Système nerveux

380 souris vont être utilisées, chacune opérée du cerveau pendant une à quatre heures pour recevoir des implants, puis soumise à des séances comportementales allant jusqu'à trois heures par jour. Toutes sont tuées à l'issue pour vérifier la position des implants et analyser le tissu cérébral, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant onze jours au plus, elles subissent jusqu'à onze injections et une restriction alimentaire qui maintient leur poids à au moins 85 % de la normale, restriction que le porteur dit destinée à entretenir leur "motivation". Les tâches, décrites comme l'apprentissage d'une règle puis son changement, ne sont pas nommées. Les retombées pour la schizophrénie ou l'autisme sont renvoyées au "plus long terme".

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre comment certains réseaux neuronaux participent à la flexibilité cognitive, c’est-à-dire à la capacité d’abandonner une stratégie devenue inadaptée afin d’en adopter une nouvelle. Nous chercherons à identifier comment certaines populations neuronales contribuent au maintien de comportements stables mais également à leur mise à jour lorsque les conditions changent. Pour répondre à cette question, nous utiliserons des approches complémentaires chez la souris. Les animaux réaliseront des tâches comportementales permettant d’étudier l’apprentissage initial d’une règle comportementale puis l’adaptation nécessaire lorsque cette règle change. Pendant ces tâches, l’activité neuronale pourra être enregistrée chez des animaux éveillés et libres de leurs mouvements afin de caractériser les dynamiques d’activité associées à l’apprentissage, aux erreurs comportementales et aux changements de stratégie. Nous étudierons également comment certaines populations cellulaires influencent ces mécanismes et peuvent favoriser des comportements persévérants lorsque l’adaptation comportementale échoue. Les données obtenues permettront une meilleure compréhension des mécanismes cérébraux impliqués dans la flexibilité cognitive et pourraient contribuer à l’identification de nouvelles pistes thérapeutiques pour des troubles neurologiques et psychiatriques associés à des déficits d’adaptation comportementale.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de faire progresser les connaissances sur les mécanismes neuronaux permettent l’adaptation du comportement lorsque les règles de l’environnement changent. Les travaux fourniront des données détaillées sur les dynamiques d’activité neuronale associées à l’apprentissage, aux erreurs comportementales, aux changements de stratégie et aux comportements persévérants. Grâce à la combinaison d’approches complémentaires ce projet permettra d’étudier de manière précise le rôle de différentes populations neuronales dans le contrôle des comportements flexibles. Les données obtenues permettront également de mieux comprendre comment certaines perturbations de l’activité inhibitrice peuvent altérer les capacités d’adaptation comportementale. À plus long terme, ces travaux contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes cérébraux impliqués dans plusieurs troubles neurologiques et psychiatriques associés à des déficits cognitifs et à une rigidité comportementale, notamment la schizophrénie, l’autisme et certains troubles neurodéveloppementaux. Ces résultats pourront contribuer au développement futur de nouvelles hypothèses et approches thérapeutiques ciblant les circuits neuronaux impliqués dans ces déficits. Les données produites dans le cadre du projet pourront également contribuer au développement de nouvelles approches visant à mieux comprendre le fonctionnement des réseaux neuronaux impliqués dans la prise de décision et l’adaptation comportementale.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie du cerveau unique sous anesthésie générale. Cette chirurgie durera entre 1 et 4 heures selon les implants réalisés. Dans certains groupes d'imagerie, une seconde courte sous anesthésie générale pourra être réalisée une seule fois; cette intervention durera 30 à 60 minutes. Les animaux pourront recevoir au maximum 5 injections sur 5 jours consécutifs, selon les lignées utilisées. Pour certaines expériences, les animaux pourront recevoir une autre injection avant certaines séances expérimentales, avec un maximum d'une injection par séance et de 11 injections par animal sur l'ensemble de la période comportementale. Après récupération post-opératoire, les animaux seront progressivement habitués aux manipulations expérimentales et aux dispositifs d’enregistrement. Les séances comportementales dureront entre 30 minutes et 3 heures maximum par jour. La période comportementale, incluant l'habituation finale la restriction alimentaire contrôlée, les enregistrements et/ou les manipulations, durera au maximum 11 jours par animal. Une restriction alimentaire modérée pourra être mise en place uniquement pendant cette périodes comportementale, pour une durée maximale de 11 jours par animal. Le poids sera surveillé quotidiennement et maintenu à au moins 85 % du poids ad libitum. Les animaux seront ensuite replacés en hébergement collectif avec leurs congénères lorsque cela sera compatible avec leur état clinique et l'intégrité des implants.

Impact sur les animaux

Ce projet implique des chirurgies du cerveau réalisées sous anesthésie générale pouvant durer entre 1 et 4 heures selon la complexité des implants. Ces interventions sont susceptibles d’entraîner une douleur légère à modérée pendant quelques jours après la chirurgie, ainsi qu’une gêne transitoire liée à la cicatrisation et à la présence des implants chroniques. Les animaux subiront également des manipulations répétées, des périodes d’habituation aux dispositifs expérimentaux, des connexions aux systèmes d’enregistrement et, pour certains protocoles, un hébergement individuel temporaire. Ces procédures pourront induire un stress modéré transitoire. Les tâches comportementales nécessiteront une restriction alimentaire contrôlée destinée à maintenir la motivation des animaux. Cette restriction pourra entraîner une diminution modérée et réversible du poids corporel. Les nuisances attendues au cours du projet sont donc principalement : une douleur post-opératoire légère à modérée et transitoire, une gêne liée aux implants chroniques, un stress modéré associé aux manipulations et aux procédures comportementales, ainsi qu’une perte de poids légère et réversible liée à la restriction alimentaire.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet ne pourront pas être replacés ou adoptés à l’issue des procédures expérimentales. Une partie des animaux sera maintenue en vie de manière séquentielle entre certaines procédures compatibles du projet afin de permettre la réalisation des enregistrements comportementaux et des analyses prévues. La poursuite des expérimentations sera conditionnée à l’état de bien-être des animaux et à l’absence de signes de douleur ou de détresse incompatibles avec la poursuite des procédures. À l’issue du projet, tous les animaux seront mis à mort selon les méthodes réglementaires prévues afin de permettre la réalisation des analyses finales nécessaires aux objectifs scientifiques du projet. Ces analyses incluront notamment l’étude des tissus cérébraux, la vérification de la localisation des implants et des injections ainsi que l’évaluation de l’expression des marqueurs expérimentaux. Les animaux ne pourront pas être réutilisés dans d’autres projets en raison des chirurgies intracérébrales, des implants chroniques, des manipulations expérimentales réalisées et des prélèvements tissulaires finaux nécessaires aux analyses scientifiques.

Remplacement

Il n’existe actuellement pas d’alternative non animale permettant d’étudier de manière complète les mécanismes cérébraux impliqués dans la flexibilité cognitive et l’adaptation du comportement lorsque les règles de l’environnement changent. Les objectifs du projet nécessitent l’étude de l’activité de réseaux neuronaux intacts pendant des comportements complexes impliquant perception, apprentissage, prise de décision et modification de stratégie comportementale. Les cultures cellulaires, modèles informatiques ou autres approches in vitro ne permettent pas de reproduire l’organisation complète des circuits cérébraux, les interactions entre différents types cellulaires, ni les comportements cognitifs étudiés dans ce projet. De plus, les expériences nécessitent l’étude de l’activité neuronale chez des animaux éveillés réalisant des tâches comportementales, ce qui ne peut pas être reproduit par des méthodes alternatives. L’utilisation d’animaux vivants est donc nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Le nombre d’animaux sera limité autant que possible et plusieurs analyses complémentaires pourront être réalisées à partir d’un même animal afin de maximiser les données obtenues.

Réduction

Le nombre total d’animaux inclus dans ce projet a été estimé en tenant compte des objectifs scientifiques et des mesures de réduction mises en œuvre afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux. Plusieurs analyses complémentaires pourront être réalisées à partir d’un même animal, notamment les expériences comportementales, les enregistrements d’activité cérébrale, l’imagerie et les analyses histologiques finales, afin de maximiser les données obtenues pour chaque animal utilisé. Le nombre d’animaux sera également réduit grâce à l’utilisation de protocoles expérimentaux standardisés, à l’expérience des expérimentateurs et à l’optimisation des procédures chirurgicales et comportementales, permettant de limiter les pertes expérimentales et la variabilité des résultats. Lorsque cela sera possible, les tissus prélevés pourront également être utilisés pour plusieurs analyses complémentaires. Les animaux ne pourront généralement pas être réutilisés après certaines procédures en raison des implants chroniques, des manipulations expérimentales réalisées ou des analyses terminales nécessaires à la collecte des tissus cérébraux. La taille des groupes expérimentaux sera déterminée à partir des données de la littérature, d’expériences antérieures et d’analyses statistiques adaptées afin d’obtenir des résultats scientifiquement interprétables tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Des tests statistiques paramétriques ou non paramétriques appropriés seront utilisés selon les données obtenues.

Raffinement

Toutes les mesures visant à réduire au minimum la douleur, la souffrance, l’angoisse et les dommages durables subis par les animaux seront appliquées tout au long du projet. Les protocoles expérimentaux ont été conçus afin de limiter le stress lié aux manipulations, aux chirurgies et aux tâches comportementales. Les animaux bénéficieront d’une période d’habituation aux expérimentateurs et aux dispositifs expérimentaux afin de réduire le stress associé aux procédures. Les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie adaptée et accompagnées d’une prise en charge analgésique appropriée. Une surveillance régulière des animaux sera effectuée après les procédures expérimentales afin d’évaluer leur état général, leur poids, leur activité locomotrice et l’apparition éventuelle de signes de douleur ou de détresse. Des points limites spécifiques et précoces seront appliqués afin d’éviter toute souffrance prolongée. Les conditions d’hébergement et d’enrichissement du milieu seront adaptées aux besoins physiologiques et comportementaux des animaux. Les expérimentateurs impliqués dans le projet sont formés aux procédures expérimentales et au suivi du bien-être animal. Les protocoles expérimentaux pourront être ajustés au cours du projet afin d’intégrer toute nouvelle méthode de raffinement permettant d’améliorer le bien-être des animaux ou de réduire les nuisances expérimentales.

Choix des espèces

La souris est un modèle largement utilisé pour l’étude des fonctions cognitives et des mécanismes cérébraux impliqués dans l’apprentissage, la mémoire et la flexibilité comportementale. Les propriétés fondamentales des circuits neuronaux chez la souris sont comparables à celles observées chez d’autres mammifères, ce qui permet d’obtenir des connaissances pertinentes pour la compréhension du fonctionnement cérébral normal et pathologique. Cette espèce permet également la réalisation d’approches expérimentales complémentaires chez un même animal. Les souris présentent en outre l’avantage de pouvoir être génétiquement modifiées afin d’étudier le rôle de populations neuronales spécifiques impliquées dans les comportements étudiés. Les lignées transgéniques utilisées dans ce projet présentent des phénotypes compatibles avec les objectifs expérimentaux et ne présentent pas d’altérations majeures du comportement ou de l’état général en dehors des manipulations expérimentales réalisées dans le cadre du projet. Les souris seront incluses dans la procédure à partir d’environ 5 semaines d’âge selon les cohortes expérimentales. Les chirurgies du cerveau pourront être réalisées à partir de cet âge afin de permettre une période suffisante de récupération post-opératoire et d’expression virale avant le début des tâches comportementales ou des analyses terminales. Les tâches comportementales et les enregistrements in vivo seront réalisés après la période de récupération et d’expression virale, chez des animaux adultes ou jeunes adultes, à un stade de développement compatible avec les objectifs du projet. Ce choix permet de réaliser les implants chroniques suffisamment tôt tout en effectuant les mesures comportementales et physiologiques après maturation adaptée des circuits cérébraux étudiés.

Un frottis vaginal sur animal vigile, sans anesthésie pour ne pas ajouter de stress selon le porteur, ouvre le protocole en confirmant le premier jour de gestation des rates. 625 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les rates gestantes passent les 22 jours de gestation sous régime pauvre en protéines, et leurs ratons reçoivent après la naissance des injections répétées de lipopeptide dans l'abdomen, sous anesthésie gazeuse, avant des mesures de vocalisation et des IRM pour 36 d'entre eux. Le porteur mentionne dix femelles sous régime hypoprotéiné, 586 rats analysés entre 3 et 30 jours et six rats par lot expérimental, sans qu'on puisse déduire de ces nombres comment se répartissent les 625 rats demandés.

Objectifs

Les pathologies pré- et postnatales telles que le retard de croissance intra-utérin (RCIU) et l’inflammation chronique sont des facteurs de risque importants d’apparition de troubles neurodéveloppementaux. Mieux comprendre leurs effets est donc crucial pour identifier des approches thérapeutiques efficaces visant à minimiser ces risques. Dans ce contexte l’objectif de notre projet est de comprendre et traiter les lésions induites par ces pathologies pré- et postnatales individuelles et combinées, en mettant en lien ces lésions cérébrales avec l’altération des barrières sang-cerveau que nous avons précédemment mise en évidence, et en testant l’efficacité à long terme d’agents pharmacologique neuroprotecteurs.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’apporter des informations importantes sur le lien entre l’altération des barrières sang-cerveau et les troubles du neurodéveloppement. Less données antérieures montrent que la barrière sang-cerveau est plus impactée en cas d’agressions combinées à court terme. Il est probable que la compilation de plusieurs agressions soit à l’origine de lésions cérébrales plus durables incluant des altérations des fonctions des interfaces sang-cerveau à long terme. Par exemple des différences de signal à P21 pourraient être visualisées en micro-IRM chez les animaux ayant subi une inflammation chronique postnatale en sus du RCIU. Les deux types de stress que nous explorons, retard de croissance intra-utérin et inflammation chronique telles qu’induite par une infection périnatale, sont des facteurs de risque reconnus d’apparition de troubles neurodéveloppementaux. Ces travaux évaluant un défaut de neuroprotection assurée par les interfaces sang-cerveau vont générer les données mécanistiques indispensables à l’identification d’approches thérapeutiques efficaces visant à prévenir les effets neurologiques à court et à long termes induits par ces conditions délétères.

Procédures

Le projet débute avec une mise en reproduction de deux animaux (un mâle et une femelle par cage) pendant une nuit seulement. Un prélèvement vaginal sur animaux vigiles est ensuite effectué pour confirmer la présence de spermatozoïdes et donc valider le premier jour de gestation. Quelques secondes seulement sont nécessaires pour procéder au frottis et aucune contrainte physique n’est appliquée à l’animal. Une anesthésie n’est pas envisagée pour éviter d’appliquer un stress supplémentaire à l’animal. Ces femelles gestantes sont ensuite soumises à un régime alimentaire hypo-protéiné durant toute la période de gestation (22 jours, 10 femelles). Enfin les animaux des portées sont soumis en postnatal à une injection intraperitonéale de lipopeptide accompagné ou non d'une molécule thérapeutique neuroprotectrice qui se fait sous anesthésie gazeuse. Les analyses sont ensuite effectuées entre 3 et 30 jours (586 animaux). Certains animaux sont soumis à des mesures de vocalise, et des IRM qui s'effectuent également sous anesthésie gazeuse (36 animaux). L'ensemble du projet sera réalisé dans l'établissement utilisateur EU1, sauf pour la réalisation des IRM qui sera réalisée dans l’établissement utilisateur EU2.

Impact sur les animaux

Les femelles sont soumises à un régime hypo-protéiné qui peut affecter leur comportement durant toute la période de gestation. Une inactivité ainsi qu’une prise de poids réduite associées à ce régime pourront être observées durant la période de gestation. Les ratons soumis à l'exposition au lipopetide se nourrissent moins pendant les Premières 24h (augmentation de poids réduite d'environ 25 % par rapport aux contrôles), différence qui disparait ensuite. Les ratons pourront être impactés par la séparation d’avec la mère pendant la période d’analyse de comportement, par les injections répétées sur plusieurs jours, ainsi que par les réveils d’anesthésie.

Devenir

Tous les animaux des portées ayant subi une intervention sont mis à mort à différents temps post-nataux afin de collecter les tissus pour analyses. Les mères soumises à un régime alimentaire hypoprotéiné sont mises à mort après utilisation ou sevrage des petits.

Remplacement

Bien que des modèles in vitro de barrières sang-cerveau (e.g. cellules endothéliales cérébrales) existent, ils ne permettent pas d’étudier l'influence globale des différentes cellules cérébrales sur la perméabilité de ces interfaces, et ne permettent pas de mimer des pathologies périnatales tels que le retard de croissance intrautérin. Par ailleurs, la circulation du liquide cérébrospinal dont le rôle est reconnu dans les processus neuroinflammatoires, en particulier comme vecteur de cellules immunes et de cytokines, ne peut être reproduite in vitro à l'identique de la physiologie. Les séquelles neurologiques résultantes d’une atteinte périnatale dépendent de mécanismes complexes impossibles à reproduire in vitro. Nous testons une molécule neuroprotectrice dont l’administration ne prend sens que dans un modèle d’étude globale in situ. L’analyse in vivo reste donc incontournable pour ce projet de recherche.

Réduction

- Les rates gestantes non soumises à un régime pauvre en protéine au cours de la grossesse pourront être utilisées pour de nouvelles reproductions (jusqu’à 5 reproductions par femelle), puisque seuls les ratons subissent des traitements ultérieurs à la naissance. - Nous prévoyons un nombre de six animaux par lot expérimental, et chaque condition reproduite sur 2 portées différentes, afin de remplir les conditions statistiques de test de significativité réalisés précédemment pour ce type d’expérimentation. - Les portées chez ces rats sont habituellement d’au moins 12 animaux ce qui permettra de réaliser des comparaisons au sein d’une même portée.

Raffinement

- Le poids des rates gestantes soumises à un régime pauvre en protéine sera suivi régulièrement tous les trois jours à partir de la mise en reproduction. Les rates utilisées pour les reproductions observeront une période quiescente d’un mois minimum entre une naissance et une nouvelle mise en reproduction. - Cette méthode est reconnue comme moins invasive que les autres méthodes d’induction d’un retard de croissance (ligature des artères utérines). - Les ratons seront suivis attentivement avec un contrôle pondéral journalier jusqu’à P6, puis tous les trois jours, jusqu’à P15 puis à P21 ou P30. Le traitement des animaux se fera sos anesthésie gazeuse. Après traitement ou manipulation, les animaux seront replacés avec la rate avec suivi du comportement maternel et de l’allaitement. - Pour l’exploration par IRM, la mère avec la portée sera transférée avec la litière et l’enrichissement dans une cage de transport (500 m). La cage de transport présentera un couvercle avec un emballage carton opaque. Les ratons seront séparés de leur mère uniquement pendant le temps de l’examen, qui s'effectuera sous anesthésie gazeuse. Enfin une étude pilote sera menée pour tester si la voie sous-cutanée peut être utilisée pour l’injection de traceurs ou médicaments en place de l’injection intrapéritonéale très utilisée chez les animaux en développement mais pouvant engendrer de la variabilité et moins pertinente vis-à-vis de la médecine humaine.

Choix des espèces

Les expériences décrites dans ce projet seront effectuées sur des rats, espèce utilisée dansles APAFiS précédente. C’est une espèce de prédilection pour des expérimentations qui requièrent une optimisation des gestations. Les femelles de cette lignée ont en effet des portées importantes et régulières. Elles s’occupent très bien de leurs petits. Les données déjà acquises sur ce projet l'ont été avec ce modèle. Les animaux seront mis à mort soit à 8 jours postnatal (P8), soit à P30. Ces différents temps nous permettront d’évaluer l'effet du RCIU associés ou non à l'inflammation chronique sur l'intégrité des interfaces sang-cerveau au cours du développement précoce, ainsi qu'une fois la fenêtre de plasticité cérébrale refermées (Impact sur la programmation foetale, P30).

Sur 300 rats, 180 seront mis à mort et 120 orientés vers d'autres protocoles déjà autorisés, selon leur génotype, leur sexe, leur âge et ce que réclament ces protocoles. Ils relèvent de procédures d'un niveau de souffrance modéré, limitées ici au tatouage des phalanges et à un prélèvement d'oreille de 2 mm pour génotypage, sous anesthésie locale, vers l'âge de quatre semaines. Ces rats appartiennent à une lignée transgénique qui développe progressivement des caractéristiques de la maladie d'Alzheimer, et le porteur prévoit de limiter à dix mois l'âge des reproducteurs pour rester en deçà des déficits les plus marqués. Il retient le rat pour sa taille, qui permet selon lui de réaliser mesures physiologiques et imagerie cérébrale dans de bonnes conditions.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mettre en place et maintenir une colonie de rats présentant certaines caractéristiques de la maladie d’Alzheimer afin de disposer d’un modèle animal adapté aux futurs projets de recherche. Ces recherches visent à mieux comprendre les liens entre le sommeil, les mouvements naturels des vaisseaux sanguins du cerveau, les mécanismes d’élimination des déchets cérébraux et le développement de la maladie d’Alzheimer. Pour cela, une lignée de rats génétiquement modifiés sera importée depuis un laboratoire partenaire européen puis reproduite au sein de l’établissement utilisateur afin de produire les animaux nécessaires aux futurs projets de recherche autorisées.

Bénéfices attendus

La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative fréquente dont les mécanismes restent encore partiellement compris. Les connaissances obtenues grâce à ce projet permettront d’améliorer la compréhension des liens entre le sommeil, le fonctionnement des vaisseaux sanguins cérébraux et l’accumulation de substances impliquées dans la maladie. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer à identifier de nouvelles pistes pour la prévention, le diagnostic précoce ou le développement de stratégies thérapeutiques destinées aux patients atteints de maladie d’Alzheimer.

Procédures

À l’âge d’environ 4 semaines, chaque animal fera l’objet d’une procédure d’identification par le tatouage des phalanges et d'un génotypage réalisé au moyen d'un prélèvement auriculaire par ear punch de 2 mm, effectué au cours de la même manipulation. Une anesthésie locale par lidocaïne sera appliquée avant le prélèvement afin de limiter la douleur liée à cette procédure. L'ensemble de la manipulation dure environ 5 minutes et n'est réalisé qu'une seule fois par animal.

Impact sur les animaux

Les effets attendus sont principalement liés aux manipulations nécessaires au maintien de la lignée, à la reproduction, à l'identification et au génotypage des animaux. Le tatouage et le prélèvement auriculaire par punch peuvent provoquer une douleur légère et transitoire ainsi qu'un stress temporaire lié à la contention. Les mises en reproduction, les changements de cage et le sevrage des jeunes animaux peuvent également entraîner un stress de courte durée. Les animaux appartenant à cette lignée développent progressivement certaines caractéristiques de la maladie d'Alzheimer. Toutefois, ils seront majoritairement utilisés aux stades précoces et intermédiaires de la maladie, avant l'apparition des déficits les plus sévères. Leur état de bien-être fera l'objet d'une surveillance régulière afin de détecter rapidement toute altération de leur état général.

Devenir

A l’issue de la procédure d’élevage, les animaux seront orientés selon leur génotype, leur sexe, leur âge, leur état sanitaire et les besoins d'un autre projet. Les animaux nécessaires aux expériences futures autorisées seront maintenus jusqu’à leur inclusion dans les protocoles correspondants. Les animaux WT issus des mêmes portées pourront être conservés comme contrôles ou comme reproducteurs, afin d’assurer la pérennité de la colonie. Les animaux non retenus pour les expériences ou la reproduction, ou atteignant un point limite, seront mis à mort conformément à la réglementation en vigueur.

Remplacement

La maladie d’Alzheimer implique des mécanismes complexes faisant intervenir de nombreux systèmes biologiques, notamment les interactions entre activité cérébrale, sommeil, système vasculaire, neuroinflammation et neurodégénérescence. Des approches de remplacement seront utilisées autant que possible dans le projet, notamment des modèles in silico, des analyses de données existantes et des systèmes expérimentaux simplifiés tels que des dispositifs in vitro ou des hydrogels mimant certaines propriétés du tissu cérébral. Ces approches permettront de réduire le recours à l’animal et d’orienter les hypothèses expérimentales. Cependant, elles ne permettent pas de reproduire l’ensemble des interactions physiologiques nécessaires à cette étude, notamment l’organisation du sommeil, les régulations vasculaires cérébrales, les interactions neurovasculaires, les réponses inflammatoires progressives et l’évolution neuropathologique dans un organisme vivant. Le recours à un modèle animal reste donc nécessaire pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Le modèle rat choisit est adapté à cette question car il reproduit progressivement plusieurs caractéristiques de la maladie d’Alzheimers. Le maintien de cette lignée est donc nécessaire afin de produire les animaux requis pour les expériences autorisées dans le cadre du projet.

Réduction

Les stratégies de reproduction seront organisées afin d’optimiser la production d’animaux expérimentaux tout en limitant le nombre total d’animaux produits. Les animaux WT issus des mêmes portées que les animaux transgéniques seront utilisés comme contrôles afin de limiter les biais liés à l’origine des portées et d’optimiser le nombre d’animaux nécessaires. Les reproductions seront planifiées de manière à obtenir des lots homogènes d’animaux correspondant aux différents groupes d’âge étudiés dans des projets de recherche autorisés à venir (3, 6 et 9 mois). Cette organisation permettra de limiter la production excédentaire d’animaux. Le génotypage des descendants permettra de sélectionner uniquement les animaux nécessaires au maintien de la lignée ou aux futurs projets expérimentaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur, avec enrichissement du milieu, accès ad libitum à l’eau et à l’alimentation, et surveillance quotidienne par du personnel qualifié. L’état général, le poids, le comportement, l’activité, l’aspect du pelage et la présence éventuelle de chromodacryorrhée seront suivis afin de détecter précocement toute altération du bien-être. Les animaux seront manipulés régulièrement et de manière adaptée afin de limiter le stress lié à la contention, aux interventions de suivi et aux procédures réalisées dans le cadre de l’élevage. Les procédures d’identification et de génotypage seront réalisées par du personnel formé, selon les pratiques en vigueur, afin de réduire la durée de manipulation et l’inconfort. Le tatouage au doigt et la biopsie d’oreille seront réalisés avec le matériel approprié, en limitant le nombre de manipulations et en surveillant les animaux après la procédure afin de détecter toute réaction locale ou tout signe d’inconfort persistant. Une surveillance particulière des animaux reproducteurs sera mise en place, notamment chez les animaux vieillissants, afin de détecter les signes éventuellement associés au phénotype dommageable de la lignée transgénique, tels qu’une perte de poids, une modification du comportement ou une chromodacryorrhée. Dans ce projet, l’âge maximal des animaux maintenus pour la reproduction sera limité à 10 mois, ce qui réduit le risque d’apparition de déficits cognitifs ou de signes cliniques majeurs, généralement décrits à des âges plus avancés. Des points limites adaptés seront appliqués afin de permettre une prise en charge rapide des animaux présentant une altération du bien-être. Selon la situation, les mesures pourront inclure une surveillance renforcée, des soins adaptés, le retrait de la reproduction ou une mise à mort anticipée si nécessaire, afin de limiter toute souffrance inutile. Les pratiques de raffinement seront réévaluées pendant toute la durée du projet. Toute amélioration validée permettant de réduire le stress, la douleur ou l’inconfort des animaux pourra être intégrée aux procédures, en concertation avec la structure chargée du bien-être animal, les vétérinaires et le personnel compétent.

Choix des espèces

Le projet utilise des rats, incluant une lignée transgénique développant progressivement certaines caractéristiques de la maladie d’Alzheimer. Ce modèle est particulièrement adapté à l’étude des interactions entre sommeil, fonctionnement des vaisseaux sanguins cérébraux et progression de la maladie. Le rat a été choisi car sa taille permet la réalisation de mesures physiologiques et d’imagerie cérébrale dans de bonnes conditions. Les animaux seront utilisés à différents âges correspondant à plusieurs étapes de l’évolution de la pathologie. Les reproducteurs seront utilisés à partir de leur maturité sexuelle, tandis que les descendants pourront être suivis jusqu’à l’âge de 10 mois, période correspondant à des stades précoces et intermédiaires de la maladie avant l’apparition des symptômes.

625 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les rates gestantes sont soumises à un régime pauvre en protéines pendant les 22 jours de gestation pour provoquer un retard de croissance chez leurs petits, dont les barrières sang-cerveau seront ensuite examinées, et les ratons reçoivent après la naissance des injections répétées de lipopeptide dans l'abdomen, sous anesthésie gazeuse. Le porteur indique que ces ratons se nourrissent moins pendant les premières 24 heures, avec une prise de poids réduite d'environ 25 % par rapport aux contrôles, et signale aussi l'effet de la séparation d'avec la mère pendant les mesures de vocalisation et les IRM. Les petits sont mis à mort entre 3 et 30 jours pour prélever leurs tissus, les mères après le sevrage, et le porteur écrit que l'analyse in vivo reste "incontournable" pour ce projet de recherche.

Objectifs

Les pathologies pré- et postnatales telles que le retard de croissance intra-utérin (RCIU) et l’inflammation chronique sont des facteurs de risque importants d’apparition de troubles neurodéveloppementaux. Mieux comprendre leurs effets est donc crucial pour identifier des approches thérapeutiques efficaces visant à minimiser ces risques. Dans ce contexte l’objectif de notre projet est de comprendre et traiter les lésions induites par ces pathologies pré- et postnatales individuelles et combinées, en mettant en lien ces lésions cérébrales avec l’altération des barrières sang-cerveau que nous avons précédemment mise en évidence, et en testant l’efficacité à long terme d’agents pharmacologique neuroprotecteurs.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’apporter des informations importantes sur le lien entre l’altération des barrières sang-cerveau et les troubles du neurodéveloppement. Less données antérieures montrent que la barrière sang-cerveau est plus impactée en cas d’agressions combinées à court terme. Il est probable que la compilation de plusieurs agressions soit à l’origine de lésions cérébrales plus durables incluant des altérations des fonctions des interfaces sang-cerveau à long terme. Par exemple des différences de signal à P21 pourraient être visualisées en micro-IRM chez les animaux ayant subi une inflammation chronique postnatale en sus du RCIU. Les deux types de stress que nous explorons, retard de croissance intra-utérin et inflammation chronique telles qu’induite par une infection périnatale, sont des facteurs de risque reconnus d’apparition de troubles neurodéveloppementaux. Ces travaux évaluant un défaut de neuroprotection assurée par les interfaces sang-cerveau vont générer les données mécanistiques indispensables à l’identification d’approches thérapeutiques efficaces visant à prévenir les effets neurologiques à court et à long termes induits par ces conditions délétères.

Procédures

Le projet débute avec une mise en reproduction de deux animaux (un mâle et une femelle par cage) pendant une nuit seulement. Un prélèvement vaginal sur animaux vigiles est ensuite effectué pour confirmer la présence de spermatozoïdes et donc valider le premier jour de gestation. Quelques secondes seulement sont nécessaires pour procéder au frottis et aucune contrainte physique n’est appliquée à l’animal. Une anesthésie n’est pas envisagée pour éviter d’appliquer un stress supplémentaire à l’animal. Ces femelles gestantes sont ensuite soumises à un régime alimentaire hypo-protéiné durant toute la période de gestation (22 jours, 10 femelles). Enfin les animaux des portées sont soumis en postnatal à une injection intraperitonéale de lipopeptide accompagné ou non d'une molécule thérapeutique neuroprotectrice qui se fait sous anesthésie gazeuse. Les analyses sont ensuite effectuées entre 3 et 30 jours (586 animaux). Certains animaux sont soumis à des mesures de vocalise, et des IRM qui s'effectuent également sous anesthésie gazeuse (36 animaux). L'ensemble du projet sera réalisé dans l'établissement utilisateur EU1, sauf pour la réalisation des IRM qui sera réalisée dans l’établissement utilisateur EU2.

Impact sur les animaux

Les femelles sont soumises à un régime hypo-protéiné qui peut affecter leur comportement durant toute la période de gestation. Une inactivité ainsi qu’une prise de poids réduite associées à ce régime pourront être observées durant la période de gestation. Les ratons soumis à l'exposition au lipopetide se nourrissent moins pendant les Premières 24h (augmentation de poids réduite d'environ 25 % par rapport aux contrôles), différence qui disparait ensuite. Les ratons pourront être impactés par la séparation d’avec la mère pendant la période d’analyse de comportement, par les injections répétées sur plusieurs jours, ainsi que par les réveils d’anesthésie.

Devenir

Tous les animaux des portées ayant subi une intervention sont mis à mort à différents temps post-nataux afin de collecter les tissus pour analyses. Les mères soumises à un régime alimentaire hypoprotéiné sont mises à mort après utilisation ou sevrage des petits.

Remplacement

Bien que des modèles in vitro de barrières sang-cerveau (e.g. cellules endothéliales cérébrales) existent, ils ne permettent pas d’étudier l'influence globale des différentes cellules cérébrales sur la perméabilité de ces interfaces, et ne permettent pas de mimer des pathologies périnatales tels que le retard de croissance intrautérin. Par ailleurs, la circulation du liquide cérébrospinal dont le rôle est reconnu dans les processus neuroinflammatoires, en particulier comme vecteur de cellules immunes et de cytokines, ne peut être reproduite in vitro à l'identique de la physiologie. Les séquelles neurologiques résultantes d’une atteinte périnatale dépendent de mécanismes complexes impossibles à reproduire in vitro. Nous testons une molécule neuroprotectrice dont l’administration ne prend sens que dans un modèle d’étude globale in situ. L’analyse in vivo reste donc incontournable pour ce projet de recherche.

Réduction

- Les rates gestantes non soumises à un régime pauvre en protéine au cours de la grossesse pourront être utilisées pour de nouvelles reproductions (jusqu’à 5 reproductions par femelle), puisque seuls les ratons subissent des traitements ultérieurs à la naissance. - Nous prévoyons un nombre de six animaux par lot expérimental, et chaque condition reproduite sur 2 portées différentes, afin de remplir les conditions statistiques de test de significativité réalisés précédemment pour ce type d’expérimentation. - Les portées chez ces rats sont habituellement d’au moins 12 animaux ce qui permettra de réaliser des comparaisons au sein d’une même portée.

Raffinement

- Le poids des rates gestantes soumises à un régime pauvre en protéine sera suivi régulièrement tous les trois jours à partir de la mise en reproduction. Les rates utilisées pour les reproductions observeront une période quiescente d’un mois minimum entre une naissance et une nouvelle mise en reproduction. - Cette méthode est reconnue comme moins invasive que les autres méthodes d’induction d’un retard de croissance (ligature des artères utérines). - Les ratons seront suivis attentivement avec un contrôle pondéral journalier jusqu’à P6, puis tous les trois jours, jusqu’à P15 puis à P21 ou P30. Le traitement des animaux se fera sos anesthésie gazeuse. Après traitement ou manipulation, les animaux seront replacés avec la rate avec suivi du comportement maternel et de l’allaitement. - Pour l’exploration par IRM, la mère avec la portée sera transférée avec la litière et l’enrichissement dans une cage de transport (500 m). La cage de transport présentera un couvercle avec un emballage carton opaque. Les ratons seront séparés de leur mère uniquement pendant le temps de l’examen, qui s'effectuera sous anesthésie gazeuse. Enfin une étude pilote sera menée pour tester si la voie sous-cutanée peut être utilisée pour l’injection de traceurs ou médicaments en place de l’injection intrapéritonéale très utilisée chez les animaux en développement mais pouvant engendrer de la variabilité et moins pertinente vis-à-vis de la médecine humaine.

Choix des espèces

Les expériences décrites dans ce projet seront effectuées sur des rats, espèce utilisée dansles APAFiS précédente. C’est une espèce de prédilection pour des expérimentations qui requièrent une optimisation des gestations. Les femelles de cette lignée ont en effet des portées importantes et régulières. Elles s’occupent très bien de leurs petits. Les données déjà acquises sur ce projet l'ont été avec ce modèle. Les animaux seront mis à mort soit à 8 jours postnatal (P8), soit à P30. Ces différents temps nous permettront d’évaluer l'effet du RCIU associés ou non à l'inflammation chronique sur l'intégrité des interfaces sang-cerveau au cours du développement précoce, ainsi qu'une fois la fenêtre de plasticité cérébrale refermées (Impact sur la programmation foetale, P30).

Une amputation de la phalange distale dans les huit premiers jours de vie, pratiquée sur toutes les souris pour les identifier et les génotyper, ouvre le protocole. 5 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, exposées à des sons de deux heures et pouvant aller jusqu'à huit heures, puis suivies par des séances d'audition d'une heure toutes les une à deux semaines, une partie subissant en plus une chirurgie d'une heure suivie de deux heures de mesures. L'objet est de mesurer ce que le bruit abîme dans le système auditif et ses relais cérébraux, chez des souris dont beaucoup portent des mutations de gènes de surdité. Toutes sont tuées, le porteur indiquant qu'elles "ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés", et que leurs corps servent ensuite, quand c'est possible, à des entraînements à la dissection au sein du centre de recherche.

Objectifs

Objectif : Etudier les conséquences d’un son d’intensité moyenne à forte et ce dans la durée sur les réseaux neuronaux auditifs et la santé des individus. LE SYSTEME AUDITIF Le système auditif humain comprend l’oreille externe, l’oreille moyenne, l’oreille interne, ainsi que les centres neuronaux de traitement des stimuli auditifs. La cochlée comporte l’organe de Corti, qui abrite les cellules sensorielles, dites cellules ciliées. Il repose sur une membrane basilaire, qui contribue à l’analyse fréquentielle du son. Il y a quelques 14 000 cellules ciliées chez l’homme. Sous l’effet de la stimulation sonore, leur dépolarisation conduit à la libération de neurotransmetteur. Au total, ces 30 000 neurones chez l’homme forment le nerf auditif, qui lie la cochlée au noyau cochléaire, premier relais auditif du cerveau. Ensuite, l’information chemine à travers les divers autres noyaux du cerveau jusqu’au centre auditif. LE BRUIT ENVIRONNEMENTAL L’exposition à un bruit excessif est la première cause environnementale de troubles de l’audition. La surexposition sonore dans les mégapoles dont la densité de population ne cesse de croître ainsi que dans de nombreuses activités de loisirs pour lesquelles l’exposition sonore est peu ou mal contrôlée constitue une menace grandissante pour l’audition à l’échelle planétaire. Les conséquences au niveau central, aussi bien du point de vue des réseaux neuronaux que du point de vue des performances de l’individu dans des tâches auditives sont en outre peu étudiées. A un niveau plus intégratif encore, les conséquences du bruit sur la santé des individus et leurs interactions sociales restent également un sujet de recherche actif. Des résultats suggèrent en outre que les lésions cochléaires dues à une surexposition au bruit sont à l’origine d’une exacerbation de la progression de la perte auditive liée à l'âge (presbyacousie).

Bénéfices attendus

En caractérisant les atteintes auditives liées à la surexposition sonore et également dans les formes génétiques de surdité, notre projet permettra les avancées suivantes : - Nous déterminerons les mécanismes physiopathologiques à l’origine des surdités dans les modèles porteurs des mutations des gènes étudiées. - Un grand nombre de cas de surdités progressives reste souvent inexpliqué. En caractérisant très finement la signature audiologique des souris mutantes, notre travail aidera à identifier les cas de surdités non expliqués qui pourraient être liés à des expositions sonores répétées d’intensités moyennes. - Enfin, notre travail générera des pistes pour de nouvelles approches thérapeutiques susceptibles de prévenir la surdité chez les patients exposés ou porteurs de mutations spécifiques dans des gènes de surdité en testant de nouvelles molécules aux effets protecteurs face à une exposition traumatique sonore.

Procédures

Les interventions seront : - Un prélèvement de phalange sera effectué sur tous les animaux pour l’identification des souris, dans les 8 premiers jours de vie du projet afin de déterminer s’ils sont porteurs ou non de mutations du gène étudié et pour pouvoir commencer les expérimentations à partir du stade P12. Cette procédure dure une dizaine de secondes. Les prélèvements seront utilisés pour le génotypage. De plus cela permettra de constituer les cohortes avant le sevrage et de ne pas maintenir en vie des animaux non nécessaires à la reproduction ou aux expérimentations. Pour les expérimentations sur l’adulte, les animaux seront identifiés soit par prélèvement auriculaire soit par une puce implantée en sous-cutané. - Nous effectuerons un suivi de l’audition de modèles de souris pour des atteintes auditives à la suite de de l’exposition sonore et dépendant du gène étudié. Ce suivi aura lieu à la suite de l’exposition et au cours du temps, approximativement toutes les unes à deux semaines afin de suivre l’évolution de la surdité induite par le bruit. Chaque suivi dure environ 1h. - Une partie des animaux auront une chirurgie soit terminale soit pour permettre des enregistrements électrophysiologiques sur l’animal éveillé ensuite. Chaque chirurgie aura une durée de 1h et suivi de 2h de mesures fonctionnelles.

Impact sur les animaux

La plupart des procédures impliquent des expérimentations légères ou modérées ou une succession d’expérimentations légères. Quelques manipulations du projet pourraient entraîner des nuisances : - L'identification se fait par amputation de la phalange distale dans les 8 premiers jours de vie, douleur au moment de l’amputation. - Certaines expositions sonores d’une durée de 2h et pouvant aller jusqu’à 8h pourraient induire un stress temporaire sur l’animal, n’excédant pas quelques heures. C’est pourquoi les différentes mesures utilisant ces tests sont espacées dans le temps. Les études des cinquante dernières années sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité liée au bruit chez les rongeurs. - En ce qui concerne les chirurgies : Si celles-ci sont terminales, un protocole de médication antidouleur sera appliqué à l’animal en début de procédure. Pour les chirurgies de préparation aux enregistrements neuronaux sur animal éveillé, la douleur et l’inconfort modérée seront contrôlés par des antalgiques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, l’ensemble des animaux du projet sont des organismes génétiquement modifiés, de nombreuses procédures nécessitent la mise à mort de l’animal pour récupérer des tissus afin d’effectuer différentes expérimentations ex vivo. D’autres procédures impliquent des interventions qui signifient qu’on ne peut pas les réutiliser. La plupart des animaux sont porteurs de mutations de gènes de surdité très spécifiques rendant impossible leur réutilisation par d’autres équipes. Cependant, une fois les animaux mis à mort, nous essayons de les utiliser pour des entraînements à la dissection et la mise au point de nouveaux protocoles lorsque c’est possible. Ces partages se font typiquement à l’échelle du centre de recherche au-delà de notre équipe.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative que ce soient des études au niveau cellulaire ou tissulaire ne sont connues et envisagées pour ce projet. En effet, il n’est pas possible actuellement de simuler de manière pertinente les effets des entrées sensorielles sur des circuits cérébraux composés de millions de neurones densément connectés, en interaction avec l’évolution des niveaux de stress des animaux.

Réduction

La réduction a pour objectif d’utiliser le nombre suffisant d’animaux pour avoir des résultats scientifiques significatifs. Les groupes sont constitués afin de garantir une puissance statistique de 80% pour des différences de 20%. Nous utilisons des tests classiques pour tester la significativité de nos résultats. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et nous appliquons plusieurs mesures sur le même animal dès que possible.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement par les expérimentateurs ou les zootechniciens. Ce projet ne concerne que des procédures dont la mise en œuvre ne devrait se traduire ni par une dégradation de l’état de santé de l’animal ni par des douleurs importantes. Si nous observions un comportement anormal en termes de santé (observation du poids, du pelage, etc.) dès l’initiation de l’intégration dans un groupe expérimental, l’animal serait immédiatement mis à mort. Plusieurs méthodes de raffinement sont utilisées dans nos projets. Nous avons par exemple veillé à ce que nos tests comportementaux ne reposent pas sur des motivations par des déprivations de nourriture ou d’eau. Lors des chirurgies, des antalgiques et des couvertures chauffantes sont utilisées afin de limiter au strict minimum le risque d’hypothermie et de stress physique. Un renforcement des enrichissements (igloo, coton, tunnel, roue…) est utilisé dans les cages d’hébergements. En cas d’hypothermie, des couvertures chauffantes sur le fond de la cage sont également utilisées. En cas de déshydratation, des réhydratations sous-cutanées sont réalisées ainsi que la fourniture de gel nutritif ou de croquettes mouillées. Plusieurs points limites spécifiques et précoces pendant la chirurgie (hémorragies, baisse des constantes vitales etc…), post-chirurgie (infections, douleurs persistantes) ou post-stimulation sonore basés sur une grille de scorage incluant aspect extérieur, activité de déplacement, capacité à boire et s’alimenter, réactivité à la préhension, isolement du groupe, sont établis pour éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Nous souhaitons recourir aux souris de laboratoire dont le système auditif est similaire à celui de l’homme. De plus, la souris de laboratoire est le seul mammifère modèle pour lequel on dispose d’outils génétiques conséquents. L’audition se met en place chez la souris autour de P10-P12. Le projet impliquera principalement donc des animaux âgés d’au moins P10 afin de pouvoir étudier les effets du bruit sur le système auditif au cours de la vie de l’animal.

Une injection dans la patte arrière provoque un œdème et une douleur qui dure de deux à sept jours, puis la voûte plantaire est soumise à un stimulus mécanique ou thermique jusqu'au retrait de la patte, à huit reprises en soixante-douze heures. 133 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue pour des prélèvements terminaux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objet est de tester si un antihistaminique ancien, la mépyramine, encapsulé dans des nanoparticules, soulage durablement cette douleur après une seule injection. Le porteur qualifie ces mesures de "tests comportementaux non invasifs", tout en décrivant un stimulus qui "va déclencher une douleur légère à modérée provoquant le retrait spontané de la patte".

Objectifs

Les douleurs liées à l’inflammation (arthrites, tendinites, douleurs post-opératoires) sont très fréquentes et souvent traitées par des médicaments anti-inflammatoires ou des antidouleurs puissants (morphine et dérivés), dont l’usage prolongé expose à des effets indésirables et à un risque de dépendance. Ce projet étudie une nouvelle façon d’administrer un médicament antihistaminique connu depuis longtemps, la mépyramine, dont on a récemment découvert qu’il bloque des récepteurs impliqués dans la transmission de la douleur. Ce médicament est encapsulé dans des nanoparticules (NPs) qui permettent de le protéger, de le libérer progressivement et de prolonger son effet. Une autre nanoparticule, appelé hybride, associera la mépyramine à une morphine endogène naturellement produite par l’organisme pour soulager la douleur, afin de tester si la combinaison des deux est plus efficace. L’objectif est de vérifier, chez le rat, si ces nanoparticules permettent de soulager durablement la douleur liée à une inflammation, d’abord dans un modèle d’inflammation de courte durée (2-3 jours), puis, si les résultats sont positifs, dans un modèle d’inflammation plus durable (une semaine).

Bénéfices attendus

Si les résultats sont positifs, ce projet montrera qu’un médicament déjà connu, la mépyramine, reformulé sous forme de nanoparticules, peut soulager durablement la douleur d’inflammation après une seule injection, par un mécanisme différent de celui de la morphine et de ses dérivés. Cela ouvrirait la voie à de nouvelles options de traitement de la douleur inflammatoire, permettant de limiter le recours aux antidouleurs opioïdes et leurs effets indésirables (tolérance, dépendance), pour des pathologies très répandues (arthrites, douleurs post-opératoires). La combinaison avec la Leu-enképhaline, molécule naturelle de l’organisme impliquée dans le soulagement de la douleur, pourrait permettre de renforcer cet effet tout en utilisant de plus petites quantités de chaque substance. Ces résultats fourniront des données précliniques de preuve de concept et constitueront une étape importante avant d’envisager le développement clinique de ce type de traitement chez l’Homme (option analgésique périphérique non opioïde).

Procédures

80 rats seront soumis à : - trois injections sous anesthésie générale (quelques secondes par injection) - des tests comportementaux non invasifs sur animal vigile avec des mesures répétées sur les deux pattes, à 8 reprises sur 72 heures. Chaque mesure dure 10 à 20 secondes. 53 rats seront soumis à : - trois à sept injections maximum sous anesthésie générale (quelques secondes par injection, maximum une injection par jour), - des tests comportementaux non invasifs sur animal vigile avec des mesures répétées sur les deux pattes, à 6 reprises sur 7 jours. Chaque mesure dure 10 à 20 secondes.

Impact sur les animaux

Dans le modèle d’inflammation modérée de courte durée, les animaux développent un œdème local et une sensibilité douloureuse de la patte injectée (boiterie discrète, léger léchage de la patte), maximales entre 3 et 24 heures et résolutives en 48 à 72 heures. Aucune altération de l’état général, de la prise alimentaire ou du poids n’est habituellement observée à ces doses. Le modèle d’inflammation persistant induit un œdème plus marqué et plus durable, associé à une sensibilité douloureuse de la patte injectée, persistant sur toute la durée de la procédure (7 jours). Une boiterie modérée et une diminution transitoire de l’appui sur la patte affectée sont attendues. Une légère baisse de la prise alimentaire peut survenir dans les 48 premières heures. La voute plantaire des pattes arrière du rat sera soumise à un stimulus mécanique ou thermique, qui va déclencher une douleur légère à modérée provoquant le retrait spontané de la patte, l’animal n’étant pas contraint. L’anesthésie (pour réaliser les injections) entraînent un léger stress lié à la perte de conscience.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de leur procédure. Cette mise à mort systématique est justifiée par la nécessité de réaliser des prélèvements terminaux (sang et organes) indispensables aux analyses.

Remplacement

Comprendre comment un médicament soulage la douleur nécessite d’observer un comportement chez un animal possédant un système nerveux complet : aucune méthode alternative (cultures cellulaires, simulations informatiques) ne permet aujourd’hui de remplacer complètement cette étape. Avant d’en arriver à l’animal, des études en laboratoire (sur des cellules et sur les nanoparticules elles-mêmes) ont déjà permis de vérifier que les médicaments conservent leur activité une fois encapsulés, et de choisir les formulations les plus prometteuses, limitant ainsi le nombre de produits testés chez l’animal. Aucune méthode de remplacement total n’est donc disponible à ce stade pour atteindre l’objectif scientifique du projet, à savoir démontrer in vivo l’efficacité analgésique périphérique et prolongée des nanomédicaments étudiées dans un contexte de douleur inflammatoire.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé au plus juste sur la base de tests statistiques pour obtenir des résultats fiables, en se basant sur l’expérience d’études similaires. Le projet est organisé en deux étapes : un premier test rapide (modèle de douleur transitoire, quelques jours) permet de vérifier si les nanoparticules sont efficaces avant de poursuivre, le cas échéant, avec un second test plus long (modèle de douleur persistante, une semaine). Si une formulation ne fonctionne pas lors du premier test, elle ne sera pas testée une seconde fois, ce qui évite d’utiliser des animaux pour des produits inefficaces. Chaque animal sera également son propre témoin, grâce à la comparaison entre la patte traitée et la patte non traitée, ce qui améliore la fiabilité des résultats sans augmenter le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux sont habitués à la manipulation et aux tests avant le début de l’expérience pour limiter leur stress le jour de la procédure. Toutes les injections sont réalisées par du personnel formé, sous une courte anesthésie générale. Un suivi clinique quotidien sera assuré par les expérimentateurs, avec des points limites permettant une intervention précoce en cas de signe de souffrance excédant les attendus du modèle. Les tests comportementaux seront réalisés dans une salle calme, par le même expérimentateur, afin de limiter le stress lié à la manipulation et la variabilité des mesures. Les animaux sont logés dans des cages aménagées, en groupes, avec accès libre à l’eau et à la nourriture, dans un environnement enrichi afin de favoriser le bien-être animal. L'accès à la nourriture et à l'eau sera facilité pendant la période où les animaux présentent une gêne locomotrice.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce de référence pour les tests de douleur utilisés dans ce projet (mesure de la sensibilité de la patte). Sa taille permet des mesures précises et répétées. Des rats adultes jeunes (8 à 12 semaines), mâles, seront utilisés : ce stade correspond à un système nerveux et immunitaire matures, garantissant des réponses stables et comparables aux études antérieures.