légers dommages cérébraux dans moins de 10 % des cas, avec des douleurs transitoires possibles. Il présente les ultrasons comme un "espoir majeur" pour des maladies génétiques cérébrales sans traitement, alors que le projet se limite à évaluer le passage de particules virales et l'état du cerveau après traitement.
Objectifs
La principale limite à l'efficacité des thérapies dans le cerveau est leur accès restreint en raison de la barrière protégeant le cerveau de tout élément pouvant être toxique, mais limitant aussi le passage de la majorité des médicaments. Récemment, une technique utilisant des ultrasons a attiré l'attention en tant que moyen non invasif pour perturber temporairement cette barrière. Les ultrasons permettent de perturber cette barrière à travers le crâne et donc sans opération chirurgicale nécessaire. Dans cette étude, nous évaluerons chez la souris le potentiel thérapeutique de cette approche. En plus des données que nous obtiendrons avec des séances d'imagerie médicale, reflétant le caractère réversible ou non de l’ouverture de la barrière, nous évaluerons la durée d'efficacité du traitement. Enfin, nous étudierons les modifications provoquées dans le cerveau après avoir reçu une onde ultrasonore afin d’en évaluer l'intégrité après traitement.
Bénéfices attendus
Les ultrasons représentent un espoir majeur de traitement de nombreuses pathologies cérébrales tel que les maladies génétiques. Des essais cliniques utilisant cette technique chez l'homme sont en cours. Nous souhaitons ici évaluer des approches plus performantes que les traitements habituels et profiter d'une délivrance par ultrasons. Avec le développement en cours des ultrasons chez l'homme, les méthodes que nous proposons pourraient bénéficier d'un transfert rapide vers l'homme. Dans le cas de maladies génétiques, nous souhaitons évaluer le potentiel des ultrasons pour administrer un traitement efficace et durable dans le cerveau. Cette approche pourrait permettre de corriger, au niveau génétique, des anomalies au niveau cérébral, ce qui représente un espoir conséquent pour les personnes atteintes de ce type de maladie, qui ne disposent à ce jour d'aucun traitement efficace, à l'exception de traitements de leurs symptômes.
Procédures
Tous les animaux seront exposés à une séance d'imagerie médicale anatomique pour une durée maximale de 2h, anesthésie incluse. Pour les besoins de l'imagerie médicale effectuée dans ce projet, une partie des animaux recevront une injection permettant d'améliorer la qualité de l'image. Tous les animaux recevront une séquence ultrasonore ainsi qu'une injection intraveineuse de notre traitement. Tous les animaux seront également exposés à des séances d'imageries servant à évaluer l'efficacité du traitement et nécessitant une injection dans l'abdomen, ces séances pouvant être répétées jusqu'à 2 fois par semaine.
Impact sur les animaux
De possibles douleurs transitoires pourraient apparaître suite à l’apparition de légers dommages dans le cerveau provoqués par l'ouverture de la barrière le protégeant, visualisables par imagerie médicale (fréquence observée inférieure à 10%). Notre protocole nécessite une pose de cathéter dans la veine de la queue, ainsi que des injections dans l'abdomen qui seront réalisées sous anesthésie générale, présentant des contraintes de classe légère pour les animaux et n’engendre pas de souffrance ou de stress. Le transport entre les laboratoires du projet peut également générer un léger stress ou inconfort chez l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin d'en analyser les tissus.
Remplacement
Le projet portant sur l’étude de la réponse du cerveau, et plus particulièrement la barrière le protégeant, il nous est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. De plus, il n'existe pas à ce jour de méthodes alternatives, n'impliquant pas d'animaux vivants, qui permettent l'étude du passage de particules virales à travers cette barrière grâce aux ultrasons. L’étude qui en découle comporte des analyses du cerveau afin d'évaluer l’impact cellulaire des ultrasons qui ne sauraient être remplacées par un modèle informatique ou cellulaire.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé avec l’aide d’un logiciel permettant d’évaluer le nombre d’animaux minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives sur les paramètres à mesurer. Ce nombre tient compte des risques de mort et d’exclusion d’un animal lors des différentes procédures. Le nombre d’animaux nécessaires à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats. Le suivi de l'efficacité du traitement se faisant sur plusieurs semaines pour chaque animal, notre étude nécessite très peu de groupes de souris.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l'hébergement des animaux de l'Annexe II du premier février 2013 de l'arrêté fixant les conditions d'agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l'environnement. Toutes les mesures seront prises pour réduire la souffrance des animaux. L’ensemble des expérimentations seront réalisées sous anesthésie adaptée, les animaux seront maintenus en température et un suivi de la fréquence cardiaque et respiratoire sera effectué lors des séances d'imagerie médiale et de traitement par ultrasons. L'imagerie médicale nous permettra également de visualiser l'apparition d'éventuel dommage au cerveau avant le réveil de l'animal, permettant une administration préventive d'un analgésique dans ce cas. Une échelle de cotation de douleur basée sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d'évaluer l'état général de chaque animal et de définir des points limites, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l'animal. De plus, dans le cas où certains signes de douleurs seraient observés, sans dépassement des points limites, un traitement sous-cutané avec un analgésique sera mis en place.
Choix des espèces
L’ensemble des animaux utilisés seront des souris à l'âge adulte, soit à partir de 6 semaines. Nous avons optimisé les protocoles pour des animaux de ce calibre, ce qui nous permettra un transfert sans difficulté pour ces expérimentations.
Caractérisation des mécanismes moléculaires d’un modèle murin de SLA/DFT
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées à l'issue, 1 340 souris porteuses d'une mutation reproduisant la sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale vieillissent jusqu'à quatorze mois, dans des procédures dont le niveau de souffrance déclaré va du sans réveil au sévère. Le porteur indique que ces souris prennent moins de poids dès trois mois, puis perdent du poids et de la mobilité et développent des tremblements entre dix et quatorze mois, la maladie conduisant à leur mort. Pour 1 040 d'entre elles, la procédure se limite à l'attente de cette dégradation, sans autre intervention que la pose d'une bague et une biopsie, avant la mise à mort. Le porteur décrit des travaux menés sur des motoneurones issus de cellules souches de patients, tout en concluant que "seul un modèle animal" permet d'établir la chronologie des atteintes.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (ou maladie de Charcot) et la démence fronto-temporale sont des maladies neurodégénératives conduisant à la mort des motoneurones (neurones situés dans la moelle épinière innervant et commandant les fibres musculaires). Ces deux pathologies présentent un spectre clinique commun, 50% des patients atteints de sclérose latérale amyotrophique développent une démence frontotemporale, 15% des patients atteints de démence frontotemporale présentent des signes de sclérose latérale amyotrophique. Précédemment, une mutation sur le gène d'une protéine de la mitochondrie (= petit organite qui a un rôle essentiel dans les processus énergétiques cellulaires) a été identifiée chez des patients souffrant d'une sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale. Parmi tous les facteurs impliqués dans le processus conduisant à une sclérose latérale amyotrophique, un dysfonctionnement des mitochondries a toujours été envisagé comme un acteur majeur de cette pathologie. Mais, l'identification d'une mutation dans un gène codant pour une protéine de la mitochondrie fut la 1ère preuve génétique démontrant le rôle primaire des mitochondries dans des atteintes du motoneurone. L'objectif général de notre projet de recherche est de comprendre comment la mutation de ce gène codant pour une protéine de la mitochondrie conduit à la mort des motoneurones. Pour cela, nous devons caractériser la séquence des évènements reliant l'atteinte des mitochondries à la mort des motoneurones en 1/ identifiant les mécanismes moléculaires conduisant à la mort des motoneurones et 2/ en établissant une cinétique permettant de comprendre la séquence des évènements conduisant à la mort des motoneurones.
Bénéfices attendus
Actuellement, la sclérose latérale amyotrophique et la démence frontotemporale ne présentent pas d'option thérapeutique, il est donc important de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Une meilleure compréhension des mécanismes conduisant à la mort des motoneurones est importante pour identifier de nouvelles voies moléculaires pouvant par la suite être ciblée comme piste thérapeutique dans le traitement des atteintes du motoneurone associées à un dysfonctionnement mitochondrial.
Procédures
Les animaux seront élevés dans le cadre d’un protocole de vieillissement. La majorité des animaux (1040 animaux) ne seront soumis à aucune autre intervention avant la mise à mort des animaux. Pour les 300 animaux restants, une injection intrapéritonéale d'une solution analgésique sera effectuée au moment de la mise à mort des animaux, suivie 15 minutes plus tard d'une deuxième injection intrapéritonéale d'une solution anesthésique. Deux injections en intrapéritonéales seront donc réalisées pendant la durée de vie de la souris, d'une durée de quelques secondes (3 à 5 secondes par injection). Après l'analgésie et l'anesthésie de l'animal, une perfusion intracardiaque sera effectuée.
Impact sur les animaux
Les souris présentant une sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale présenteront un phénotype dommageable conduisant à la mort des animaux. Les animaux présenteront : - une prise de poids diminuée par rapport aux souris contrôles dès l'âge de 3 mois, - une diminution du poids et/ou une diminution de la mobilité des animaux et/ou la présence de tremblements à un stade plus avancé de la vie de l'animal (autour de 10 à 14 mois). L'identification des animaux (pose d'une bague et biopsie) entrainera une douleur légère de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures. Les animaux étudiés présentent un phénotype de maladie neurodégénérative (sclérose latérale amyotrophique et démence frontotemporale) nécessitant la mise à mort des animaux afin de prélever les organes pour les analyser.
Remplacement
Dans un but de remplacement, des expériences in vitro ont été réalisées précédemment sur des cellules en culture à partir de fibroblastes primaires issus des patients porteurs de la mutation d'intérêt et à partir de motoneurones différenciés à partir de cellules souches induites exprimant la mutation d'intérêt. Des expériences sur les motoneurones continueront à être menées. Néanmoins, bien que ces modèles cellulaires issus des patients présentent un potentiel important pour rempacer et réduire l'utilisation de l'animal, ils ne permettent pas de reproduire les interactions physiologiques et les mécanismes physiopathologiques intégrés à l'ensemble de l'organisme. La sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale étant une pathologie touchant plusieurs organes, seul un modèle animal animal permettra de caractériser et surtout d'établir une cinétique (à des âges différents) permettant de mieux comprendre les mécanimes moléculaires associés à la mort des motoneurones dans les différents organes.
Réduction
Dans un but de réduction, nous utiliserons des modèles cellulaires (notamment des motoneurones différenciés à partir de cellules souches induites) pour étudier les mécanimes moléculaires associés à la mort des motoneurones. Ces expériences nous permettront de répondre à certaines questions scientifiques et ainsi de diminuer le nombre d'animaux utilisés. Des statistiques prédictives ont également été réalisées dans le but d'utiliser le minimum d'animaux nécessaires à ce projet. Afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs, nous aurons besoin de 15 animaux par expérience et par génotype.
Raffinement
Dans un but de raffinement, un suivi hebdomadaire du poids sera réalisé et une fiche de score sera utilisée pour assurer un suivi optimal de chaque animal. Cette fiche de score a été établit en lien avec le phénotype attendu de sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale et a été précédemment utilisée pour le suivi de ces souris. Les animaux seront observés hebdomadairement, ce qui permettra d'identifier précocement tout signe clinique, de stress ou de douleur. Le phénotype de sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale étant associé à une perte de poids, les animaux seront pesés une fois par semaine. Lorsqu'une perte de poids sera observée, une surveillance accrue de l'animal sera réalisée (2 fois par semaine ou tous les jours suivant le pourcentage de perte de poids), de l'eau et de la nourriture gélifiée seront également ajoutés dans la cage. Lors de cette surveillance hebdomadaire, une attention particulière sera portée sur la mobilité (affaiblissement des membres inférieurs ou tremblements) et sur le comportement des animaux. Les animaux seront surveillés selon les critères suivants: - poids: le point limite est fixé à une perte irréversible de poids supérieure ou égale à 15% par rapport à la pesée précédent la 1ère diminution du poids, - mobilité: le point limite est fixé à l'apparition d'un affaiblissement des pattes arrières ou à des tremblements associés à une incapacité des souris à se retourner en moins de 15 secondes lorsqu'elles sont sur le flanc, - comportement (associé au phénotype de démence frontotemporale): le point limite est fixé à l'apparition éventuelle d'un comportement agressif non résolu par l'enrichissement ou l'isolement. L'environnement de l'animal sera enrichi par ajout d'un igloo en papier mâché et de carrés de ouate ou de tissu compressé (pour permettre à l'animal de se faire un nid à l'abri de la lumière), ainsi que de batonnets en bois (pour permettre à l'animal de ronger) dans chaque cage.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est un modèle de choix en raison de similarités génétiques et physiologiques avec l'homme, permettant d'extrapoler les résultats et d'en tirer des conclusions valables pour l'homme. De plus, elle présente un cycle de vie court et un cycle de reproduction avec une natalité importante. La souris est un modèle qui nous permet d'obtenir assez de matériel biologique pour réaliser les analyses protéique, génomique et histologique nécessaires au déroulé de ce projet de recherche. De plus, le modèle murin utilisé est un modèle spécifique déjà établi et caractérisé (modèle de sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale). Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Les animaux seront utilisés à 5 stades de développement : - stade d'apparition des 1ers signes cliniques = 3 mois de vie, - stade intermédiaire = 6 mois de vie (stade nécessaire pour établir une cinétique permettant de déterminer la séquence des évènements conduisant à la mort des motoneurones), - stade intermédiaire = 9 mois de vie (stade nécessaire pour établir une cinétique permettant de déterminer la séquence des évènements conduisant à la mort des motoneurones), - stade intermédiaire = 11 mois de vie (stade nécessaire pour établir une cinétique permettant de déterminer la séquence des évènements conduisant à la mort des motoneurones), - stade correspondant à l'atteinte finale de la maladie (= soit perte de poids supérieure à 15% par rapport à la pesée précédent la 1ère diminution de poids, soit un affaiblissement partiel de l'extension des pattes ou tremblements, associé à une incapacité pour la souris de se retourner sur elle-même lorsqu'elle est sur le flanc en moins de 15 secondes). L'atteinte finale de la maladie se déclare entre 12 et 14 mois de vie.