Système nerveux

Deux chirurgies intracérébrales par animal, la première sur des nouveau-nés d'un jour anesthésiés par immersion dans la glace, la seconde de quarante-cinq minutes à l'âge adulte pour implanter une fibre optique. 800 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées pour récupérer leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 480 d'entre elles et modéré pour 320. Le porteur note que le refroidissement rapide de la peau est connu pour être douloureux chez l'homme, et enveloppe donc les souriceaux dans un gant de latex avant de les poser sur la glace. Le bénéfice annoncé se limite à mieux comprendre comment les odeurs facilitent la mémorisation de souvenirs plaisants.

Objectifs

Marcel Proust, dans son livre « Du Côté de Chez Swann » (1919), décrit l'odeur d'une madeleine trempée dans du thé de tilleul comme déclenchant une joie immense, le ramenant au temps des après-midi passés auprès de sa tante. Nos souvenirs sont en effet associés à diverses informations sensorielles, notamment olfactives. Les souvenirs évoqués par les odeurs ont souvent été décrits dans la littérature comme ayant des caractéristiques très spécifiques qui les différencient des autres mémoires sensorielles. Ils ont notamment été rapportés comme étant plus anciens et ayant une charge émotionnelle, notamment positive, plus importante. Cependant, les bases neurales de cette mémoire olfactive formée à l'enfance restent aujourd’hui méconnues. Dans ce contexte, l'objectif est de réaliser une étude longitudinale visant à modéliser un souvenir olfactif précoce chez la souris. Ainsi l’étude consiste à mettre en mémoire une information olfactive durant la période infantile et à tester son rappel à l’âge adulte (ce qui n’est pas envisageable sur le modèle humain). Ce modèle permettra également d’étudier les bases neurales de la mémoire olfactive infantile à l'âge adulte avec un intérêt particulier pour le rôle des neurones nés en post-natal dans le bulbe olfactif, la première structure cérébrale en charge du traitement de l’information olfactive (ce qui est à nouveau inenvisageable sur le modèle humain). Ce projet permettra de mieux comprendre comment ces odeurs d’enfance ont cette faculté de donner ces caractéristiques mnésiques et émotionnelles si particulières à nos souvenirs. Ce projet de recherche fondamental sera mené sur 800 souris sur une période de 5 ans. La signature neurale du souvenir olfactif formé à l’enfance sera étudiée chez l’adulte, principalement post-mortem à l’échelle cellulaire et moléculaire. Nous modulerons également par optogénétique (outil permettant d'activer ou d'inhiber des neurones d'intérêts à l'aide d'une stimulation lumineuse) les neurones du bulbe olfactif nés en post-natal, pour étudier leur rôle dans le souvenir olfactif. Enfin, grâce à la photométrie de fibre optique (technique consistant à enregistrer un signal optique, émis ici par les neurones cibles), nous étudierons l’activité en temps réel, en réponse à l’odeur mise en mémoire, de structures impliquées dans le souvenir olfactif.

Bénéfices attendus

Nous étudions les bases neurales des souvenirs olfactifs de l’enfance. D’un point de vue fondamental, ces résultats permettront de mieux comprendre les mécanismes qui permettent aux odeurs de faciliter la mise en mémoire à long-terme de souvenirs émotionnellement intenses et plaisants.

Procédures

Nous procèderons à des injections cérébrales de vecteurs viraux (la durée de la chirurgie est d'environ 10 minutes par souris, avec un temps d'injection virale de 3 à 6 secondes) et à la mise en place de fibres optiques (la durée de la chirurgie est d'environ 45 minutes par souris) dans la même structure. L'approche utilisée permettra d’étudier le lien causal entre activité de structures cérébrales et comportement, en fonction de la valeur hédonique des odeurs ou du genre de l’animal. L’ensemble de cette procédure chirurgicale comprend 2 chirurgies intracérébrales, avec une l’injection virale chez le nouveau-né et une implantation de fibre optique à l’âge adulte. La phase de récupération et la phase de comportement s’étend sur 3 mois maximum. Les tests comportementaux corresponderont à des mesures de temps d'investigation et de locomotion en présence d'odeurs, pour étudier leur mémorisation, sur de courtes durées (1 à 5 minutes). Les animaux seront également soumis à une injection intrapéritonéale de marqueurs de prolifération aux jours postnataux (P) P1 et P7, respectivement, pour marquer les nouveaux neurones.

Impact sur les animaux

Les animaux implantés (procédure chirurgicale) étant remis entre congénères (pour éviter l'isolement des animaux), ils peuvent être susceptibles de se blesser. Des dégradations du matériel d’implantation et donc de la zone neurale correspondante peuvent aussi être engendrées. Les chirurgies peuvent également induire des effets secondaires indésirables (perte de poids, douleurs, stress, apathie, stéréotypie etc). Enfin, la manipulation des animaux ainsi que les injections intrapéritonéales peuvent induire chez les animaux un stress léger. Une surveillance adaptée sera mise en place à l’aide d’une grille de score évaluant l’état physiologique et comportemental de l’animal, définissant des points limites connus et maitrisés.

Devenir

Tous les animaux utilisés selon cette procédure seront mis à mort afin de récupérer le cerveau et contrôler les injections ou analyser l’activité neuronale.

Remplacement

L’étude de processus physiologiques et plus particulièrement l’étude des bases neurales du comportement nécessite l’utilisation d’animaux vivants et ne peut s’envisager sur modèles strictement in vitro. Notre projet se focalise sur un modèle expérimental nécessitant l’utilisation d’un modèle animal. Il n'existe pas de modèle cellulaire reproduisant nos procédures expérimentales.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux (15 souris minimum par groupe), pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats (ANOVA, t-test, test de corrélation). Ces prévisions sont basées sur les précédentes études de l’équipe et les données de la littérature. De plus, pour assurer de la fiabilité statistique nous randomiserons les animaux et les groupes, et afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous corrélerons (grâce à des statistiques adaptées) le comportement et les paramètres cellulaires sur les mêmes animaux.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance rapprochée, à l’aide d’une grille d’évaluation, pour détecter les points limites de souffrance. Pour réduire le risque d’un impact physique et psychique, une semaine de repos sera effectuée à l’arrivée des animaux avant mise en reproduction. Une sciure avec copeaux longs sera utilisée (avec ajout de coton pour les mères et les petits). Les animaux seront maintenus en groupe (de 5 maximum). Les cages sont transparentes pour favoriser la communication. Procédure chirurgicale chez le nouveau-né (jour postnatal (P) P1) : les souris seront anesthésiées par hypothermie (la température centrale du corps des rongeurs restant ici bien inférieure à celle nécessaire pour éprouver de la douleur). Après chirurgie, les animaux seront placés sur une plaque chauffante jusqu’à leur réveil (~10 minutes) afin de limiter le risque de rejet des nouveau-nés par la mère. Cette méthode d’anesthésie est préférable à d’autres méthodes (inhalation de gaz), du fait de la capacité des nouveaux-nés à stopper leur respiration. Puisque le refroidissement rapide de la peau non protégée est connu pour être douloureux chez l’homme, nous envelopperons les souris dans une protection (gant de latex) avant de les placer dans la glace. Procédure chirurgicale à l’âge adulte : les souris seront placées sous anesthésie générale à l’aide d’un analgésique approprié. Une injection d’antalgique sera pratiquée avant et après chirurgie, réitérée ensuite en fonction de l’état de l’animal. En attendant un réveil partiel, les animaux seront placés sous une lampe chauffante. Le test de pli de peau sera pratiqué pour vérifier le niveau d’hydratation (une injection de NaCl sera faite si besoin). Les animaux seront transportés via des cages à couvercles filtrants jusqu’à une armoire ventilée en secteur conventionnel, pour y être placés dans une cage propre avec nourriture et eau à volonté. Leur poids sera contrôlé pendant les 3j suivants. L'état général sera évalué régulièrement pendant la phase de récupération (3 semaines).

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris car son comportement et l’importance écologique de la fonction olfactive de cette espèce sont particulièrement adaptés à la question de recherche qui nous intéresse. De plus le système olfactif humain et de la souris présentent de grandes similarités, faisant de cette espèce un très bon modèle pour étudier le système olfactif. Enfin, l’ensemble des données antérieures a été obtenu chez cette espèce, elle est classiquement utilisée dans ce type d’étude, et nos données pourront être comparées à celles de la littérature. La période de formation de la mémoire olfactive prend place du jour postnatal (P) P23 à P33, correspondant au stade juvénile chez la souris. C’est en effet cette période qui est la cible de la plus grande partie des souvenirs olfactifs chez l’Homme (c'est-à-dire avant 10 ans). Les tests comportementaux, visant à étudier la mémoire et la préférence de l’odeur d’enfance, seront réalisés aux stades jeune adulte (2 mois), adulte (6 mois), et adulte avancé (1 an), afin d’étudier l’acquisition ainsi que la rétention à long terme du souvenir olfactif. La maturité sexuelle, qui se situe 8 semaines chez les femelles et 10 chez les mâles, est atteinte.

672 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour l'analyse de marqueurs biologiques et des vérifications anatomiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacun subit une chirurgie d'injection intracérébrale et d'implantation d'une fibre optique pouvant durer une heure trente, puis jusqu'à trois mois de rationnement alimentaire destiné à le maintenir entre 90 et 95 % de son poids, et jusqu'à quatre mois de tâche comportementale à raison d'une heure par jour. Le porteur qualifie cette faim entretenue d'atteinte "très peu" marquée au bien-être des animaux non-humains, et la présente comme la condition de leur motivation. L'objet du projet, la prise de décision risquée et sa bascule vers le pathologique, est rattaché aux addictions comportementales et au jeu pathologique sans qu'aucune application clinique ne soit décrite.

Objectifs

La flexibilité comportementale est une caractéristique essentielle de la prise de décision dans un environnement dynamique et incertain et est fondamentale pour notre adaptation au quotidien. Une prise de décision inadaptée est caractéristique de plusieurs pathologies neuropsychiatriques impliquant des altérations du contrôle exécutif et de la flexibilité (comme les addictions, la dépression, la schizophrénie, ...). Nous proposons de modéliser la prise de décision adaptée et inadaptée chez le rat, dans un paradigme comportemental permettant d’étudier la prise de risque, avec la perspective d'identifier des mécanismes qui entrainent la transition vers le comportement pathologique. Nous chercherons alors à identifier les bases neurophysiologiques de ces processus afin de mettre en évidence les marqueurs biologiques impliqués dans la prise de décision anormale. Nous utiliserons des approches interventionnelles pour tester si en modifiant l’activité des différentes régions impliquées nous pouvons soit entraîner une transition vers une prise de décision inadaptée soit rétablir un comportement adaptatif. Nous espérons ainsi pouvoir clarifier les rôles des différentes régions impliquées dans la prise de décision risquée, adaptée ou mal-adaptée, avec un impact potentiel non seulement dans le cadre des addictions comportementales (telles que le jeux pathologique) mais aussi d'autres pathologies psychiatriques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de préciser la connectivité des différentes régions impliquées dans la prise de décision adaptée et inadaptée ainsi que de préciser leur rôle. Une hypothèse majeure actuelle est que la prise de décision mal adaptive qui caractérise un grand nombre de pathologies mentales est associée à un syndrome de dysconnectivité de ces régions, ce projet fondamental pourrait donc ouvrir de nouvelles voies pour une meilleure compréhension des addictions comportementales, avec une pertinence possible pour d’autres types d’addictions.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie d’injection intra cérébrale de composés et d’implantation à demeure de fibre optique d’une durée maximale d’une heure et demie. Ils seront soumis également à une restriction légère d’accès à la nourriture (rationnement afin de les maintenir à 90-95% de leur poids initial) qui durera maximum 3 mois consécutifs ainsi qu'à une tâche comportementale dont les sessions durent maximum 1h par jour pour une durée maximale de 4 mois au total.

Impact sur les animaux

Les chirurgies d’injection intra cérébrale de composés et d’implantation de fibres présentent un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur). Les animaux seront mis en rationnement alimentaire léger (90-95% de poids corporel) afin de garantir leur motivation pour la tâche comportementale, ce qui impacte très peu leur bien-être (légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à effectuer une tâche pour obtenir une récompense alimentaire). Cette restriction temporaire est en partie compensée par la nourriture obtenue au cours de la tâche comportementale (entre 3 et 6 g par jour).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour l’analyse des marqueurs biologiques et les vérifications anatomiques.

Remplacement

Elucider les bases neuronales de fonctions cognitives ne peut, par définition, s’étudier que chez des organismes entiers. L’approche cognitive chez l’homme n’autorise pas la manipulation fine des circuits neuronaux qui est nécessaire à la compréhension de leur fonctionnement.

Réduction

Nous cherchons à utiliser le nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des données exploitables lors de l'utilisation des tests statistiques. Le recours à des méthodes réversibles permet de diminuer le nombre d’animaux nécessaire puisque l’inhibition de régions spécifiques peut être réalisée sur les mêmes animaux à différentes étapes du protocole comportemental.

Raffinement

Le bien-être animal étant essentiel pour garantir des données comportementales exploitables, toute souffrance sera évitée. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement adapté (matériel de nidification, tunnel et barre à ronger) et seront hébergés en cage collective, même après les chirurgies. Les protocoles de chirurgie ont été optimisés afin de garantir des conditions optimales (analgésie centrale, locale, gel oculaire, tapis chauffant, scoring post-opératoire). Des points limites généraux et spécifiques ont été identifiés afin de permettre une prise en charge optimale de la douleur et de l’inconfort.

Choix des espèces

D’une façon générale les rongeurs sont un bon modèle d’étude du système nerveux. Les principes fonctionnels à l’œuvre dans ces circuits sont transposables à l'homme. De plus de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez le rat des aptitudes cognitives complexes. Les animaux utilisés pour ce projet seront des jeunes adultes âgés d’environ 3 mois au début des expériences afin de limiter la variabilité de taille.

Génotypées par prélèvement d'un bout de queue vers sept jours de vie, puis traitées par voie orale dès la naissance, 3 288 souris sont soumises à des tests de mémorisation et de locomotion, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever les tissus du cerveau et de la moelle épinière. Le projet porte sur le rôle d'une protéine dans la formation de la myéline, avec l'espoir déclaré d'ouvrir des pistes pour les maladies démyélinisantes comme la sclérose en plaques. Le porteur revendique un recours aux cultures de cellules et de tissus pour réduire le nombre de souris adultes utilisées, ces cultures reposant elles-mêmes sur des souriceaux tués à trois ou quatre jours.

Objectifs

La myéline est une substance qui entoure le prolongement des neurones et qui est responsable de la conduction nerveuse et donc de la transmission des commandes initiées par le système nerveux. La myéline est produite par des cellules appelées oligodendrocytes, localisés dans le cerveau et la moelle épinière. La perte de myéline ou d’oligodendrocytes peut survenir dans le cas de pathologies appelées maladies démyélinisantes (telle que la sclérose en plaques) ou lors de traumatismes (par ex. accidents de la route), et peuvent mener à de lourds handicaps. La formation de la myéline (myélinisation) et sa réparation (remyélinisation) sont des processus complexes qui font intervenir de nombreux mécanismes dans les oligodendrocytes. Le but de ce projet est de comprendre l’implication d’une protéine, en recherchant son rôle dans le développement et maturation des oligodendrocytes et de la myéline chez la souris. Ce projet s’appuie sur des études précédentes montrant que l’activation de ce type de molécule est capable de protéger la myéline. Pour étudier l’implication de cette protéine uniquement dans les oligodendrocytes, nous caractériserons les souris d’intérêt d’un point de vue macroscopique (locomotion, cognition) mais aussi microscopique (état des tissus, organes, cellules). Le projet proposé nous permettra de mieux comprendre le rôle de cette protéine pendant le développement des cellules (âge précoce), puis leur maturation lors de la formation de la myéline (âge plus tardif). Ces expériences sont nécessaires pour mieux étudier les pathologies liées à la perte de myéline. De nombreux modèles alternatifs (cultures de cellules, ou de tissus) sont utilisés dans ce projet afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Ce projet permettra d’ouvrir la voie à de nouvelles pistes thérapeutique pour les maladies démyélinisantes, pour lesquelles il n’existe actuellement pas de traitements efficaces.

Bénéfices attendus

Par ce projet, nous espérons faire émerger de nouvelles pistes pour le traitement des maladies démyélinisantes.

Procédures

- Un prélèvement à la queue sera réalisé à l’âge de P7-10 sur l’ensemble des souris afin de vérifier leur génotype (lien de leur parenté). - Les souris seront traitées oralement à P0 (via une pipette) en utilisant le réflexe de succion, spontané à cet âge. Cette manipulation dure moins d’1min. - Les souris réaliseront des expériences de comportement afin de vérifier leur capacités cognitives et motrices (mémorisation, locomotion). Ces expériences sont non-invasives et non douloureuses. Elles se feront sur animal vigile et dureront chacune maximum 10 min.

Impact sur les animaux

- Nuisance de prélèvement lors de la biopsie de queue (douleur légère et de courte durée). -Le stress de contention dû aux traitements lors de la manipulation des animaux sera minimisé par un geste rapide et par l’utilisation du réflexe de succion spontané à P0. - Nos travaux précédents n’ont pas montré de phénotype dommageable sur notre lignée KOOLA10 traitée à P0. Les animaux qui seront gardés jusqu’à 21jours et 8sem seront attentivement surveillés dans le cas ou des effets indésirables surviendraient.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort à l’issue des expérimentations, nous permettant de prélever les tissus d’intérêt et de les analyser.

Remplacement

Le modèle animal que nous utilisons permet de mimer certains aspects des pathologies que nous étudions (telle que la Sclérose en plaques), et pour lesquelles il n’existe pas de traitement. Ce modèle est donc nécessaire pour mieux comprendre ces maladies. Les processus de myélinisation et de réparation de la myéline impliqués dans les maladies démyélinisantes que nous étudions induisent des processus biologiques et physiologiques complexes qui nécessitent l’intervention de multiples acteurs cellulaires. Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Il n’existe pas, dans notre domaine, d’alternatives satisfaisantes aux méthodes expérimentales proposées dans ce projet. Le modèle animal reste nécéssaire pour mesurer l’inflammation et la démyélinisation, ainsi que la récupération fonctionnelle de l’animal.

Réduction

Nous avons prévu d’utiliser des modèles in vitro de cultures de cellules et ex vivo de culture de tissus nous permettant de réduire les études in vivo sur souris adultes et ainsi de réduire considérablement le nombre d’animaux vivants utilisés. Les animaux contrôles utilisés dans nos procédures sont indispensables pour établir des comparaisons fiables et tirer des conclusions précises. Ces animaux nous permettront de contrôler les variables externes, d’éliminer les biais et de mesurer les effets de nos traitements en les comparant aux groupes expérimentaux. Ils renforcent ainsi la validité de nos conclusions. De plus, nous avons limité au minimum le nombre d'animaux pour atteindre la puissance statistique suffisante nécessaire à l’interprétation des résultats. Ce nombre a été évalué́ à partir d’études précédentes (les expériences histologiques et biochimiques nécessitent au moins 6 animaux et les expériences comportementales en nécessitent au moins 10). Ces précautions permettent de limiter les variations inter-individuelles et d’aboutir à des conclusions rigoureuses. Les animaux issus des études comportementales seront ensuite utilisés pour les études des tissus prélevés, nous évitant ainsi d’avoir recours à de nouveaux lots de souris dédiés à cette analyse. De plus, plusieurs tissus d’intérêt seront prélevés sur chaque souris, permettant encore de réduire le nombre d’animal utilisé.

Raffinement

Nous avons choisi des tests comportementaux qui ne sont ni invasifs ni douloureux, et nous avons réduit la durée des études au maximum. Les animaux disposeront de coton pour enrichir leur environnement. Les animaux seront attentivement surveillés dans le cas ou des effets indésirables surviendraient à cause du traitement sur le long terme. Un suivi particulier du bien-être des animaux sera mis en place et une grille spécifique de prise en charge de la douleur sera utilisée pour définir des points limites adaptés au phénotype observé, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.

Choix des espèces

Les souris sont des mammifères qui partagent de nombreuses similitudes biologiques avec l’Homme, en particulier au niveau génétique et neurologique. Elles constituent des modèles de choix pour (1) étudier les mécanismes des pathologies neurologiques humaines et (2) explorer des traitements potentiels de manière pertinente pour ces maladies. Les souris sont des organismes modèle bien établis en recherche biomédicale, et offrent une capacité élevée de reproduction et de cohérence dans les résultats expérimentaux, permettant des interprétations fiables et de tirer des conclusions robustes. De plus, les techniques d’analyse à notre disposition pour évaluer l’implication de notre molécule d’intérêt et l’état de la myéline (affectée dans la pathologie étudiée) sont très bien adaptées chez la souris. Afin de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés, nous envisageons des expériences in vitro de cultures de cellules et ex vivo de culture de tissus. Ces techniques nécessitent l’utilisation d’animaux à des stades périnataux (P3-4 et P7-10 respectivement) compatibles avec la survie en culture en boite de Pétri. Pour les études in vivo, les animaux sont âgés d’au moins 21 jours car il est connu que le processus de formation de la myéline autour des prolongements neuronaux est achevé à cet âge, mimant ainsi au mieux les processus pathologiques de la maladie étudiée. Il est donc indispensable pour la bonne réalisation de ce projet de recourir à l’utilisation de ce modèle animal, aux âges indiqués.

Pour comprendre comment s'installe l'hypersensibilité mécanique, 306 souris reçoivent une injection sous-cutanée de la molécule testée ou d'un placebo, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées ensuite pour prélèvement de tissus. 114 subissent une incision de la peau de la patte au scalpel sous anesthésie et 114 autres l'injection d'un composé inflammatoire dans la patte. La sensibilité de la patte lésée est mesurée avec des filaments calibrés la veille et le lendemain, le porteur indiquant que ces lésions accroissent la sensibilité et peuvent entraîner une perte de poids. Il déclare viser à terme la prescription de la molécule comme antidouleur en clinique, et affirme que la douleur ne peut pas être dissociée du système physiologique global de l'animal.

Objectifs

Depuis 2013, notre équipe travaille sur une molécule nommée Tafa4. Cette molécule est présente naturellement en petite quantité dans notre organisme et celui des souris. Si on supprime cette molécule chez la souris, on transforme une douleur aigue en douleur chronique quel que soit le type de lésion. Nous avons aussi constaté que l'injection de Tafa4 permettait de réduire l'hypersensibilité mécanique suite à une lésion, c’est-à-dire qu’après une lésion, les souris sont moins en douleur. Cette molécule a donc une forte valeur thérapeuthique et notre équipe de recherche se propose d'étudier et de comprendre les mécanismes moléculaires à l'origine de cet effet. Recemment, nous avons montrés que l'injection de Tafa4 avant une lésion post opératoire (type chirurgie) empêchait la mise en place de l'hypersensibilité mécanique, ou de la douleur chez la souris. Ainsi, ce projet possède un double objectif. D'une part de comprendre comment la preinjection de tafa4 empêche la mise en place de l'hypersensibilité mécanique, augmentant encore son potentiel thérapeuthique. D'autre part, cet effet préventif est le modèle parfait pour comprendre comment l'hypersensibilité mécanique se met en place, ce qui est une question biologique ouverte depuis des années et qui serait à même d'avoir une incidence sur la prise en charge de certaines douleurs.

Bénéfices attendus

Le but final est que TAFA4 soit prescrite comme une molécule antidouleur en clinique. De plus, comprendre comment l'hypersensibilité se met en place ouvrira un nouveau panel de solution pour la prise en charge de patients souffrant de douleurs chroniques.

Procédures

Afin d’étudier l’effet préventif de TAFA4, nous serons ammenés à injecter la molécule (ou un placebo) en sous-cutannée sur toutes les souris (306). 114 d’entre-elles seront opérées chirurgicalement sous anesthésie général. L’anesthésique sera administré par voie intra-péritonéale. La chirurgie consiste en une fine incision de la peau de la patte avec une lame de scalpel. Pour le modèle inflammatoire, nous injecterons un composé inflammatoire dans la patte de la souris sur 114 d’entre-elles. Ces interventions dureront moins de 20 minutes. Un jour avant et un jour après ces procédures, nous mesurerons la sensibilité au niveau de la patte des animaux grâce à des filaments exerçant une pression donnée.

Impact sur les animaux

Avec les differents modèles de lésions post-opératoires et inflammatoires, la sensibilité des souris au niveau de la patte lésée sera acrue. Ces lésions peuvent entrainer une perte de poids. Toutes ces procédures seront réalisées par un personnel qualifié et expérimenté et tout sera mis en oeuvre pour minimiser la nuisance provoquée. Il y aura une surveillance accrue les jours suivant les chirurgies.

Devenir

Les animaux seront mis à mort car nous devons prélever leurs tissus qui seront par la suite analysés. En effet, l’analyse est indispensable pour comprendre les mécanismes de la douleur et nottamment l’effet préventif de TAFA4.

Remplacement

La thématique principale de notre laboratoire étant de comprendre la physiologie de la douleur, notre projet nécessite l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement par des méthodes non-animales. En effet, la douleur ne peut être dissociée du système physiologique global de l’animal. L’étude comportementale, constituant le point de départ de notre étude, est le résultat d’une intégration complexe de l’information sensorielle de la périphérie vers des zones spécialisées du cerveau. Ainsi, l’expérimentation animale sur des souris est indispensable à l’étude des phénomènes physiologiques et à la réalisation de notre projet. .

Réduction

Des stratégies seront mises en place afin d’éviter ou de limiter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires tout en obtenant suffisamment de données pour répondre aux questions liées à l'étude. Ainsi, l’élaboration précise des protocoles de comportement et le choix pertinent des contrôles sont des éléments déterminants. De plus nous procèderons à une utilisation maximale des données obtenues en réalisant toute une série de tests comportementaux non-invasifs sur le même animal, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Par ailleurs, l’utilisation d’outils statistiques permet d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaire. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables. Les procédures décrites sont appliquées depuis plusieurs années au sein de notre équipe et sont maitrisées par les expérimentateurs. Nous avons donc l'expérience nécessaire concernant la réalisation des procédures et l’évaluation de l'impact sanitaire sur les animaux. La qualité de notre plan expérimental ainsi que l’étude détaillée du nombre d’animaux nécessaires à l’obtention d’un résultat scientifique statistiquement valable nous permettent d’optimiser le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, dans un environnement enrichi (coton et/ou dôme) pour optimiser les conditions d’hébergement et favoriser un comportement normal afin de diminuer au maximum le stress des animaux. Les élevages sont effectués au sein de notre établissement agréé et 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages. De ce fait, l’état sanitaire et environnemental des animaux sont contrôlés tous les jours. Nous avons recours à l'anesthésie/analgésie lors du procédé chirurgical et des soins pré-, per- et post-opératoires adéquats sont administrés. Les procédures expérimentales seront planifiées (disponibilité des locaux d'expérimentation, du matériel, période d'acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation), ce qui permettra de diminuer le stress des animaux et de favoriser la validité des expériences. Enfin, des points limites les plus précoces possibles seront établis en fonction des tests de comportements utilisés. Un examen clinique sera effectué quotidiennement afin de vérifier la cicatrisation et l’état général de l’animal. Toutes ces stratégies d’optimisation seront mises en place dans le but de réduire voire supprimer la souffrance chez l’animal.

Choix des espèces

Chez la souris, les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires à celles décrites chez l’homme. De plus, differents tissus impliqués dans l'intégration nociceptives (peau, neurones sensoriels et moèlle epinière) sont parfaitement décrit chez la souris. La recherche sur la douleur est menée sur les rongeurs mâles depuis des décennies. Pourtant, plusieurs études ont montré que les femmes ont des seuils de douleur aiguë plus bas que les hommes et qu’elles sont prépondérantes parmi les patients souffrant de douleurs chroniques, ce qui suggère fortement des mécanismes sexuellement dimorphiques impliqués dans la perception, la modulation et le traitement de la douleur. Nos travaux seront donc réalisés sur des souris mâles et femelles. Lorsque les phénotypes étudiés sont comparables entre mâles et femelles, les données seront regroupées. Cela aura alors un impact considérable sur le nombre total de souris utilisées

840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique de quatre-vingt-dix minutes, une privation alimentaire maintenue à 90 % de leur poids pendant environ huit semaines et treize semaines de régimes lipidiques modifiés, puis un conditionnement opérant où il faut appuyer sur un levier pour obtenir de la nourriture. 720 sont tuées pour analyse histologique et les 120 géniteurs à sept ou huit mois, à la fin de leur période de reproduction. Le porteur qualifie les effets de la privation alimentaire de "très limités" et justifie le recours aux souris par des dimensions comportementales qu'il déclare non modélisables in vitro ou in silico.

Objectifs

Le but de ce projet est de déterminer quelles sont les types de neurons qui sont vulnérables à une déficience en acides gras polyinsaturés (AGPI) de type n-3. Pour cela, nous utiliserons une approche transgénique qui permettra de restaurer les taux d'AGPI dans des populations spécifiques de neurones en situation de carence générale en AGPI n-3. Nous testerons les processus de prise de décision par des tâches comportementales de conditionnement opérant où l'animal doit appuyer sur un levier pour obtenir une récompense alimentaire. Nous mesurerons l'activité neuronale par des approches d'imagerie in vivo chez l'animal se comportant.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de comprendre comment le statut cérébral en AGPI - qui est perturbé dans plusieurs pathologies psychiatriques- influence les processus de prise de décision.

Procédures

Les procédures de conditionnement opérant nécessitent une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum) durant environ 8 semaines - 1 chirurgie stéréotaxique d'environ 90 minutes- Exposition chronique à des régimes modifiés en lipides pendant environ 13 semaines

Impact sur les animaux

Une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum) a des effets très limités pour l'animal. Les chirurgies stéréotaxiques présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opération. L'exposition chronique à des régimes modifiés en lipides n'a pas d'impact évident pour l'animal.

Devenir

Tous les animaux expérimentaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour procéder à des analyses histologiques (720). Les géniteurs (120) seront mis à mort à l'âge de 7-8 mois, à la fin de la période de reproduction.

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions comportementales, non modélisables sur des modèles in vitro ou in silico.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. En particulier, nous utiliserons une stratégie de croisements génétiques qui permettra l'utilisation de tous les animaux de la descendance et comparerons les mâles et les femelles. Du fait de cette stratégie, tous les animaux (génotypes et sexes) issus de nos croisements seront utilisés. Le nombre d'animaux nécessaires est basé sur des expériences précédemment effectuées au laboratoire permettant de révéler des différences statistiques entre groupes.

Raffinement

Tous les efforts seront faits pour réduire la souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en cages collectives et environnement enrichi (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier). Du fait de la déprivation alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés tous les jours de la semaine. Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille et seront consignés sur une fiche de scorage. Si un score élevé persiste pendant plus de 48h les animaux seront mis à mort. Dans tous les cas, si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera mis à mort dans les 48h.

Choix des espèces

Ce projet nécessite l'utilisation de modèles transgéniques disponibles uniquement dans des modèles souris. Les animaux expérimentaux seront utilisés à l'âge adulte (>8 semaines) puisque le projet vise à évaluer les conséquences fonctionnelles des manipulations en AGPI sur le cerveau mature.