Système nerveux

1 496 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une injection intracérébroventriculaire d'agrégats de peptide bêta-amyloïde par chirurgie stéréotaxique, puis reçoivent un candidat-médicament chaque jour pendant dix-sept jours, avant un prélèvement terminal de sang et de cerveau. Le porteur mesure l'activité locomotrice pour évaluer les rythmes circadiens et indique que des effets indésirables comme une sédation peuvent apparaître. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun test in vitro ni modèle informatique ne rend compte du comportement d'un "organisme vivant entier" et conclut à l'impossibilité de remplacer l'animal.

Objectifs

Au cours du vieillissement normal, le sommeil se modifie et il peut être profondément altéré par certaines maladies neurodégénératives, tel que la maladie d’Alzheimer (MA). Les personnes souffrant de démences présentent à la fois des modifications de l’architecture de leur sommeil et des perturbations de leurs rythmes circadiens. Des études ont montré que le manque de sommeil peut augmenter de manière significative les taux de bêta-amyloïde dans certaines régions du cerveau. L’objectif de cette étude est 1) d'examiner si une injection intracérébroventriculaire (ICV) d'agrégats du peptide bêta-amyloïde Aβ (1-42) perturbe le rythme circadien chez le rat et 2) dans le cas où l'injection ICV d'agrégats Aβ (1-42) perturbe le rythme circadien, d’examiner l’effet d’une administration quotidienne de candidats médicaments sur ces perturbations préalablement observées.

Bénéfices attendus

Au cours du vieillissement normal, le sommeil se modifie et il peut être profondément altéré par certaines maladies neurodégénératives, tel que la maladie d’Alzheimer (MA). Les personnes souffrant de démences présentent à la fois des modifications de l’architecture de leur sommeil et des perturbations de leurs rythmes circadiens. 40 à 70 % des personnes ayant la MA éprouvent des problèmes de sommeil qui au fil du temps vont être amplifiés ; ce qui est épuisant pour la personne atteinte mais également pour son aidant. La prise en charge de ces troubles repose sur des traitements médicamenteux tels que des antipsychotiques ou des benzodiazépines. Mais ces médicaments ont souvent des effets indésirables inquiétants chez les personnes atteintes de la MA ; ils peuvent aggraver le déclin cognitif et accroître les risques de chute. Ainsi, ce modèle peut être utile pour le développement de cibles thérapeutiques pour traiter cette problématique.

Procédures

Dans un premier temps, les animaux sont soumis à une intervention chirurgicale (injection d'Aβ (1-42) par stéréotaxie) qui dure dans sa totalité environ 45 minutes (de l'anesthésie jusqu'au réveil). Ensuite, au moment du test de comportement (test de l'activité locomotrice), les animaux reçoivent une injection par jour du candidat médicament; et ceci durant 17 jours maximum. A la fin de l’étude, juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang et de cerveau est réalisé sur l'ensemble des animaux. Cette procédure est réalisée sous anesthésie générale et elle dure en moyenne 20 minutes (dans sa totalité). Le prélèvement de cerveau est une demande fréquente dans les études de recherche préclinique. Cela permet de réaliser des mesures de paramètres biochimiques.

Impact sur les animaux

1) Chirurgie : injection ICV - Les rats sont anesthésiés avec de l’isoflurane et placés dans un appareil stéréotaxique. Puis, selon les groupes, une injection intracérébroventriculaire (ICV) d'agrégats du peptide bêta-amyloïde Aβ (1-42) ou de véhicule est réalisée. 2) Administration des candidats médicaments - Les administrations sont réalisées tous les jours et pendant toute la durée de l’enregistrement de l’activité locomotrice. Lors de l’administration d’un nouvel agent thérapeutique, différents effets indésirables peuvent être observés : inconfort dû à l’injection, des effets secondaires dus aux produits (comme la sédation par exemple)

Devenir

Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à la fin de l’étude à un prélèvement sanguin et de cerveau.

Remplacement

L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement des médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet de molécules sur le comportement est la conséquence de leur action au niveau de l’ensemble de l’organisme et en particulier sur le système nerveux. La mise en évidence de ces effets est réalisée sur un organisme vivant entier. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou modèle informatique ne permet de rendre compte de l’ensemble de ces phénomènes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent pas donc être remplacés par des méthodes alternatives. Pour le présent projet : il n’existe aucun modèle permettant d’évaluer le cycle circadien dans la maladie d’Alzheimer.

Réduction

Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables ; ceci afin d'éviter de multiplier les expériences. Il correspond à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux reçoivent trente minutes, avant l’acte chirurgical, une administration en sous-cutanée d’’un analgésique (Opiacés ou AINS). Après la chirurgie, les animaux reçoivent 1 ml de solution de lactate Ringer en sous-cutanée. Une coupelle contenant du « Gel Diet Energy » (Safe) mélangé à de la nourriture mouillée est déposée sur le sol de la cage pour stimuler l’appétit et la mobilité gastro-intestinale de l’animal. 24h post-opératoire, les animaux reçoivent une administration en sous-cutanée ou voie orale (per os) d’analgésique (Opiacés ou AINS). Ils sont pesés et leur état général est évalué selon notre grille de surveillance pour détecter tous signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des rats correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. La lignée de rat utilisée est : Sprague-Dawley 9-10 semaines au moment de la chirurgie. Les molécules développées sont destinées à des patients adultes.

396 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardées vivantes pour être réutilisées dans d'autres enregistrements. Rendues épileptiques, elles sont irradiées par microfaisceaux de rayons X sous anesthésie, la tête fixée dans un cadre stéréotaxique, pour tester une alternative à la chirurgie du foyer épileptique. Le porteur indique qu'un animal perdant plus de 20 % de son poids ou présentant une akinésie est mis à mort, et qu'un surdosage d'irradiation entraîne aussi l'euthanasie. Les bénéfices annoncés pour les patients épileptiques restent renvoyés à une éventuelle application chez l'humain.

Objectifs

Le traitement pharmacologique des différents types d’épilepsie est complexe et doit répondre au mieux aux différents types de crises présentées par les patients. Il n’est efficace que chez 70 % des patients. L’épilepsie Mésio-Temporale (MesioTemporal Lobe Epilepsy ou MTLE) est la forme d’épilepsie focale la plus fréquente en clinique parmi celles qui ne répondent pas aux traitements pharmacologiques par les anti-épileptiques de référence. La MTLE est le plus souvent caractérisée sur le plan histologique par une sclérose de l’hippocampe (dispersion des cellules granulaires du gyrus denté et mort des neurones pyramidaux au niveau de la corne d’Ammon, CA1 et CA3). La résection chirurgicale du foyer épileptique ou zone épileptogène (ZE) est l’unique possibilité, à l’heure actuelle, de guérir les patients atteints de MTLE. Cette chirurgie nécessite une craniotomie pour enlever le foyer épileptique. C’est une méthode efficace dans 50 à 70 % des cas, mais qui comporte plusieurs risques (infection, effets secondaires, troubles cognitifs) et représente un coût hospitalier important (plus de 10 jours d’hospitalisation et suivi pendant plusieurs mois). L’irradiation par microfaisceaux de Rayons-X ou « Microbeam Radiation Therapy » (MRT) est de plus en plus étudiée chez l’animal dans le but d’une application à l’homme dans le cas de tumeurs cérébrales ou de maladies neurologiques dans lesquelles un circuit nerveux dysfonctionne (Serduc et al, 2010 ; Studer et al, 2015). Il s’agit d’une technique non invasive, focalisée et avec une très faible toxicité pour les tissus adjacents du fait de sa grande précision. Dans des pathologies comme la MTLE, cette méthode permettrait de s’affranchir d’une chirurgie invasive (Pouyatos et al, 2013). L’objectif de ce projet est donc de développer sur un modèle de MTLE chez la souris (Riban et al, 2002 ; Heinrich et al, 2011) un protocole de MRT qui permette de rendre moins invasive la prise en charge des patient atteints d’une épilepsie focale.

Bénéfices attendus

L’irradiation par microfaisceaux de Rayons-X ou « Microbeam Radiation Therapy » (MRT) est de plus en plus étudiée chez l’animal dans le but d’une application à l’homme dans le cas de tumeurs cérébrales ou de maladies neurologiques dans lesquelles un circuit nerveux dysfonctionne (Serduc et al, 2010 ; Studer et al, 2015). Il s’agit d’une technique non invasive, focalisée et avec une très faible toxicité pour les tissus adjacents du fait de sa grande précision. Dans des pathologies comme la MTLE, cette méthode permettrait de s’affranchir d’une chirurgie invasive (Pouyatos et al, 2013).

Procédures

- Pendant l’irradiation les souris seront anesthésiées et, après vérification de l’absence de réflexe du retrait de la patte, elles seront fixées dans un cadre stéréotaxique afin d’éviter tout mouvement de la tête et les précautions suivantes seront prises afin de limiter le stress et la douleur: - Anesthésie générale: Kétamine + Xylazine (voir ci-dessous) d’environ 40 min. - Anesthésie locale: baume à la lidocaïne 2% au niveau des oreilles.

Impact sur les animaux

Comme le développement d’une épilepsie et le traitement par MRT peuvent altérer la prise alimentaire, notre point limite se basera à la fois sur le poids de l’animal et sur son comportement général. Un animal sera immédiatement euthanasié si l’un des signes suivants est observé: perte de poids > 20% du poids mesuré le jour de l’irradiation, akinésie, rotation (voir Annexe 3). La radiothérapie peut être une source de souffrance si la dose délivrée est trop élevée. Les choix concernant les champs d’irradiation et les doses délivrées à la peau ont donc été effectuées en fonction des connaissances actuelles et de notre expertise. En cas d’erreur ou de problème technique au moment de l’irradiation d’un animal et notamment de surdosage, l’animal sera euthanasié immédiatement par surdosage de pentobarbital (150 mg/kg). Après radiothérapie, des effets secondaires invalidants (hyper ou hypo-locomotion, modification de la prise de nourriture, nécrose de la peau, ischémie cérébrale) peuvent apparaitre avec des délais différents selon les animaux

Devenir

L’ensemble des animaux seront gardés en vie à la suite de la manipulation. Ils seront rapatriés dans l’animalerie du GIN afin de réaliser les enregistrements de leurs crises, leur comportement et les contrôles histologiques. Ces procédures font l’objet d’une demande d’autorisation gérée par le comité d’éthique du GIN.

Remplacement

L’utilisation de l’animal dans son intégrité est nécessaire pour répondre à notre question. Il n’existe aucun modèle cellulaire qui permette de mettre en évidence un foyer épileptique dans le cerveau ni de le traiter par irradiation et l’utilisation d’irradiation fractionnée spatialement n’est pas encore possible chez l’homme. Le développement d’une stratégie thérapeutique telle qu’envisagée dans cette étude nécessite d’avoir recours à un modèle animal dans lequel le développement d’un foyer épileptogène a été clairement caractérisé et mis en évidence. Dans cette étude, la souris sera utilisée, malgré sa petite taille, en complément de l’étude effectuée chez le rat en parallèle. En effet, le modèle souris d’épilepsie mésiotemporale présente une plus grande stabilité, une évolution plus rapide de la pathologie, une fréquence de crises plus importante et une plus grande similitude des symptômes avec la clinique humaine. L’utilisation des modèles souris et rat sera ainsi très complémentaire et permettra d’obtenir des résultats plus fiables pour la préparation des essais cliniques.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum tout en permettant une exploitation statistique rigoureuse des résultats. Pour cela, en fonction de l’expérience acquise en modélisation animale des épilepsies, nous estimons que 396 animaux au total seront utilisés pendant 5 ans dans les quatre séries d’expériences de ce projet.

Raffinement

Nous veillerons à suivre les animaux quotidiennement de façon à intervenir immédiatement dès qu’un signe évocateur de douleur serait observé. Pour réduire toute douleur, souffrance ou anxiété, ils seront anesthésiés et analgésiés de façon profonde durant toutes les interventions (chirurgie, IRM, irradiation) et les techniques d’imagerie que nous utiliserons dans nos procédures sont sans douleur pour l’animal et permettent de répéter les acquisitions chez le même animal. Les animaux seront maintenus avec de la nourriture et de la boisson à volonté, ainsi que des objets en carton et du coton. Il seront habitués à la manipulation par des expérimentateurs agrémentés. A la fin des expériences, les animaux seront euthanasiés par surdosage de pentobarbital.

Choix des espèces

Le modèle d’épilepsie KA-MTLE chez la souris et chez le rat sont actuellement les modèles de référence les plus proches des conditions observées chez l’homme, aussi bien sur le plan électrophysiologique, histologique que pharmacologique. Malgré sa taille réduite nous souhaitons utiliser l’espèce souris, en complément de l’étude sur le rat, en raison de sa plus grande prédictivité et sa plus grande stabilité dans le temps que le modèle rat. Des animaux adultes seront utilisés dans ce projet. Ils auront 8 semaines en début d’expérience et 12 à 15 semaines lorsqu’ils seront irradiés à l’ESRF. Le modèle de souris KA-MTLE a été développé chez des animaux de cet âge afin de travailler sur un cerveau mature qui restera stable tout au long de la procédure.

240 hamsters syriens vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit des injections répétées de mélatonine, une autre subit une chirurgie d'implantation d'un système d'infusion continue d'hormones thyroïdiennes dans le cerveau, pour étudier la prolifération cellulaire saisonnière de l'hypothalamus. Le porteur indique que la chirurgie est douloureuse, que le passage en jours courts provoque une perte de poids d'environ 15 % et que l'isolement en cage individuelle peut générer du stress. Tous les animaux sont ensuite tués pour prélever le cerveau, le sang et les testicules.

Objectifs

L’hypothalamus est une partie du cerveau qui contrôle les fonctions métaboliques et reproductives. Chez les mammifères, il a été montré que les changements saisonniers des hormones thyroïdiennes et de la mélatonine régulent l’activité de l’hypothalamus pour ajuster les fonctions métaboliques et reproductives avec les saisons. Notre projet déterminera quel est le rôle des hormones saisonnières (mélatonine et hormones thyroïdiennes) dans la prolifération cellulaire saisonnière de l’hypothalamus du hamster syrien, un mammifère saisonnier. Des études chez le mouton ont montré que l'exposition à des jours courts d’hiver (avec un pic long de mélatonine), qui induit une activation de leur reproduction, est associée à une augmentation de la prolifération cellulaire dans l’hypothalamus. Nos données préliminaires chez le hamster syrien montrent que l'exposition à des jours courts (qui, à l’inverse du mouton, inhibent sa reproduction) induit également une prolifération cellulaire dans l’hypothalamus. Ces observations suggèrent que la prolifération saisonnière des cellules hypothalamiques se produit en réponse au signal saisonnier, indépendamment de la stratégie de reproduction de l'animal. Notre projet testera quelles hormones saisonnières (mélatonine et/ou hormones thyroïdiennes) induit la prolifération cellulaire hypothalamique en jours courts chez le hamster syrien mâle.

Bénéfices attendus

Ce projet nous aidera à mieux comprendre la nature du signal saisonnier endocrine (mélatonine et/ou hormones thyroïdiennes) qui contrôle la prolifération cellulaire saisonnière dans l'hypothalamus du cerveau adulte d’un mammifère. Les résultats obtenus nous permettront ensuite d’envisager de futures expériences pour 1) établir la nature des cellules hypothalamiques nouvellement formées suite au changement des saisons, 2) analyser le rôle physiologique de la prolifération cellulaire adulte saisonnière et 3) d’étudier l’effet de perturbateurs saisonniers (réchauffement climatique, pollution lumineuse nocturne) sur la prolifération cellulaire saisonnière. Ces travaux ont des implications cliniques potentielles car des études récentes montrent que la physiologie humaine présente aussi des variations saisonnières d’hormones liées au métabolisme, à la reproduction et à la croissance.

Procédures

Dans la première expérience où nous testons l’effet d’un allongement du pic nocturne de mélatonine en jours longs, chaque hamster recevra une injection de solvant ou de la mélatonine (durée de la préhension plus injection : 2 min) chaque jour pendant 2 ou 4 semaines. Un jour avant la fin de l’expérience, une injection intrapéritonéale d’une substance qui permet la visualisation des cellules nouvellement formées (durée de la préhension plus injection : 2 min) sera donnée sur chaque hamster vigile. Toutes les injections se feront sur animal vigile. Les hamsters seront stabulés à raison de de 3 individus par cage enrichie (tunnel, nid, bâton en bois). Dans la deuxième expérience où nous testons l’effet d’une augmentation des concentrations des hormones thyroïdiennes en jours courts, chaque hamster aura une chirurgie pour implanter un système permettant l’infusion continue de solvant ou d’hormones thyroïdiennes dans le cerveau (durée de la chirurgie sous anesthésie profonde : 30 min) pendant 2 ou 4 semaines. Un jour avant la fin de l’expérience, une injection intrapéritonéale d’une substance qui permet la visualisation des cellules nouvellement formées (durée de la préhension plus injection : 2 min) sera donnée sur chaque hamster vigile. Les hamsters seront stabulés en cages individuelles enrichies (tunnel, nid, bâton de bois) car la situation de jours courts les rend naturellement agressifs et les animaux pourraient s’attaquer les uns aux autres, notamment au niveau des plaies des implantations. A la fin de l'étude, tous les animaux seront mis à mort après anesthésie profonde.

Impact sur les animaux

Le hamster syrien peut être stressé par les manipulations/préhensions qu’il devra subir régulièrement. Les injections intrapéritonéales peuvent engendrer une douleur locale mais de courte durée. L’intervention chirurgicale est jugée douloureuse per se (douleur modérée) et peut également entrainer des inflammations. Le transfert en jours courts entraine naturellement une perte de poids d’environ 15%, mais il est possible que la perte de poids soit supérieure. Les hamsters opérés et leurs contrôles sont suite à l'impantation transférés en jours courts et sont placés en cage individuelle (car étant naturellement plus agressifs en jours courts, ils pourraient s’attaquer, notamment au niveau des plaies) ce qui peut conduire à un stress de l’isolement.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux pour prélèvements 1) du cerveau post-mortem dans le but d’analyser la prolifération cellulaire grâce à la visualisation par une technique de coloration de cellules nouvelles nées par immunohistochimie ; 2) du sang pour doser les hormones de la reproduction, 3) des testicules dont la masse indique le statut reproducteur de l’animal.

Remplacement

Le projet vise à étudier l’effet de plusieurs hormones de la saisonnalité sur les processus de prolifération cellulaire dans l’hypothalamus. Ce sont des fonctions intégrées typiques des mammifères qui par conséquent ne peuvent pas être étudiées chez des organismes non-mammifères, des lignées cellulaires ou des modèles biomathématiques, et qui nécessitent des organismes entiers. Dans ce contexte il n'est encore pas possible de proposer d’alternatives pour des études préliminaires dans des modèles hors-champs.

Réduction

Le nombre de animaux a été calculé sur des connaissances du modèle et une méthode mathématique en intégrant la variabilité inhérente au modèle et aux gestes réalisés. Ce nombre permettra d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Les tests statistiques utilisés pour comparer les groupes ont été choisis pour permettre d’évaluer l’effet de plusieurs hormones de la saisonnalité sur les processus de prolifération cellulaire dans l’hypothalamus.

Raffinement

Tous les hamsters seront dans des cages enrichies avec du matériel de nidation, un bâton à ronger, et tunnel de refuge. Avant et pendant les traitements, les hamsters, qui sont des animaux sociaux, seront placés en cage collective (3 individus par cage). Il y aura une exception pour les hamsters stabulés en jours et ayant eu une intervention chirurgicale qui seront isolés car il y a des risques qu’ils soient agressifs entre eux. Les hamsters soumis à des traitements seront traités avec des analgésiques et anesthésiques adaptés pour réduire leur souffrance induite par les procédures à un niveau minimum. Les animaux seront habitués à la manipulation avant le début des injections pour limiter le stress généré par celles-ci. Ils seront observés quotidiennement pour détecter tout signe de souffrance. Des points-imites ont été établis pour soustraire l’animal à la souffrance durant la durée de l’étude.

Choix des espèces

Le hamster syrien est un modèle de rongeur dont la physiologie saisonnière est bien caractérisée. Des résultats récents chez le hamster syrien ont montré l’existence d’une prolifération cellulaire hypothalamique augmentée lors du transfert en jours courts type hiver. De plus les procédures expérimentales proposées chez cette espèce sont bien maitrisées, ce qui contribuera à en limiter les effets dommageables pour l’animal. Pour ce projet seuls les mâles seront utilisés car la bonne intégration de l’information photopériodique est facilement observable par la modification de la taille des testicules. Nous utiliserons des hamsters mâles post-pubères âgés entre 3 et 8 mois, car notre expérience nécessite que les hamsters aient un âge où la maturation sexuelle est optimale.

6 chevaux sains vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardés vivants comme animaux d'enseignement. Chaque cheval subit une biopsie de la langue réalisée à travers la joue sous sédation et anesthésie locale, ainsi que des examens cliniques et des administrations orales de médicaments sur trois jours. Le porteur reconnaît que des complications modérées à sévères comme une hémorragie ou une anorexie peuvent survenir. Il présente cette étude comme une étape préliminaire "indispensable" avant des prélèvements sur des chevaux malades, pour améliorer le diagnostic de la maladie de l'herbe.

Objectifs

Démontrer la tolérance et la faisabilité de la technique de biopsie de langue réalisée à travers la joue, chez des chevaux vivants sains. Ce travail est une étape préliminaire indispensable à la réalisation des prélèvements chez des chevaux symptomatiques, dans un contexte clinique.

Bénéfices attendus

Permettre de valider la faisabilité et la tolérance d'une technique de biopsie linguale sur des chevaux debouts, afin d'améliorer le diagnostic et la prise en charge des chevaux atteints de la maladie de l'herbe. Le diagnostic précoce et fiable de cette maladie présente un réél enjeu éthique et financier.

Procédures

3 interventions : 3 examens cliniques par jour pendant 3 jours, soit 9 examens cliniques, 10 minutes par examen ; 2 administrations per os de médicaments par jour pendant 3 jours, soit 6 per os, 1 minute par administration ; la réalisation de la biopsie linguale transbuccale (à travers la jour) sous anesthésie locale et sédation.

Impact sur les animaux

Des complications modérées à sévères pourraient éventuellement survenir, telles qu'une hémorragie ou une anorexie (perte totale d'appétit). Des complications plus modérées pourraient éventuellement survenir, telles qu'une dysorexie (difficultée à manger, perte d'appétit partielle) les premiers jours après l'intervention, une inflammation douloureuse ou une infection du site d'incision de la joue, des symptômes de fièvre et d'infection généralisée.

Devenir

A l'issue de la première procédure, les 3 chevaux seront replacés pour l'enseignement de l'anatomie. A l'issue de la 2e procédure, les 3 chevaux seront conservés au sein de l'EU, en tant que chevaux d'enseignement clinique.

Remplacement

Une étude préliminaire a été effectuée sur des cadavres afin de garantir la faisabilité de la technique. Notre projet cherche maintenant à démontrer la faisabilité de cette procédure sur des chevaux vivants debouts, avec les difficultées que cela représente : comportement d'acceptation de la procédure, déglutition, mastication et mouvements de langue. La procédure vise également à recenser les complications éventuelles qui pourraient survenir. Aucun modèle inerte ne peut être utilisé pour cette étape du projet.

Réduction

Aucun projet ne s'est intéressé à la réalisation de biopsie linguale chez des chevaux vivants. La faisabilité de la procédure par approche transbuccale a été au préalable évaluée sur des cadavres et la technique a été améliorée au fur et à mesure des essais. Les analyses histologiques effectuées ont démontré la bonne qualité des prélèvements. La procédure a été optimisée avant d'être employée sur des chevaux vivants, permettant de réduire leur nombre. Aucun test statistique n'a été utilisé pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

Nous optimisons la technique pour améliorer le bien-être des animaux. Les chevaux seront logés au box sur une litière paillée, avec une nourriture standard (foin et granulés), avec des congénères en visuel et sortis 2 fois par jour. Un enrichissement du milieu à l'aide de jeux, de pierres à sel et de pipolino sera effectué selon les individus et leur niveau d’habituation, afin de ne pas générer une source de stress supplémentaire. Pour la réalisation des biopsies, les chevaux seront tranquillisés, après l’administration d’antalgiques et des anesthésies locales seront réalisées pour tous les actes pouvant être inconfortables. Enfin, les chevaux seront remis au box et re-nourris dès que les effets de la sédation auront disparu. La procédure sera réalisée si le cheval supporte une sédation adéquate, sans agitation avec un arrêt de la mobilité de la langue, afin de prélever la biopsie dans des conditions optimales. Si tel n’est pas le cas, la procédure sera arrêtée et le cheval sorti du protocole.

Choix des espèces

Espèce cible pour la pathologie concernée Chevaux adultes. La maladie de l'herbe se déclare le plus souvent chez de jeunes adultes entre 2 et 7 ans. Notre projet vise à tester la faisabilité des biopsies chez des chevaux de taille adulte.

124 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une chirurgie pour l'implantation d'un capteur sous-cutané porté dix-sept jours, toutes courent ou marchent sur un tapis, puis sont endormies profondément pour des prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien. Le porteur indique que l'étude vise à savoir si certains neurones de la moelle épinière thoracique participent à la régulation cardiovasculaire, un objectif de connaissance fondamentale sans application annoncée. Les animaux sont mis à mort pour collecter un maximum de tissus.

Objectifs

Cette demande d’autorisation de protocole s’inscrit dans un projet plus large qui vise à déterminer si les neurones présents autour du canal central dans la moelle thoracique et qui sont en contact avec le liquide céphalorachidien (cellules appelées LCR-cNs) font partie du système nerveux autonome sympathique (SNAS) en charge, entre autres, de la régulation cardiovasculaire. L’objectif de ce projet sera donc de regarder la pression artérielle de base et sa modulation lors d’un exercice moteur chez des souris dont les LCR-cNs seront spécifiquement invalidés pour le gène codant pour une protéine appelée PKD2L1 qui leur confère une sensibilité aux déformations mécaniques et aux variations de pH. En parallèle de ces expériences, nous regarderons l’effet d’un exercice physique sur la composition du plasma sanguin et du LCR chez la souris. Les molécules identifiées seront alors testées sur l’activité des LCR-cNs en tranches par des approches électrophysiologiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de savoir si l'activité de certains neurones de la moelle épinière thoracique sont capables de moduler la commande nerveuse du système nerveux autonome et de participer à la régulation du tonus cardiovasculaire. Ces neurones constitueraient ainsi un système sensoriel intrinsèque à la moelle épinière qui pourrait informer directement les réseaux neuronaux des changements métaboliques de l’organisme sans obligatoirement passer par les structures présentes dans l’encéphale. Les informations recueillies fourniront de nouvelles données sur l’organisation de la moelle épinière et son implication dans la régulation des fonctions vitales.

Procédures

Certains animaux subiront une chirurgie peu invasive d’une heure environ pour suivre leurs paramètres cardio-vasculaires dans le temps et courront sur un tapis, 15 minutes pendant 4 jours d’affilé (n=28) Ces animaux porteront un capteur en sous-cutané pendant 17 jours. D'autres marcheront (n=24) ou courront (n=48) à 2 vitesses différentes (24 animaux par vitesse), pendant 15 minutes. Enfin les 24 marcheurs, 48 coureurs et 24 sédentaires seront profondément endormis avant des prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une chirurgie peu invasive mais seront suivis avec une analgésie adaptée. Les animaux marcheront ou courreront pendant 15 minutes sur un tapis roulant après une phase d'entrainement où aucun système aversif ne sera utilisé

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à l'issue des procédures car nous travaillons à mieux comprendre des systèmes biologiques aujourd'hui mal connu et il est important de collecter un maximum d'information via les prélèvements de tissus.

Remplacement

Cette étude in-vivo fait suite à plusieurs années de recherche ex-vivo sur des moelles épinières extraites. Malgrès les nombreuses connaissances accumulées, il est impossible de mettre en évidence les interactions entre les populations de cellules de la moelle épinière étudiées ici et le reste de l'organisme sans réaliser des expérimentations in vivo.

Réduction

Afin de cibler très précisément des questions soulevées par le projet, des études préliminaires sur moelles extraites ont été faites et ont permis de grandement limiter le nombre d'animaux utilisés. De plus le nombre d'animaux a été reduit au minimum afin d'avoir des résultats statistiquement viables à exploiter . Enfin pour réduire le nombre d'animaux utilisés, nous allons utiliser un système de mesure de la pression artérielle qui sera implanté (télémétrie ). Ainsi, chacun des animaux sera son propre contrôle (avant et après exercise physique). Le nombre d’animaux a été établi sur la base des minimums nécessaires pour effectuer des tests statistiques robustes et des données bibliographiques dont nous disposons.

Raffinement

La technique de télémétrie permet à l'animal d'être libre de ses mouvements dans la cage. Sauf en cas d'avis vétérinaire pour un soin, aucun animal ne sera isolé afin de préserver le caractère grégaire de la souris. Lors de la chirurgie d'implantation, des soins post-opératoires seront faits (anesthésie et analgésie), les conditions d'asepsies seront respectées (stérilisation du matériel) et le personnel dédié à la chirurgie sera parfaitement formé . Les animaux seront vus quotidiennement et seront évalués suivant une méthode d'évaluation validée avec des points limites gradés et précis. Toutes les cages seront enrichies avec du matériel de nidification et un tunnel en carton.

Choix des espèces

La souris est une espèce dont le génome est parfaitement connu et que l'on peut très facilement manipuler. Ainsi dans le cadre de notre étude, la lignée cellulaire à étudier a été ciblée en supprimant un gène cible. De plus, la souris est une espèce dont la gestation et la phase juvénile est courte, permettant ainsi d'avoir régulièrement des animaux au génotype voulu. Les animaux seront utilisés adultes (autour de 7 semaines). Nous devons attendre que les animaux fassent 22gr pour leur implantation en télémétrie (recommandation du fabriquant) mais nous ne voulons pas avoir des animaux trop âgés par soucis technique (implantation facilitée chez les individus jeunes).