Système nerveux

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une lésion cérébrale est provoquée par injection de 6-OHDA pour modéliser la maladie de Parkinson, puis les souris subissent quatorze tests de douleur, dont le test de von Frey, l'immersion de la queue, la plaque chaude et le test à la formaline. Le porteur précise que la douleur liée au modèle "ne peut être soulagée car c'est l'objectif de l'étude". Il affirme que la caractérisation de la douleur nécessite une observation comportementale possible seulement sur "animal vivant et vigile".

Objectifs

La maladie de Parkinson est caractérisée par une perte progressive des neurones dopaminergiques de la substance noire compacte. Cette maladie est classiquement associée à des symptômes moteurs, cependant il est maintenant reconnu que de nombreux symptômes non moteurs, incluant la douleur, sont très communs. Les symptômes douloureux peuvent être observés chez environ 85 % des patients Parkinsoniens. Le seuil de douleur est également altéré chez les patients Parkinsoniens, présentant ou non des symptômes de douleur. Ces douleurs sont négativement associées avec la qualité de vie des patients. Ces symptômes de douleurs sont donc un souci majeur dans la prise en charge de la maladie. Les douleurs associées à la maladie de Parkinson suggèrent que les circuits cérébraux permettant de percevoir et traiter les informations douloureuses pourraient être dysfonctionnels. Cependant, la cible ou les cibles de ces dysfonctionnement douloureux ne sont pour l’heure pas encore connues dans le cadre de la maladie de Parkinson. Notre objectif est d’étudier en utilisant des approches lésionnelles et comportementales si une structure cérébrale, le striatum joue un rôle dans ces dysfonctionnements douloureux. Nous proposons donc ici une expérience préliminaire permettant caractériser les altérations des réponses nociceptives observées, chez la souris, dans un modèle classique de la maladie de parkinson : l’injection de 6- hydroxydopamine (6-OHDA) dans le striatum. Ces injections permettent à la fois de détruire les terminaisons dopaminergiques dans le striatum ainsi que les corps cellulaires des neurones dopaminergiques à l’origine de ces projections dans la substance noire compacte. Ces injections seront réalisées de façon unilatérale chez des souris mâles et femelles C57BL/6j et des groupes contrôles pseudo opéré y seront associés.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de caractériser un modèle murin (valide chez les mâles et les femelles) de la maladie de parkinson, bien caractérisé sur les symptômes moteurs mais où les altérations des seuils nociceptifs ne sont pas connues. Or des symptômes douloureux bien caractérisés pourraient être prédictifs dans l’évolution de la maladie chez l’Homme. Cela nous permettra également par la suite d'étudier les structures ou réseaux du système nerveux central à la base de ces altérations et de potentiellement révéler de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter les douleurs spécifiquement chez le patient parkinsonien. Cette avancée pourrait permettre de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques, potentiellement différentes chez le mâle et la femelle.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie stéréotaxique lésionnelle d'une durée d'1h30 environ. Les animaux développeront des douleurs suite à la modélisation de la maladie de Parkinson. Avant la chirurgie à J1 les animaux auront un test de von Frey, à J2 le test d’immersion de la queue, à J4 un deuxième test de von Frey et à J5 un deuxième test d’immersion de la queue. 15J après la chirurgie, à J1 les animaux auront un test de von Frey, à J2 un test de la plaque chaude, à J3 un tail pressure test, à J4 le test du plantar, à J5 le test de l’acétone, à J9 un test de von Frey, à J10 un test de la plaque chaude incrémentée, à J11 le test d’immersion de la queue, à J12 le rotarod et à J13 le test de la formaline.

Impact sur les animaux

La présence de douleur liée à la modélisation de la maladie de Parkinson qui ne peut être soulagée car c'est l'objectif de l'étude. Les lésions dopaminergiques peuvent entrainer une perte de poids d'environ 5% attendue. Ces animaux vont développer des œdèmes inflammatoires (test de la formaline) nécessaires à l'expérimentation qui seront suivis et mesurés quotidiennement (taille de l'œdème, présence d'un érythème, d'une plaie ouverte ou d'une nécrose). Cet œdème sera d’environ 1 cm de diamètre et diminue dans les premières 24h après l’injection pour disparaître complètement 3 jours après maximum. Les animaux subiront des tests comportementaux nociceptifs au nombre de 14 au total (4 tests avant la chirurgie pour l'obtention de valeurs de base, puis 1 test par jour pendant 5 jours et cela 2 semaines).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque à l'issue de la procédure 2.

Remplacement

Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, la caractérisation de la douleur dans la maladie de parkinson nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Un calcul statistique « power analysis » a été réalisé pour définir un nombre d’animaux nécessaire afin d’obtenir des résultats valides au plan statistique (multiple ANOVA) : ce nombre est de 10 animaux par groupe au minimum. Afin de garantir un nombre minimum de 10 animaux par groupe (nombre nécessaire donné par notre calcul statistique de power analyse qui a été réalisé sur la base de nos connaissances techniques et des études antérieures), il est nécessaire d’utiliser un nombre maximum de 20 animaux au total par groupe. En effet, la possibilité d’une mauvaise localisation de la lésion (25% d’erreur environ) et la variabilité comportementale interindividuelle, nous oblige à prévoir un nombre d’animaux 2 fois supérieur à celui attendu au final. La mise au point des sites d’injection a déjà été réalisé sur des études antérieures. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés la procédure expérimentale détaillée ci-après fera partie d’un enchainement et utilisera les mêmes animaux, ce qui en réduira grandement l’effectif.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en animalerie dont la température, l’humidité et le cycle jour/nuit sont contrôlés, nourriture et boisson sont disponibles ad libitum. Ils seront hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Nous travaillerons en cycle jour/nuit (lumière allumée de 8h à 20h). Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont systématiquement utilisées. Les signes de mal-être suivants seront recherchés : perte de poids, blessure ou plaie ouverte, dégradation de l'état du pelage, dos arqué. En cas de signes de souffrance de l’animal, des soins (désinfection, suture de plaie), une administration d’antalgique ou d’anti-inflammatoire, une séparation (blessures entre congénères) seront réalisés après concertation avec le vétérinaire, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux (SBEA) et/ou le personnel zootechnique de l’institut. Enfin, des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la SBEA de l’institut pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Le modèle lésionnel de maladie de Parkinson utilisé dans cette étude a été caractérisé et validé pharmacologiquement chez la souris. De plus, pour de futures études, de nombreuses lignées de souris transgéniques existent et sont disponibles ce qui nous permettra de répondre de façon précise la question des mécanismes physiopathologiques impliqués dans cette comorbidité maladie de Parkinson/douleur. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 6 semaines, poids supérieur à 20g).

318 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un état de mal épileptique est induit par injection de kaïnate et un implant crânien est posé pour l'enregistrement EEG, pour étudier le lien entre crises épileptiques et neurodégénérescence. Le porteur indique que les décharges peuvent provoquer un arrêt cardiaque ou conduire l'animal à se blesser dans 10 % des cas, et prévoit la mise à mort des souris perdant plus de 15 % de leur poids. Il affirme qu'il n'existe "pas de modèle alternatif" pour observer les crises et le déclin cognitif.

Objectifs

L'association entre crise épileptique et neurodégénérescence a été observée en clinique. Malgré ça, à l’heure actuelle, aucune étude n’a intégré des modèles précliniques pour examiner systématiquement comment des crises épileptiques peuvent accélérer des processus de neurdégénérescences et en cours de vieillissement. Dans ce projet, nous allons tester les hypothèses suivantes : i) les crises épileptiques suffisent à déclencher les voies amyloïdes et l’hyper phosphorylation de tau dans le cerveau ; ii) ces effets sont plus sévères au cours du vieillissement. Cette exploration est importante, au vu de l’incidence croissante des épilepsies et des comorbidités neurologiques chez la personne âgée.

Bénéfices attendus

Pouvoir mettre en évidence une corrélation pathophysiologique entre une crise épileptique qui arriverait pendant le vieillissement et le développement de la maladie d'Alzheimer.

Procédures

- Entre 2 et 5 injections intra-péritonéales sur une durée de 2 heures - Une procédure chirurgicale d'une durée de 40 minutes.

Impact sur les animaux

L'induction d'un status epilepticus sur la souris engendre des décharges neuronales fortes. Celles-ci peuvent provoquer un arrêt cardiaque ou entrainer l'animal à se blesser dans la cage (morsure de la langues). Ces effets sont observés dans 10 % des cas. L'injection, si nécessaire, de diazépam entraine une somnolence de l'individu avec absence d'hydratation (comblée par une IP de solution saline stérile) et d'alimentation pendant plusieurs heures. La pose d'un implant crânien pour suivi électroencéphalographique peut entrainer un inconfort temporaire, signe de grattage plus intense au niveau de celui-ci.

Devenir

A la suite de la procédure 1, les animaux seront mise à mort par CO2 car leur utilisation est terminée. Les animaux de la procédure 2 seront mise a mort comme décrit dans la procédure pour prélèvement d'organes.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle alternatif pour observer les crises épileptiques et le déclin cognitif (maladie d'alzheimer) dans leur globalité.

Réduction

Cette étude permettra de faire des analyses en longitudinales sur les animaux d'un an puisque le comportement sera effectué sur les méme animaux que le prélèvement d'organes. De plus, Nous avons prévu de créer une banque d'échantillons à partir des prélèvements qui seront effectués (organes et sang). Elle nous servira à la suite du projet ou encore pour des études préliminaires pour des nouveaux.

Raffinement

Le raffinement passe par le maintien de l'enrichissement dans les cages notamment en cas d'isolement des souris pour les besoins de l'expérience. La socialisation sera de nouveau rendue possible quand les contraintes expérimentales le permettront. Tous les animaux seront surveillés lors de la procédure 1 et un SE supérieur à 2 H entrainera l'injection IP de diazépam à 0.5mg/kg pour stopper les crises et éviter ainsi une surmortalité. Pour la procédure 2 avec chirurgie, une grille de score (ci-joint) sera établie et permettra par exemple de : -procéder à une désinfection en cas de palie ou de suture problématique sous isoflurane, -surveiller le poids de l'animal avec une mise à mort si perte > 15% et apport de nourriture appétente si perte entre 10 et 15%. Pour les enregistrement EEG, une habituation à la contention sera effectuée chaque jour pour minimiser les stress lors des enregistrements.

Choix des espèces

L'espèce souris a été choisi en fonction des modèles nécessaires à l'étude. Un modèle isomorphe est nécessaires. La mise en place d'un modèle épileptique artificiellement induit . La souris répond aux besoins scientifiques et aux règles des 3R. Le fond génétique C57Bl/6 est utilisé dans le modèle car il a pu montrer la meilleure réponse physiopathologique. Le modèle d'épilepsie utilisé ici, induit par injection de kainate est un modèle connu et robuste. Il permet l'étude de la physiopathologie de l'épilepsie. Les animaux utilisés sont des adultes mâles agés de 2 mois, 6 mois et 9 mois. Les souris seront gardées au long court pour les points de prélèvement à 6 mois, 9 mois et 1 an. Nous allons induire une crise épileptique a des stades différents de la vie pour évaluer les conséquences de celle-ci en fonction de l'âge.