Système nerveux

2 112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent des mutations mimant la sclérose latérale amyotrophique et subissent des chirurgies cérébrales, implantation de pompes, pose d'électrodes sous-durales et injection intracérébrale, puis des tests glycémiques, métaboliques et des tests comportementaux non détaillés sur trente-cinq jours. Le porteur indique que les chirurgies provoquent des douleurs atténuées par des analgésiques et prévoit de retirer un animal dont l'état ne s'améliore pas sous 48 heures. Il affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur un modèle animal dont l'hypothalamus est bien caractérisé et conclut que la souris ne "saurait être remplacée".

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA), la plus fréquente des maladies du système moteur adulte (2 à 3 nouveaux cas pour 100 000 habitants), reste une pathologie incurable et présente un pronostic extrêmement sévère, conduisant au décès, 2 à 5 ans après l’apparition des premiers symptômes. La SLA présente des formes sporadiques (90%) et familiales (10%). Diverses lignées de souris transgéniques ont été mises au point, récapitulant les symptômes de la maladie : une dégénérescence des neurones moteurs cortico-spinaux et des motoneurones spinaux, une dénervation des muscles striés squelettiques accompagnée d’une atrophie musculaire et d’une paralysie progressive se finissant par la mort. Ces lignées transgéniques sont à la base des recherches expérimentales dans le domaine de la SLA. Outre les symptômes moteurs, la SLA est aussi accompagné par une perte de poids très importante (chez l’homme et modèles murins) due à une diminution de la prise alimentaire, associée à un changement de la dépense énergétique. Il a été observé récemment que les modèles transgéniques ont aussi des dysfonctionnements du sommeil et du métabolisme. Ces altérations à l’origine de ces symptômes n'ont pas encore été demontrees. Chez la souris, l’hypothèse expliquant les bases cellulaires de ces dysfonctionnements sont un défaut fonctionnel des neurones hypothalamiques impliquées dans la régulation de la balance énergétique, la prise alimentaire et le sommeil. Ceci suggère l’existence d’un défaut hypothalamique touchant le contrôle de la prise alimentaire et la qualité/quantité de sommeil aussi chez le patient SLA. De plus d'un point de vue moléculaire, il a été montré que l'une des molécules impliquées dans la maladie, est un élément central de l’horloge interne. Ce dernier gène particulièrement contrôle de façon remarquable le rythme de prise alimentaire et le sommeil. Ceci faisant le lien entre la pathologie étudiée et les problèmes de l'horloge interne. Nous investiguerons donc, dans cette etude, le sommeil et le metabolisme de ces lignees transgeniques mimant la SLA.

Bénéfices attendus

Ces expériences nous permettront de déterminer si les défauts fonctionnels de l’hypothalamus peuvent être reversés et ainsi ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour la SLA. Au-delà de la SLA, ce projet est destiné à contribuer à l’effort commun de recherche sur l’étiologie des maladies neurodégénératives du système moteur.

Procédures

Les animaux subiront des procédures chirurgicales (implantation de pompes iPRECIO durée 2h, implantation d’électrodes subdurales durée 3h, injection intracérébrale durée 2h) en plus de test glycémique (durée 2h), comportementaux et métaboliques. Ces expériences dureront maximum 35 jours et prennent en compte le développement de la pathologie dans les 2 lignées transgéniques. Les prélèvements ne seront fait qu’en phase terminale d’une procédure.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons à des douleurs causées par les procédures chirurgicales qui seront atténuées par des antalgiques et analgésiques avant, pendant et après la chirurgie ainsi qu’une surveillance quotidienne pendant la période de récupération des souris. Nous préviendrons toutes infections par l’apport d’antibiotique a la fin des procédures chirurgicales. Enfin, nous ne laisserons aucune souris dans la souffrance en nous référant à la feuille en Annexe 1. Il sera pris la décision de sortir une souris de l’étude si les conditions de la souris ne montrent pas d'amélioration sous 48 heures.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort pour des analyses biochimiques et immunologiques, après avoir collecté sang, tissus et organes.

Remplacement

La SLA est une maladie d’origine multifactorielle et multicellulaire. Les cultures cellulaires ne permettent pas de modéliser l’aspect intégré de cette pathologie. Nous avons donc besoin de recourir à des modèles animaux qui présentent, en outre, une organisation du système nerveux proche de celle de l’homme pour réaliser ce projet de recherche.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux dans ce projet, les animaux destinés aux analyses biochimiques ou histologiques seront au préalable inclus dans les études fonctionnelles. Le nombre de souris incluses dans ce projet a été précisément calculé à partir des observations faites dans le laboratoire lors d’études préliminaires ce qui a permis de calculer la puissance statistique et d’éviter les biais de taille d’effet (nombre suffisant permettant l’exploitation statistique). Le logiciel GPower nous a permis de calculer le nombre minimum nécessaire par groupe à 24. Secondairement lorsque les données seront récoltées nous utiliserons une analyse statistique ANOVA à un facteur avec une analyse post-hoc pour analyser les résultats.

Raffinement

Les animaux auront accès ad libitum à l’eau et à la nourriture, bénéficieront de conditions d’hébergement conformes à la réglementation en vigueur. L’enrichissement de l’environnement des animaux (coton compressé pour faire des nids, maisons en plastique rouge), le maintien des interactions sociales et la surveillance quotidienne des animaux permettront de s’assurer de leurs bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Des points limites (perte de poids, difficultés métaboliques, etc.) permettant de soustraire l’animal à la souffrance ont été établi. De plus, nous appliquerons également le principe de raffinement au niveau des méthodes de pré-anesthésie, d’anesthésie et de prise en charge analgésique en cas de procédure.

Choix des espèces

La souris est un modèle important et pertinent dans l’étude de la SLA. Pour intégrer la complexité de la pathologie, et notamment des implications du dysfonctionnement de hypothalamus, il est indispensable de travailler avec un modèle animal possédant une structure hypothalamique bien caractérisée. De plus, les modèles transgéniques de souris sont des modèles expérimentaux très puissants (génétique connue, commercialisation d’outils moléculaires, etc.). En conséquence, dans le cadre de la question biologique posée, le modèle animal choisi ne saurait être remplacé par un autre. Les animaux seront utilisés à partir de 30 jours, au moment du sevrage, car l’injection de DREADDS nécessite d’être faite sur des souris âgées de 30 jours car le DREADDS est laissé 15 jours avant de pouvoir conduire un quelconque effet. Pour les pompes iPRECIO et l’EEG des animaux de 65 jours seront utilisés pour pouvoir observer les effets au stade présymptomatique.

Pour préciser le lien entre la protéine DYRK1A et les lésions de la maladie d'Alzheimer, 240 souris issues de croisements entre des lignées qui développent des lésions amyloïdes ou tau et des lignées portant une ou trois copies du gène Dyrk1a vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit sans anesthésie cinq prises de sang à la veine sous la mâchoire, de 2 à 6 mois, puis un labyrinthe en Y, un test de reconnaissance d'un nouvel objet et la piscine de Morris, où elle doit retrouver à la nage une plateforme immergée. Toutes sont tuées à 6 mois, 128 pour l'extraction du cerveau et 112 par perfusion cardiaque de paraformaldéhyde sous anesthésie. Le porteur affirme que la souris est tenue pendant la prise de sang "sans que l'animal n'exprime ou montre des signes de détresse", et cite un risque d'hémorragie dans la bouche et d'hématome au visage.

Objectifs

Les personnes atteintes du syndrome de Down présentent des niveaux accrus de DYRK1A dans le tissu cérébral et de plasma. Une expression accrue des transcrits DYRK1A a été signalée dans des échantillons d'hippocampe provenant de patients atteints de la maladie d'Alzheimer, bien que les niveaux de protéine DYRK1A dans des homogénats de cortex frontal se soient avérés similaires entre les patients atteints de la maladie d'Alzheimer et les témoins. Récemment, il a été demontré que les personnes âgées souffrant de troubles de la mémoire et présentant une imagerie amyloïde positive présentaient des taux plasmatiques de DYRK1A plus faibles que celles présentant une imagerie amyloïde négative. En outre, il a éte également observé que les adultes âgés cognitivement normaux et sans dépôts amyloïdes présentaient des niveaux plasmatiques de DYRK1A plus élevés que les individus plus jeunes, ce qui pourrait suggérer que l'augmentation de DYRK1A associée à l’âge protègerait de la maladie d'Alzheimer. Dans cette étude, nous cherchons à préciser le lien entre les niveaux cérébraux et plasmatiques de DYRK1A et les deux neuropathologies de la maladie d'Alzheimer.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à mieux comprendre le rôle de la surexpression/downregulation de DYRK1A dans l'étiologie de la maladie d'Alzheimer, en particulier les pathologies amyloïdes et tau. Ce projet contribuera également à une meilleure compréhension de l'apparition précoce de la neuropathologie de la maladie d'Alzheimer chez les personnes atteintes du syndrome de Down, étant donné que le gène codant pour la DYRK1A est situé sur le chromosome 21 et qu'il est donc surexprimé dans cette population. L'étude de biomarqueurs plasmatiques capables d'identifier les individus à haut risque pour la maladie d'Alzheimer de manière rapide et efficace permettrait d'initier un traitement pré-symptomatique de cette maladie, en particulier dans les populations à haut risque. Enfin, les efforts visant à élucider les mécanismes moléculaires impliqués dans les pathologies amyloïdes et tau pourraient également ouvrir de nouvelles approches thérapeutiques visant à modifier le développement de la maladie d'Alzheimer.

Procédures

Des prélèvements sanguins seront effectué at 2, 3, 4, 5, 6 mois sur chacune des 240 souris (5 échantillons/animal; 1 échantillon/mois; durée de la procédure: 2 à 3 minutes). Nous prélèverons le sang dans la veine submandibulaire, un procédé rapide, simple et reconnu, qui permet aux chercheurs de prélever rapidement 0,2 à 0,3 ml de sang sans recourir à l'anesthésie. Ensuite, les souris effectueront des tests comportementaux: Y maze, reconnaissance de nouvel objet et piscine aquatique de Morris. Le labyrinthe Y est basé sur une session de 8 minutes. La reconnaissance d'objets nouveaux est basée sur quatre sessions : deux sessions d'habituation, une session de familiarisation et une session de test. Chaque session a une durée de 10 minutes. Le test du labyrinthe aquatique de Morris est basé sur des épreuves d'apprentissage qui se dérouleront sur 5 jours, à raison de 4 épreuves par jour (intervalle inter-épreuves : 60 min), et d'un "test de sonde" le 7ème jour (48 h après le dernier jour d'entraînement). Pendant les essais d'apprentissage, l'animal doit localiser une plate-forme cachée immergée sous la surface de l'eau en 90 secondes. Pendant le “probe test”, les souris sont autorisées à nager librement pendant 60 secondes. Les souris auront une semaine de repos entre les tests afin de réduire les effets de transfert des tests précédents. Chaque souris sera testée pour tous les paradigmes comportementaux, et l'ordre des tests sera le même pour chaque souris. Chaque souris effectuera chaque test une fois. A l'issue de ces tests, 128 souris seront euthanasiés selon une méthode réglementaire afin d'extraire les cerveaux pour les analyses biochimiques (durée de la procédure: 3 à 5 minutes pour chaque souris). Les 112 souris restantes recevront une perfusion cardiaque de parafolmaldéhyde afin d'éliminer le sang du cerveau pour les études immunohistochimiques (durée de la procédure: 10 à 15 minutes pour chaque souris).

Impact sur les animaux

Pendant le prélèvement de l’échantillon de sang (étape 1), l'animal est retenu avec précaution par la peau du cou et du dos afin d'immobiliser la tête, sans que l'animal n’exprime ou montre des signes de détresse. Les personnes effectuant les prélèvements de sang sont familiarisées avec la technique de prélèvement. Le sang s'écoule rapidement après la ponction, et une fois la contention de la souris relâchée, le saignement s'arrête rapidement. Une ponction trop profonde peut entraîner la pénétration du sang dans la cavité buccale et un risque d'hémorragie. Un hématome sur le côté du visage peut se produire occasionnellement. Les souris seront observées pendant 30 minutes après le prélèvement de sang pour vérifier leur comportement normal et leur hémostase. Les tests comportementaux (étape 2) sont basés sur les comportements spontanés de l’animal avec une procédure graduelle d’habituation-familiarisation aux dispositifs de test. Pour limiter le stress durant les tests, les souris seront habituées à l’expérimentateur/la manipulation et seront transférées de leur cage à la salle de comportement au moins une heure avant le test. En général, les tests comportementaux utilisés dans ce projet peuvent causer un stress léger. Pour tous les tests, on prendra soin de placer et de retirer délicatement l'animal de l'appareil de test et, entre les animaux, l'appareil sera nettoyé des débris. Pour les tests dans l'eau (Labyrinthe aquatique de Morris), les souris sont surveillées en permanence pendant qu'elles sont dans l'eau, et à la fin du test, les souris sont essayer avec un torchon et placé dans une cage avec un autre torchon avant de les remettre dans leur cage d'origine. Enfin, le stress des animaux sera évalué quotidiennement par des échelles d'hétéroévaluation (perte de poids, pelade, agressivité, prostration, agitation, les petits yeux, les oreilles en arrière, etc). La perfusion transcardiaque (étape 3) de souris est une procédure définitive. Cette procédure se déroule avec un animal complètement anesthésié (vérifier l’absence de réflexe de retrait et palpébral). Si l'animal réagit à la coupe pendant la procédure chirurgicale, un anesthésique supplémentaire sera administré immédiatement.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées (euthanasie réglementaire ou perfusion transcardiaque de souris) pour prélever le cerveau afin d’étudier les lésions de la pathologie Alzheimer (amyloide et tau).

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative autre que le recours aux modèles souris de maladie d'Alzheimer et aux croisements avec des souris surexprimant ou sous exprimant DYRK1A, pour atteindre les objectifs du projet: analyses de la pathologie Alzheimer (amyloide et tau) ainsi que des déficits d'apprentissage et de mémoire.

Réduction

Réduction: le nombre d'animaux est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre a été calculé sur la base d'études précédemment élaborées et publiées, notamment des études du laboratoire. Des groupes de 10 à 12 souris seront nécessaires afin d’atteindre un poiuvoir statistique suffisant permettant de détecter des variations significatives dans les données comportementales. Nous utiliserons sur 3 ans un total de 240 souris.

Raffinement

Raffinement: les méthodes utilisées et la manière de traiter les animaux pendant les expériences et dans l’animalerie assureront à ces derniers un minimum de contraintes et un maximum de bien-être. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les procédures expérimentales sont les plus appropriées pour minimiser toute douleur, souffrance, anxiété/détresse ou dommage que les animaux pourraient subir. Des mesures telles que la formation du personnel, la surveillance quotidienne, l'habituation, l'acclimatation et le temps de récupération sont prises pour réduire tout impact physique et psychologique potentiel des procédures expérimentales. Les conditions d'élevage et d'hébergement (enrichissement de l'environnement avec des carrés de coton) sont mises en œuvre afin d'accroître autant que possible le bien-être des animaux. La préférence pour les procédures non invasives par rapport aux procédures invasives est prise en considération et, lorsque des interventions invasives sont nécessaires, les directives appropriées en matière d'anesthésie/analgésie seront suivies, en accord avec le comité de bien-être animal.

Choix des espèces

Les souris APP23 sont un modèle de maladie d'Alzheimer développant une pathologie amyloïde étendue. Les souris PS19 sont un modèle de tauopathie, qui développent des enchevêtrements neurofibrillaires, une perte neuronale et une atrophie cérébrale caractéristiques de la pathologie tau retrouvée dans la maladie d'Alzheimer. Ces deux modèles murins de la maladie d'Alzheimer présentent des déficits cognitifs. Le modèle de souris mBACtgDyrk1a porte trois copies du gène Dyrk1a de la souris comme dans la trisomie 21, alors que les souris DYRK1A+/- KO portent une seule copie de ce gène. Dans ce projet, nous analyserons les effets de la surexpression du gène Dyrk1a, ainsi que sa sous-expression sur les pathologies amyloïde et tau en croisant ces différentes lignées de souris. Des échantillons de sang seront prélevés sur des souris adultes âgées de 2 à 6 mois afin de détecter différents biomarqueurs. Les performances cognitives seront évaluées à l'âge de 4 mois, et des tissus cérébraux seront prélevés sur les souris à l'âge de 6 mois.

600 souris vont être utilisées dans un projet d'élevage impliquant un niveau de souffrance modéré, 450 étant transférées vers un autre établissement et 150 reproducteurs tués pour prélèvement du cerveau. La lignée porte un phénotype décrit comme "dommageable", une paralysie progressive des membres postérieurs que les animaux développent à partir de cinq mois et demi. Le porteur précise qu'il faut maintenir ces souris en vie jusqu'à un stade avancé de paralysie, en les aidant alors à s'alimenter et à s'hydrater, car c'est à ce stade que la pathologie visée s'étend dans le cerveau. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative" et que l'étude in vivo est "indispensable".

Objectifs

Il s’agit d’un projet d’élevage de souris transgénique avec phénotypage dommageable dans le but de générer des animaux nécessaires pour répondre à des questions scientifiques avec des enjeux de santé public majeurs. Pour mener à bien notre projet de recherche, nous aurons recours à des souris transgéniques pour la protéine Tau humaine qui présentent l’avantage d’être un modèle robuste d’induction et de propagation de la tauopathie. Les avancées de notre projet scientifiques, de par l'utilisation de ces animaux à phénotype dommageable, permettront de répondre à des questions majeures sur les mécanismes de mise en place de la maladie d'Alzheimer aboutissant sur des innovations thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Cet élevage a pour but de générer le nombre d'animaux nécessaires à nos deux projets de recherche tout en surveillant l'apparition du phénotype dommageable et en assurant le bien être animal. Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs du projet. En effet, les tauopathies sont des maladies neurodégénératives complexes pour lesquelles des spécificités semblent être impliquées et l'étude de certains de ces aspects est indispensable in vivo afin de pouvoir analyser les différences d'induction et de propagation au sein de l'organisme vivant.

Procédures

Il s'agit d'un élevage de souris à phénotype dommageable. 450 animaux produits au sein de ce projet sont destinés à être transférés dans un autre établissement utilisateur dans le cadre de projets préalablement autorisés. 150 animaux reproducteurs seront euthanasiés par CO2, leur cerveau sera prélevé, congelé dans de l’azote liquide et stocké à -80°C afin d'être analysés pour les besoins des projets de recherche.

Impact sur les animaux

Le phénotype dommageable attendu sera une paralysie des membres inférieurs qui sera détectable cliniquement à partir de 22 semaines d’âge (5,5 mois) chez les souris homozygotes et entre 9 et 12 mois d’âge (36-48 semaines) pour les souris hétérozygotes. Les premiers signes de développement de la paralysie observables seront une perte d’équilibre lors de la marche et un affinement progressif du bas du corps. Les animaux à ce stade peuvent encore se déplacer et se dresser sur les pattes arrières pour accéder aux croquettes et à l’eau de boisson. Il faut bien suivre le développement de la paralysie à partir de ce stade. Il va progresser vers un stade avancé en un mois pour les souris homozygotes et en 2-3 mois pour les hétérozygotes. A ce moment-là il faudra aider ces animaux à s’alimenter et à s’hydrater en leur mettant à disposition des croquettes en poudre mouillées et en ajoutant de l’eau gélifiée. Pour les besoins des différents projets nous devons garder les animaux en vie jusqu’à un stade avancé de paralysie car c’est à ce moment que la pathologie de Tau s’étend dans l’hippocampe, région de grand intérêt pour notre recherche.

Devenir

450 animaux produits au sein de ce projet sont destinés à être transférés dans un autre établissement utilisateur dans le cadre de projets préalablement autorisés. 150 animaux reproducteurs seront euthanasiés par une méthode réglementaire, leur cerveau sera prélevé, congelé dans de l’azote liquide et stocké à -80°C. Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique l'euthanasie de ces animaux.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre projet les objectifs du projet. En effet, les tauopathies sont des maladies neurodégénératives complexes pour lesquelles des spécificités semblent être impliquées et l'étude de certains de ces aspects est indispensable in vivo afin de pouvoir analyser les différences d'induction et de propagation au sein de l'organisme vivant.

Réduction

Nous utiliserons 600 animaux, nombre minimal nous permettant d’obtenir un résultat statistiquement significatif afin de pouvoir aboutir à des conclusions scientifiquement solides pour l’ensemble des travaux. Le nombre d'animaux a été établi grâce à un calcul de puissance et il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Toutes les précautions seront prises afin de n’imposer aucune souffrance ou une contrainte minimale aux souris utilisées. Nous avons défini un ensemble de points limites pour la procédure d’élevage. De plus, un programme d’enrichissement sera appliqué en ajoutant dans la cage, une petite maison en carton et de matériel pour la nidification (coton compacté).

Choix des espèces

Nous aurons recours à une lignée de souris transgénique pour la protéine Tau qui représente un modèle de tauopathie robuste et fiable car la cinétique de développement de la tauopathie est prédictible. Les animaux seront utilisés à des stades adultes (à partir de 6 semaines) leur permettant de pouvoir être mis en accouplement.

330 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit trois chirurgies puis une dizaine de séances où il porte un microscope miniature fixé sur la tête pendant qu'il se déplace, avant d'être tué par perfusion intracardiaque pour analyse du cerveau. Le porteur indique que les chirurgies provoquent des lésions osseuses et tissulaires pouvant s'accompagner de douleur, de perte de poids et d'immobilité, et que le port du dispositif peut d'abord induire un stress. Il affirme que le remplacement "n'est pas possible" car il s'agit d'un système intégré "non modélisable".

Objectifs

Notre recherche vise à comprendre les bases fonctionnelles cérébrales qui permettent à l'animal de s'orienter dans l'environnement et d'effectuer des tâches motrices complexes. À cette fin, nous utiliserons des microscopes miniatures pour visualiser l'activité neuronale d'animaux au comportement libre. (1) Notre objectif est de comprendre la structure dynamique du réseau de neurones d'orientation spatiale et comment il est influencé par les stimuli visuels. L'activité des populations de cellules sera enregistrée pendant que les animaux marchent librement dans une arène ronde avec des repères visuels proéminents. Pour examiner comment l'entrée visuelle régit le circuit neuronal de direction de la tête, nous allons faire varier l'entrée sensorielle de l'animal en enregistrant en présence de repères visuels proéminents, puis en éteignant la lumière et en la rallumant. (2) Notre deuxième objectif est d'étudier le rôle des neurones du cervelet lors de la locomotion libre. Le cervelet est l'une des régions clés du cerveau impliquées dans la coordination motrice. On sait que le microcircuit cérébelleux traite les informations sensori-motrices et réalise des modifications immédiates des pattes correspondant au mouvement en cours. Les bases cellulaires d'une telle intégration demeurent largement inconnues. Le but de ce projet est d'examiner le rôle des neurones du cervelet dans la coordination des mouvements. Nous proposons d'étudier le rôle du réseau chez la souris éveillée en mouvement libre en utilisant l'imagerie calcique nous informant sur l'activité neuronale sous-jacente. La tâche pour cette étude consiste pour les animaux à traverser librement une échelle horizontale - avec des barreaux - reliant deux plateformes. Une telle tâche nécessite une intégration sensorimotrice qui implique le cervelet.

Bénéfices attendus

Notre recherche vise à comprendre les bases fonctionnelles cérébrales qui permettent à l'animal de s'orienter dans l'environnement et d'effectuer des tâches motrices complexes. Nous serons ainsi en mesure, à terme, de démontrer comment le cerveau est capable d’orienter et d’orchestrer le mouvement dans des conditions physiologiques. Une meilleure compréhension du fonctionnement des neurones dans les structures concernées est nécessaire pour permettre un diagnostic précoce et un traitement de des pathologies neurologiques liées.

Procédures

Les souris de cette étude subiront 2 procédures : Procédure n°1: Rôle des neurones du cervelet lors de la locomotion libre (6-8 semaines au total) et Procédure n°2: Dynamique du réseau neuronal d'orientation spatiale dans le présubiculum (6-8 semaines au total). Les animaux de la procédure n°1 (100 souris en total) subiront 3 chirurgies dont 1 peu invasive et environ 10 séances de comportement couplé à des enregistrements de mouvement et d'imagerie calcique. Les animaux de la procédure n°2 (230 souris en total) subiront 3 chirurgies dont 1 peu invasive et environ 10 séances de comportement couplé à des enregistrements de mouvement et d'imagerie calcique. Les deux procédures se terminent par la mise à mort des animaux par perfusion intra-cardiaque.

Impact sur les animaux

Les chirurgies invasives prévues par le protocole impliquent des dommages osseux et tissulaires. En conséquence, les animaux peuvent être potentiellement exposés à la douleur combinée à une perte de poids, à l'immobilité ou à un comportement anormal. Avant, pendant et après la chirurgie, nous traitons ces problèmes potentiels par l'administration de médicaments analgésiques et anti-inflammatoires. La durée typique de récupération après une opération est de 1 à 2 jours, période pendant laquelle les animaux sont traités avec ces médicaments. Le fait de porter le microscope miniature sur la tête de l'animal pendant les enregistrements peut initialement induire un stress. Cela peut entraîner une immobilité ou une mobilité réduite, ce qui constitue un comportement anormal indésirable. Avant d'imager l'activité neuronale à l'aide du miniscope, l'animal sera soumis à plusieurs séances d'habituation d'une durée de 2 à 3 jours, ce qui lui permettra de s'habituer à porter l'appareil d'imagerie.

Devenir

Tous les animaux suivant les procédures 1 et 2 sont sacrifiés comme indiqué à l'étape E. Ils sont mise à mort par perfusion intra-cardique avec dosage des anesthésiques pour prélèvement d'organes et analyses histologiques. L'étude histologique post-mortem nous permet d'identifier la localisation et l'identité des neurones enregistrés.

Remplacement

L'intégration des informations sensorimotrices pendant la navigation spatiale libre implique de multiples régions et réseaux cérébraux. Afin de comprendre le rôle des neurones dans le comportement moteur et l'orientation, il est donc primordial de réaliser des expériences sur animal vivant en libre movement afin de conserver la structure et l’activité des réseaux neuronaux sous-jacents. Le remplacement n'est pas possible car il s'agit d'une étude d'un système intégré, non modélisable

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux, cette étude d'imagerie in vivo est réalisée avec des implants permanents. Une fois implantés, les animaux sont maintenus en vie et utilisés pour de plusieurs sessions d'enregistrement. L'optimisation des soins aux animaux contribue en outre à l'utilisation d'animaux pour plusieurs sessions d'enregistrement et à réduire le nombre d’animaux. Enfin, nous utiliserons les tests statistiques appropriés afin d’obtenir des résultats exploitables à partir du plus petit nombre d’animaux possible

Raffinement

Tout signe de douleur, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé avec des analgésiques et anti-inflammatoires. Une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. La surveillance quotidienne de l'animal permettra d'arrêter toute procédure expérimentale en cas de signes d’anxiété ou de souffrance définis dans l’échelle d’évaluation.

Choix des espèces

La souris a été choisie car en combinant souris transgénique et injections virale de GCaMP nous serons en mesure de mesurer l’activité calcique dans des populations neurales spécifiques pendant le mouvement libre. Il s'agit de mammifères dont le fonctionnement du cerveau peut être comparé à celui de l'homme pour les questions abordées dans ce projet. Les animaux seront utilisés à partir de l’âge où leur activité motrice est arrivée à son niveau mature (P30) et pendant les deux mois qui suivent. À cet âge, la locomotion est entièrement développée et les structures cérébrales impliquées dans la locomotion et l'orientation sont matures..

880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie provoquant un traumatisme crânien, puis sont tuées pour que leurs cerveaux servent à préparer des débris de myéline destinés à des cultures cellulaires. Le porteur indique que le traumatisme peut réduire la prise de nourriture et d'eau, et prévoit une analgésie et des points limites. Il affirme que ce projet, visant à produire ces débris à partir de cerveaux de souris, ne peut être remplacé par des modèles in vitro.

Objectifs

Le traumatisme crânien est un problème majeur de santé publique lourd de conséquences neurologiques et lésionnelles à court comme à long terme pour lequel il n’existe aujourd’hui aucun traitement. Ces conséquences tardives sont en grande partie reliées à des lésions jusqu’ici largement sous-estimées et méconnues : les lésions de la substance blanche. Cette dernière contient essentiellement des cellules nerveuses entourées d'une gaine particulière, la myéline, permettant la transmission des informations dans le cerveau. L'espoir d'améliorer le pronostic du traumatisme crânien repose sur la découverte des mécanismes impliqués dans les lésions de la substance blanche et les désordres neurocomportementaux conséquents. Parmi ces mécanismes, des études suggèrent le rôle de la neuro-inflammation dans les lésions de la substance blanche après un traumatisme crânien. La microglie est une cellule immunitaire du cerveau qui joue un rôle majeur dans la neuro-inflammation. Des études suggèrent que les débris de myéline induits par le traumatisme crânien pourraient activer à leur tour la microglie. Une fois activée, la microglie peut adopter 2 phénotypes distincts, c'est-à-dire qu'elle peut exercer des effets délétères, mais elle peut aussi exercer des effets bénéfiques, et ceci, selon son environnement. Ainsi, des études ont rapporté aussi bien des effets pro- ou anti-inflammatoires des débris de myéline, mais à ce jour, aucun lien entre débris de myéline et activation microgliale n’a pu être mis en évidence dans le traumatisme crânien. L'objectif de ce projet est donc de préparer des débris de myéline à partir de cerveaux de souris mâles Swiss ayant subi un traumatisme crânien, afin (1) d'étudier leurs effets (bénéfiques ou délétères) sur le phénotype microglial, et (2) d'identifier les mécanismes mis en jeu, et ceci sur des cultures de microglies de souris.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche permettra d'identifier des cibles moléculaires permettant de moduler la neuro-inflammation d'origine microgliale induite par les débris de myéline suite à un traumatisme crânien.

Procédures

Une procédure chirurgicale permettant d'induire un traumatisme crânien sera réalisé chez les souris. L’ensemble de cette procédure dure 10 minutes.

Impact sur les animaux

L'induction du traumatisme crânien peut entraîner une diminution de la prise alimentaire et d'eau.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort et leurs cerveaux seront prélevés pour préparer les débris de myéline.

Remplacement

L'objectif de ce projet étant de préparer des débris de myéline à partir de cerveaux de souris mâles Swiss ayant subi un traumatisme crânien pour en étudier les effets sur des cultures de microglies, il ne peut donc être remplacé par des modèles in vitro ou autres.

Réduction

Le faible taux d'échec (10%) des gestes pour réaliser le traumatisme crânien, ainsi que la bonne connaissance de la temporalité des mécanismes induits par le traumatisme crânien (activation microgliale, démyélinisation, détection des débris de myéline, déficits comportementaux, lésions de la substance blanche) permettront de réduire le nombre d'animaux au minimum

Raffinement

L'eau et la nourriture seront fournies à volonté et le milieu sera enrichi par des cotons compactés. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables, afin de limiter tout stress et modification de hiérarchie. Afin de s'assurer du bien-être animal, l'intervention chirurgicale permettant de réaliser le traumatisme crânien sera réalisée sous anesthésie générale et un analgésique sera donné en pré- et post-opératoire, afin de limiter la souffrance des animaux. La mise en place de points limites et l'observation du comportement des animaux permettront d'identifier toute souffrance et douleur, et d'entraîner une mise à mort anticipée, si nécessaire.

Choix des espèces

Au vu de la littérature, la souris est l’espèce la plus utilisée pour la réalisation des modèles de traumatisme crânien. Le traumatisme crânien sera réalisé chez des souris jeunes adultes (6-8 semaines), puisque c'est un évènement fréquent dans cette tranche d'âge chez l'Homme.

Les 96 souris de ce projet appartiennent à des lignées génétiquement modifiées, conçues pour que l'équipe puisse éteindre l'activité électrique ou l'horloge moléculaire de cellules précises de leur cerveau. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : une injection dans la profondeur du cerveau sous anesthésie générale, puis un hébergement en cage individuelle équipée d'une roue, pour mesurer leur rythme d'activité sous alternance de jour et de nuit, puis dans l'obscurité constante. L'effet recherché est une perte ou un décalage de leur rythme circadien, qui peut provoquer selon le porteur une fatigue liée à des troubles du sommeil. Toutes sont tuées en fin de procédure pour vérifier au microscope l'emplacement de l'injection, et une souris qui perdrait 15 % de son poids serait tuée avant, par dislocation cervicale.

Objectifs

En France, environ 15% de la population active est concernée par le travail de nuit. Ce mode d'organisation du travail augmente les risques de troubles du sommeil et du métabolisme, de cancer ou de problèmes cardiovasculaires et psychiques. Pour répondre à cet enjeu de santé publique, il convient de mieux connaitre l'horloge interne qui régule nos rythmes biologiques en adéquation avec le cycle jour-nuit de 24 heures. Cette horloge circadienne (= "autour du jour") est localisée dans une petite structure du cerveau profond, appelée les noyaux suprachiasmatiques (NSC). Les NSC contiennent environ 10000 cellules nerveuses, douées d'une rythmicité circadienne autonome reposant sur un petit ensemble de gènes, appelés gènes de l'horloge. Alors que les interactions entre ces gènes de l'horloge sont maintenant bien connues et définissent les rouages moléculaires de l'horloge, le rôle des différentes cellules des NSC reste mal connu. Pour répondre à cette question, notre approche expérimentale vise à éteindre l'activité électrique ou à inactiver le mécanisme de l'horloge moléculaire dans des populations cellulaires spécifiques des NSC chez des souris génétiquement modifiées. Notre objectif sera de cibler une dizaine de populations cellulaires différentes et d'identifier lesquelles participent au rythme de locomotion circadienne, mesurée à l'aide d'une roue d'activité dans la cage des animaux.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra d'identifier les cellules régulant les rythmes circadiens, et selon quelle modalité (phase, amplitude, période?). Cette dissection cellulaire de l'horloge circadienne des Mammifères est une étape essentielle pour comprendre le fonctionnement physiologique de l'horloge et son dérèglement pathologique dans le cadre de notre société moderne, active 7 jours sur 7, 24 heures sur 24. A terme, les cellules ainsi identifiées pourraient constituer la cible de traitements adaptés pour accompagner les travailleurs de nuit et les voyageurs souffrant de jetlag. Un autre bénéfice attendu consiste dans l'obtention de nouvelles données sur le rôle du canal NALCN que nous ciblerons pour éteindre l'activité électrique des cellules des NSC. Ce canal ionique est associé à des maladies génétiques rares. Les enfants touchés par ces maladies développent très souvent des troubles du rythme veille-sommeil. Comprendre le rôle précis de NALCN dans l'horloge circadienne serait une avancée majeure pour alléger les conditions de vie de ces jeunes patients et de leur famille, déjà confrontés à des situations très sévères.

Procédures

Injection intra-cérébrale sous anesthésie générale. Hébergement en cage individuelle (avec contact visuel avec des congénères) pour mesure du rythme de lcomotion volontaire dans une roue d'activité.

Impact sur les animaux

L'effet attendu des manipulations réalisées est une perturbation de l'horloge circadienne : diminution ou perte totale de la rythmicité circadienne, ou déphasage entre le rythme interne et le cycle jour-nuit extérieur. La perte de rythme n'est a priori pas dommageable sur la durée du protocole. Le déphasage peut provoquer une fatigue liée à des troubles du sommeil. Sur le long terme, le développement d'un syndrome métabolique (diabète, obésité) ou au contraire un amaigrissement est possible, ainsi qu'un risque accru de cancer est possible. Cependant, ces effets extrêmes ne sont pas envisageables en quelques semaines. La nuisance potentiellement causée par la procédure chirurgicale d'injection stéréotaxique sera traitée par anesthésie/analgésie et surveillance des animaux

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour réaliser une vérification histologique du site d'injection.

Remplacement

Le fonctionnement moléculaire de l'horloge a déjà été largement étudié in vitro. Mais comprendre l'impact de ce mécanisme dans des cellules spécifiques au sein d'un organisme nécessite le recours aux modèles animaux. Ici, nous regarderons comment une manipulation cellulaire dans le cerveau profond modifie le rythme repos-activité chez la souris. Les résultats expérimentaux que nous obtiendrons révéleront la complexité fonctionnelle de l'horloge circadienne. Ces données pourront servir de base pour une modélisation réaliste de ce système.

Réduction

Pour chaque groupe expérimental, la quantité totale d'activé sera mesurée en condition d'éclairage jour-nuit, puis d'obscurité constante. Les paramètres du rythme d'activité locomotrice, directement liés à l'horloge, seront évalués sous ces conditions d'obscurité constante (= conditions de libre cours) : 1. Analyse qualitative : le rythme circadien d'activité est-il préservé ou aboli? 2. Analyse quantitative : si une rythmicité est préservée, la période du rythme en conditions de libre cours sera le paramètre limitant. Nous avons réalisé une étude statistique (programme G-Power) pour estimer la taille nécessaire de nos groupes expérimentaux.

Raffinement

L'injection stéréotaxique de petits volumes (1 µl) dans les NSC est largement documentée, et maitrisée dans notre équipe. Cette opération est conduite sous anesthésie générale de l'animal, et est suivie d'une observation accrue pendant la phase de réveil, avec utilisation d'analgésiques et per- et post-opératoire. La mesure de l'activité locomotrice implique l'hébergement en cage individuelle, équipée d'une roue d'activité. Pour limiter l'isolement social, les animaux garderons un contact visuel avec leurs congénères. D'autre part, l'accès à la roue constitue un enrichissement des conditions d'hébergement très apprécié. Les animaux seront observés visuellement de façon quotidienne. En plus des signes de souffrance couramment recherchés (prostration, poil hérissé, amaigrissement), nous utiliserons la mesure d'activité locomotrice comme point limite spécifique à la procédure mise en œuvre : toute souris parcourant une distance inférieure de 50% à celle parcourue par des souris contrôles sera pesée et observée plus en détail. En fonction des signes cliniques observés, la souris aura accès à une nourriture hydratée et/ou un analgésique adapté. Nous ne nous attendons pas à un degré de souffrance justifiant la mise à mort des animaux, mais si une souris devait atteindre un poids inférieur de 15% au poids avant l'opération, alors elle sera euthanasiée par dislocation cervicale.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère de choix, donnant accès à un grand nombre de lignées génétiquement modifiées. Ici les lignées Bmal1-flox et Nalcn-flox sont uniques et particulièrement adaptée pour répondre à la question posée. D'autre part, la mesure de l'activité locomotrice volontaire dans des cages à roue est un outil très largement utilisé en chronobiologie pour évaluer le fonctionnement de l'horloge circadienne des rongeurs. Souris jeunes adultes (7-8 semaines), lorsque la croissance est terminée pour des coordonnées stéréotaxiques fiables.

Équipées par chirurgie d'un capteur implanté de pression artérielle, 212 souris sont enregistrées à plusieurs âges, et 106 d'entre elles doivent aussi marcher sur un tapis roulant "à vitesse soutenue". 274 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis tuées pour des prélèvements de tissus, la moitié portant une mutation semblable à celle de la sclérose latérale amyotrophique humaine, qui provoque des atteintes motrices. Le projet cherche si la régulation de la pression artérielle se dérègle avant les premiers symptômes moteurs. Le RNT ne dit pas jusqu'à quel stade de la maladie les souris sont gardées, et ses effectifs ne concordent pas : 212 souris opérées et 168 autres gardées jusqu'au vieillissement font 380, pour 274 déclarées.

Objectifs

La moelle épinière thoracique contient l'essentiel des neurones à l'origine de la commande nerveuse autonome sympathique, un acteur majeur du maintien de l'homéostasie corporelle, responsable du contrôle d'un grand nombre d'activités automatiques de l'organisme. Les neurones préganglionnaires sympathiques (SPNs), étage de sortie de la commande sympathique, connectent au sein des ganglions sympathiques les neurones postganglionnaires sympathiques qui à leur tour connectent les organes cibles. Les SPNs sont des neurones qui sont moléculairement extrêmement proches des neurones qui commandent les muscles striés : les motoneurones (MNs). La sclérose latérale amyotrophique (SLA), troisième maladie neurodegerative après Alzeihmer et Parkinson est caractérisée par la perte des neurones moteurs corticaux et des MNs spinaux conduisant à une atrophie musculaire, à la paralysie progressive des malades et à leur décès par insuffisance respiratoire. Les causes précises de la dégénérescence des MNs sont à ce jour encore inconnues et nous ignorons encore si cette dégénérescence est initiée directement au niveau des MNs ou au niveau du muscle. Notre hypothèse est que les SPNs sont aussi atteints dans la SLA et participent via un dysfonctionnement du contrôle vasculaire musculaire à la dégénérescence du muscle et des MNs. L’objectif de ce projet est donc de mettre en évidence des altérations précoces (avant l'apparition des symptômes moteurs) de la régulation de la pression artérielle sur un modèle murin de la SLA.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mieux comprendre les mécanismes de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) dont l'issu est aujourd'hui toujours fatale chez l'homme (dans les 3 à 5 ans suivant les premiers symptômes).

Procédures

Certains animaux subiront une chirurgie (n=212) et certains d'entre eux marcheront aussi sur un tapis roulant à vitesse soutenue (n=106). Les 168 autres animaux seront maintenus en vieillissement pour des prélèvements post-motem uniquement.

Impact sur les animaux

La mutation portée par les animaux est similaire à celle de l'homme. Ces animaux vont présenter des altérations motrices qui seront surveillées de très près par une équipe compétente (50% des animaux de l'étude)

Devenir

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, des prélèvements de tissus seront faits. Cela permettra de faire des études histologiques et immuno-histologiques

Remplacement

Des études préliminaires sur tissus ont été faites afin d'orienter le projet. De plus, une grosse partie du projet se fera ex-vivo grâce à des techniques d'histologie et d'immuno-histologie. Il n'existe pas de modèle mathématique simulant les modifications induites par SLA sur les paramètres cardiovasculaires car les connaissances de cette maladie sont aujourd'hui limitées. De plus, le suivi de paramètres physiologiques au cours de la vie d'un animal n'est pas possible en dehors d'un système intégré comme un organisme entier. Il n'est donc pas possible de faire cela sur des tissus ex-vivo. C'est à cause du manque de connaissance de notre modèle (la SLA) que nous avons recours à l'utilisation d'animaux présentant cette maladie.

Réduction

Afin de déterminer au mieux le nombre d'animaux, nous avons calculé le n à l'aide de tests statistiques. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous allons utiliser un système de mesure de la pression artérielle qui sera implanté. Ainsi, chacun des animaux sera enregistré à chaque temps permettant de ne pas multiplier le nombre d'animaux par le nombre de temps d'enregistrement. Une étude pilote sur très peu d'animaux (16) sera faite et conditionnera l'utilisation des autres animaux.

Raffinement

Les individus porteurs de la mutation seront suivi régulierement et l'évaluation des signes moteurs sera faite toutes les semaines, puis 2 fois par semaine, puis tous les 2 jours puis quotidiennement afin de ne jamais laisser un animal en souffrance. Sauf en cas d'avis vétérinaire pour un soin, aucun animal ne sera isolé afin de préserver le caractère grégaire de la souris. Lors de la chirurgie d'implantation, des soins post-opératoires seront faits (analgésie, antibiothérapie si nécéssaire sur avis vétérinaire, tapis chauffant pour le réveil), les conditions d'asepsies seront respectées (autoclavage, stérilisation à froids, matériels à usage unique stérile) et le personnel dédié à la chirurgie sera parfaitement formé (formation réglementaire et spécifique auprès d'un centre de formation dédié).

Choix des espèces

La souris est un modèle dont le génome est parfaitement connu. De plus, un modele murin de la sclérose latérale amyotrophique existe. Le système de reproduction des souris permet d'avoir régulièrement des animaux dans un espace relativement réduit. Enfin le choix de l'espèce est aussi conforme au R de réduire puisque nous avons choisi un modèle mammifère relativement petit. Les animaux de l'étude pilote seront implantés à P50 pour être enregistrés à partir de P60 Les animaux de l'étude complémentaire seront implantés à P21 (minimum 22gr) pour être enregistrés à partir de P29