Système nerveux

Une instillation nasale de virus grippal ou une injection de cytomégalovirus dans le péritoine, puis une série de tâches non nommées mesurant anxiété, humeur et mémoire : 856 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'infection provoque un syndrome fébrile pouvant durer sept jours, avec perte de poids et anxiété, et chaque souris passe jusqu'à dix jours seule en cage pour l'évaluation individuelle. Le porteur écrit pourtant que "les tests comportementaux ne génèrent aucun stress" et qu'il n'a pas noté d'état de stress lié à l'isolement, dans un projet dont l'objet est précisément de mesurer un état d'abattement et d'isolement provoqué par l'infection. Toutes sont tuées en fin de procédure pour prélever organes et sang.

Objectifs

Le système immunitaire est requis pour la défense de l’hôte contre les agressions de corps étrangers (virus, bactéries, etc..). Les cellules dendritiques (DC) sont des acteurs clés du système immunitaire, en première ligne dans la reconnaissance des microbes. Lorsqu’elles détectent un corps étranger, les DC produisent des molécules véhiculées dans tout le corps pour orchestrer l’activation de tous les autres acteurs du système immunitaire. Une production de ces molécules spécifiques dérégulée en temps et/ou en quantité peut avoir un rôle délétère, parfois fatal, sur l’individu infecté, comme observé récemment dans le cadre du Covid. Au cours des infections virales, les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC), sont la principale source de molécules spécifiques qui signalent l'infection et sont source d'inflammation appelées Interférons (IFN). Les IFN sont indispensables pour limiter la propagation de virus. Cependant, lorsque les pDC sont absentes ou incapables de produire des IFN, l'hôte infecté contrôle toujours efficacement l'infection. La capacité des pDC de produire des IFN est retrouvée dans la majorité des vertébrés, cette capacité est donc probablement très ancienne. Il est alors possible que cette fonction ne serve pas uniquement à combattre des infections virales, mais aussi à remplir d'autres fonctions importantes dans l'organisme. Notre objectif est de tester si les molécules produites par les pDC induisent un état d'abattement, d’isolement et d'affaiblissement des capacités de reconnaisance/conscience de l'environnement à court ou long-terme, comportement qui ressemble aux états dépressifs. Les pDC pourraient aussi participer à la mise en place d'une détérioration des cellules du cerveau dans la maladie d'Alzheimer (AD), la première maladie neurodégénérative qui affecte plus d'1 million de personnes en France, a un poids sociétal lourd pour les familles et reste sans traitement efficace. Afin de tester cette hypothèse nous induirons la perte des cellules pDC dans un modèle de souris, combinée ou non à des caractéristiques de la maladie d'Alzheimer et que nous infecterons avec deux types de virus : la souche A du virus de la grippe (IAV) qui induit une infection restreinte du système respiratoire, ou le cytomégalovirus murin (MCMV) qui induit une infection dans tout l'organisme et persiste sous forme latente, cachée. Nous évaluerons l’impact de ces infections sur le comportement des souris par des tests comportementaux.

Bénéfices attendus

Nos travaux vont certainement contribuer à accroitre nos connaissances concernant les interactions entre systèmes immunitaire et nerveux. Si notre hypothèse est correcte, il sera envisageable de cibler la production d'agent participant à l'inflammation pour développer de nouvelles stratégies de thérapie pour les patients dépressifs, ou souffrant d'un affaiblissement des capacités de reconnaisance/conscience de l'environnement progressifs. Ces nouvelles approches seront d’abord validées dans un cadre infectieux, ensuite elles pourront être étendues à d’autres contextes inflammatoires, les maladies impliquant une dégénérescence des cellules du cerveau et en particulier la maladie d'Alzheimer.

Procédures

Des souris seront infectées soit par une courte injection par voie intrapéritonéale à l'état vigile d'un faible volume de liquide physiologique contenant du virus. D'autres souris recevront une faible dose de virus par instillation nasale réalisée une seule fois sous anesthésie générale gazeuse de courte durée. Une prise de sang sera effectuée sur les souris infectées, une seule fois sur animal vigile. Il s'agit d'un geste rapide (moins de 5 minute par souris). Un point de compression sera ensuite réalisé à l'aide d'une compresse stérile jusqu'à arrêt d'un saignement potentiel. Les souris effectueront ensuite une séquence de tâches afin d'évaluer leur comportement et plus précisément leur niveaux naturels d'anxiété, leur humeur motivée ou déprimée, et leurs capacités d'apprentissage et de mémoire. La séquence durera moins de deux semaines et comprendra la séparation des animaux pour leur évaluation à l'échelle individuelle sur une durée correspondant à moins de 30 minutes au total par jour pendant 4 jours, ou pendant moins de 10 jours dans le cas de l'évaluation de la mémoire à long-terme. Les souris seront libres de leurs mouvements et en capacité d'explorer dans des cages au cours de chaque test comportemental. Aucune tâche nécessite un effort particulier, ou génère quelque douleur ou angoisse, du fait que les stimulations ne dépassent pas celles rencontrées naturellement en zootechnie, et sont associées à des récompenses alimentaires positives.

Impact sur les animaux

Dans le cas d'infection par les virus, les animaux présentent un syndrome fébrile, associé à des symptômes généraux comme de la fièvre indiquant que l'organisme lutte contre une infection. Ce dernier peut durer jusqu'à 7 jours et entraîner une perte de poids, et de l'anxiété. Les injections ne sont source d'aucun stress particulier, du fait qu'elles ne sont pas répétées, du faible volume injecté, et du fait de la manipulation journalière préalable des souris par le personnel qualifié dans la semaine précédente. La prise de sang peut généré un stress léger du fait de la contention. Dans le cadre d'un test d'évaluation du comportement, les animaux sont hébergés temporairement en cage individuelle. Du fait de l'enrichissement de leur habitat, du caractère temporaire (moins de 10 jours), il n'a pas été noté d'état de stress lié à l'isolement, mais ces manifestations seront étroitement surveillées. Les souris étant libres d'exploration, non restreintes et les tâches étant toutes effectuées dans la salle d'hébergement où elle ont été acclimatées, les tests comportementaux ne génèrent aucun stress et du fait que les stimulations ne dépassent pas celles rencontrées naturellement en zootechnie, et sont associées à des récompenses alimentaires positives, ceci afin de pouvoir justement mesurer leur état d'anxiété naturel.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de réaliser divers prélèvements d'organes et/ou de sang utilisés pour des analyses complémentaires. Ces prélèvements sont essentiels pour étudier les paramètres inflammatoires et les mécanismes cérébraux entrant en jeu dans ce projet.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude intervient après de nombreuses études in vitro utilisant des modèles cellulaires qui ont démontré l’impact de facteurs produits par des pathogènes et de l’inflammation sur l’activation des cascades moléculaires impliquées dans les capacités cognitives et la réponse adaptative des comportements. Les études in vitro ne permettent pas d’étudier l’importance des manipulations proposées sur le comportement et la cognition, et sont ainsi complétées par l'utilisation de l'animal qui seule permet d'étudier la coordination des différentes régions du cerveau entre elles et leurs intéractions avec le reste de l'organisme et en particulier le système immunitaire.

Réduction

Tous ces animaux seront sous un même fond génétique homogène (gènes communs) pour nous permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés en évitant au maximum les variabilités. Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en permettant une analyse statistique valide des résultats. Des études sur des modèles animaux similaires ont montré que l'analyse d'un total de 12 animaux par groupe répartis sur deux expériences reproduites étaient nécessaires. En outre, un même groupe d'animaux pourra être utilisé pour plusieurs tests comportementaux et nous reproduirons chaque expérience 2 fois de manière indépendante.

Raffinement

Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement à l’initiation du modèle. Les animaux seront gardés tant que possible en groupes sociaux stables formés de 2 à 5 individus compatibles. Un animal sera euthanasié en cas de mal-être trop important évalué par l'utilisation d'une grille de scoring. Ces signes, nous les avons défini en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Ces signes sont : respiration anormale, perte de poids >20% du poids initial, déshydratation, léthargie, aspect du poil anormal. Les souris sont préalablement familiarisées avec l'aliment de convalescence (gel) dans les jours précédant l'infection, ce qui optimise leur convalescence. Des mesures seront prises pour limiter l’anxiété et l’impact environnemental sur les souris (amélioration de l'enrichissement par de petites maisonnettes, tubes en carton et bâtons de bois à ronger, et ajouts de coton pour la confection de nids). Une surveillance journalière, par observation directe de l'attitude des souris dans la cage et leur pesée, par le personnel animalier ou expérimentateur permettra de déterminer l’éventuelle souffrance des animaux (comme précisé pour chacune des expériences). Lors des prélèvement de sang, avec utilisation de tubes de contention, l'animal sera surveillé et le geste sera réalisé rapidement afin de limiter l'évènement stressant, les souris seront replacées avec leurs congénères et il sera vérifié que le prélèvement ne les a pas affaiblies ou perturbées (changement de comportement). Enfin, les tests comportementaux sont choisis et menés en respectant les besoins écologiques des modèles: la recherche spatiale est motivée par récompense positive, les souris sont acclimatées à tous les tests et habituées aux dispositifs au moins une semaine avant chaque test. Les tests ne requièrent que mobilité, exploration libre d'objets, d'eau de boisson sucrée ou stimulus sonore de niveau équivalent à celui auquel elles peuvent être exposée lors du change de cage.

Choix des espèces

Les réactions physiologiques de la souris face à des corps étrangers, ici des virus, sont suffisamment proches de celle de l’homme pour que son étude nous permette d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire et nerveux de ces 2 espèces. Ce point est maintenant formellement établi dans la littérature en ce qui concerne l’étude des sous-populations de cellules dendritiques. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées pour lesquelles des animaux génétiquement modifiés sont nécessaires, notamment pour l'étude de la maladie d'Alzheimer. Seuls des animaux adultes seront étudiés ici de façon à ce que leur système immunitaire soit mature. Enfin dans le cas des modèles de la maladie d'Alzheimer, une maladie neurodégénérative dont le premier facteur de risque est l'age, des animaux adultes plus mûrs mais non vieillissants seront étudiés pour correspondre au mieux au métabolisme d'un humain de 45 ans ou plus.

Toutes les femelles qui ont mis bas seront tuées, leurs petits aussi, pour prélèvement de structures du cerveau, tandis que les femelles non fécondées restent en vie et seront réutilisées. 350 souris vont être utilisées au total dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 50 d'entre elles étant gardées vivantes. Les femelles gestantes sont hébergées seules pendant toute la gestation, puis soumises à trois séances de stress de 45 minutes par jour pendant sept jours, les descendants recevant ensuite des injections dans le péritoine, jusqu'à cinq chez les adultes, et quatre gavages espacés de douze heures. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'il n'existe pas de culture in vitro capable de reproduire "l'environnement complexe caractéristique de l'hippocampe en développement".

Objectifs

Le stress prénatal, subi durant le développement foetal, est associé à un risque accru de développer des troubles comportementaux, caractérisés notamment par des déficits de mémoire et une altération émotionnelle, et à une vulnérabilité à développer des troubles psychiatriques (dépression, stress post-traumatique, troubles anxieux...). Il a été montré que ces troubles dépendent d'une altération des neurones dans une région clé du cerveau impliquée dans le controle de la mémoire et des émotions. Notre objectif est de comprendre les mécanismes par lesquels le stress prénatal peut impacter ces neurones en utilisant un modèle animal. Pour cela, nous utiliserons 2 approches: dans la première nous comparerons la croissance des neurones entre les animaux contrôles et stressés à 2 moments clés du développement (premières semaines de vie et âge adulte); dans la seconde, nous déterminerons si le stress prénatal modifie l'expression de molécules clés durant le développement des neurones.

Bénéfices attendus

En caractérisant l’effet du stress prénatal sur le développement des neurones de l'hippocampe, cette étude pourrait contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels un stress précoce peut entrainer des modifications à long terme dans la structuration d'une structure clé pour la gestion de nos émotions et de nos capacités cognitives. L'objectif ultime est de repérer des biomarqueurs ouvrant la voie à des stratégies de prévention et d'intervention ciblées.

Procédures

Hébergement individuel des femelles gestantes pendant la duré de la gestation. Stress: 3 sessions de 45 min par jour pendant 7 jours. Injections intrapéritonéales : 1 pour les animaux en développement, 5 pour les animaux adultes, espacées de 24h. Chaque injection dure moins d'1 minute, préhension de la cage inclue. Gavage: 4 espacées de 12h . Chaque intervention dure moins d'1 minute, préhension de la cage inclue.

Impact sur les animaux

1) l'hébergement individuel des femelles gestantes engendre une nuisance légère en limitant les interactions sociales directes; 2) Le stress appliqué aux femelles gestantes engendre un état de stress transitoire avec une baisse de la prise de poids associée à la gestation. 3) Les injections intrapéritonéales peuvent engendrer un incomfort de courte durée. 4) Le gavage nécessite une préhension de l'animal et peut générer un inconfort modéré de faible durée.

Devenir

Toutes les femelles ayant mis bas sont mises a mort, parce qu'elles ne peuvent être réutilisées. Les femelles non fécondées sont maintenues en vie. Les animaux issus des reproduction et utilisées en expérience sont mises à mort pour prélèvement de structure.

Remplacement

L’objectif de ce projet étant d’étudier les propriétés des neurones de l'hippocampe après exposition à un stress prénatal, il est nécessaire de réaliser ces manipulations sur des animaux vivants. De plus, les caractéristiques des neurones sont dictées en partie par l'environnement cérébral et dépendent donc de l'intégrité du cerveau. Il n’existe pas à l'heure actuelle de modèle en culture ou in vitro permettant de reproduire l’environnement complexe caractéristique de l'hippocampe en développement. Ceci justifie donc l’utilisation des animaux pour atteindre les objectifs de ce projet.

Réduction

Nous nous engageons à utiliser le nombre minimal de souris nécessaire pour garantir la robustesse et la fiabilité des analyses statistiques. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les frères et soeurs d’une même portée seront répartis entre les différents lots. Enfin, les femelles mises en reproduction mais non gestantes seront conservés en vie et réutilisés pour des expériences ultérieures, ce qui contribuera à limiter le nombre total d’animaux utilisés dans le cadre de ce projet.

Raffinement

Pour l'ensemble des animaux, un suivi sera assuré en utilisant des grilles permettant de scorer de façon objective le bien-être de l'animal par la mesure du poids, l’évaluation de l’apparence physique (poil hérissé, apathie...) et du comportement (comportements répétés, vocalisations..) . Ces grilles permettent d'établir des points limites au-delà desquels une décision de traitement ou de retrait de l'expérience est prise. Ainsi, si un animal montre des signes de détérioration rapide de son état de santé évalué sur ces critères avant la fin des procédures, celles-ci seront ajustées ou stoppées pour éviter toute souffrance prolongée ou excessive.

Choix des espèces

La neurogenèse (création de nouveaux neurones) a été largement étudiée chez les rongeurs, lesquels représentent un modèle pertinent en raison de la similitude de leurs réponses physiologiques au stress avec celles des humains. Ils permettent ainsi une exploration intégrée des effets comportementaux, neurobiologiques et génétiques du stress. La souris a été choisie dans ce projet car 1) les études précédentes sur lesquelles il se base ont été réalisées sur des souris , et 2) une partie du projet repose sur l'utilisation de souris transgéniques, seul modèle disponible pour isoler les cellules d'intérêt et mener à bien le projet. Les souris utilisées pour la reproduction ont entre 7 et 8 semaines puisqu'il s'agit de l'âge optimal pour la reproduction. Les descendants étudiés seront âgés de 3 jours à 5 mois puisque nous étudions les neurones pendant le développement précoce et à l'âge adulte.

Ouvertes par laparotomie pendant une heure pour atteindre les embryons, les femelles gestantes servent de voie d'accès à une greffe d'interneurones humains injectés in utero. D'autres souris sont greffées à deux ou quatre jours de vie, brièvement séparées de leur mère, d'autres encore à l'âge adulte par une chirurgie de trois heures qui ouvre le crâne et y scelle une fenêtre permanente. Suivent des séances d'imagerie répétées, tête immobilisée, sur des souris parfois éveillées, à un, trois et sept mois après la greffe. 998 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, le prélèvement du cerveau interdisant, écrit le porteur, toute réutilisation, replacement ou adoption.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment un gène propre à l’être humain, influence la formation et le fonctionnement des réseaux cérébraux. L’objectif général est de déterminer comment ce gène modifie la survie, la migration, la maturation, l’intégration synaptique et l’activité d’interneurones humains greffés dans un cerveau vivant. Ces cellules jouent un rôle de « frein » et limitent les excès d’activité. Deux contextes pathologiques seront étudiés séparément : la schizophrénie et la maladie d’Alzheimer. Dans l’axe « Schizophrénie », le projet s’appuie sur les associations génétiques rapportées entre le gène et cette pathologie. La schizophrénie est associée à des anomalies de maturation des circuits corticaux inhibiteurs. Le projet testera si la présence, l’absence ou le dosage de ce gène modifie le développement d’interneurones humains greffés avant ou juste après la naissance, en étudiant leur migration, leur maturation, leur capacité à établir des connexions et l’organisation de leur activité. Dans l’axe « Maladie d’Alzheimer », les effets de ce gène seront étudiés dans un cerveau adulte présentant un environnement amyloïde. Le projet déterminera si le gène augmente ou réduit la vulnérabilité fonctionnelle et moléculaire de ces cellules. Le projet n’a pas d’objectif comportemental, car le nombre de cellules humaines greffées est insuffisant pour modifier le comportement de la souris. Les conclusions reposeront sur des analyses cellulaires, histologiques, transcriptomiques et sur des mesures répétées de l’activité calcique, complétées par des analyses du cerveau en fin d’étude. Les bénéfices attendus sont l’identification de mécanismes reliant le gène à la fragilité ou à la résistance des circuits, ainsi que de signatures pouvant orienter les stratégies ciblant les réseaux impliqués dans la schizophrénie et la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

À l’échelle du projet, les bénéfices attendus sont d’abord mécanistiques. Dans l’axe « Schizophrénie », les expériences permettront de déterminer si le gène étudié modifie la migration, la maturation, l’identité et l’activité d’interneurones humains pendant des fenêtres précoces du développement cérébral. Elles permettront de distinguer un effet sur la survie d’un effet sur la vitesse ou la qualité de maturation. Dans l’axe « Alzheimer », le plan déterminera si le gène étudié modifie spécifiquement la réponse des interneurones humains à un environnement amyloïde, notamment les programmes de stress, de maturation synaptique et l’activité calcique. La combinaison de l’histologie, de la transcriptomique et de l’imagerie longitudinale doit produire des résultats interprétables à plusieurs niveaux : localisation et maturation des cellules, mécanismes moléculaires et fonctionnement au cours du temps. Les résultats pourront identifier des signatures de vulnérabilité ou de résilience dépendantes de ce gène et améliorer la pertinence des modèles précliniques portant sur le récepteur α7, puisque les souris ne possèdent pas naturellement de ce gène. Aucun bénéfice thérapeutique immédiat ni effet comportemental n’est attendu. À plus long terme, les mécanismes identifiés pourront orienter des études pharmacologiques ciblant l’axe étudié et aider à sélectionner des marqueurs cellulaires ou fonctionnels pour de futurs projets. L’utilisation des animaux imagés pour les analyses terminales maximise les informations obtenues et pourra réduire les effectifs de travaux ultérieurs.

Procédures

- Chirurgie abdominale chez la souris gestante. Chaque chirurgie dure environ 60 min, en excluant les temps de préparation de l’animal et les temps post-opératoires. - Greffe de cellules chez l’embryon de souris au dernier tiers de gestation : injection 30 secondes au total. - Greffe de cellules chez la souris nouveau-né au dernier tiers de gestation : injection 45 secondes au total par hémisphère. - Greffe de cellules chez la souris adulte par injection dans le cerveau : injection 60 min /souris. - Pour les animaux inclus dans le suivi d’imagerie longitudinale, une fenêtre crânienne chronique est implantée au moment de l’intervention adulte; la chirurgie complète (craniotomie, injection éventuelle, pose de fenêtre et fixation) dure au maximum 3 heures, hors préparation et réveil.

Impact sur les animaux

Chez les nouveau-nés, les effets indésirables attendus sont liés à la manipulation et au geste d’injection d’une durée courte (quelques minutes) : stress transitoire associé à une courte séparation d’avec la mère (et réciproquement, stress de la mère vis-à-vis de la portée), ainsi qu’une douleur modérée (de quelques jours, lié à la chirurgie). Chez les femelles gestantes subissant une chirurgie abdominale (laparotomie pour accès in utero), les nuisances attendues comprennent une douleur post-opératoire modérée et une gêne transitoire liées à la cicatrisation. Chez les adultes subissant une chirurgie stéréotaxique, les effets indésirables attendus correspondent principalement à une douleur post-opératoire modérée, une baisse transitoire d’activité et, plus rarement, une perte de poids modérée immédiatement après l’intervention. Pour les animaux qui sont inclus dans la procédure d’imagerie avec fenêtre crânienne, des nuisances additionnelles sont attendues. Dans les jours suivant la craniotomie et la pose de la fenêtre, certains animaux peuvent présenter un inconfort local et un grattage autour de la zone opérée ou du matériau de scellement ; ce comportement est généralement transitoire et diminue au cours de la première semaine. Enfin, l’imagerie in vivo nécessite une phase d’habituation (manipulations répétées, installation sur le dispositif et, lorsque l’enregistrement est réalisé chez l’animal éveillé, contention légère et immobilisation de la tête). Ces étapes peuvent entraîner un stress et un inconfort léger, surtout lors des premières séances, parfois suivis d’une irritabilité transitoire.

Devenir

À l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort. Les objectifs du projet reposent sur l’analyse détaillée du cerveau ce qui nécessite le prélèvement des tissus cérébraux et donc ne permet pas de conserver l’animal en vie. En conséquence, les animaux ne peuvent pas être réutilisés, replacés ni proposés à l’adoption, car le prélèvement du cerveau est indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Remplacement

L’objectif central du projet est de recréer un contexte cérébral in vivo pour analyser le développement, l'intégration et le fonctionnement de neurones d'origine humaine au sein de réseaux nerveux intacts, et leur modulation dans des contextes pathologiques pertinents pour la maladie d'Alzheimer et la Schizophrénie. Ce niveau d'organisation (architecture tridimensionnelle, vascularisation, interactions cellulaires, connectivité à longue distance, activité des circuits) n'est pas accessible in vitro. Les protocoles nécessitent des méthodes standardisées chez les rongeurs, avec des outils robustes. La souris est un modèle de choix : élevage maîtrisé, lignées génétiques, suivi longitudinal. La xénogreffe de neurones humains permet d'étudier des gènes humains dans un cerveau vivant, indispensable pour relier mécanismes cellulaires et phénotypes de réseau. Les organoïdes cérébraux et les systèmes microphysiologiques sont des avancées majeures, mais ne reproduisent pas un cerveau fonctionnel intact. Ils modélisent certaines étapes du développement et des interactions locales, mais sans vascularisation perfusée, système immunitaire, innervation périphérique ou interactions systémiques. Ces limites restreignent leur maturation et empêchent d'étudier la connectivité à longue distance, la régulation neurovasculaire, les réponses métaboliques/hormonales et les propriétés pharmacocinétiques/pharmacodynamiques. Outils complémentaires in vitro, ils demeurent insuffisants pour la dynamique fonctionnelle, la plasticité et les interactions de réseaux dans un cerveau vivant. Les approches in vivo restent indispensables pour comprendre l'intégration de cellules humaines dans un environnement cérébral complet, en conditions physiopathologiques réalistes.

Réduction

Le projet combine des approches transversales (prélèvements terminaux à des temps définis pour différents analyses) et longitudinales (suivi répété des mêmes animaux, notamment par imagerie fonctionnelle), afin de maximiser l’information obtenue par animal. Une partie des animaux suivis longitudinalement est ensuite utilisée pour les analyses terminales, ce qui permet de relier des phénotypes fonctionnels à des mesures tissulaires et moléculaires sans augmenter les effectifs. Les tissus non immédiatement analysés peuvent être conservés dans des conditions adaptées afin d’éviter de nouveaux prélèvements. Les analyses sur cellule ou noyau unique reposent sur des protocoles déjà établis, capables de générer une grande quantité d’information à partir d’un nombre limité d’échantillons, ce qui contribue directement à la réduction du nombre d’animaux. Pour les greffes in utero, la taille des portées permet de limiter le nombre de femelles gestantes nécessaires. Le stade d’injection retenu a été optimisé lors d’études précédentes et assure une bonne survie de la progéniture. Les mâles et les femelles sont inclus avec une répartition aussi équilibrée que possible. Les animaux sont mis à mort en fin de protocole car les objectifs nécessitent le prélèvement du cerveau ; ils ne peuvent donc pas être réutilisés.

Raffinement

Les chirurgies seront réalisées dans un laboratoire dédié exclusivement à la chirurgie. L’élevage sera en cage individuelle par portée et des mesures seront prises pour éviter tout animal isolé au-delà d’une période de 24h. Les animaux seront placés sur dispositif chauffant pour maintenir une bonne température corporelle avant, pendant et après l’expérience et seront étroitement surveillés après chirurgie sous anesthésie et analgésie multimodale. Les points limites spécifiques et précoces pour chaque étape du projet serons appliqués. Dans les procédures expérimentales, les souris feront l’objet d’une surveillance renforcée, de soins pré- et post-opératoires adaptés, des mesures de gestion de la douleur seront entreprises pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des souris. De façon générale et pour l’ensemble des protocoles de chirurgies sous anesthésie, nous rechercherons à minimiser la douleur par antalgiques, ajout de gel hydrique, par un réchauffement continu des animaux, et par des solutions de réhydratation maintenues à la température corporelle. Un renforcement des mesures de bien-être animal sera systématiquement appliqué à chaque étape. Il inclut une surveillance accrue durant la période critique post-opératoire, une évaluation plus fréquente de la douleur et de l’état général des animaux, et l’intervention rapide en cas de signes de gêne ou de souffrance. Le renforcement de l’enrichissement des cages sera intensifié par l’ajout de matériaux de nidification, de dômes en carton et d’éléments favorisant le comportement naturel. L’utilisation et l’état des cotons et nids seront surveillés pour s’assurer du confort thermique et comportemental des animaux.

Choix des espèces

L’évaluation du rôle du système nicotinique et d’un récepteur particulier chez l’homme dans les processus associés à la maladie d’Alzheimer et la Schizophrénie ne peut être réalisée autrement que sur animaux vivants, présentant des niveaux de développement cognitif et de capacités mnésiques suffisants pour représenter un modèle d’étude pertinent. Les protocoles décrits ne peuvent s’effectuer que chez les rongeurs (rat ou souris) du fait des outils disponibles (taille des appareillages), et de la manipulation plus aisée. La souris représente un des meilleurs modèles, jusqu’à présent, sur lesquels on peut étudier les comportements liés à la psychiatrie, dont l’élevage et le maintien en bonnes conditions reste pratique à réaliser en laboratoire, et dont on sait également analyser et manipuler le génome (pour étudier notamment le rôle des sous-unités nicotiniques dans le cadre de ce projet). La Procédure 1 utilise des femelles adultes en fin de gestation. Cette intervention permet l’accès aux embryons à E17.5 et la réalisation des greffes in utero décrites dans la Procédure 2. Les descendants sont ensuite analysés à 1, 3 et 7 mois post-greffe. Ces temps correspondent respectivement à la prise de greffe et à la migration initiale, à une phase intermédiaire de différenciation et de maturation, puis à une maturation plus avancée et à l’intégration fonctionnelle. La Procédure 3 utilise des souriceaux à P2-P4. Ce stade postnatal précoce reste compatible avec une forte plasticité cérébrale, tout en permettant d’étudier la survie, la maturation et l’intégration d’interneurones humains dans un hôte immunodéficient permissif. Les analyses sont réalisées aux mêmes temps, à 1, 3 et 7 mois post-greffe. La Procédure 4 utilise des souris adultes âgées d’au moins 2 mois, dont les circuits cérébraux sont établis. Les analyses à 3, 4 et 7 mois post-greffe permettent d’évaluer successivement l’intégration initiale, les réponses précoces, puis les effets plus tardifs sur la maturation et l’activité des cellules greffées. Les modèles embryonnaire, néonatal et adulte répondent ainsi à des questions complémentaires et ne seront pas interprétés comme une comparaison reposant uniquement sur l’âge de greffe.

420 souris d'une lignée reproduisant la maladie d'Alzheimer vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvements terminaux, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal concerné reçoit une substance par voie orale puis subit trois prélèvements sanguins par incision, espacés d'une heure dans la même journée, séquence répétée à sept, dix et quinze mois. Les tests portent sur la mémoire sociale, la reconnaissance et la localisation d'objets et la mémoire spatiale, l'un d'eux obligeant la souris à nager quatre essais par jour pendant cinq jours. Tout cela pour mesurer les effets d'une roue d'exercice laissée en cage, que le porteur décrit comme une approche "simple et accessible".

Objectifs

La maladie d’Alzheimer et, plus largement, certaines formes de vieillissement du cerveau s’accompagnent souvent d’une baisse progressive de la mémoire et d’autres capacités de réflexion. Aujourd’hui, les solutions thérapeutiques restent limitées. De nombreuses études chez l’humain et chez l’animal indiquent que l’activité physique est une approche simple et accessible, qui peut aider à préserver les fonctions cognitives. En revanche, comment l’exercice produit ces effets reste incompris, notamment via des mécanismes qui impliquent l’ensemble de l’organisme. Des travaux récents suggèrent que l’intestin pourrait jouer un rôle important dans la communication avec le cerveau. Les micro-organismes naturellement présents dans l’intestin (le microbiote) peuvent influencer des substances circulant dans le sang, qui à leur tour pourraient agir sur l’inflammation et sur certaines cellules du cerveau impliquées dans la protection et l’équilibre du tissu cérébral. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre le lien entre activité physique, fonctionnement de l’intestin et évolution des troubles de la mémoire dans un modèle de souris de la maladie d’Alzheimer. Plus précisément, nous voulons déterminer si l’exercice volontaire peut modifier des signaux venant de l’intestin et si ces changements sont associés à une meilleure préservation des fonctions de l’hippocampe (une région clé pour la mémoire). À terme, ce travail vise à identifier des pistes biologiques pouvant expliquer pourquoi certaines personnes résistent mieux que d’autres au déclin cognitif.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera d’abord des bénéfices scientifiques à court terme en améliorant la compréhension des liens entre l’intestin et le cerveau au cours de la maladie d’Alzheimer. Il cherchera à préciser comment les micro-organismes naturellement présents dans l’intestin (le microbiote) et certaines molécules circulant dans le sang peuvent influencer l’inflammation et le fonctionnement du cerveau, notamment dans une région essentielle pour la mémoire (l’hippocampe). Grâce à un suivi à plusieurs moments de l’évolution de la maladie et à des mesures complémentaires (tests de mémoire, analyse dans le sang, étude du microbiote, observation de cellules impliquées dans la défense du cerveau, et évaluation de dépôts caractéristiques de la maladie), l’étude pourra identifier des profils biologiques associés à une plus grande vulnérabilité, ou au contraire à une meilleure résistance du fonctionnement cognitif. Le projet évaluera aussi l’effet d’une intervention simple et accessible, l’activité physique volontaire, afin de déterminer si elle peut favoriser des changements bénéfiques du côté de l’intestin et du sang, et s’ils sont associés à une meilleure préservation de la mémoire. L’étude intégrera également des indicateurs du fonctionnement intestinal (par exemple le transit et la perméabilité), pour mieux comprendre le rôle possible de la barrière intestinale et de l’inflammation générale dans la communication intestin–cerveau. À plus long terme, l’identification et la mise à l’épreuve de molécules candidates pourrait aider à repérer des marqueurs de progression de la maladie ou de réponse à l’exercice, et ouvrir des pistes pour de futures stratégies de prévention ou d’accompagnement combinant hygiène de vie et actions ciblant le métabolisme.

Procédures

Certains animaux recevront une substance par voie orale, la procédure dure moins de 30 secondes et est réalisée sur animal vigile. Ces mêmes animaux auront 3 prélèvements sanguins espacés de 1h chacun, réalisés sur animal vigile sans anesthésie mais avec une analgésie locale, et ceci se répètera 3 fois à au moins 3 mois d'intervalle. Pour certains animaux 3 tests comportementaux seront effectués au cours de 2 à 3 semaines. Ils peuvent induire du stress du fait du déplacement des souris vers de nouvelles pièces et de la mise en contact avec de nouveaux objets.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus dans ce projet sont limités et seront surveillés tout au long de l'étude. Activité physique volontaire (roue en cage) : chez certains animaux, elle peut s'accompagner d'une légère diminution du poids, transitoire et d'intensité faible. Administration orale de substances : certains animaux recevront ponctuellement des substances par voie orale. La manipulation est brève (environ 15 secondes) et peut provoquer un inconfort ou un stress transitoire d'intensité légère lié à la contention. Prélèvements sanguins: ces prélèvements nécessitent une petite incision. Elle peut entraîner une douleur brève au moment du geste (environ 10 secondes) et une gêne locale temporaire d'intensité légère (petite plaie, sensibilité) jusqu'à cicatrisation, généralement en quelques jours. Chaque prélèvement est répété 3 fois dans la même journée à une heure d'intervalle. L'ensemble « administration orale + prélèvements » est réalisé à 7, 10 et 15 mois, avec plusieurs mois entre les séances, ce qui permet une cicatrisation complète et limite les effets cumulatifs. Tests comportementaux : ces tests peuvent générer un stress léger car ils reposent sur la nouveauté et l'exploration, mais ils sont de courte durée (sur 1 à 3 jours). Un des tests de mémorisation peut induire un stress modéré car l'animal doit nager ; le protocole est réparti sur 6 jours (4 essais/jour pendant 5 jours, puis 1 essai le 6ème jour).

Devenir

A la fin des procédures expérimentales, les animaux sont mis à mort afin de réaliser des prélèvements terminaux indispensables pour répondre aux objectifs du projet.

Remplacement

Le projet a pour objectif d’étudier, chez l’animal, l’effet d’une activité physique volontaire puis de l’administration de certaines molécules d’intérêt sur l’évolution de troubles de la mémoire et sur la communication entre l’intestin et le cerveau dans un modèle murin de maladie d’Alzheimer. Une partie essentielle du projet repose sur l’évaluation de capacités complexes (mémoire sociale, reconnaissance/localisation d’objet, apprentissage et mémoire spatiale). Ces fonctions ne peuvent pas être mesurées de façon pertinente avec des méthodes sans animal (cellules en culture, tissus isolés, ou modèles informatiques). De plus, l’étude porte sur des interactions entre plusieurs organes et sur des mécanismes qui évoluent dans le temps : intestin et microbiote, substances circulant dans le sang, réponses immunitaires, puis effets sur le cerveau. Ces échanges, qui dépendent du fonctionnement global de l’organisme et de différents stades de la maladie, ne peuvent pas être reproduits de manière fiable par des approches alternatives. Conformément à la démarche des 3R, lorsque des molécules ou des voies biologiques prioritaires seront identifiées, des approches complémentaires hors de l’animal pourront être utilisées (par exemple sur des cellules) pour préciser certains mécanismes. Toutefois, ces méthodes ne peuvent pas remplacer l’étude in vivo nécessaire pour établir le lien entre l’intervention (exercice/administration), les changements dans l’organisme et les effets sur le cerveau et le comportement.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé au plus juste à partir de nos données antérieures dans ce modèle et des informations disponibles dans la littérature. Il est fixé entre 10 et 15 animaux par groupe. Ces effectifs correspondent au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables, notamment pour comparer les groupes entre eux et analyser l’évolution de la maladie au cours du temps chez les mêmes animaux. Le choix des effectifs tiennent également compte de la variabilité naturelle entre individus, pour les tests de comportement, du désintérêt de certains animaux à utiliser la roue d’exercice placée dans la cage et enfin à une mortalité plus élevée de la lignée de souris alzheimer au cours du vieillissement. Intégrer ces facteurs dès la planification évite d’avoir à constituer de nouvelles cohortes en cours d’étude.

Raffinement

Les conditions d’hébergement et les pratiques de manipulation sont conçues pour réduire au maximum le stress et le risque de blessures. Les souris seront hébergées en groupes stables de 2 à 4 dans des cages enrichies avec du matériel de nidification et un élément d’enrichissement (bûchette), afin de favoriser les comportements naturels (repos, exploration, construction du nid). L’activité physique se fera via une roue en cage, permettant à l’animal de choisir librement l’intensité et la durée. Afin de préserver les périodes de repos et d’éviter une activité excessive, les roues pourront être retirées pendant la phase d’inactivité (journée), ce qui encourage le repos. Les mâles peuvent parfois présenter des comportements d’agressivité. Pour limiter ce risque, les groupes seront constitués le plus tôt possible (après le sevrage et dès que le génotype est connu) afin de stabiliser les relations sociales. Les animaux seront surveillés régulièrement pour détecter rapidement tout signe de tension (poursuites répétées, morsures, plaies, perte de poils, amaigrissement). Si un risque de blessure apparaît, une adaptation de l’hébergement sera mise en place, pouvant aller jusqu’à l’hébergement individuel du ou des animaux concernés, uniquement si nécessaire pour prévenir les blessures, réduire la nuisance et maintenir les animaux tout au long de la procédure. Les tables de suivi de soins des animaux comportent des points limites stricts et spécifiques au projet, définis en concertation avec le vétérinaire référent, permettant une prise de décision rapide et standardisée en cas d'altération de l'état général.

Choix des espèces

Le choix de la souris est justifié car elle constitue un modèle de référence pour étudier la mémoire et les fonctions de cérébrales: l’organisation du cerveau est largement conservée chez les mammifères. Les connaissances disponibles chez la souris sur les mécanismes liés à l’inflammation cérébrale et aux modifications observées dans la maladie d’Alzheimer permettent d’établir, dans des conditions contrôlées, des liens entre changements dans le cerveau et performances de mémoire. De plus, les tests de comportement utilisés dans ce projet sont bien validés chez la souris et sont connus pour être influencés par des interventions de mode de vie, comme l’activité physique. La souris est également une espèce de référence pour étudier le rôle de l’intestin et des micro-organismes intestinaux (microbiote) dans la communication intestin–cerveau. L’activité physique peut modifier la composition et le fonctionnement du microbiote. Le choix d’une roue en cage permet une activité volontaire, où l’animal choisit lui-même l’intensité et la durée, ce qui limite le stress par rapport à des méthodes plus contraignantes. Nous utiliserons un modèle murin bien établi de la maladie d’Alzheimer, qui présente avec l’âge des changements caractéristiques et des troubles de la mémoire, ainsi que des modifications rapportées du microbiote. Ce modèle est donc adapté à une étude dans la durée des liens entre intestin, sang et cerveau, et des effets potentiels de l’exercice. Seuls des animaux jeunes adultes à âgés seront inclus, afin d’étudier l’évolution liée à l’âge : les plus jeunes auront 4 mois (âge où les animaux sont adultes) et les plus âgés 15 mois (âge correspondant à un stade avancé de vieillissement chez la souris). Cette plage d’âges est nécessaire pour suivre la progression des troubles au cours du temps et évaluer l’effet d’une intervention mise en place précocement.

Quinze minutes de contention par jour pendant cinq jours servent d'entraînement, avant une heure de contention sur souris éveillée pour l'imagerie. 180 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin de chaque procédure pour l'analyse des tissus. Elles subissent d'abord une chirurgie sous anesthésie générale pouvant durer une heure trente, puis jusqu'à quatre injections, pour observer en direct comment les astrocytes gèrent l'énergie dans un cerveau atteint d'Alzheimer. Le porteur retient des souris génétiquement modifiées reproduisant la maladie, étudiées à 3 et 4 mois avant les symptômes puis à 8 et 10 mois une fois ceux-ci installés, et des souris ordinaires de 3 et 12 mois pour le vieillissement dit normal.

Objectifs

Ce projet de recherche vise à mieux comprendre comment la maladie d'Alzheimer affecte le cerveau et pourquoi les fonctions cérébrales déclinent progressivement au cours de cette maladie. La maladie d'Alzheimer est la cause la plus fréquente de démence et touche des millions de personnes dans le monde. Elle entraîne des pertes de mémoire, des difficultés de réflexion et d'accomplissement des activités quotidiennes, et n'a actuellement aucun traitement curatif. Bien que certains traitements récents puissent ralentir la progression de la maladie chez certains patients, leurs effets restent limités. Il existe donc un besoin important de mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans cette maladie afin de développer des thérapies plus efficaces. En plus des modifications affectant les neurones, des preuves croissantes suggèrent que des problèmes de circulation sanguine cérébrale et d'approvisionnement en énergie apparaissent très tôt dans la maladie d'Alzheimer, même avant que les symptômes ne deviennent visibles. Les cellules cérébrales nécessitent un apport constant en oxygène et en énergie pour fonctionner correctement, et des perturbations dans ces processus peuvent contribuer à la progression de la maladie. Ce projet se concentre sur un type spécifique de cellule cérébrale appelé astrocyte. Ces cellules aident à soutenir les neurones, régulent l'activité cérébrale et contrôlent la distribution de l'énergie et du flux sanguin dans le cerveau. Cependant, on ne comprend pas encore bien comment la maladie d'Alzheimer et les dommages vasculaires affectent le fonctionnement normal des astrocytes. En utilisant des méthodes d'imagerie avancées sur des modèles murins de la maladie d'Alzheimer, cette étude observera comment les cellules de soutien du cerveau réagissent pendant l'activité neuronale et comment ces réponses sont altérées par la progression de la maladie ou par des dommages aux petits vaisseaux sanguins. Les expériences permettront aux chercheurs d'étudier les interactions entre les cellules cérébrales, le métabolisme énergétique et la circulation sanguine en temps réel. Les connaissances acquises grâce à ce projet pourraient améliorer notre compréhension des mécanismes précoces impliqués dans la maladie d'Alzheimer et les troubles apparentés. À plus long terme, cette recherche pourrait aider à identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à préserver l'équilibre énergétique du cerveau et à améliorer ses fonctions.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes de la maladie d'Alzheimer en étudiant le rôle des cellules cérébrales appelées astrocytes et leurs interactions avec les vaisseaux sanguins. Grâce à des techniques d'imagerie avancées, nous observerons en temps réel comment ces cellules gèrent l'énergie et communiquent avec les neurones et les vaisseaux sanguins, aussi bien dans des cerveaux sains que dans des cerveaux atteints par la maladie. L'objectif est de déterminer si les problèmes de circulation sanguine dans le cerveau contribuent à perturber le fonctionnement des astrocytes, ce qui pourrait aggraver la maladie. Cette recherche pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques pour protéger le cerveau et améliorer son fonctionnement dans la maladie d'Alzheimer et d'autres formes de démence.

Procédures

Une chirurgie puis une injection de 30 secondes sous anesthésie générale de durée maximum d’1h30: 180 animaux Une seconde injection de 30 secondes sous anesthésie générale pour l’imagerie : 180 animaux Une troisième injection sur animal vigile : 160 animaux Une quatrième injection de 30 secondes sous anesthésie générale pour l’imagerie : 80 animaux Contentions pour l’entrainement sur animal vigile d’une durée de 15 minutes/animal/jour durant 5 jours : 180 animaux Contentions pour l’imagerie sur animal vigile avec ou sans stimulation visuelle d’une durée d’1heure/animal : 180 animaux

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus chez les animaux incluent un stress passager lié à la manipulation et la contention ainsi qu'aux injections, ainsi qu'une douleur modérée et une légère perte de poids après une intervention chirurgicale, avec un rétablissement complet en moins d’une semaine. Les complications, comme une infection ou une hémorragie, sont très rares. Une surveillance quotidienne est assurée pour détecter tout signe de souffrance, et des soins adaptés sont apportés si nécessaire.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour analyse des tissus.

Remplacement

Le cerveau est un organe extrêmement complexe impliquant des interactions dynamiques entre les neurones, les cellules gliales et les vaisseaux sanguins. Bien que certains aspects de ces processus puissent être étudiés in vitro, ces modèles ne permettent pas de reproduire l'environnement physiologique intégré nécessaire pour étudier les interactions neurovasculaires et neurométaboliques. Les approches in silico actuelles sont également insuffisantes pour modéliser avec précision ces mécanismes multicellulaires complexes et dépendants de l'activité. Une approche in vivo reste donc indispensable. Les modèles murins permettent d'étudier les fonctions neuronales, gliales et vasculaires dans un contexte physiologique intact. De plus, les modèles de souris transgéniques de la maladie d'Alzheimer reproduisent plusieurs caractéristiques pathologiques et fonctionnelles clés pertinentes pour la maladie humaine. Ces modèles sont donc essentiels pour étudier les mécanismes de dysfonction neurovasculaire et métabolique, ainsi que pour identifier des cibles thérapeutiques potentielles.

Réduction

Le projet prévoit au maximum 180 souris nées dans notre élevage ou achetées chez un fournisseur agréé. Toutes les mesures seront réalisées sur des groupes comprenant au maximum 10 animaux, nous avons calculé un nombre d’animaux nécessaires le plus réduit possible. De plus, les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques fiables pour des petits échantillons.

Raffinement

Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation, permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. La gestion de la douleur et de l’inconfort liés aux procédures expérimentales mettra en œuvre des méthodes d’anesthésie et d’analgésie pré- et post-opératoire, un soutien nutritionnel et thermique, ainsi qu’un suivi clinique post-opératoire incluant la prolongation des traitements analgésiques si besoin. En particulier le maintien des souris sur une couverture thermostatée jusqu’à leurs premiers mouvements puis en chambre thermostatée jusqu’à leur réveil complet post-chirurgie permet de réduire la mortalité péri-opératoire des souris.

Choix des espèces

Ce projet vise à étudier les interactions métaboliques entre neurones et astrocytes ; les organismes modèles simples possèdent des cellules gliales ressemblantes mais pas identiques aux astrocytes du cerveau des mammifères. Les souris transgéniques permettent d’étudier les interactions neurones-astrocytes dans le contexte génétique de la maladie d’Alzheimer. Le présent projet a pour but d'étudier le métabolisme cérébral chez l’animal adulte et son altération au cours du vieillissement normal et pathologique. Les animaux étudiés seront donc des adultes jeunes (3 mois) et âgés (12 mois). Pour cette étude, il existe des animaux génétiquement modifiés mimant la maladie d’Alzheimer, nous les étudirons au stade pré-symptomatique (3-4 mois), et au stade plus âgés (8-10 mois) correspondant aux phases symptomatiques.

Une souris blessée dont l'état ne s'améliore pas en 48 heures est mise à mort. 1 240 souris vont être utilisées dans ce projet sur la transmission sociale du stress, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des coupes d'électrophysiologie ou de l'immunohistochimie. La moitié subit une chirurgie crânienne de 45 minutes, une autre partie reçoit une injection huit jours de suite suivie d'une expérience aversive d'une seconde, et presque toutes passent un test de mémoire de neuf minutes par jour pendant trois jours, dont le porteur ne précise ni le dispositif ni le protocole au-delà du labyrinthe mentionné. Le laboratoire annonce des retombées pour la santé humaine qui "s'inscrivent plutôt dans le long terme et pourraient peut-être servir au traitement de pathologies telles que l'anxiété", pendant que la peur transmise se mesure par l'immobilité des souris.

Objectifs

Il existe une région spécifique du cerveau chargée de traiter les odeurs. De plus, cette région reçoit des informations provenant de différentes zones du cerveau qui peuvent modifier le traitement des informations reçues. Il existe une autre zone qui transmet des informations relatives au stress directement à la zone qui traite les odeurs, et ces informations peuvent modifier notre façon de réagir à certaines odeurs. Nous étudions au laboratoire un processus appelé «transmission sociale du stress» (de l’anglais, social transmission of stress, STS). Ce processus repose sur la communication du stress d'un individu à un autre par le biais d'une interaction sociale, et ce stress transmis est capable de provoquer des pertes de mémoire chez les animaux qui ne l'ont pas subi. Des études antérieures menées par le laboratoire ont montré que la STS est due à l'implication des récepteurs spécifiques de nos cellules cérébrales, mais le mécanisme exact reste encore inconnu.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre comment la réponse au stress se produit par le biais de l'odorat et contribuera à mieux appréhender le mécanisme d'action des astrocytes dans le bulbe olfactif par le système endocannabinoïde. En ce qui concerne les bienfaits pour la santé humaine, ce projet nous permettra de mieux comprendre comment le stress affecte notre organisme à différents niveaux, à commencer par la transmission du stress par l'odorat. Les résultats de ce projet en matière de santé humaine s'inscrivent plutôt dans le long terme et pourraient peut-être servir au traitement de pathologies telles que l'anxiété.

Procédures

Presque tous les animaux de ce projet seront soumis à un test de mémoire d'une durée comprise de 9 minutes par jour sur 3 jours consécutifs pour étudier si le stress affecte la mémoire. Parmi l’ensemble des animaux du projet, la moitié subiront en plus au préalable (minimum 4 semaines avant le test comportemental) une intervention chirurgicale d’environ 45 minutes sous anesthésie et antalgie avec pré, péri- et post médication permettant de minimiser le stress et la douleur qui permettra l’étude de l’activité neuronale. Une autre petite partie recevront une injection, pendant 8 jours consécutifs, et une expérience aversive de 1 seconde.

Impact sur les animaux

Les traitements médicamenteux et les injections intra-péritonéales sont bien contrôlés en laboratoire. De plus, les produits utilisés (et leurs doses) sont bien tolérés par les animaux. Par conséquent, la nuisance liée à ces traitements (douleurs sur le site d’injection, stress de la contention) sera maitrisée et durera moins de 7 jours. La chirurgie provoque durant quelques jours des douleurs post opératoires. Les risques associés sont ceux liés à l’anesthésie (hypothermie, troubles cardio respiratoires) et une infection de la cicatrice (très rare). Le modèle comportemental de transmission sociale du stress implique des effets stressants chez les animaux et une réaction de peur que nous détecterons à l’aide de l’immobilité de l’animal. Enfin un léger stress est attendu lors de la première exploration du labyrinthe car c’est un milieu inconnu et cela ne durera que quelques minutes.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l’issue du protocole comportemental, que ce soit pour réaliser des coupes destinées à l'électrophysiologie ou pour effectuer une immunohistochimie.

Remplacement

À ce jour, l'étendue des connaissances concernant l'organisation des circuits neuronaux chez les mammifères, y compris l'homme, et surtout leur plasticité, ne permet pas de concevoir et de mettre en œuvre des simulations numériques fiables permettant d'étudier les changements qui se produisent. De plus, l'utilisation d'invertébrés dont le système nerveux est complètement différent serait inappropriée.

Réduction

Le nombre de 1240 souris se justifie par l’utilisation d’un nombre suffisant d’animaux dans chacun des groupes expérimentaux ce qui permet l'application des tests statistiques classiques dans le domaine et également décrits dans la littérature scientifique sur le sujet. Les chiffres attendus garantissent une bonne interprétation des résultats. Toutefois, si l'expérience montre que les échantillons peuvent être réduits, ils le seront en conséquence. Dans les expériences, il faut disposer d'au moins 10 cellules et d'au moins 6 sujets expérimentaux différents. C'est pourquoi nous avons calculé ce nombre d'animaux, afin de disposer d'un nombre de cellules suffisant pour chaque expérience et chaque condition. De plus, dans les tests comportementaux, compte tenu de la grande variabilité, il faut plus de 10 spécimens pour que les comparaisons soient fiables.

Raffinement

Les animaux seront changés une fois par semaine tout en maintenant le plus possible le matériel de nidification lors du changement afin de conserver l’empreinte olfactive et ainsi diminuer le stress. Si un animal est blessé il sera d'abord soigné (si signes d’agression ou de blessure), isolé et/ou surveillé. Dans le cas où l’état de l’animal ne montre pas d’amélioration significative sous 48h, celui-ci sera euthanasié. En effet, pour l'ensemble des animaux, un suivi sera assuré en utilisant des grilles permettant de scorer de façon objective le bien-être de l'animal par la mesure du poids, l’évaluation de l’apparence physique (poil hérissé, apathie...) et du comportement (stéréotypies, vocalisations...). Si un animal montre des signes de détérioration rapide de son état de santé évalué sur ces critères avant la fin des procédures, celles-ci seront ajustées ou stoppées pour éviter toute souffrance prolongée ou excessive. Enfin, chaque animal sera également habitué à être manipulé par l’expérimentateur quotidiennement pendant la semaine précédant le protocole expérimental et aussi habitué au labyrinthe utilisé pour les tests comportementaux.

Choix des espèces

L’utilisation d’animaux dans ce projet se justifie par l’absence de modèle in vitro permettant l’étude des processus de mémorisation et la nécessité de manipuler l’expression des proteines de ces processus. L’organisation du système nerveux des souris est suffisamment proche de l’espèce humaine pour pouvoir raisonnablement extrapoler les observations faites sur ces animaux. Dans ce contexte, l'expérimentation animale reste nécessaire. La souris est le modèle idéal pour ces deux raisons 1) Possibilité d'étudier des mutants pour une protéine, 2) Reproductibilité et comparabilité avec d'autres résultats obtenus dans le laboratoire et la communauté scientifique au sens large. Les souris utilisées seront toutes à l’âge adultes (8-16 semaines) le modèle de transmission sociale du stress ayant été validé à ces âges.

Pour mesurer comment une naissance prématurée, un régime maternel gras ou un déséquilibre hormonal marquent durablement le cerveau, 12 134 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes ou allaitantes reçoivent des molécules ou un régime enrichi en graisses, puis leur descendance est suivie de la naissance à l'âge adulte, prélèvements de tissu à l'oreille ou à la queue, injections de vecteurs viraux, prélèvements sanguins, chirurgies de deux à quatre heures sous anesthésie, et des évaluations du comportement dont aucun test n'est nommé. Le porteur annonce des conditions d'hébergement dérogeant aux standards réglementés, séparation des congénères de 24 heures à deux semaines et répétable, restriction alimentaire jusqu'à dix jours, jeûne de 24 heures, exposition à 4 °C pendant 24 heures jusqu'à quatre fois. 11 634 souris seront tuées pour prélever des tissus et 500 proposées à un autre projet, pendant que les retombées annoncées pour la prévention de l'obésité, du diabète et de l'infertilité restent au conditionnel.

Objectifs

Les premiers mois de vie constituent une période essentielle pour le développement du cerveau et de l’organisme. Durant cette phase, des facteurs tels qu’une naissance prématurée, une alimentation maternelle déséquilibrée, des variations hormonales ou certaines maladies génétiques peuvent influencer durablement la santé. Ces perturbations précoces peuvent augmenter, à long terme, le risque de développer des troubles métaboliques (comme l’obésité ou le diabète), des problèmes de fertilité (par exemple le syndrome des ovaires polykystiques), ainsi que des difficultés cognitives. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre comment l’environnement précoce influence le développement du cerveau, en particulier les circuits neuronaux qui contrôlent des fonctions essentielles comme l’alimentation, l’équilibre énergétique et la reproduction. Plus précisément, ce projet vise à : - explorer l’impact des perturbations précoces sur le développement du cerveau et sur certaines fonctions essentielles tout au long de la vie, de la naissance à l’âge adulte ; - comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans ces processus ; - identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour prévenir ou corriger certaines maladies, comme l’obésité, le diabète ou les troubles de la fertilité (par exemple le syndrome des ovaires polykystiques). Ce projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs EU 1/2 et EU 2/2 et le transfert des animaux entre les établissements sera limité au maximum.

Bénéfices attendus

Les premiers mois de vie sont une période cruciale pour le développement du cerveau. Des perturbations durant cette phase, comme une naissance prématurée, des déséquilibres hormonaux ou une alimentation maternelle inadaptée, peuvent avoir des conséquences durables sur la santé de la descendance. Elles augmentent notamment le risque de troubles métaboliques (comme l’obésité, le diabète ou certaines maladies cardiovasculaires), de difficultés reproductives, ainsi que de troubles du développement cognitif à l’âge adulte. Les résultats de ce projet présentent un double intérêt. D’une part, ils permettront d’acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes cellulaires et neuronaux impliqués dans le développement postnatal des circuits cérébraux qui régulent ces fonctions essentielles. D’autre part, ils pourraient contribuer à la santé publique en ouvrant la voie à de nouvelles stratégies de prévention ou de prise en charge des maladies métaboliques et reproductives. Enfin, ces travaux participeront au développement de modèles expérimentaux plus fiables et mieux adaptés pour la recherche en endocrinologie, en neurodéveloppement et en reproduction.

Procédures

Les interventions décrites ici pourront avoir lieu dans les 2 établissements utilisateurs. Les interventions d’une même procédure auront lieu soit intégralement dans l’EU1/2 soit intégralement dans l’EU2/2. Aucun transport d’animaux n’aura lieu en cours de procédure. Les animaux dont le modèle aura été créé dans l’EU2/2 seront transportés vers l’EU1/2 pour l’évaluation métabolique et comportementale. Chez les mères: Des femelles gestantes et/ou allaitantes recevront des molécules actives (par voie orale ou par injection) ou feront l’objet d’interventions nutritionnelles (régime enrichi en graisses). Les effets de ces traitements seront évalués chez les souriceaux dès la naissance, au cours d’un suivi longitudinal à moyen et long terme. Ce suivi comprendra différentes procédures d’évaluation de la reproduction (à partir de 8 semaines), du métabolisme (entre 4 et 20 sem.), du comportement (vers 8 sem.) et de l’activité cérébrale (jusqu’à 8 sem.). Chez la descendance: Tous les animaux issus des mères gestantes seront identifiés et prélevés au niveau de l’oreille ou de la queue. Des souriceaux (mâles et femelles) recevront, à des âges définis, des injections de molécules ou de vecteurs viraux. Ils feront ensuite l’objet d’un suivi longitudinal similaire, incluant des analyses de la reproduction, du métabolisme, du comportement et de l’activité cérébrale. Types d’interventions et durée : Les animaux pourront recevoir différents types de traitements par voie orale, par injections ou implantation de dispositifs. Des prélèvements sanguins seront réalisés (veines mandibulaire, caudale ou latérale), en respectant les volumes et fréquences maximaux autorisés. La durée de ces interventions est généralement comprise entre 5 et 20 minutes. Certains groupes seront soumis à des interventions chirurgicales dans le but d’évaluer la reproduction (anesthésie: 1h; intervention: 15 à 20 minutes) ou de réaliser un enregistrement de l’activité cérébrale (anesthésie et intervention: 2 à 4 h). Au cours de ces procédures, des anesthésiques et des analgésiques seront utilisés chaque fois que nécessaire. Les anesthésies seront réalisées par injection ou par inhalation et l’analgésie sera administrée par injection ou par application locale. Les animaux impliqués dans l’étude du métabolisme pourront recevoir des régimes spéciaux (régime enrichi en graisses pendant 3 à 12 mois), une restriction alimentaire (jusqu’à 10 jours) ou des périodes de jeûne (durée maximale de 24 heures).

Impact sur les animaux

Les manipulations réalisées sur les animaux peuvent entraîner du stress, de la fatigue et un certain inconfort. Certaines procédures, telles que les interventions chirurgicales, les injections ou les prélèvements sanguins, peuvent provoquer des douleurs légères de courte durée pouvant être répétées. Dans le cadre des études métaboliques ou comportementales, les animaux seront soumis à des conditions d’hébergement dérogeant aux standards réglementés. En effet les animaux pourront être privés de leur congénères (sans isolement visuel et olfactif) pendant des durées allant de 24h à 2 semaines et pouvant être répétées. Les animaux pourront être restreints en quantité de nourriture (maximum 10 jours) et/ou être exposés à des jeûnes allant jusqu’à maximum 24h. Enfin, pour évaluer la réponse aux changements de température, les conditions standards de température d’hébergement pourront également modifiées (maximum 24h d’exposition à 4°C, 4 expositions au maximum espacées d’au minimum 72h OU 24-72h à 30°C).

Devenir

À l’issue des procédures, les animaux sont mis à mort selon des méthodes réglementaires et encadrées, afin de permettre le prélèvement des tissus nécessaires aux analyses scientifiques. Ces prélèvements sont indispensables pour comprendre en détail les mécanismes étudiés et ne peuvent pas être réalisés autrement. Les animaux ne présentant pas le bon génotype pour l'étude seront proposés pour un autre projet.

Remplacement

Pour évaluer l’impact de l’environnement périnatal sur le développement des systèmes neuroendocriniens, il n’existe actuellement pas d’alternative à l’expérimentation animale. La complexité des phénomènes étudiés, notamment l’influence de l’environnement maternel sur le développement de l’organisme, implique des interactions étroites entre plusieurs organes (cerveau, tissus périphériques, systèmes hormonaux) qui ne peuvent pas être reproduites de manière fiable par des modèles informatiques. Les animaux invertébrés ne peuvent pas être utilisés dans ce contexte, car leur organisation biologique est très différente de celle des mammifères. Ils ne possèdent pas les mêmes structures cérébrales ni les mêmes systèmes hormonaux, ce qui ne permet pas d’étudier les mécanismes neuroendocriniens pertinents pour la santé humaine. Par ailleurs, les modèles in vitro, tels que les organoïdes ou les cellules souches, bien qu’utiles pour certaines questions spécifiques, ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions entre les organes ni les réponses physiologiques intégrées de l’organisme entier. Or, ces interactions sont essentielles pour répondre aux objectifs de nos recherches en physiologie intégrée.

Réduction

​​​​​Le nombre d’animaux nécessaires a été déterminé à l’aide de calculs de puissance statistique, afin de garantir l’obtention de données fiables tout en limitant leur utilisation au strict minimum. La taille de chaque groupe expérimental a été définie à l’aide d’outils de planification adaptés, permettant d’éviter l’utilisation d’animaux en excès tout en assurant la robustesse des résultats. Par ailleurs, certaines expériences ne seront entreprises que si les résultats des étapes précédentes le justifient, ce qui permet d’éviter des expérimentations inutiles. Enfin, les protocoles expérimentaux ont été conçus pour optimiser l’utilisation de chaque animal. Lorsque cela est possible, plusieurs types d’analyses seront réalisés sur un même individu (par exemple, des évaluations physiologiques et des analyses moléculaires sur différents organes), réduisant ainsi le nombre total d’animaux nécessaires.

Raffinement

​Les animaux sont hébergés dans des conditions strictement contrôlées, garantissant leur bien-être et un bon état de santé. Ils ont accès en permanence à l’eau et à la nourriture, et leur environnement est enrichi (par exemple avec des matériaux pour construire un nid), afin de leur permettre d’exprimer des comportements naturels et de réduire le stress. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé et les animaux sont progressivement habitués à être manipulés afin de diminuer leur stress. Une attention particulière est portée à la réduction de toute douleur, peur ou inconfort. Lorsque des interventions sont nécessaires, elles sont réalisées sous anesthésie adaptée et des traitements contre la douleur sont administrés si besoin, avant et après les procédures. Après chaque intervention, les animaux sont surveillés attentivement jusqu’à leur réveil complet, puis leur état de santé est suivi quotidiennement (activité, alimentation, poids, comportement) avec le moins de perturbations possibles. Une attention particulière sera apportée afin de prévenir tout transfert d‘odeurs étrangères à la cage qui pourraient compromettre le lien entre la mère et ses petits. Des critères précis sont définis pour intervenir rapidement en cas de problème. Si un animal montre des signes de souffrance ou de détresse, il est immédiatement pris en charge et, si nécessaire, retiré de l’étude afin d’éviter toute souffrance prolongée. Dans le cadre des études métaboliques ou comportementales, les différentes contraintes sont appliquées de manière séquentielle avec des périodes de récupération permettant la stabilisation physiologique entre étapes et les animaux disposent d’un enrichissement compatible avec les mesures (litière et matériel de nidification). Lors du déplacement des animaux de l’EU2/2 vers l’EU1/2, les animaux seront transportés dans un véhicule climatisé dans des cages de transport agréées sous condition d’autorisation pour le statut sanitaire (distance 11,1 km ; statuts sanitaires équivalents) entre les EU. Les animaux seront acclimatés pour une période de 7 jours sur le site d’accueil avant toute manipulation. Des points limites ont été définis et seront appliqués. Tout animal présentant des signes s’approchant ou atteignant l’un d’entre eux seront retirés de l’étude et si nécessaire, mis à mort.

Choix des espèces

​Nos projets de recherche en physiologie intégrée visent à comprendre les interactions entre le corps et le cerveau afin d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques pour des pathologies telles que le diabète, l’obésité et l’infertilité. Nous étudierons des souris de la naissance à l’âge adulte afin de couvrir l’ensemble des étapes clés du développement et de la maturation des systèmes biologiques. La période néonatale correspond à une phase critique de mise en place et d’organisation des structures, notamment au niveau neuroanatomique et neuroendocrinien, tandis que l’âge adulte reflète un état fonctionnel stabilisé de ces systèmes. Cette approche permet d’appréhender la dynamique des mécanismes physiologiques au cours du temps et d’identifier d’éventuelles origines développementales aux altérations observées à l’âge adulte. Le recours aux animaux est strictement limité aux situations dans lesquelles aucune méthode alternative ne permet d’obtenir un niveau d’information équivalent. L’espèce utilisée a été choisie de manière à maximiser la pertinence scientifique tout en minimisant la douleur, la souffrance et le nombre d’animaux utilisés. La souris est privilégiée car des données essentielles à l’interprétation des résultats ne sont disponibles que dans cette espèce, ce qui contribue également à réduire la variabilité expérimentale et, par conséquent, le nombre d’animaux nécessaires. De plus, les études physiologiques en neuroendocrinologie ainsi que les recherches sur l’obésité et l’infertilité ont historiquement été menées chez la souris, facilitant la comparaison avec les données existantes. Enfin, certaines expériences proposées nécessitent l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour lesquels la souris constitue de loin le modèle expérimental le plus pertinent et le mieux caractérisé.

652 souris sont exposées à des stimulations électriques, à un stimulus visuel simulant l'approche rapide d'un prédateur et au froid, ou observent une congénère qui les subit, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est opérée sous anesthésie pour recevoir un virus marqueur et une fibre optique implantée dans le cerveau, une autre est soumise à une restriction hydrique pour exécuter une tâche de récompense à deux. Leur état affectif est ensuite évalué par la préférence pour une solution sucrée, le toilettage après pulvérisation d'une solution sucrée sur le pelage et la suspension brève par la queue, épreuves dont le porteur écrit qu'elles peuvent entraîner "une gêne modérée mais brève". Il écrit aussi que ces stimuli "ne sont pas considérés comme douloureux aux paramètres appliqués", alors que le projet mesure précisément la détresse qu'ils provoquent et sa transmission à une congénère, avant que toutes les souris soient tuées pour analyse du cerveau.

Objectifs

Ce projet vise à caractériser les mécanismes neurobiologiques qui sous-tendent la résonance émotionnelle, c’est-à-dire la capacité d’un individu à percevoir et partager l’état émotionnel d’un congénère, et à déterminer comment cette résonance influence l’état affectif selon la nature de l’expérience vécue. Nous étudierons deux modalités complémentaires : (1) la résonance émotionnelle négative, observée lorsque l’animal perçoit ou vit directement une expérience faiblement aversive, et (2) la résonance émotionnelle positive, mise en jeu lors de l’observation ou de l’obtention d’une récompense au sein d’une tâche réalisée en dyade. Pour chacune de ces modalités, des analyses réalisées sur des tranches de cerveau et des enregistrements de l’activité de neurones impliqués dans la régulation des émotions, à l’aide d’une fibre optique, seront combinés afin d’examiner à la fois les dynamiques neuronales en temps réel et les modifications durables des connexions entre les neurones qui en résultent. L’accent sera mis sur le rôle d’un système cérébral impliqué dans la régulation de l’humeur, de la motivation et des comportements sociaux, et susceptible de subir des adaptations distinctes selon que l’expérience partagée est positive ou aversive. À partir d’interactions sociales contrôlées entre souris, nous analyserons comment les réponses comportementales et neuronales varient en fonction de l’expérience du congénère : perception d’un état de détresse (résonance émotionnelle négative par observation), exposition directe à une situation faiblement aversive, ou observation ou obtention d’une récompense (résonance émotionnelle positive). L’utilisation d’un modèle murin est indispensable, car la souris présente des formes robustes et quantifiables de résonance émotionnelle ainsi que des mécanismes d’adaptation des connexions entre les neurones comparables à ceux observés chez l’humain dans des contextes affectifs positifs ou négatifs. Les deux sexes seront inclus afin de prendre en compte les différences bien documentées dans la sensibilité aux interactions sociales et dans la vulnérabilité aux troubles émotionnels.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des connaissances fondamentales sur les mécanismes neuronaux qui permettent à un individu de percevoir, partager et intégrer l’état émotionnel d’un congénère, qu’il soit négatif ou positif. En combinant des tâches dyadiques contrôlées, des enregistrements de l’activité des neurones chez l’animal vivant (à l’aide de dispositifs d’enregistrement adaptés) et des analyses réalisées sur des tranches de cerveau ainsi que des analyses histologiques, il permettra de caractériser de manière fine les variations d’activité de neurones impliqués dans la régulation des émotions associées aux interactions sociales et d’identifier les modifications durables des connexions entre les neurones qu’elles induisent. L’étude conjointe de la résonance émotionnelle négative (exposition directe ou observation d’un congénère exposé à un stimulus faiblement aversif) et positive (observation ou obtention d’une récompense) fournira un cadre intégré pour comprendre comment le cerveau encode, différencie et met en relation les expériences émotionnelles vécues pour soi ou observées chez l’autre. Le projet permettra également de déterminer comment ces processus influencent l’état affectif, la motivation et les interactions sociales au long cours. Bien qu’inscrit dans le champ de la recherche fondamentale, ce travail présente une portée translationnelle importante. Les neurones étudiés sont directement impliqués dans la régulation de l’humeur, la sensibilité sociale, la motivation et la vulnérabilité aux troubles affectifs. Les résultats attendus contribueront à mieux comprendre les mécanismes neurobiologiques susceptibles de conduire à une altération de la coordination émotionnelle, à une diminution des comportements sociaux adaptés ou à l’émergence d’états anxieux ou dépressifs. En apportant une compréhension mécanistique des adaptations neuronales liées aux interactions sociales positives et négatives, ce projet offrira un cadre conceptuel utile pour interpréter la variabilité interindividuelle observée dans les comportements sociaux et certaines conditions psychiatriques chez l’humain.

Procédures

Les animaux seront exposés à différentes interventions nécessaires à l’étude des mécanismes de résonance émotionnelle négative et positive. Certains animaux subiront une chirurgie réalisée sous anesthésie générale afin de permettre l’injection d’un virus inoffensif utilisé pour marquer certains neurones et, le cas échéant, l’implantation de fibres optiques destinées à l’enregistrement de l’activité des neurones chez l’animal vivant. Une gêne post-opératoire transitoire est possible mais systématiquement contrôlée par une analgésie préventive et post-opératoire adaptée, ainsi que par une surveillance quotidienne jusqu’à cicatrisation complète. Les procédures comportementales incluent soit l’observation ou l’exposition directe à des stimuli faiblement aversifs (résonance émotionnelle négative), soit la réalisation d’une tâche de récompense en dyade fondée sur une restriction hydrique courte et strictement encadrée (résonance émotionnelle positive). Ces manipulations peuvent entraîner un stress léger à modéré et transitoire, limité par une habituation préalable, un encadrement précis des paramètres expérimentaux et un suivi clinique régulier. Dans certaines conditions expérimentales, une batterie de tests comportementaux standardisés évaluant l’état affectif (préférence pour une solution sucrée, comportement de toilettage après pulvérisation d’une solution sucrée sur le pelage et suspension brève par la queue) sera réalisée. Ces épreuves peuvent induire une gêne modérée mais brève et sont espacées afin d’éviter tout effet cumulatif excessif. Enfin, les animaux seront euthanasiés à l’issue des expériences afin de permettre soit l’analyse histologique des tissus cérébraux, soit la préparation de tranches de cerveau destinées à l’étude du fonctionnement des connexions entre les neurones.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues dans ce projet restent limitées et relèvent principalement de la manipulation comportementale, de la restriction hydrique et, pour une partie des animaux, de chirurgies stéréotaxiques légères. Dans le cadre de la résonance émotionnelle négative, les situations expérimentales incluent l’exposition ou l’observation de stimuli faiblement aversifs (exposition au froid non douloureux, stimulus visuel simulant l’approche rapide d’un prédateur, stimulations électriques de faible intensité ne provoquant pas de douleur). Ces manipulations induisent une gêne transitoire mais ne sont pas considérées comme douloureuses aux paramètres appliqués. Elles peuvent provoquer une activation comportementale aiguë (immobilisation, sursauts, modification posturale) sans effet prolongé attendu. Dans le cadre de la résonance émotionnelle positive, la tâche de récompense en dyade repose sur une restriction hydrique strictement encadrée pouvant induire un stress modéré mais réversible. Les tests affectifs réalisés dans certaines conditions peuvent entraîner une gêne modérée mais brève. Les chirurgies (injection virale et implantation de fibre optique) peuvent provoquer une douleur post-opératoire légère et un inconfort local transitoire (inflammation, œdème, irritation cutanée). Des exclusions techniques (mauvaise expression virale ou mauvais positionnement de la fibre) peuvent survenir sans augmenter la sévérité individuelle. Les effets indésirables potentiels incluent une baisse transitoire d’activité, une diminution temporaire de la consommation alimentaire après la chirurgie ou une variation modérée de la motivation durant la restriction hydrique. Les conséquences de ces nuisances sont transitoires et aucun effet durable ou sévère n’est attendu.

Devenir

À l’issue des procédures expérimentales, tous les animaux seront mis à mort à mort afin de permettre les analyses des tissus cérébraux nécessaires à la réalisation des objectifs du projet. Ces analyses permettront notamment de vérifier le bon déroulement des expériences et d’étudier les modifications observées dans le cerveau. La réutilisation, le replacement ou le relogement des animaux ne sont pas envisageables, car ces analyses nécessitent le prélèvement des tissus cérébraux à la fin des expériences. L’euthanasie sera réalisée sous anesthésie profonde, selon les méthodes recommandées par la réglementation européenne en vigueur, afin de garantir une perte de conscience rapide suivie d’une mort sans douleur ni détresse.

Remplacement

Le projet vise à caractériser les mécanismes neurobiologiques qui soutiennent la résonance émotionnelle chez la souris, qu’elle soit négative (observation d’un congénère exposé à un stimulus faiblement aversif) ou positive (observation ou obtention d’une récompense). Ces phénomènes reposent sur des interactions sociales réelles, dynamiques et réciproques entre deux individus. Ils dépendent de l’intégrité des systèmes sensoriels, sociaux et moteurs, et ne peuvent être reproduits par des cultures cellulaires ou des modèles informatiques. L’étude de ces processus nécessite des comportements réalisés dans un contexte social réel, reflétant l’état émotionnel de l’animal et de son partenaire, avec des ajustements rapides et une synchronisation fine entre individus. Aucune préparation de tissus ni aucun modèle informatique ne permet de reproduire ces interactions sociales, ni d’examiner le lien direct entre comportement social, état émotionnel et activité des neurones. De plus, les approches essentielles à ce projet, permettant d’enregistrer ou de modifier l’activité de certains neurones et d’analyser les comportements en dyade, nécessitent un cerveau intact dont les différentes régions restent fonctionnelles et interconnectées. L’étude des modifications durables de l’activité cérébrale après une expérience émotionnelle, positive ou négative, impose de mesurer ces adaptations dans un organisme complet où les contraintes physiologiques, sociales et environnementales influencent réellement la réponse. Ainsi, l’utilisation du modèle murin est indispensable : il s’agit de l’espèce de référence en neurosciences sociales, présentant des comportements de partage des émotions et d’interactions sociales bien documentés, avec des outils permettant d’étudier précisément les régions cérébrales impliquées. Aucun modèle alternatif ne permettrait d’atteindre les objectifs scientifiques de ce projet.

Réduction

Plusieurs stratégies sont mises en place pour limiter strictement le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la robustesse scientifique du projet. Les dyades sont suivies longitudinalement dans les deux procédures, ce qui permet d’obtenir plusieurs mesures comportementales et de l’activité des neurones à partir des mêmes individus plutôt que de multiplier les cohortes. Les effectifs ont été déterminés par des calculs de puissance statistique réalisés à partir de nos données préliminaires et de celles de nos collaborateurs, afin de n’utiliser que le nombre minimal d’animaux nécessaire pour atteindre une puissance statistique de 80 %. Le recours à des souris génétiquement modifiées est limité aux seuls animaux indispensables aux enregistrements de l’activité des neurones, sans production excédentaire, et les deux sexes sont systématiquement inclus afin de maximiser les informations obtenues. Enfin, les analyses réalisées sur des tranches de cerveau et les analyses histologiques ne concernent qu’un sous-ensemble précisément défini d’animaux, évitant tout sacrifice non indispensable.

Raffinement

Des mesures de raffinement sont intégrées à chaque étape du projet afin de limiter au maximum la douleur, le stress et la détresse. Les animaux sont hébergés dans des cages enrichies (tunnels, matériaux de nidification, abris) et maintenus en groupes sociaux stables pour préserver la cohésion des dyades. Les chirurgies nécessaires aux procédures 2 et 4 sont réalisées sous anesthésie générale avec analgésie préventive et post-opératoire, dans des conditions garantissant la prévention des infections. Un suivi rapproché est assuré durant les jours suivant l’intervention afin d’ajuster les soins et de prévenir toute complication. Avant les tests comportementaux, les souris sont progressivement habituées au dispositif expérimental, au manipulateur et à leur environnement afin de limiter le stress lié à la nouveauté. Les sessions se déroulent dans un environnement calme et contrôlé ; l’expérimentateur reste constant pour limiter les sources de stress. L’ensemble du personnel impliqué est formé à la détection précoce des signes de douleur et de souffrance, et habilité à appliquer sans délai les mesures appropriées, incluant des soins renforcés, l’administration d’analgésiques ou, si nécessaire, une euthanasie conformément aux points limites définis.

Choix des espèces

La souris constitue l’espèce la plus pertinente pour étudier les mécanismes de résonance émotionnelle, qu’elle soit négative (observation ou exposition directe à un stimulus faiblement aversif) ou positive (observation ou partage d’une récompense en dyade). Elle présente des comportements sociaux spontanés, structurés et quantifiables, indispensables pour analyser les ajustements émotionnels et motivationnels entre individus dans un cadre expérimental contrôlé. Les régions du cerveau impliquées dans les émotions, la motivation et les interactions sociales sont largement conservées entre la souris et l’humain, permettant une exploration des mécanismes biologiques pertinente et transposable à des systèmes sociaux plus complexes. L’étude conjointe de l’activité des neurones chez l’animal vivant et des modifications durables observées dans le cerveau nécessite un cerveau intact dans lequel ces réseaux fonctionnent de manière intégrée. La souris est également l’espèce pour laquelle sont disponibles l’ensemble des outils nécessaires au projet, permettant de cibler certains neurones, d’enregistrer leur activité au cours des interactions sociales et d’étudier leur fonctionnement au fil du temps. Ces approches offrent un accès précis et spécifique aux mécanismes neuronaux impliqués dans la résonance émotionnelle. Les expériences seront menées chez des animaux adultes, stade de développement dans lequel la résonance émotionnelle est bien caractérisée chez les rongeurs et où les réseaux cérébraux sont matures et stables. Ce choix est également indispensable pour assurer le bon déroulement des manipulations expérimentales et l’exécution de tâches comportementales complexes nécessitant des capacités motrices et cognitives pleinement développées.