Système nerveux
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Imagerie spécifique des propriétés de la myéline par IRM de transfert d’aimantation inhomogène quantitatif (qihMT)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 70
440 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, dont 250 en gravité sévère. Ils servent de modèles de démyélinisation, génétiques ou induits par la cuprizone, passent des examens d'IRM, puis leur système nerveux central est prélevé par perfusion intracardiaque de fixateur suivie de décapitation. Le porteur met au point une technique d'IRM censée être spécifique de la myéline, à valider par comparaison histologique. Les retombées cliniques annoncées restent conditionnées à la réussite du projet.
Objectifs
Introduction : La myélinisation des axones est une composante fondamentale du fonctionnement du système nerveux central (SNC), puisque qu’elle assure d’une part l’isolation axonale et permet d’autre part la propagation efficace du signal électrique le long des fibres nerveuses. Ainsi, pouvoir accéder in vivo à l’intégrité de la myéline permettrait une meilleure compréhension du développement du SNC chez le sujet sain, ainsi qu’une meilleure caractérisation des pathologies neurologiques de la substance blanche (e.g. Sclérose en Plaques). Aucune technique IRM actuelle n’est réellement spécifique de la myéline et plusieurs facteurs confondants limitent ou empêchent les diagnostics précis. Les techniques basées sur le transfert d’aimantation offrent pourtant des potentialités très intéressantes. Récemment, nous avons développé une nouvelle technique dérivée du transfert d’aimantation, le transfert d’aimantation inhomogène (ihMT), dont la sélectivité du signal pour la myéline s'avère remarquable. Les objectifs majeurs de ce projet sont de développer une technique ihMT quantitative (qihMT) et de valider ses métriques quantitatives comme marqueurs spécifiques des différentes propriétés de la myéline (organisation, composition, structure, dynamique) dans des modèles pathologiques (e.g. modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), modèle de démyélinisation cuprizone, modèles de dysmyélinisation) et dans le suivi de la maturation cérébrale.
Bénéfices attendus
En cas de réussite, ce projet aura pour vocation de fournir un outil non-invasif quantitatif dont les métriques seront spécifiques des différentes propriétés de la myéline (structure, composition, fonction). Cet outil permettra un diagnostic in vivo plus précis ainsi qu’une levée des limitations des techniques actuelles. De plus, grâce à la transversalité de l’IRM, le protocole validé sur petit animal pourra être appliqué à l’homme sur la base des résultats obtenus en préclinique.
Procédures
A la fin des analyses IRM, le système nerveux central des animaux controles/modèles (nombre total de 440) sera être prélevé pour analyses histologiques par des techniques de référence d'imagerie de la myéline afin de valider les données qihMT. Le système nerveux central des animaux sera prélevé selon le protocole de perfusion intracardiaque suivant (durée 30 minutes): Administration analgésique Buprénorphine (buprecare, 0.3mg/ml) à la dose de 0.1mg/kg. La buprénorphine aura été préalablement dilué (X20) avec une solution de NaCl 0,9 %. Le volume injecté pour une souris de 25 g est de 160 microlitre. Injection d’euthasol en ip à la dose de 140mg/kg. L’euthasol aura été préalablement dilué (X40) avec une solution de NaCl 0,9 %. Le volume injecté pour une souris de 25 g est de 350 microl (seringue de 0,3 ou 0,5 ml, aiguille de 29 G) L'animal aura sa cage thoracique ouverte en vue d'effectuer une perfusion intracardiaque de 20 ml de PBS - Héparine 100U/ml puis de 50 ml de PFA 4%. A la fin de la perfusion, l'animal sera décapité et son cerveau sera prélevé puis post-fixé dans du PFA 4% à 4°C pendant 24 h.
Impact sur les animaux
Des nuisances temporaires de stress, liées à l'environnement relativement bruyant des IRM est attendu pour tous les animaux lorsqu'ils seront sortis de l'armoire de stabulation pour l'examen IRM (2heures). Une perte de poids temporaire (-5% pendant 1 semaine) due au changement de régime alimentaire est attendu pour les souris du modèle cuprizone.
Devenir
L'issue de chacune des procédures 1-6 cloturera un point particulier du projet global sur l'imagerie quantitative de la myéline. Les 440 animaux nécessaires à l'ensemble des procédures seront donc euthanasiés par perfusion intracardiaque (mise à mort décrite en 3.3.3 et demande de dérogation en 3.3.4) permettant le prélèvement de leur système nerveux central.
Remplacement
La spécificité des métriques quantitatives de la technique qihMT pour la myéline doit être démontrée in vivo afin de valider l'IRM ihMT comme marqueur spécifique utilisable dans des protocoles cliniques. Cette démonstration ne pourra être effectuée que sur la base de mesures réalisées à différents points temporels sur des animaux contrôles et modèles caractérisés d’altération/développement de la myéline. Ces mesures seront ensuite corrélées à des analyses histologiques. Ces aspects ne peuvent être conduits chez le patient du fait de l’impossibilité de réaliser une étude histologique sur un même échantillon préalablement exploré in vivo par IRM. Néanmoins, une stratégie de remplacement sera effectuée. Ainsi, à chaque fois que cela sera possible, notamment lors des ajustements de premier niveau (debuggage des séquences IRM, optimisation, tests...), des fantômes (composés chimiques ayant des caractéristiques similaires à la myéline, e.g. systemes de lipides lamellaires synthétiques) seront utilisés en lieu et place des animaux.
Réduction
Les examens IRM seront réalisés de sorte que plusieurs paramètres IRM puissent être ajustés au cours d’une même session et sur des mêmes animaux. La durée des examens n’excèdera néanmoins pas 2h par animal (durée standard d’investigation multimodale IRM sur petit animal). Un suivi longitudinal par exploration IRM non invasive sera effectué sur tous les modèles investigués, réduisant ainsi de manière drastique le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Le bien-être des animaux est assuré par les animaliers. La stabulation des animaux sera réalisée au sein de notre unité, dans des armoires dédiées à raison de 5 souris / cage et 2 rats / cage pour les animaux contrôles. Après un examen IRM, chaque animal sera placé dans une cage individuelle avec accès facilité à la nourriture/boisson puis replacé dans sa cage une heure après. Les cages de stabulation souris du CRMBM sont dotées d’un environnement enrichi (roues, tunnels... pour la stimulation des animaux). Les procédures expérimentales de chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale (anesthésie volatile Isoflurane 3% dans l’oxygene pur et ventilation assistée ou mélange kétamine (100mg/kg de poids)/xylazine (10mg/kg de poids)) et des analgésiques sont administrés (injection intramusculaire de Buprenorphine, 0.1mg/kg).
Choix des espèces
Justification de l’utilisation de souris : Existence de différents modèles génétiques caractérisés de pathologies affectant la myéline chez la souris : modèles Shiverer et Twitcher (modèles génétiques des leucodystrophies, caractérisées par une dysmyélinisation du SNC résultant d’un déficit en galactocérébrosides pour Twitcher ou en Myelin Base Protein (MBP) pour Shiverer), modèle cuprizone et EAE (miment certains effets de la sclérose en plaques par une démyélinisation locale et par des lésions axonales entrainant un déficit cognitif et une incapacité progressive, et effets inflammatoires). Justification de l’utilisation des rats : L’interêt du rat est de disposer de structures de système nerveux central plus grosses que celles de la souris et donc d’un signal IRM plus conséquent. Investigation possible grace au diamètre plus grand du scanner 7T. L’IRM étant une technique très peu sensible, le critère de rapport signal sur bruit élevé est primordial afin de limiter le temps d’examen. Pour toutes les études (hors maturation cérébrale), les animaux seront âgés de >10 semaines correspondant au début de l’âge adulte afin de s’assurer d’un niveau de maturation du système nerveux central maximal. Pour l’étude de la maturation cérébrale, les animaux seront utilisés à différents stades du développement (de D6, jusqu’à >10 semaines).
Détermination de l’implication du système sympathique dans la sclérose latérale amyotrophique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
212 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cette demande ne couvre que la partie élevage d'un projet sur la sclérose latérale amyotrophique, les animaux ne subissant pas d'intervention active mais développant les altérations motrices de la maladie, suivies par une grille de score. Le porteur indique que le phénotype lui-même est dommageable et surveille de près la moitié des animaux. Le bénéfice avancé est une meilleure compréhension d'une maladie mortelle chez l'humain.
Objectifs
Cette DAP ne couvrira que la partie élevage du projet. La moelle épinière thoracique contient l'essentiel des neurones à l'origine de la commande nerveuse autonome sympathique, un acteur majeur du maintien de l'homeostasie corporelle. Les neurones préganglionnaires sympathiques (SPNs), étage de sortie de la commande sympathique, connectent au sein des ganglions sympathiques les neurones postganglionnaires sympathiques qui à leur tour connectent les organes cibles. Les SPNs sont des neurones cholinergiques qui sont moléculairement extremement proches des neurones qui commandent les muscles striés: les motoneurones (MNs). La sclérose latérale amyotrophique (SLA), troisième maladie neurodegerative après Alzeihmer et Parkinson est caracterisée par la perte des neurones moteurs corticaux et des MNs spinaux conduisant à une atrophie musculaire, à la paralysie progressive des malades et au décès des patients par insuffissance respiratoire. Les causes précises de la degenerescence des MNs sont à ce jour encore inconnues et nous ignorons encore si cette degenerescence est initiée directement au niveau des MNs ou au niveau de son partenaire synaptique: le muscle. Notre hypothèse est que les SPNs sont aussi atteints dans la SLA et participent via un dysfonctionnement du controle vasculaire et nerveux des muscles à la degenerescence des MNs. L' objectif de ce projet est donc de mettre en évidence des altérations précoses (avant l'apparition des symptomes moteurs) de la regulation sympathique sur un modele murin de la SLA, la souris SOD1 G93A.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux comprendre les mécanismes de la SLA. La maladie se déclare à l’âge adulte chez l'humain (40- 80 ans) et va évoluer, en 3 à 5 ans, vers la paralysie complète et le décès du patient par paralysie des muscles respiratoires. Il est donc important pour les patients qu'on avance sur la connaissance de cette maladie (cause, détection de signes précoses, traitements, etc.)
Procédures
Les animaux ne subiront aucune procédure. Seul le phénotype sera dommageable et donc suivi dans le temps grâce à une feuille de scoring. L'ensemble des animaux du projet seront concernés (n=80)
Impact sur les animaux
La mutation portée par les animaux est similaire à celle de l'homme. Ces animaux vont présenter des altérations motrices qui seront surveillées de très près par une équipe compétente (50% des animaux de l'étude)
Devenir
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, des prélèvements de tissus seront faits. Cela permettra de faire des études histologiques et immunohistologiques.
Remplacement
le nombre d'animaux choisit pour l'étude est le minimum nécessaire afin d'obtenir des résultats statistiques fiables. Il est important de ne faire ni trop, ni trop peu afin de ne pas avoir à refaire l'ensemble de l'expérimentation. Ce nombre a été choisit sur la base de d'expériences précedentes du laboratoire et de la bibliographie dans ce domaine. Les tests utilisés seront d'abord un test de normalité afin de savoir si les courbes des données recueillies suivent la loi normale. En fonction, des tests paramétriques ou non seront faits afin de comparer nos lots.
Réduction
Un grand nombre d'expérimentations dans notre laboratoire sont faites ex vivo, sur cellules vivantes. Cela a permis d'obtenir un certain nombre de données en évitant toute souffrance animale. Toutefois, dans certains cas, il est indispensable de travailler dans un système intégré comme un organisme complet. Ainsi, il n'est, dans notre cas, pas possible de reproduire les modifications de commande nerveuse sympathique dans une modèle de maladie, avec uniquement des systèmes ex-vivo. Pour le traitement des données, nous utiliserons des tests ANOVA one and two ways.
Raffinement
Les individus porteurs de la mutation seront suivis régulierement. Un scoring sera fait toutes les semaines à partir de P60 puis tous les 3 jours à partir de P90. Sauf en cas d'avis vétérinaire pour un soin, aucun animal ne sera isolé inutilement afin de préserver le caractère grégaire de la souris.
Choix des espèces
La souris est un modèle dont le génome est parfaitement connu. De plus, un modele murin de la sclérose latérale amyotrophique existe. Le système de reproduction des souris permet d'avoir régulièrement des animaux dans un espace relativement réduit. Enfin le choix de l'espèce est aussi conforme au R de réduire puisque nous avons choisi un modèle mammifère relativement petit. Les mâles reproducteurs seront mis en accouplement dès 7 semaines à la descente des testicules. Les stades de prélèvements sont ceux habituellement utilisés dans la littérature pour l'évaluation de la SLA sur ce modele murin.
Etude des troubles de l’humeur associés à l’obésité : mécanismes neurochimiques
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
470 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent un régime hyperlipidique, une partie subit une chirurgie stéréotaxique implantant une sonde dans le cerveau, un isolement en cage individuelle de trois semaines et des tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé. Le porteur étudie les troubles de l'humeur associés à l'obésité et à l'inflammation, avec des retombées nutritionnelles ou pharmacologiques renvoyées au long terme. Il affirme que le recours au modèle animal reste une "nécessité expérimentale".
Objectifs
Le thème général du projet concerne l'étude des effets nocifs d'une alimentation déséquilibrée sur les troubles de l'humeur. Plus précisément, il s'agit ce caractériser et de comprendre le développement des troubles de l'humeur associés à la consommation chronique d'un régime hypercalorique hyperlipidique chez la souris. Nous nous intéressons particulièrement aux effets de cette alimentation sur l'inflammation dite "de bas bruit" qu'elle va générer, et qui va médier un certain nombre de processus conduisant à la perturbation du fonctionnement des systèmes de neurotransmission monoaminergiques qui peuvent sous-tendre le développement des troubles de l'humeur, jusqu'à la dépression. Si certains effets de l'inflammation dans ces phénomènes sont aujourd'hui décrits, les mécanismes neurochimiques précis mis en jeu ne sont pas encore totalement élucidés. En particulier, leur implication dans le déficit de réponse aux antidépresseurs, dont la proportion est largement plus présente chez les patients dépressifs présentant une inflammation chronique, reste peu étudiée et reste à démontrer.
Bénéfices attendus
Ce travail apportera des données scientifiques utiles pour une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la dépression associée à l’inflammation. Puisque ce projet s’inscrit dans le cadre de recherches translationnelles (c’est-à-dire permettant d’aborder une même question par des approches précliniques et cliniques), il permettra à plus long terme de développer de nouvelles stratégies nutritionnelles et/ou pharmacologiques pour améliorer la réponse thérapeutique et la prise en charge des individus atteints de troubles de l’humeur, en particulier lorsque ces derniers sont associés à un contexte inflammatoire.
Procédures
Des chirurgies seront réalisées sur souris anesthésiées, afin d'insérer dans une région spécifique du cerveau une sonde de dialyse, permettant de receuillir le milieu extracellulaire et d'y doser un neurotransmetteur, la dopamine. Il est prévu un nombre de 120 souris pour cette procédure, qui sera réalisée une seule fois sur chaque animal. Les souris seront soumises à la contention nécessaire à une injection intra-péritonéale (470 souris), 120 souirs seront placées en isolement pendant 3 semaines. Les souris seront soumises à des tests comportementaux (420 souris).
Impact sur les animaux
La prise de poids induite par l'exposition chronique au régime hyperlipidique et les désordres métaboliques associés pourront être cause de nuisance pour les souris. Un comportement anxieux et/ou de type dépressif (modèlisé ici) est atendu chez les souris soumises au régime hyperlipidique et fait l'objet de cette étude. Les douleurs attendues concernent celles liées à la chirurgie stéréotaxique, la contention et l'injection intra-péritonéale et l'isolement en cage individuelle.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures, afin de prélever leur cerveau pour analyses ultérieures.
Remplacement
L'objectif général du projet est de mieux comprendre chez l'animal les ménanismes mis en jeu dans le développement des troubles de l'humeur en condition inflammatoire induite par une exposition chronique à un régime obésogène. Dans ce contexte de recherche, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l'étude des troubles de l'humeur reste une nécessité expérimentale afin d'appréhender la réalité physiologique de nos résultats. La recherche d'alternatives dans des bases de données démontre que les solutions de rechange ne sont pas à ce jour disponibles ou applicables.
Réduction
Les mêmes souris seront sucessivement soumises à plusieurs tests lors de l'évaluation comportementale.Lorsque cela est possible, les mêmes souris seront soumises à plusieurs tests lors de l'évaluation comportementale. De même, un maximum de mesures biologiques (périphériques et cérébrales) sera réalisé sur chaque animal dans la limite de compatibilité entre les différentes techniques. Le nombre minimal de souris pour chaque groupe expérimental est fixé afin d'obtenir une puissance statistique satisfaisante, afin de ne pas répéter la procédure.
Raffinement
A leur arrivée, les souris bénéficient d'une période minimale d'une semaine d'habituation à leur nouvel environnement avant de débuter les expérimentations. En concertation avec la structure Bien-Etre du laboratoire, nous avons défini les meilleurs conditons d'hébergement possibles ainsi que les points limites et d'arret précoces et adaptés. Les souris seront ainsi hébergées par 5 (excepté pour le test comportemental de mesure de fatigue en cage individuelle avec roue d'activité sur une période maximale de 3 semaines), avec présence de différents enrichissements, surveillance quotidienne et soins apportés rapidement si nécessaire. Les protocoles réalisés sur les animaux sont au préalables soumis puis approuvés par l'équipe en charge de l'animalerie afin d'assurer les bonnes conditions d'expérimentation. Pour les procédures invasives et/ou susceptibles de générer une douleur, les soins pré- et pos-opératoires sont appliqués, l'anesthésie, l'analgésie et l'euthanasie sont mises en place de façon appropriée par des expérimentateurs formés et expérimentés. Le nombre d'animaux utilisé est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes évitant la répétition des expériences.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée ici est la souris, dont la petite taille et la facilité de manipulation permet un hébergement facile au sein de l’animalerie du laboratoire, dans le respect des règles d’éthique. Les manipulations nutritionnelles sont également faciles à conduire chez la souris et les expériences de comportement sont faciles à mettre en œuvre et très bien maitrisées au laboratoire qui possède tout l’équipement dédié. Les animaux arriveront au laboratoire à l’âge du sevrage (P21). Ils seront mis immédiatement sous régime contrôle ou hyperlipidique jusqu’à la fin de l’expérience. Toutes les expériences seront ensuite faites à l’âge adulte (après 15 semaines d'exposition au régime).
NEUROCONFLICT: Circuits neuronaux impliqués dans des situations conflictuelles chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
1 950 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de souffrance légère à modérée. Elles reçoivent des injections de cocaïne, des chocs électriques jusqu'à 0,6 mA, des chirurgies stéréotaxiques avec vecteurs viraux et l'implantation de fibres optiques, avant une perfusion intracardiaque, pour étudier les circuits neuronaux du conflit approche-évitement et de la rechute. Le porteur affirme que la cocaïne, l'évitement et la perfusion "n'engendrent ni douleur ni stress" et que le choc choisi reste inférieur aux intensités habituelles. Il conclut à la "nécessité" d'un organisme vivant intègre, qu'aucune technique in vitro ne remplacerait.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’identifier les mécanismes impliqués dans les situations conflictuelles chez la souris, lorsque l'individu hésite entre approche et évitement en condition normale ou sous l'influence de substances psychoactives telles que la cocaïne. Identifier les circuits neuronaux des comportements conflictuels est clé afin d'empêcher le phénomène de rechute. Ce projet se focalise sur des structures cérébrales critiques dans ces deux types de comportement, à savoir l'hippocampe, le noyau paraventriculaire du thalamus ainsi que de leur cible cérébrale commune : le nucleus accumbens. Bien que ces structures aient déjà été impliquées dans les comportements addictifs aux substances psychoactives, il reste à comprendre leur interaction pendant les comportements d'approche, d'évitement, et de rechute chez la souris. Afin d'atteindre l’objectif général, nous réaliserons une étude anatomo-fonctionnelle de ces structures cérébrales à plusieurs moments clés des comportements d'approche ou d'évitement. Ce projet nécessitera ainsi l'utilisation de différentes lignées de souris transgéniques permettant la manipulation et enregistrement de l’activité au sein de ces différents circuits.
Bénéfices attendus
Les expériences proposées amélioreront notre compréhension sur le phénomène de rechute, en examinant comment les informations contenues dans l’environnement peuvent déclencher des comportements inadaptés précipitant la recherche compulsive de cocaïne. Les neurones du noyau accumbens participant à ce circuit en recevant des informations de l'hippocampe et du thalamus paraventriculaire pourraient représenter une cible thérapeutique pour prévenir les rechutes chez les patients atteints d’addiction à la cocaïne, et plus largement aux drogues d’abus.
Procédures
Ce projet implique 3 procédures expérimentales décrites en item 4 Toutes les procédures (1, classe légère, 2 à 3, classe modérée) comprennent le comportement d’évitement (4h sur une journée, les animaux recevront un maximum de 1 injection de substance psychoactive et de saline), un comportement de récompense avec une substance psychoactive ou une solution saline (entre 15 min et 1h par jour, sur 4 jours, les animaux recevront un maximum de 4 injections de la substance psychoactive, et de 4 injections de saline) et la perfusion intracardiaque (7 min). Les procédures 2 et 3 comprennent la chirurgie stéréotaxique pour des injections de vecteurs viraux (45-60 min sous anesthésie générale) et peut comprendre une injection d'un composé chimique ou d'une solution saline (étude pharmacogénétique, CNO). La procédure 3 comprend également une chirurgie stéréotaxique additionnelle pour l’implantation de fibres optiques (1 ou 2 fibres, 60-90 min) pour les études d’optogénétique et de photométrie de fibre.
Impact sur les animaux
Le comportement de récompense à la cocaïne, d’évitement et la perfusion intracardiaque n’engendrent ni douleur ni stress. L'intensité du choc électrique choisie (maximum de 0.6 mA) est inférieure aux intensités de chocs classiquement utilisées dans la littérature (0,7 mA). Les approches de chirurgie stéréotaxique sont des procédures dont la douleur est prise en charge tout le long de l'expérience, via l’usage d’anesthésiques et analgésiques, avant, pendant et après la chirurgie (jusqu’à 8 jours).
Devenir
Notre étude nécessite d’une part de fixer les tissus cérébraux afin d’y réaliser des marquages immunohistochimiques. Ce but expérimental nécessitant la mise en place d’une méthode de mise à mort de perfusion intracardiaque. A l’issue de chaque procédure, les souris recevront une dose d’anesthésique et perfusées avec une solution fixatrice (4% paraformaldéhyde). Ces souris ne seront donc pas impliquées dans une autre procédure.
Remplacement
L’utilisation d'animaux vivants se justifie par la nécessité d’identifier des phénomènes physiologiques complexes au sein des circuits neuronaux impliqués dans le comportement conflictuel chez la souris, ainsi que leur interaction fonctionnelle. De nombreuses structures cérébrales entrent en jeu et communiquent entre elles. Il est donc nécessaire d’étudier un organisme vivant intègre, qui ne peut être remplacé à ce jour par des techniques in vitro. De plus, le niveau de complexité dans une telle étude est si important qu’aucun modèle informatique n’existe à l’heure actuelle pour remplacer l’animal, d’autant que de nombreux mécanismes biologiques sous-tendant les comportements conflictuels restent inconnus.
Réduction
Nous prévoyons d’utiliser un maximum de 1950 souris adultes (mâles et femelles) sur une période de 5 ans (Annexe Chronogramme). Plan d'expériences: Afin de réduire le nombre d’animaux, toutes les souris de chaque groupe serviront aux immunomarquages après la phase de comportement. Statistiques : le nombre d’animaux par groupe a été déterminé en utilisant un calcul de puissance (voir 3.4.10). Pour comparer 2 groupes, nous utiliserons un t-test de Student ou un test non-paramétrique. Pour comparer plus de 2 groupes, nous utiliserons une analyse de variance (ANOVA) à 1 ou 2 facteurs. Dans le cas des mesures répétées (évaluation des performances mnésiques), des ANOVAs à mesures répétées suivies des tests post-hoc adéquats seront utilisés. Les animaux mâles et femelles seront utilisés pour toutes les expériences. L'analyse des données se fera en tenant compte du sexe car dans de nombreux cas le niveau basal dans les tâches comportementales est différent. Ceci nous permettra de plus d'utiliser toutes les souris générées.
Raffinement
Enfin, en vue du raffinement des procédures, un soin particulier est apporté aux questions relatives au bien-être animal. Le manque d’interactions sociales pour les expériences où les souris sont stabulées individuellement est compensé par un enrichissement des cages avec des cylindres de coton permettant de stimuler l’activité naturelle, diminuer le stress et faciliter la thermorégulation. En outre, les cages, transparentes sont rapprochées les unes des autres afin que chaque animal puisse avoir un contact visuel avec ses congénères. Avant chaque procédure expérimentale, les animaux sont manipulés fréquemment afin de les habituer aux expérimentateurs et réduire ainsi leur stress. Enfin, pour les procédures impliquant une neurochirurgie, un protocole d’anesthésie et d’analgésie péri- opératoire est en place afin de garantir la bonne prise en charge de nos animaux. La santé des animaux sera surveillée tout au long de l'expérience et évaluée grâce à une grille codifiant le niveau de bien être (Annexe Points Limites). Cela nous permettra d'intervenir immédiatement et de manière appropriée si un premier signe de souffrance est détecté.
Choix des espèces
La souris représente un modèle de choix pour notre projet par la possibilité d’étudier des individus génétiquement modifiés (la souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux transgéniques, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement) et dont la physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain pour que les informations obtenues soient pertinentes sur un plan médical. Toutes les souris C57Bl6/j arriveront dans notre animalerie expérimentale à l’âge de 11 semaines. Les souris transgéniques seront élevées dans notre animalerie. Les procédures expérimentales débuteront après 1 semaine d’habituation. Il est admis qu’à 12 semaines, la croissance des os est achevée, ce qui facilite les procédures impliquant une chirurgie stéréotaxique (car les points de repère anatomiques se situent sur le crâne). Les souris ne seront plus utilisées au-delà de 10 mois.
Caractérisation d’un modèle de souris des mouvements anormaux liés à la mutation de l’Adenylyl cyclase 5
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 044 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de souffrance légère à modérée. Elles passent les tests comportementaux du rotarod et de l'open-field pendant neuf jours, 864 d'entre elles recevant en plus trois injections intrapéritonéales quotidiennes, pour caractériser un modèle de mouvements anormaux lié à une mutation du gène ADCY5 et tester une molécule. Le porteur décrit un stress possible lié aux injections et au nouvel environnement, ainsi qu'une légère perte de poids. Il présente la souris comme "le modèle le plus utilisé" pour ces maladies du mouvement.
Objectifs
L’objectif général de ce projet est de déterminer le phénotype de ces souris et de caractériser les anomalies de fonction de l’AC5 (gain de fonction ou perte de fonction) consécutives à cette mutation, et les conséquences sur les voies de signalisation dans lesquelles l’AC5 est impliquée. Nous avons choisi de commencer par une évaluation comportementale motrice et une évaluation de l’effet de KW6002 par deux procédures comportant le test de l’open field et du rotarod, qui font l’objet de cette demande.
Bénéfices attendus
Bénéfices tant scientifiques que théreputiques. Mise en évidence des anomalies motrices similaires à celles observées chez les petients et essai d'un traitement potentiel de ces anomalies. Ces découvertes bénéficeront à la caractérisation et compréhension des anomalies moléculaires expliquant les symptômes observés chez les patients et permettront de découvir de nouveaux traitement et d'améliorer la prise en charge des patients qui souffrent d'une maladie rares et orpheline donc nécessitant un effort de recherche pour les soutenir.
Procédures
Pas de prélèvement ni de chirurgie. Tous les animaux décrits dans les procédures N°1 et N°2 (nombre maximum 1044) vont passer des tests comportementaux rotarod et openfield d’une durée totale de 9 jours. Les temps passés sur l’appareil rotarod et dans l’appareil openfield pour chaque animal sont environ 35 min et 10 min respectivement. Les animaux décrits dans la procédure N°2 (nombre maximum 864) recevront des injections intrapéritonéales tous les jours au cours des tests comportementaux d’une durée totale de 9 jours. Chaque animal reçoit 3 injections par jour dont 1 injection avant chaque test openfield et 1 injection avant le test rotarod. Chaque injection dure moins d’une minute
Impact sur les animaux
Les protocoles utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de douleur possible. Les injections intrapéritonéales ainsi que le nouvel environnement dans l’appareil openfield pourraient potentiellement introduire un stress chez certains animaux. Une légère perte du poids (jusquà 1g) pourrait arriver chez certains animaux notamment ceux qui présentent une meilleure capacité motrice durant le test du rotarod. Mais ce phénomène s’arrête quand le test est fini. Les animaux reprennent leur poids très rapidement. Une fatigue liée aux tâches d’apprentissage pourrait apparaître pendant la réalisation de la tâche, mais qui n’induirait qu’un arrêt de la participation à la tâche par l’animal sans conséquence négative pour lui, il sera replacé dans sa cage. Toutes les précautions nécessaires seront prises afin d’éviter le stress. L’animal est manipulé tous les jours pendant deux semaines avant commencer les protocoles. L’animal sera placé aussi dans l’appareil afin d’acclimater. Les expérimentateurs vérifient quotidiennement l’état d’animal notamment les signes du stress
Devenir
A la fin des procédures, il y aura une euthanasie réglementaire pour des analyses biochimiques au niveau cérébrale pour l'étude des anomalies neurobiologiques en lien avec les anomalies.
Remplacement
Notre projet propose de disséquer les bases moléculaires du rôle de la mutation d’ADCY5 dans le contrôle moteur et l’apparition de mouvements anormaux, mettant en jeu différents réseaux neuronaux. Le fonctionnement de ce réseau ne peut, à ce jour, pas être reproduit ni modélisé par des modèles in vitro ou computationnels. Le projet met en jeu des approches intégrées sur animal entier, nécessitant des souris transgéniques et ne peut se faire qu’à l’aide d’études comportementales au niveau de l’animal. Il est donc impossible de remplacer les animaux par un modèle cellulaire pour les tests comportementaux. Les études in vitro et sur les invertébrés ne permettent pas l'étude de comportements tels que les mouvements anormaux et leurs conséquences. Une fois les acteurs moléculaires déterminés, nous étudierons les mécanismes moléculaires à l’aide de modèles de cultures lorsque cela est possible pour limiter le nombre d’animaux utilisés. D’une façon générale, nous nous efforçons continuellement d’évaluer nos approches et adapter nos expériences pour des modèles in vitro ou computationnels autant que possible.
Réduction
Concernant la réduction, des expériences précédentes nous ont permis de définir le nombre minimal d'animaux permettant de générer des données statistiquement solides. Le nombre total d’animaux est de 1044 au maximum. Quand cela sera possible et afin de réduire leur nombre, les mêmes animaux sont utilisés dans les deux tests comportementaux rotarod et openfield. – Nos connaissances sur le modèle étudié, notamment sur les potentielles doses fonctionnelles de KW6002, nous permettront de limiter le nombre de doses à essayer et d’animaux nécessaires pour générer des résultats statistiquement robustes.
Raffinement
Concernant le raffinement, pour toute cette étude, les conditions d’hébergement et les protocoles expérimentaux utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de douleur et d’inconfort possible. Pendant les procédures, les animaux seront observés et manipulés quotidiennement et une pesée sera effectuée tous les 7-10 jours. Les animaux seront hébergés en groupe de 2 à 5 animaux, dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne nocturne de 12h. L’eau, la nourriture seront fournies ad libitum, un carré de coton pour nidifier est placé dans chacune des cages de manière à offrir aux animaux un enrichissement. Ils feront l’objet d’un contrôle quotidien. L’évaluation de la douleur et de la détresse est réalisée en observant l’aspect des souris et leur comportement. Les points limites seront pour l’apparence et la posture : poil ébouriffé, perte excessive de poils, blessure cutanée, automutilation, dos courbé, yeux enfoncés, couché sur le côté, hypothermie. Pour les comportements anormaux ces points limites seront : agressivité soudaine, abattement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, apathie, prostration, diminution de l’appétit et amaigrissement, changement des périodes de sommeil, réduction de la mobilité. Ces contrôles seront enregistrés et doivent permettre de repérer tout animal malade ou blessé et de prendre les mesures appropriées. Le cas échéant, des méthodes seront mises en place pour réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux (injection d’antalgiques) si trouble mineur ou passage, ou bien mise à mort règlementaire par CO2. Les mutations dans les lignées transgéniques envisagées ne sont pas dommageables pour l’état de santé de l’animal.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus utilisé pour les maladies du mouvement proche de celle de l’homme. La souris est un modèle reconnu d’étude du mouvement, notamment car elles ont des mouvements coordonnés des pattes pour des comportements moteurs élaborés et sont déjà utilisées dans des modèles de mouvements anormaux, particulièrement pertinents dans l’étude de la pathologie étudiée ici. Dans nos études, les souris transgéniques portent la même mutation que chez les patients. Les animaux utilisés seront adultes âgés au-delà de 8 semaines. Cette partie du projet s’intéresse à la cause et les traitements des mouvements anormaux liés aux mutations du gène ADCY5, exprimés dans un organisme mature, à l’âge adulte, en prenant en compte la variabilité individuelle et le sexe. Afin de ne pas interagir avec les phénomènes développementaux, nous utiliserons donc uniquement des animaux adultes
Identification et manipulation des réseaux neuronaux encodant pour la valeur, la valence et la prépondérance des émotions de peur chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 536 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié dans des procédures de souffrance modérée et l'autre moitié sévère. Chaque animal subit deux chirurgies cérébrales puis une perfusion intracardiaque et un prélèvement du cerveau, pour cartographier les circuits neuronaux de la peur au moyen d'outils comportementaux, électrophysiologiques et optogénétiques. Le porteur déclare pourtant "aucun" effet indésirable attendu, alors que 768 souris sont classées en souffrance sévère. Il conclut qu'il "n'existe pas de méthode alternative", une culture cellulaire ne contenant pas les connexions neuronales étudiées.
Objectifs
L’objectif principal de ce protocole est double. Premièrement, développer et valider un protocole de comportement chez la souris libre de ses mouvements pour distinguer les termes de valeur, de valence et de la prépondérance. Deuxièmement, l’identification et la manipulation des réseaux neuronaux qui encodent les signaux mentionnés ci- dessus. Ces objectifs seront atteints en utilisant une combinaison d’outils comportementaux, électrophysiologiques, pharmacologiques et optogénétiques.
Bénéfices attendus
Le développement d’un protocole pour dissocier simultanément la valeur, la valence et la prépondérance nous permettra d’étudier comment les réseaux neuronaux dédiés encodent ces différents signaux. Cela nous permettra de développer de nouvelles cibles thérapeutiques pour des pathologies telles que l’anxiété ou le trouble de stress post-traumatique où la prise de décision de ces signaux est souvent inadaptée.
Procédures
Opérations chirurgicales : tous les animaux sont soumis à deux procédures chirurgicales Prélèvements de tissus : touds les animaux sont soulmisd au prélèvement du cerveau après perfusion intracardiaque à la fin de l'expérimentation
Impact sur les animaux
aucun
Devenir
Euthanaise de l'ensemble des animaux à la fin de la procédure expérimentale afin de prélever le cerveau
Remplacement
L'identification et la manipulation des circuits impliqués dans l’encodage de valence, valeur et prépondérance de signaux de peur nécessitent l'utilisation d'un cerveau intact chez l'animal vigile. De plus, des méthodes telles que la culture cellulaire ou bien les coupes de cerveau ne contiennent pas les connections neuronales qui sont le sujet de nos travaux. Il n'existe donc pas de méthodes alternatives.
Réduction
le nombre d’animaux a été calculé par l’estimation de la variance observée avec ce type de données permettant d’atteindre une signification statistique. Ce nombre est de 15 souris par groupe mais par expérience 8 animaux par groupe sont suffisant et seront utilisés, soit un total de 1536 animaux pour la réalisation de ce protocole.
Raffinement
afin de réduire au minimum la souffrance des animaux, nous appliquons systématiquement un traitement antalgique avant et trois jours suivant les actes chirurgicaux qui sont réalisées sous anesthésie gazeuse. L’évaluation du poids de l’animal est effectuée de façon journalière à partir du moment où il est isolé en cage individuelle et rentre dans la phase expérimentale. Ces mesures ont lieu lors de la manipulation journalière des animaux en même temps que la vérification de l’état général de l’animal. Ces mesures sont consignées dans un cahier d’expérience prévu à cet effet. Pour identifier les dommages et contraintes subis par l’animal, nous avons définis des points limites au nombre de 5. Ces cinq aspects évalués au cours de nos expériences nous aident à déterminer un point final à l’expérimentation. Chaque critère est évalué de 0 à 3 et si un critère obtient le score maximal, ceci induit un arrêt immédiat de l’expérience. Sur la base des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et les zootechniciens seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez les souris.
Choix des espèces
La souris est un bon modèle pour les études comportementales. Son utilisation est généralisée dans le domaine des neurosciences et en particulier pour l’étude des circuits neuronaux impliqués dans le comportement de peur. De plus, nous utilisons ici des modèles transgéniques divers ce qui présente un intérêt scientifique fort. Les animaux seront utilisés entre 2 et 6 mois post natal fin de permettre une comparaison avec des résultats précédemment publiés.
Rôle du cortex insulaire dans l’effet protecteur d’un traitement à la progestérone sur la rechute à la cocaïne
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
5 184 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à l'auto-administration de cocaïne, à des chirurgies cérébrales, à des prélèvements vaginaux quotidiens chez les femelles et à un stress pharmacologique à la yohimbine, pour étudier l'effet de la progestérone sur la rechute. Le porteur décrit une perte de poids et une hyperactivité après la cocaïne, ainsi que des effets de la yohimbine comparables à ceux observés chez l'humain. Les retombées thérapeutiques contre la rechute sont renvoyées au "long terme".
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont triples : - Premièrement, tester l’effet d’un traitement à la progestérone sur les tests comportementaux de rechute induite par l’exposition aux signaux associés à la cocaïne, par l’injection de la cocaïne ou par un stress - Deuxièmement, l’identification le rôle causal des neurones de l’insula exprimant les PR sur la rechute à la cocaïne - Troisièmement, déterminer comment l’activité des neurones PR de l’insula est modifiée par le traitement à la progestérone sur la rechute à la cocaïne
Bénéfices attendus
Ce projet sera une caractérisation unique de l'effet de la progestérone sur l'activité des neurones exprimant les récepteurs à la progestérone (PR) du cortex insulaire pendant la rechute de cocaïne. Nous pourrons ainsi élucider le rôle causal de cette population neuronale dans la rechute à la cocaïne, et démontrer l’effet protecteur de la progestérone dans la rechute chez les animaux mâles et femelles. A long terme, ce projet a le potentiel d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques applicables à l’humain (homme et femme) pour prévenir la rechute à la cocaïne grâce à un traitement à la progestérone.
Procédures
Chez les femelles, le cycle hormonal sera suivi par un prélèvement vaginal quotidien commençant une semaine avant le test de rechute et cela pendant 5 jours, ainsi qu’un prélèvement avant chaque test de rechute amenant à un total de 7 prélèvements par souris. Les échantillons seront collectés à l'aide de pointes de coton stériles humidifiées avec du sérum physiologique stérile. Un coton-tige par souris sera inséré dans l'orifice vaginal avec une pénétration peu profonde, tourné à 360 degrés et retiré. Un prélèvement ne dure au maximum 10 secondes par animal. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale, avec injection d’anti-inflammatoires et ajout d’anesthésiants locaux sur la zone d’incision. L’acte chirurgical sera effectué dans des conditions de propreté maximales. Des antibiotiques et analgésiques seront administrés en cas d’infection ou de douleur post-opératoire.
Impact sur les animaux
La prise de cocaïne peut engendrer une perte de poids lors dès les premières prises, mais cette perte n’excède pas 3 ou 4 jours à l’issus desquels les animaux retrouvent leur poids initial. La cocaïne peut également engendrer une hyperactivitée des animaux qui disparaît au bout d’1 heure après la fin de la prise de drogue. Les effets toxiques de la yohimbine sont similaires à ceux observés chez l'homme. L'hypertension, la tachycardie, la stimulation du système nerveux central et l'antidiurèse peuvent se produire (A. Garrard, dans Encyclopedia of Toxicology (Third Edition), 2014). Néanmoins en injection aigu à la concentration utilisée les effets indésirables restent minimes mais nous contrôlerons l’était général des animaux pendant 24 heures après l’injection.
Devenir
Tous les animaux seront sacrifiés à la fin de chaque procédure afin de procéder à des analyses sur les tissus cérébraux.
Remplacement
Le projet porte sur une analyse de la connexion des neurones et de leurs propriétés de transmission d’informations au cours du comportement. Par conséquent cette procédure doit être effectuée chez des animaux vivants. L’étude de ces phénomènes n’est donc pas possible sur des cellules isolées, car elles ne permettent pas la quantification des connections neuronales ou la mesure de l’activité en réponse à une stimulation sensorielle.
Réduction
Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux afin d’obtenir une analyse fiable (le nombre d’animaux estimé permet d’effectuer des tests statistiques) et complète de la connectivité et de l’activité de la région cérébrale d’étude. Nous utiliserons ainsi 5184 animaux sur cinq ans.
Raffinement
La majorité des animaux seront hébergés en cages collectives, afin de limiter le stress dû à l’isolement. Nous avons réduit au strict minimum les animaux hébergés individuellement pour des raisons expérimentales (endommagement du matériel implanté pouvant mettre en péril la santé de l’animal si arraché par un congénère). Les cages seront également enrichies en nids en coton. Une surveillance particulière sera adressée aux animaux en période péri-opératoire. L’acte chirurgical sera effectué dans des conditions de propreté maximales. En cas d’infection, le vétérinaire référent sera sollicité pour mettre en place un traitement antibiotique approprié.
Choix des espèces
Des souris génétiquement standards (C57Bl6/J) seront utilisées afin de caractériser leur comportement lors des procédures d’auto-administration de cocaïne, de rechute et d’enregistrement de l’activité neuronale. Des souris génétiquement modifiées (PR-IRES-Cre) seront également utilisées lorsque nous étudierons une population neuronale spécifique (exprimant les récepteurs à la progesterone) afin de cibler, lors de l’étude du role causal, uniquement ces neurones d’intérêt. De plus, il a été démontré que le comportement des animaux peut varier entre les souches génétiquement modifiées ou standards. Ainsi, nous utiliserons également des souris PR-IRES-Cre pour des études comportementales afin de comparer leur comportement avec les souris génétiquement standard. Tous les animaux utilisés seront adultes (10 semaines) afin d’étudier des populations et des circuits neuronaux matures.
Monitoring permanent du volume sanguin cérébral via un dispositif doppler implantable ultrasensible chez le porc
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
12 porcs vont être utilisés dans une procédure unique menée sous anesthésie générale, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque animal subit une trépanation du crâne pour y insérer une sonde Doppler, puis la formation provoquée d'un caillot sur la carotide par application de chlorure de fer et compression manuelle, l'ensemble durant jusqu'à six heures d'anesthésie. Le projet vise à valider un dispositif de mesure continue du flux sanguin cérébral, présenté comme "unique et idéal" pour de futurs patients. Sur le remplacement, le porteur se borne à affirmer que les procédures ont un "caractère de stricte nécessité" et ne peuvent être remplacées, sans autre argument.
Objectifs
Le Doppler ultrasensible (Ultrasensitive Doppler UD) est une technique d'imagerie échographique récente qui permet une évaluation fiable et continue du flux sanguin. Son utilisation transcranienne chez l'adulte est fortement limitée par l'épaisseur du crâne. Alors le UD peut être utilisé comme outil raisonnablement invasive : une sonde placée dans un dispositif implantable lequel est inséré dans le trou de trépan destiné aux autres outils de mesure déjà utilisés en clinique (ImplantableUD, IUD). Ce dispositif implantable sera équipé d'un système de motorisation (motorizedIUD, mIUD). Ainsi différents plans d'imagerie seraient obtenus afin de mesurer le VSC, mais aussi la vitesse du flux sanguin et le calibre des artères, sur de larges zones du cerveau. Il fournirait donc une mesure continue de l'hémodynamique cérébrale et constituerait une technique unique et idéale de monitoring pour ces patients. Les soins donnés pourraient être parfaitement adaptés à l'état du cerveau ce qui en retour diminuerait le risque de décès et d'handicaps neurologiques sévères.
Bénéfices attendus
Le Doppler ultrasensible (Ultrasensitive Doppler UD) est une technique d'imagerie échographique récente qui permet une évaluation fiable et continue du flux sanguin. Son utilisation transcranienne chez l'adulte est fortement limitée par l'épaisseur du crâne. Alors le UD peut être utilisé comme outil raisonnablement invasive : une sonde placée dans un dispositif implantable lequel est inséré dans le trou de trépan destiné aux autres outils de mesure déjà utilisés en clinique (ImplantableUD, IUD). Ce dispositif implantable sera équipé d'un système de motorisation (motorizedIUD, mIUD). Ainsi différents plans d'imagerie seraient obtenus afin de mesurer le VSC, mais aussi la vitesse du flux sanguin et le calibre des artères, sur de larges zones du cerveau. Il fournirait donc une mesure continue de l'hémodynamique cérébrale et constituerait une technique unique et idéale de monitoring pour ces patients. Les soins donnés pourraient être parfaitement adaptés à l'état du cerveau ce qui en retour diminuerait le risque de décès et d'handicaps neurologiques sévères.
Procédures
Temps 1 : sédation au box, installation en salle de chirurgie, anesthésie générale et intubation avec anestésie locale et analgésie. Perfusion IV, maintient température Temps 2 : chirurgie : incision scalp 5 cm, 1 trou de trepan (diamètre 14mm), positionnement de la sonde tenue sur un bras mécanique Temps 3 : TDM de perf avec mesure concomitante du VSC par le doppler implantable Temps 4 : 10 minutes d’Hyperventilation. Gaz du sang. TDM de perf avec mesure concomitante du VSC par le doppler implantable. Temps 5 : Retour a une ventilation normale. GDS. Injection IV de Diamox. TDM de perf avec mesure concomitante du VSC par le doppler implantable. Temps 6 : incision cervicale. Application de FeCl pour formation de thrombus et faire emboliser en faisant un stress mécanique sur l'artère avec les doigts sur la carotide avec mesure concomitante du VSC par le doppler implantable. Puis TDM de perf avec mesure concomitante du VSC par le doppler implantable. Temps 7 : mise à mort avec mesure concomitante du VSC par le doppler implantable.
Impact sur les animaux
Une unique procédure sans réveil sera suivie sous anesthésie générale. L’analgésie visant à éviter la gêne occasionnée est assurée par l’injection systématique d’une analgésie adéquate au type de procédure.
Devenir
Dans un souci de raffinement, le long de l’expérience, les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux. A l'issu de la procédure chirurgicale les animaux ne pourraient récupérer leur état physiologique respectant leur bien-être, la mise à mort est donc nécessaire.
Remplacement
Afin de respecter la règle des trois R, les procédures expérimentales prévues dans le cadre de cette recherche ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum, selon les calculs d’effectifs effectués en s’appuyant sur des études précédentes, et des tests statistiques appropriés seront utilisés afin de mettre en évidence les résultats attendus. Nous estimons maximum 12 porcs nécessaires à l’étude. Sur la base de la littérature, le nombre d’animaux à utiliser a été établi à 12 animaux au total que nous utiliserons en deux campagnes de manipes. Cependant, dans un souci de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, des analyses intermédiaires seront réalisées après l’exploration des 2 premiers animaux, de façon à arrêter l’étude prématurément si les résultats significatifs sont avérés avec un effectif plus faible : il est envisagé d’arrêter les expériences avant, si possible avec 4 animaux ou 6 animaux.
Raffinement
Dans un souci de raffinement, le long de l’expérience, les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux. La procédure menée dans ce projet se réalisera sous anesthésie générale avec ventilation assistée et contrôle des paramètres physiologiques. Elle inclut une phase de préparation et chirurgie puis une phase d’imagerie. Nous estimons une durée de 6h d’anesthésie maximum pour l’intégralité de la procédure.
Choix des espèces
Le porc est un modèle couramment utilisé pour l’implantation de prothèses. Son poids et caractéristiques physiologiques sont similaires à l’homme. Les modèles de pathologies cérébrales sont développés chez les rongeurs couramment mais l’anatomie et la physiologie vasculaire du porc est plus proche de celle de l’Homme. En effet, les résultats d’une étude chez le porc apportent des informations plus probantes pour une utilisation ultérieure en clinique chez l’Homme, notamment pour les pathologies cérébrovasculaires. Pour ces raisons, nous avons choisi le porc comme modèle d’étude. Sur la base de la littérature, le nombre d’animaux à utiliser a été établi à 12 animaux au total pour les deux groupes. Cependant, dans un souci de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, des analyses intermédiaires seront réalisées après l’exploration des 2 premiers animaux, de façon à arrêter l’étude prématurément si les résultats significatifs sont avérés avec un effectif plus faible : il est envisagé d’arrêter les expériences avant, si possible avec 4 animaux par groupe.
Effet de la lumière sur le rythme circadien chez un vertébré diurne, le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
2 040 poissons zèbres, utilisés au stade larvaire, vont être tués à l'issue, dans des procédures classées de souffrance légère. Les larves transgéniques sont traitées au métronidazole pour détruire des populations de neurones photorécepteurs, puis leur activité locomotrice est filmée avant mise à mort et génotypage, afin d'étudier l'effet de la lumière sur le rythme circadien. Le porteur note que la mesure d'activité renseigne aussi sur l'anxiété des larves, une larve anxieuse restant davantage sur les bords du puits. Il justifie le choix du poisson zèbre par son caractère de vertébré diurne, jugé "plus pertinent" que les rongeurs pour cette question.
Objectifs
Notre équipe s’intéresse à comprendre quelles sont les structures controlant l’entrainement du rythme circadien par la lumière en utilisant le poisson zèbre Danio Rerio comme organisme modèle. La recherche de notre équipe focalise sur différentes structures d’intérêt en particulier la glande pinéale et l’hypothalamus et sur une famille de gènes codant pour des photopigments de la classe des mélanopsines. Ce projet consiste en la réalisation de mesures d’activité locomotrice sur larves sauvages ou dans lesquelles l’activité neuronale de photorécepteurs spécifiques a été abolie soit en éliminant ces populations neuronales, soit en invalidant leur activité synaptique. Ces larves sont âgées au maximum de 9 jours.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comprendre comment la lumière agit sur le rythme circadien chez un vertébré diurne.
Procédures
Les larves transgéniques sont traitées au métronidazole durant deux jours (jour 2 et 3), changées de milieu (eau) puis leur activité locomotrice est filmée en plaque 96 puits. Elles sont ensuite mises à mort et génotypées.
Impact sur les animaux
Le traitement au métronidazole et la mesure d'activité locomotrice n'induisent pas d'effet indésirable connu alors que ces techniques sont largement utilisées. Pour ce qui concerne les larves génétiquement modifiées (transgènes donnant de l'expression de la nitroreductase : nfsB-mCherry), un effet n'est attendu qu'une fois le metronidazole ajouté au milieu. De plus, après traitement au métronidazole, l'expression des transgènes ne devrait induire ni malformation ni létalité mais pourrait modifier le comportement des larves (activité, humeur...). De manière intéressante, la mesure d'activité locomotrice permet directement d'évaluer le niveau d'anxiété de l'animal. Une larve anxieuse passera en effet plus de temps sur les bords du puit qu'une larve normale (thigmotaxie). Le projet inclus une analyse pilote de ce paramètre après le traitement au métronidazole, ce qui nous permettra de décider d'une éventuelle réduction du nombre d'animaux utilisés s'il s'avérait qu'un des transgènes induisait une anxiété voire un changement de stratégie (voir paragraphe raffinement).
Devenir
Les larves sont génotypées après les expériences. Certains adultes transgéniques peuvent être mis à mort selon la procédure réglementaire effectuée par une personne habilitée à effectuer cette tache.
Remplacement
Notre projet utilise des larves plutôt que des adultes.Le produit du gène nfsB-mCherry nécessite l’addition du métronidazole pour être actif. Ainsi les adultes porteurs ne seront pas traités et ne subiront donc pas d’effets.
Réduction
L'équipe s'intéresse uniquement au comportement des larves. Par conséquent, les poissons adultes gardés au laboratoire sont consacrés uniquement à la reproduction et ne sont soumis à aucune expérimentation. Le nombre d'individus hébergés correspond au nombre minimal nécessaire au maintien des lignées et à la production d’oeufs nécessaires à notre expérimentation. Nous prenons soin de faire évoluer nos protocoles expérimentaux afin de réduire le nombre d’individus hébergés dans l’animalerie. Notamment, le fait d’analyser 96 larves simultanément et durant quatre jours permet de réduire le nombre de fondateurs nécessaires pour nos analyses. Les nombres de larves utilisées correspondent aux standards utilisés dans des études similaires. Nous utilisons des transgènes permettant une occurrence plus forte de larves tests que des mutations récessives (occurrence de ½ plutôt que ¼). De plus, si au cours de l’étude nous nous apercevons que nous pouvons obtenir des résultats statistiquement significatifs avec moins d’animaux, nous n’utiliserons que le nombre minimal d’animaux statistiquement nécessaire.
Raffinement
Nous avons prévu d’utiliser le gène nfsB-mCherry pour induire la mort de populations neuronales spécifiques. Si nous observons des effets génants (stress, anxiété) chez les larves modèles au cours des expériences pilotes mesurant la thigmotaxie, nous envisagerons d’utiliser le gène codant pour la toxine botulique qui empêchera l’activité synaptique des neurones cibles. Afin d’éviter que les adultes porteurs soient affectés, nous utiliserons un système de deux transgènes, l’un permettant l’expression de l’activateur transcriptionnel Gal4 et l’autre permettant l’expression de la toxine botulique sous un promoteur UAS. Ce système n'a pas été choisi en première instance car il nécessite plus d'animaux.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un vertébré diurne donc plus pertinent à étudier que les rongeurs pour les questions de rythme circadien. C'est un modèle reconnu pour l'étude du comportement animal. Les larves sont traitées à jour 2 et 3 avec le métronidazole de manière à pouvoir laisser du temps pour l'entrainement circadien. Les mesures d'activité locomotrice sont effectuées à partir du jour 6 pour trois ou quatre cycles selon les expériences. Les larves de zebrafish ont une activité locomotrice rythmique à partir du cinquième jour. L'étude à partir de jour 6 permet d'avoir un jour complet pour que les larves s'habituent à la plaque.
Signalisation du Récepteur mGlu2 dans le Cerveau de Souris. Altérations dans des Modèles Précliniques de Schizophrénie et Interférences entre Antipsychotiques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections quotidiennes de PCP pendant dix jours pour reproduire un modèle de schizophrénie, puis des injections de petites molécules et des tests comportementaux légers, avant le prélèvement du cerveau. Le porteur indique que le PCP diminue l'appétit et les interactions sociales, cette baisse d'interaction étant précisément le paramètre mesuré. Il affirme que le recours à la souris est "guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques" et que l'expérimentation humaine "ne peut atteindre ce niveau de résolution".
Objectifs
La schizophrénie touche 1% de la population. Les traitements actuels en contrôlent mal les symptômes et ont de lourds effets secondaires. Des activateurs du récepteur mGlu2 du glutamate sont actuellement en étude clinique mais les premières molécules ont échoué du fait d’une interférence avec les antipsychotiques atypiques actuels. Si les molécules mGlu2 restent de bons candidats pour un traitement de première intention, cela amène d’importantes questions. Ce projet cherche à 1) décrypter la signalisation du récepteur mGlu2 dans le cerveau avec l’espoir de trouver de nouveaux régulateurs / effecteurs, 2) caractériser l’altération de ces nouveaux régulateurs et effecteurs dans des modèles précliniques établis de la schizophrénie, 3) déterminer l’impact des antipsychotiques actuels sur ces nouveaux effecteurs et régulateurs pour comprendre l’interférence entre les deux classes d’antipsychotiques 4) déterminer l’importance des nouveaux régulateurs et effecteurs dans la capacité du récepteur mGlu2 à reverser des déficits comportementaux de modèles précliniques de schizophrénie.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait apporter une meilleure compréhension du mode d’action d’une nouvelle génération prometteuse d’antipsychotiques et de son interférence avec les antipsychotiques atypiques actuellement utilisés.
Procédures
Des animaux vigiles recevront des injections sous cutanées de PCP (1 injection par jour pendant 10 jours), des injections intrapéritonéales de petites molécules (1 injection qui met 30 min à agir) et soit seront sacrifiés pour prélévements biochimiques/immunofluorescence soit passeront des tests comportementaux de classe légère (2 jours pour l'ensemble des tests).
Impact sur les animaux
Les lignées KO 5-HT2A , KO mGlu2 et le modèle chimique PCP ont des phénotypes non dommageables. D'anciennes publications sur le modèle PCP décrivent une diminution d'appétit et une diminution d'interaction sociale. La diminution d'interaction sociale est justement l'un des paramètres que l'on cherche à mesurer dans le modèle PCP et qui est réversé par les antipsychotiques glutamatergiques. Contrairement aux publications initiales, les dernières publications sur le modèle PCP subchronique (doi.org/10.1016/j.pbb.2018.09.007) et le suivi de poids lors de notre dernier projet (1316-7251_iExplore-RAM-O1-F-003) ne montrent pas de variation de poids par rapport aux souris Véhicule. Dans nos mains le modèle PCP n'a jamais atteint les points limites que nous continuerons de surveiller. Les manipulations envisagées ne présentent pas de douleur d'un niveau supérieure à une piqure d'aiguille et nous ne devrions pas avoir besoin de recourir à des antalgiques/analgésiques. Le PCP injecté aux animaux a lui même été initialement développé comme un analgésique. Comme l'injection répétée de PCP induit une diminution de l'interaction sociale et de l'appétit nous la classons comme modérée.
Devenir
procédure 1: tous les animaux de cette procédure seront mis à mort pour le prélèvement du cerveau nécessaire aux analyses biochimiques et protéomiques. procédure 2: tous les animaux de cette procédure seront mis à mort pour le prélèvement du cerveau nécessaire aux analyses par immunofluorescence. procédure 3: tous les animaux de cette procédure seront mis à mort pour prélèvements biochimiques pour réutilisation possible dans d'autres projets.
Remplacement
Comme il est impossible de rendre compte de l’hétérogénéité et de la complexité du cerveau et de la circuiterie neuronale dans des cultures cellulaires, nous aurons recours à des modèles animaux pour étudier in vivo la réponse biochimique aux antipsychotiques. Ces analyses biochimiques impliquant le prélèvement du cerveau, elles sont impossibles directement chez l’homme. Les réponses comportementales aux antipsychotiques ne peuvent être mesurées que sur l’organisme conscient, excluant un travail sur cultures cellulaires. Le modèle souris est particulièrement adapté au projet car il est un standard dans la mesure de l’action des antipsychotiques toutes générations confondues avec des tests comportementaux bien établis pour cette espèce, ce qui limitera les mises au point et donc le nombre d’animaux utilisés. De nombreux modèles génétiques et de nombreux outils moléculaires sont disponibles pour la souris et permettront de visualiser ou de cibler spécifiquement des mécanismes cellulaires ou des protéines. L’expérimentation humaine ne peut atteindre ce niveau de résolution. Enfin, l'état actuel des connaissances ne permet pas une modélisation informatique des phénomènes cérébraux impliqués dans l’action des antipsychotiques. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques.
Réduction
Nos principales grilles de lecture sont la protéomique, l'immunofluorescence et les tests comportementaux. La protéomique permet de caractériser et quantifier en relatif des milliers de protéines en une seule expérience. L'immunofluorescence permet de réaliser une multitude de combinaisons de marqueurs à partir d'un animal. Le modèle PCP décrit dans la saisine est un modèle d’étude privilégié du fait de sa robustesse dans l’établissement du phénotype « schizophrénie » (100 % des individus) et de la réponse aux antipsychotiques. Nos méthodes statistiques concernant des données de protéomique (significance B), de biochimie et d’immunofluorescence (Anova) ont déjà été éprouvées et publiées à maintes reprises par nous et/ou des collègues du domaine.
Raffinement
Les manipulations envisagées ne présentent pas de douleur d'un niveau supérieur à une piqure d'aiguille et nous ne devrions pas avoir besoin de recourir à des antalgiques/analgésiques. Le PCP injecté aux animaux a lui même été initialement développé comme un analgésique. Avant les premières injections les souris seront habituées à la manipulation quotidiennement pendant 1 semaine pour effacer les stress de transport et de manipulation. Les lignées choisies et le modèle chimique PCP ont un phénotype non dommageable. La répétition des injections sous cutanées journalières au même point pouvant entrainer une inflammation et une gêne pour l'animal nous déplacerons chaque jour le point d'injection sous cutanée. Pour les souris prétraitées en IP journalières, les injections seront décalées chaque jour de bas en haut du ventre de l'animal coté droit pour ne pas risquer de percer la vessie ou le caecum. Les animaux pour les expériences de comportement (procédure 3) passeront l'ensemble des tests comportementaux du moins stressant au plus stressant. Les souris sont hébergées en groupes de 4 à l'intérieur desquels elles ne reçoivent pas les mêmes traitements, ce qui élimine le stress d'isolement et la propagation de la douleur sociale. Les cages présentent un enrichissement intermédiaire (petite maison, alvéole de boite à oeufs et serpentin en carton) qui stimule l'activité et limite l'agressivité. la fréquence d'observation est assurée, au minimum une fois par jour, par les animaliers de la zone d'expérimentation animale et par le chercheur (qui se rend chaque jour dans la zone d'expérimentation animale pour ce traitement et/ou pour d'autres expériences). Notre projet pour 5 ans impliquant une équipe de 3 personnes nécessitera 1120 souris issues de plusieurs lignées spécifiques déjà élevées dans nos animaleries. Les procédures décrites dans ce document ne nécessiteront aucune mise au point et sont standards dans l’étude de la réponse aux antipsychotiques.
Choix des espèces
Comme il est impossible de rendre compte de l’hétérogénéité et de la complexité du cerveau et de la circuiterie neuronale dans des cultures cellulaires, nous aurons recours à des modèles animaux pour étudier in vivo la réponse biochimique aux antipsychotiques. Ces analyses biochimiques impliquant le prélèvement du cerveau, elles sont impossibles directement chez l’Homme. Les réponses comportementales aux antipsychotiques ne peuvent être mesurées que sur l’organisme conscient, excluant un travail sur cultures cellulaires. Le modèle souris est particulièrement adapté au projet car il est un standard dans la mesure de l’action des antipsychotiques toutes générations confondues avec des tests comportementaux bien établis pour cette espèce, ce qui limitera les mises au point et donc le nombre d’animaux utilisés. De nombreux modèles génétiques et de nombreux outils moléculaires sont disponibles pour la souris et permettront de visualiser ou de cibler spécifiquement des mécanismes cellulaires ou des protéines. L’expérimentation humaine ne peut atteindre ce niveau de résolution. Enfin, l'état actuel des connaissances ne permet pas une modélisation informatique des phénomènes cérébraux impliqués dans l’action des antipsychotiques. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques.
Étude et manipulation du corépresseur transcriptionnel Sin3A dans les processus de la mémoire à long-terme chez la souris C57BL/6 adulte et âgée
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
312 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections intracérébrales de virus AAV et de shRNA, puis passent une batterie de tests comportementaux (open-field, labyrinthe en croix surélevé, conditionnement à la peur) avant une perfusion intracardiaque, pour étudier le rôle de la protéine Sin3A dans la mémoire de la souris jeune et âgée. Le porteur reconnaît que les animaux peuvent développer prostration, perte de poids supérieure à 20 % et stress lié au conditionnement par la peur. Les retombées thérapeutiques contre le déclin cognitif lié à l'âge sont annoncées comme une perspective, tandis que le remplacement par des méthodes sans animaux est écarté au motif qu'il ne reproduirait pas la mémoire à l'échelle de l'animal entier.
Objectifs
Comprendre les événements biologiques conduisant à l’apparition des troubles cognitifs est un enjeu majeur de la recherche fondamentale en neurosciences. Une dérégulation des mécanismes épigénétiques et de l’expression des gènes impliqués dans la mémoire semble être une des causes de déficit cognitif lié à l'âge. Nous faisons l'hypothèse que la protéine Sin3A, un répresseur de l'expression des gènes, joue un rôle majeur dans la cognition et dans ses troubles associés. Nous altérerons l’expression de la protéine Sin3A pour identifier, au niveau cellulaire et moléculaire, les mécanismes impliquées dans le fonctionnement cérébral et les capacités cognitives, ainsi que leurs altérations liées à l'âge. Ce projet a comme objectifs : 1. de créer un nouveau modèle murin pour l'étude du corépresseur transcriptionnel SIN3A dans les processus de mémoire ; 2. de comprendre le rôle du corépresseur transcriptionnel SIN3A dans la mise en place de la mémoire à long-terme chez la souris adulte et âgée ; 3. d'étudier les conséquences d'une inactivation de ce corépresseur transcriptionel SIN3A sur les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent la mémoire à long-terme ; 4. de proposer une nouvelle approche pour restaurer un décificit cognitif (apprentissage et mémoire) lié à l'âge. Ce travail éclaircira le rôle des modifications épigénétiques dans la mémorisation à long terme et fournira de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des troubles cognitifs liés à l'âge.
Bénéfices attendus
Ce projet examinera et comparera systématiquement les mécanismes comportementaux, anatomiques, électrophysiologiques, cellulaires et moléculaires des troubles cognitifs associés à l'âge chez la souris. De plus, ce projet fera progresser de façon spectaculaire les connaissances actuelles sur les troubles cognitifs dans le cerveau âgé. Outre sa contribution à la résolution des problèmes économiques et sociaux associés aux troubles cognitifs survenant au cours du vieillissement, ce projet fournira des informations importantes sur le rôle du corépresseur transcriptionnel SIN3A dans les fonctions cognitives. Ce point est très important au vu du nombre croissant de publications sur le dysfonctionnement de la mémoire dans le vieillissement. Nous sommes convaincus que les résultats de ce projet seront exploités par une large communauté de neuroscientifiques, de pharmacologues et d'industries pharmaceutiques intéressés par les aspects développementaux du cerveau et de ses troubles. En outre, l'identification des mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent le déficit de mémoire lié à l'âge, fournira de nouvelles perspectives dans la compréhension du déficit cognitif lié au vieillissement.
Procédures
1. Injection intracérébrale d'adenovirus associé (AAV5)-CamK2-mCherry (cette procédure concerne 92 animaux du projet et dure environ 60 min par animal). 2. Injection intracérébrale de shRNAs (cette procédure concerne les 312 animaux du projet et dure environ 60 min par animal). 3. Injections de 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) (cette procédure concerne 92 animaux du projet et dure moins de 5 secondes par animal). 4. Le test de l'open-field (cette procédure concerne 288 animaux du projet et dure environ 30 min par animal). 5. Le labyrinthe en croix surélevé (cette procédure concerne 288 animaux du projet et dure environ 5 min par animal). 6. Conditionnement à la peur surélevé (cette procédure concerne 288 animaux du projet et dure environ 6 min par animal). 7. Perfusion intra-cardiaque surélevé (cette procédure concerne 96 animaux du projet et dure environ 20 min par animal).
Impact sur les animaux
Certains animaux de ce projet peuvent développer des signes de souffrance tels qu'un isolement et une indifférence par rapport au milieu extérieur, une diminution du comportement exploratoire, une attitude prostrée avec dos vouté, une expression faciale modifiée, une fuite ou défense à la manipulation, ou une perte de poids>20% (basée sur des pesées quotidiennes). Des douleurs post-chirurgies et post-injections peuvent également apparaitre. Enfin, les animaux soumis à des tests comportementaux peuvent développer un état de stress notamment ceux qui sont soumis au test de conditionnement par la peur.
Devenir
A l'issue de chaque procédure expérimentale, l'ensemble des animaux (soit 312 au total) sera mis à mort pour poursuivre les investigations cellulaires et moléculaires.
Remplacement
De nombreux modèles animaux mimant les pathologies humaines ont été mise au point, grâce auxquels de nouvelles approches fondamentales et thérapeutiques de ces maladies ont été développées. La présence chez la souris de gènes équivalents à ceux de l’homme et la possibilité de manipuler simplement le génome de la souris ont conduit à une multiplication du nombre de modèles murins. Le modèle murin permet de comprendre la fonction d’un gène par la dysfonction en l’invalidant, ou de tester une hypothèse en vérifiant si une mutation observée conduit à la maladie ou s'il s'agit d'un simple polymorphisme du gène. De plus, les rongeurs sont capables de réaliser des apprentissages de différentes natures (simple et complexe) et nous pouvons analyser leur mémoire d’un point de vue comportemental (tests de mémoire), structural (études morphologiques), cellulaire (études des réseaux neuronaux) et moléculaire (études des gènes). Ainsi, l'utilisation d'un modèle animal dans ce projet ne peut être remplacé par des modèles in vitro ou in sillico.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est le nombre minimum nécessaire pour obtenir une puissance statistique suffisante, d’après nos observations et celles rencontrées dans la littérature.
Raffinement
Tous les animaux sont hébergés selon les normes de bien être en vigueur (4 individus, présence d'enrichissement). Ils seront observés quotidiennement et des points limites ont été définis. Tous les signes de souffrance détectés lors de l'observation quotidienne tels qu'un isolement et une indifférence par rapport au milieu extérieur, une diminution du comportement exploratoire, une attitude prostrée avec dos vouté, une expression faciale modifiée, une altération de l’état du pelage, une fuite ou défense à la manipulation, ou une perte de poids>20% conduiront à la mise à mort des animaux en accord avec le vétérinaire référent.
Choix des espèces
Le fond génétique C57BL6/JRj sera utilisé dans ce projet ; il est particulièrement bien adapté pour les analyses comportementales et métaboliques que nous comptons mener. Nous pourrons donc comparer directement nos observations avec celles de la littérature. Cela permet aussi d’éliminer les mises au point potentielles, et donc réduire l’utilisation de souris. Les protocoles décrits ci-dessous, relativement classiques, sont aussi bien maitrisés par les personnes impliquées dans ce projet. Des jeunes adultes âgés de 3 mois ainsi que des souris âgées de 16-18 mois seront utilisés dans ce projet afin d’étudier les conséquences d’une inactivation de la protéine SIN3A dans un cerveau mature et vieillissant. L’utilisation de ces deux stades (adulte et âgé) nous permettra également d’étudier cette protéine SIN3A au cours du vieillissement cérébral.
Effet cérébral de l’hypoxie intermittente : vers une pathologie de type Alzheimer ? Etude sur la dynamique des réseau neuronaux et corrélation avec les lésions cérébrale
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une exposition à l'hypoxie intermittente pendant six semaines, pour certaines une implantation d'électrodes cérébrales, des tests de mémoire, des injections et des gavages, pour comparer les lésions cérébrales de l'apnée du sommeil et de la maladie d'Alzheimer. Le porteur indique une perte de poids transitoire, ainsi qu'une douleur et un stress liés à la chirurgie et aux contentions répétées. Il affirme que la compréhension des échanges entre régions cérébrales ne peut se faire que sur "animal entier".
Objectifs
L'hypoxie intermittente, modèle expérimental du syndrome d'apnées du sommeil, induirait il des lésions cérébrales comparables à celles retrouvées dans la maladie d'Alzheimer? Les troubles du sommeil sont fréquents chez les personnes âgées. Ces dernières années, des études à la fois chez l’homme et chez les rongeurs ont mis en évidence une association entre sommeil perturbé et la maladie d’Alzheimer mais les mécanismes sous-jacents restent encore en grande partie inconnus. Le syndrome d’apnées du sommeil (SAS) est l’une des causes des troubles du sommeil et il est caractérisé par une obstruction répétée des voies aériennes supérieures, entrainant une diminution fluctuante du taux d’oxygène sanguin (hypoxémie intermittente), un sommeil fragmenté et des signes tels que la somnolence et des troubles de la concentration/attention/mémoire. Le SAS doublerait le risque de démence chez l’homme, et serait associé au dépôt cérébral des protéines amyloïdes ß (Aß) retrouvées dans la maladie d’Alzheimer. Dans les modèles animaux, l’hypoxie intermittente (IH) entraine une anomalie électrophysiologique (plasticité synaptique) au niveau de l’hippocampe du cerveau, une perte des neurones et une production d’Aß. Par ailleurs, les troubles cognitifs présentés par les patients souffrants de SAS touchent la mémoire (hippocampe) et l’attention/concentration (cortex préfrontal). Or, la maladie d’Alzheimer est caractérisée au niveau physiopathologique par une altération des connexions entre les différentes régions cérébrales, notamment entre l’hippocampe et le cortex préfrontal. En utilisant l’électrophysiologie, notre objectif est d’analyser l’effet de l’hypoxie intermittente chronique sur le cerveau à plusieurs niveaux, en comparant entre le modèle souris SAS (hypoxie intermittente) et le modèle transgénique Alzheimer: 1) sur la connexion entre l'hippocampe et le cortex préfrontal, 2) sur les lésions cérébrales potentiellement induites par l’hypoxie intermittente, 3) si l'hypoxie intermittente est associée à la sénescence cérébrale (vieillissement), étude de l'effet du traitement contre la sénescence pour un éventuel effet contrecarrant l'effet délétère de l'hypoxie intermittente sur le cerveau.
Bénéfices attendus
D’un point de vue fondamental, ces études cherchent à préciser le fonctionnement cérébral (échanges d’information entre 2 régions importantes du cerveau, touchées dans la maladie d'alzheimer mais aussi dans le SAS). Leur réalisation sur le modèle murin des apnées du sommeil par l’hypoxie intermittente a pour but de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents des déficits cognitifs induits par l’hypoxie intermittente et de comparer avec les lésions cérébrales dans le modèle de la maladie d’Alzheimer. De plus ces études apporteront une évaluation originale de l’effet additif de l’hypoxie intermittente sur la pathologie Alzheimer. A long terme, à défaut d'avoir à l'heure actuelle un traitement guérissant la maladie d'Alzheimer, le projet permettra d'avoir des résultats sur le plan biologique avant de se prononcer sur l'effet potentiel thérapeutique/préventif du traitement des apnées du sommeil pour prévenir/ralentir le développement de la maladie d'Alzheimer.
Procédures
Au total 728 souris seront analysées dont: - sur 192 souris: intervention chirurgicale sous anesthésie générale et antalgique (électrodes implantés dans le cerveau pendant 2-3h), et après un temps de récupération après la chirurgie de 2 semaines, les souris vont être exposées soit à l'hypoxie soit à la normoxie pendant 6 semaines et enregistrement de l'activité cérébrale sur l'animal vigil dans les 10 jour suivants; (par exemple chez l'Homme, des enregistrements intracérébraux sont également réalisés chez certains patients avec une épilepsie grave). - 392 souris: après exposition soit à l'hypoxie soit à la normoxie pendant 6 semaines, réalisation d'un test de mémoire puis prélèvement cérébral après euthanasie pour analyser les différentes lésions du cerveau. - et si l'hypoxie entraine une sénescence cellulaire (« vieillissement »), 144 souris : traitement d'un produit sénolytique (contre la sénescence) pendant l'exposition soit à l'hypoxie soit à la normoxie pendant 6 semaines, réalisation d'un test de mémoire puis prélèvement cérébral après euthanasie pour analyser les lésions cérébrales.
Impact sur les animaux
perte de poids transitoire en début d'hypoxie intermittente (procédure 1); douleur, stress, angoisse lors de la chirurgie (procédure 2) et de la perfusion intracardiaque (procédure 5) ; restrictions alimentaires pour le conditionnement du comportement, (procédure 2) ; la douleur des injections intrapéritonéales pour le EDu (procédure 4) ; les contentions répétées pour le gavage (procédure 6) Ces effets indésirables seront remédiés par l'anesthésie et les antlagiques avant et après l'intervention
Devenir
Sur 536 animaux, nous réaliserons l'étape finale expérimentale pour prélever leur cerveau, permettant de l'analyser et rechercher les différentes lésions cérébrales. Les 192 autres animaux, après l'enregistrement de leur activité cérébrale pendant la réalisation d'un test de mémoire, seront euthanasiés de façon réglementaire.
Remplacement
La compréhension de la logique des échanges d’informations au niveau du cerveau entre 2 régions (l’hippocampe et le cortex préfrontal) ne peut faire l’objet de recherches que sur un animal entier, non anesthésié, dans un état de vigilance et des conditions comportementales précises (enregistrement de leur activité cérébrale pendant la réalisation d'un test de mémoire,). L’analyse des lésions cérébrales pour corréler avec les données électrophysiologiques ne peut faire l’objet de recherches que sur un animal entier. Compte tenu de l'analyse à plusieurs échelles (lésions cérébrales et impact sur le test du comportement), de façon intégrative, une méthode de remplacement n'est pas envisageable.
Réduction
Le développement de méthodes de traitement des signaux très sophistiquées ainsi que l’analyse statistique multivariables des résultats ont permis de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ces études.
Raffinement
L’anesthésie générale lors de la mise en place des électrodes, la sédation rapide et profonde avec un euthanasiant (avec un analgésique) pour l’étude d’immunohistochimie/perfusion intracardiaque, l’utilisation d’analgésie adéquate pour chaque procédure, la procédure d’euthanasie dans une pièce dédiée à cet objectif, l’enrichissement du milieu (coton maison en carton, baton à ronger etc), ainsi qu’une procédure quotidienne d’observation et d’examen, sont les pratiques expérimentales destinées à réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux utilisés dans ce projet. Les animaux sont regroupés par 5 (sauf pour la procédure 2, dérogation de l'hébergement décrite dans la procédure) dans des cages contenant un lit de litière, des morceaux de coton pour la nidification ainsi qu’une maison en carton qui leur permet à la fois de s’y cacher et de faire leur dent. Les animaux provenant de l’extérieur sont placés dans ces cages et ne sont manipulés au minima une semaine après leur arrivée (respect d'une semaine d'acclimatation) , afin de faciliter au mieux l’acclimatation à leur nouvel environnement. Pour chaque procédure, seront considérés comme points limites : 1. Tout dérèglement physiologique aboutissant à une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire 2. Modification du comportement caractéristique d'une douleur intense, une détresse ou une souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et/ou terne, prostration, dos vouté) 3. Anomalies pouvant entrainer une douleur intense, une détresse ou une souffrance : perte de poids supérieure ou égale à 20% du poids initial de l'animal, plaies et ulcères, tumeurs, fractures... 4.La pesée des animaux se fera de façon hebdomadaire, et renforcée en post opératoire aiguë avec une augmentation de la fréquence des pesées /48h pendant la 1ère semaine post op »
Choix des espèces
L’immense majorité des études portant sur ce sujet est réalisée chez le rongeur, notamment chez la souris du fait de la possibilité de développer des modèles génétiquement modifiés (modèle de maladie d’Alzheimer qui sera comparé avec les résultats des souris non transgéniques dites WT, en hypoxie intermittente). En effet les souris transgéniques portant la mutation humaine de la maladie d'Alzheimer permet de reproduire des lésions cérébrales semblables à la maladie d'Alzheimer et un trouble de la mémoire. Ces lésions cérébrale se développent progressivement dans le modèle transgénique que nous allons étudier. De plus, il ets également important de travailler l'effet de l'âge/vieillissement, car un des facteurs de risque de la maladie d'Alzheimer est l'âge. Enfin, il ets important de connaitre si l'impact de l'hypoxie intermittente varie en fonction du stade de la vie, ainsi que l'effet potentiel du traitement sénolytique. C'est pourquoi nous avons besoin d'étudier sur plueurs groupes d'âge les animaux. Au début de l’expérimentation (procédure 1) les animaux seront âgés de 1.5 mois, de 10.5 mois et de 20,5 mois respectivement, pour que les expériences 1 à 6 citées dans le projet soient réalisées chez des souris mâles de 3 mois, 12 mois et 22 mois, pour comparer entre le profil électrophysiologique induit par le modèle Alzheimer et celui induit par l’hypoxie intermittente. D’après les études publiées sur ces souris transgéniques Alzheimer et les données publiées chez le modèle hypoxie intermittente, dans la très grande majorité des cas des souris C57BL6 âgés