Système respiratoire
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
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- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système urogénital
Etude de la réponse pulmonaire induite par des polluants environnementaux
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
2 400 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à 126 administrations de composés et subir jusqu'à 27 prélèvements sanguins sur animal vigile, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Certaines subissent une trachéotomie sous anesthésie générale pour la mesure de leur capacité pulmonaire. Le porteur indique que l'exposition à l'ozone provoque une gêne respiratoire, une locomotion réduite et une perte de poids allant jusqu'à 15 %. Toutes seront tuées, leurs poumons ensuite lavés pour analyser la réponse immunitaire, et le porteur estime à douze le nombre de candidats médicaments testables sur la période.
Objectifs
Ce projet a pour but d’étudier les mécanismes et le rôle des acteurs impliqués dans les réponses inflammatoires et immunitaires pulmonaires déclenchées par l'exposition à des polluants environnementaux tels que l’ozone ou les pesticides. L’exposition à des polluants environnementaux induit des lésions inflammatoires des voies aériennes pouvant conduire au développement de pathologies inflammatoires chroniques pulmonaires telles que la BPCO (BronchoPneumopathie Chronique Obstructive). La BPCO constitue un réel problème de santé publique car elle touche 7 millions de personnes en France avec un taux de mortalité de 9.2%. Il s’agit de la 3ème cause de mortalité en France. Cette pathologie se caractérise par une inflammation des bronches provoquant une réduction du diamètre de celles-ci. Les bronches s’épaississent et fabriquent davantage de mucus. Les alvéoles qui assurent les échanges gazeux sont détruites (emphysème) et l’élasticité du tissu pulmonaire est altérée. Il n’existe actuellement pas de thérapie. L’objectif de ce projet est donc de d’étudier le rôle des cellules immunitaires et des mécanismes impliqués dans la réponse de défense de l’organisme afin d’améliorer nos connaissances et proposer de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
La mise en place de ces modèles chez des souris spécialement modifiées permettra de mieux comprendre le rôle de certains mécanismes impliqués dans la maladie et de confirmer leur contribution au développement de l’inflammation. Une fois validées ces molécules représentent des cibles thérapeutiques potentielles dont la pertinence sera vérifiée par l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques. Ce projet s’inscrit dans la continuité d’un précédent projet dont les résultats ont donné lieu à 2 publications scientifiques.
Procédures
Prélèvements de sang : maximum 27 prélèvements sur une étude (3 fois par semaine maximum, 30 secondes/souris) sur animaux vigiles et un prélèvement de sang en terminal sous anesthésie gazeuse (30 secondes/souris). Administrations de composés : maximum 126 administrations/souris (2x/jour à 2x/semaine) selon la voie d’administration (30 secondes/souris). Une trachéotomie est réalisée sous anesthésie générale dans le cas d’une analyse de la capacité pulmonaire (20min/souris). Nous estimons à 12 le nombre de candidats médicaments qui pourront être testés sur cette période.
Impact sur les animaux
L'exposition à l'ozone ou aux pesticides provoque une gêne respiratoire réversible et une inflammation pulmonaire chez les souris. D’après notre expérience, la première exposition à l’ozone cause un stress transitoire avec locomotion réduite, réversible dans l’heure suivant l’exposition. Elle cause également une perte de poids transitoire (jusqu’à 15%), avec un retour progressif au poids de départ dès la deuxième semaine d’exposition des études chroniques. Pour les traitements : un stress et une gêne respiratoire transitoire ; un risque très faible de lésion trachéale et des perturbations respiratoires transitoires pourront être observés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort. A l'issue de la mise à mort, un lavage bronchoalvéolaire et des prélèvements seront effectués pour étudier la réponse immunitaire dans les différents compartiments.
Remplacement
Aucun modèle expérimental in vitro n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier la réponse et les interrelations entre les différents acteurs cellulaires et moléculaires des réponses immunitaires innées et acquises. Après la caractérisation in vitro sur différentes populations cellulaires (lignées de macrophages, de cellules épithéliales, des modèles biologiques en 3D reproduisant certaines caractéristiques d’un organe) des voies activées par les polluants, l’objectif du projet est d’étudier la réponse inflammatoire pulmonaire à l’ozone, les microplastiques ou les pesticides. L’étude in vivo est indispensable pour ce projet puisqu’il nécessite plusieurs niveaux d’interactions entre les réponses inflammatoires et pulmonaires complexes qui ne peuvent être développés in vitro ou in silico.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Les tests statistiques utilisés permettront de comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 1 variable ou comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 2 variables.
Raffinement
Les principaux signes cliniques observés dans ces modèles de pathologie font partie des critères d’évaluation à savoir la prostration, amaigrissement et difficultés respiratoires. Si le poids ou la mobilité des souris sont affectés, de l’hydrogel sera déposé au fond de la cage pour limiter la perte de poids et la déshydratation. Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l'état clinique des souris utilisées sera assurée grâce à une grille d’évaluation scorée qui permettra la mise en place d’une surveillance renforcée les cas échéants et l’éventuel déplacement des lieux de dépôt de la nourriture et de la boisson. Les administrations seront réalisées sous anesthésie afin de réduire à un strict minimum le stress et la souffrance de l'animal. Les animaux sont observés en continu pendant les expositions et lors des anesthésies jusqu’à leur réveil complet. Des points limites précoces ont été déterminés pour une prise en charge rapides et des critères d’arrêt mis en place pour éviter tout stress ou souffrance des animaux.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie scientifiquement : -La souris est un mammifère qui présente une architecture anatomique et fonctionnelle comparable à l’espèce humaine. -La souris est l’un des seuls modèles de mammifères permettant de telles modifications génétiques de précision cellulaire. -La souris reste l’animal modèle de référence dans la communauté scientifique pour étudier expérimentalement les mécanismes immunitaires pulmonaires. Les animaux sont utilisés au stade adulte (7 semaines minimum) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature.
Effets du Carvacrol sur l’hypertrophie cardiaque induite par la monocrotaline chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système respiratoire
Une injection unique de monocrotaline installe en trois à quatre semaines une hypertension pulmonaire qui épaissit le ventricule droit et peut évoluer vers une insuffisance cardiaque. 132 rats, mâles et âgés de quatre semaines à l'injection, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gavés pendant 28 jours avec du carvacrol, un composé de l'origan et du thym. Chacun passe ensuite sous anesthésie générale un électrocardiogramme, une IRM d'une heure et demie, une échographie et une mesure de la pression pulmonaire, avant d'être tué pour prélever les tissus. Le porteur décrit chez ces rats un "léger essoufflement" et une gêne qu'il qualifie de modérée au motif que les animaux ne sont pas soumis à l'effort.
Objectifs
L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une affection cardiovasculaire sévère caractérisée par une élévation anormale de la pression dans les artères pulmonaires, entraînant une surcharge de travail inadéquate du cœur droit. Cette surcharge de pression provoque progressivement un épaississement de la paroi du ventricule droit, pouvant dans les cas les plus extrêmes conduire à une insuffisance cardiaque. Malgré des avancées thérapeutiques, l’HTAP évolue rapidement et demeure difficile à détecter à un stade précoce, compromettant ainsi le pronostic vital. De nombreuses études ont montré que l’HTAP est associée à un remodelage des vaisseaux pulmonaires, à des altérations de l’activité électrique cardiaque et à un remodelage de la structure du cœur. Parmi les composés bioactifs issus de sources naturelles, le Carvacrol (CAR) présent dans l’origan, le cresson poivré et le thym suscite un intérêt croissant pour ses propriétés antioxydantes, anesthésique, analgésique, anti-inflammatoires et cardioprotectrices. Des études récentes indiquent que le CAR pourrait moduler l’activité électrique cardiaque en agissant et il aurait la capacité de protéger le cœur des effets de l’infarctus. Dans ce contexte et malgré l’utilisation répandue du CAR dans les médicaments, les compléments alimentaires et les aliments, les données relatives à ses mécanismes d’action, en particulier concernant la fonction cardiaque dans un contexte HTAP, demeurent encore insuffisantes.. Dans ce contexte, nous chercherons à déterminer si le CAR peut contribuer à limiter le remodelage cardiaque et les altérations de l’activité électrique dans un modèle HTAP induite chez le rat.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra à court terme de mieux comprendre les mécanismes associés à la pathologie de l’HTAP. Elle permettra également de mettre en évidence l’effet thérapeutique de substances pharmacologiques sur ces divers mécanismes mis en jeu. L’efficacité de traitements préventifs et curatifs seront mis en évidence ainsi que d’éventuels effets secondaires. Si les études sont positives, des études cliniques pourront être envisagées à plus long terme sur les substances bénéfiques identifiées de façon à mettre en place un traitement plus efficace avec un rapport bénéfice-risque minimum pour les patients.
Procédures
Ce projet vise à mieux comprendre et traiter l’hypertension artérielle pulmonaire, une maladie grave qui touche les vaisseaux sanguins des poumons et fatigue fortement le cœur. Pour cela, un modèle de cette maladie sera reproduit chez le rat grâce à une injection unique d'une molécule pour déclencher la maladie. La maladie apparaît généralement après 3 à 4 semaines. L’augmentation de la pression dans les artères pulmonaires oblige alors la partie droite du cœur à travailler davantage. Avec le temps, cela provoque un épaississement du muscle cardiaque (hypertrophie) qui peut évoluer vers une insuffisance cardiaque droite. Le projet permettra d’évaluer les effets protecteurs de la molécule, ce traitement sera administré par gavage (par voie orale) pendant 28 jours après l’apparition de la maladie. Son efficacité sera étudiée à partir d’analyses du sang et des tissus. Lorsque la maladie sera installée, plusieurs examens seront réalisés sur chaque animal sous anesthésie générale afin de limiter la douleur et le stress : un électrocardiogramme (ECG) pour étudier l’activité électrique du cœur (une seule fois, environ 10 minutes) ; une IRM avec injection d’un produit de contraste pour observer le cœur et les vaisseaux (une seule fois, environ 1h30) ; une échographie cardiaque (une seule fois, environ 30 minutes) ; une mesure de la pression dans les artères pulmonaires et du débit cardiaque (une seule fois, environ 30 minutes) - un prélèvement sanguin (une seule fois, quelques minutes). L’ensemble de ces examens permet de suivre l’évolution de la maladie et d’évaluer si le traitement testé peut protéger les poumons et le cœur.
Impact sur les animaux
Chez le rat, la pathologie peut se manifester par un léger essoufflement et une diminution de l’activité. Comme les animaux ne sont pas soumis à l’effort, la gêne attendue est considérée comme modérée. Une prise de poids plus faible peut également être observée. Les anesthésies nécessaires aux examens peuvent entraîner une hypothermie,. L’injection du produit induisant l’HTAP peut provoquer une légère irritation locale. Enfin, le CAR, composé naturel présent notamment dans le thym et l’origan, est généralement bien toléré et ne présente pas d’effets indésirables significatifs aux doses utilisées.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever les tissus d'intérêt pour des analyses.
Remplacement
Il est indispensable de mieux comprendre les mécanismes physiologiques et moléculaires mis en jeu dans cette pathologie afin de pouvoir élaborer une prise en charge plus ciblée. Seules des expérimentations sur modèle animal entier pourront permettre d’atteindre ce but. Par ailleurs, il est très difficile d’obtenir des échantillons de patients souffrant d’hypertension pulmonaire, ce qui limite considérablement l’étude directe des mécanismes cellulaires et moléculaires de l’HTAP et renforce donc indirectement la nécessité de modèles expérimentaux fiables pour tester en routine des médicaments à fort potentiel thérapeutique.
Réduction
Pour limiter le nombre d'animaux, les animaux sont répartis dans différents groupes expérimentaux et seront mutualisés pour permettre l’obtention de données scientifiques robustes. Les échantillons prélevés serviront pour des analyses histologiques, biochimiques et fonctionnelles. L’estimation du nombre d’animaux repose sur notre expertise préalable, en cohérence avec les données issues de la littérature, et tient compte également des besoins requis pour une analyse statistique adéquate réalisée préalablement.
Raffinement
Une attention permanente sera portée au bien-être des animaux tout au long du protocole, Lors des examens, les animaux seront sous anesthésie générale avec un protocole antidouleur approprié ainsi qu’une surveillance accrue (électrocardiogramme, capteur de pression…). Si l’état de l’animal le nécessite, les responsables du projet et/ou les vétérinaires pourront intervenir pour adapter le protocole antidouleur ou interrompre la procédure. Afin de garantir le bien-être des animaux tout au long de l’expérimentation, des outils structurés tels que l’arbre décisionnel et les critères d’arrêt des souffrances sont mis en place pour guider la prise de décision et intervenir rapidement en cas de détresse. Des points limites ont été définis afin de prévenir toute souffrance excessive des animaux inclus dans l’étude. Ces critères reposent sur l’identification de signes cliniques et comportementaux traduisant une altération significative du bien-être de l’animal, le suivi est réalisé par le personnel formé et attentif aux conditions des animaux.
Choix des espèces
Le rat est utilisé car les rongeurs sont des espèces couramment employées pour développer des modèles expérimentaux d’HTAP. En effet, les rongeurs permettent de reproduire de manière fiable les altérations vasculaires et hémodynamiques observées dans cette pathologie ce qui permet d’évaluer efficacement les traitements expérimentaux. L’injection de la molécule induisant la pathologie sera effectuée chez les rats mâles juvéniles âgés de 4 semaines et l’évaluation de l’effet de la molécule thérapeutique sera donc réalisée chez des rats de 8 semaines.
Investigation chez le rat de la toxicité des opioïdes de synthèse.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
Deux injections d'opioïdes de synthèse par jour pendant dix jours, des chirurgies de vingt à quarante-cinq minutes, des sondes portées une à trois semaines et jusqu'à quinze prises de sang en 24 heures : 1 138 rats vont être utilisés ainsi, 891 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 247 un niveau sévère, tous tués à l'issue. Une partie porte un cathéter pendant 48 heures, une autre un guide implanté dans le cerveau pour prélever du liquide cérébral pendant neuf heures, avec des isolements de six à vingt-quatre heures en enceinte de mesure. Le projet mesure la toxicité respiratoire de ces molécules et compare des traitements de l'overdose et du sevrage. Le porteur indique que ces administrations peuvent provoquer rigidité musculaire, hypothermie et dépression respiratoire allant jusqu'au coma et à la mort, l'atteinte d'un point limite déclenchant la mise à mort.
Objectifs
Les nouveaux opioïdes de synthèse, très puissants, sont associés à un risque élevé d’intoxications graves, notamment en raison de leur toxicité respiratoire et de leur consommation fréquente avec d’autres substances. Nous étudierons leur toxicité, leurs interactions avec d’autres substances et la meilleure façon de traiter les overdoses ou le sevrage. Ainsi ce projet expérimental chez le rat vise à évaluer l’impact de ces substances sur la respiration et sur le diaphragme, principal muscle impliqué dans la ventilation, dans un contexte d’intoxication induite par injection unique, ou de tolérance après injection répétée d'opioïdes. Nous évaluerons l’efficacité de différentes molécules pour reverser ces effets respiratoires. Nous analyserons ensuite l’évolution des concentrations sanguines et cérébrales et étudierons d’éventuelles interactions en co-administration. De plus nous évaluerons l’efficacité de différentes stratégies de prise en charge du sevrage induit par ces opioïdes. Les résultats attendus permettront de mieux comprendre leur toxicité et de contribuer à l’amélioration de la prise en charge des intoxications associées à ces nouveaux opioïdes.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de mieux caractériser les mécanismes de toxicité mis en jeu par les opioïdes de synthèse seuls ou en association, d’explorer les mécanismes de ces interactions et de déterminer la meilleure stratégie de traitement des intoxications. Ce projet permettra d'optimiser la prise en charge de ces intoxications pouvant avoir des conséquences fatales mais aussi d’optimiser le traitement de la dépendance au-delà du simple traitement des symptômes.
Procédures
Les animaux soumis aux études de toxicité aiguë (administration unique) : subiront 1-2 injections (5-10sec). Indépendamment, les animaux soumis aux études de toxicité chronique: subiront 2 injections/j pendant 10j puis 1-3 injections supplémentaires correspondant à une molécule d’intérêt et/ou une molécule de réversion(5-10sec). Parmi eux, une 1ère partie sera soumise à : une procédure chirurgicale sous anesthésie générale (20min)+port d'une sonde de télémétrie (7 à 18j)+mise en boite de mesure isolée (6h). Une 2ème partie: procédure chirurgicale sous anesthésie générale (30min)+port d'un cathéter (48h)+ prélèvements de sang sur animal vigile (11 prélèvements de 30 sec sur 5h). Une 3ème partie: procédure chirurgicale sous anesthésie générale (45min)+port d'une sonde (7 à 18j) et isolement en cage individuelle (7j ou jusqu’à cicatrisation)+mise en cage de mesure isolé (6h). Une 4ème partie: procédure chirurgicale sous anesthésie générale (45min)+port d'une sonde (10 à 18j) + mise en cage de mesure isolé (1 à 2 fois 24h). Une 5ème partie: procédure chirurgicale sous anesthésie générale (30min)+ port d'un cathéter (48h)+prélèvement de sang sur animaux vigiles (15 prélèvements de 30sec sur 24h). Une 6ème partie: procédure chirurgicale(45min)+ port d’un guide cérébral (7 à 18j)+ prélèvements de fluides extracellulaires (1h équilibration+8h prélèvements). Une dernière partie des animaux: mesures de l’activité locomotrice (sur 3 à 4j, pendant 30min+20min d'habituation) et mesure de l’anxiété (sur 1 à 3j, pendant 5min).
Impact sur les animaux
Stress léger de quelques secondes lors des injections. Stress léger lors de l'isolement du rat dans une enceinte fermée pendant 6 heures durant l’étude de mesures respiratoires. Stress léger lors de l’isolement du rat dans un tube pendant 8h pour réaliser les prélèvements sanguins. Stress léger lors de l'hébergement des rats en cage individuelle à la suite de la chirurgie, jusqu'à la fin de la cicatrisation, puis au cours de la procédure pour évaluer l’activité des muscles (6h). Isolement du rat dans une cage individuelle pour mesures de l’activité cérébrale (1 à 2 fois 24h). Isolement du rat dans un contenant de mesure inviduel pendant 9 heures pour prélèvement de liquide cérébral. Isolement des rats au cours des études comportementales de 50 minutes pour la mesure de l’activité locomotrice et de 5 min pour la mesure d'anxiété. Léger risque de formation de caillot dans les vaisseaux et de baisse d’activité locomotrice pour certains animaux lors de la mise en place de cathéters. Chirurgie légère à modérée de 10 min à 35 min après anesthésie générale précédée d’une analgésie. L’administration des différents opioïdes peut entrainer une réduction de l’activité locomotrice, une rigidité musculaire, une hypothermie et une dépression respiratoire pouvant aller jusqu’au coma et au décès. Variabilité de la durée et de l’intensité de ces effets en fonction des molécules administrées.
Devenir
La réutilisation des animaux est impossible en raison de la récupération post-mortem de l'appareillage implanté pour réaliser des mesures ou de l'atteinte d'un point limite qui requiert la mise à mort des animaux ou de la récupération de tissu post-mortem.
Remplacement
Les procédures réalisées sur animaux, ne sont pas remplaçables par des expériences alternatives. Le rat constitue un modèle nécessaire à cette étude en raison du fonctionnement de son système respiratoire proche de celui de l’être humain.
Réduction
Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Cependant, si aucun effet ventilatoire significatif n’est perçu lors des mesures respiratoires, une partie des expériences ne sera pas réalisée dans le but de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés. De la même manière, la procédure de prélèvements de liquide cérébral ne sera réalisée que si des effets sont observés soit au niveau des concentrations sanguines soit au niveau respiratoire. Cette procédure permet de réduire le nombre d’animaux utilisé, puisqu’elle permet la réalisation d’études longitudinales en effectuant plusieurs prélèvements successifs, à différents temps, sur un même individu.
Raffinement
Tous les rats du projet bénéficient des conditions d’hébergement contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Des points limites spécifiques adaptés aux différentes procédures seront mis en place pour détecter et réduire toute souffrance ou douleur. Toutes les interventions chirurgicales prévues dans ce projet seront réalisées sous anesthésie générale et accompagnées d'une gestion adéquate de la douleur pendant la période péri-opératoire. En cas de besoin, des procédures réglementaires de mise à mort anticipée seront appliquées. De plus, une ouate en silicone sera déposée au fond de la cage après la chirurgie pour favoriser une meilleure cicatrisation et une prise en charge plus rapide en cas de saignement. Par ailleurs, concernant la procédure de mesure d’activité musculaire, les rats opérés seront ajoutés à ces cages pour enrichissement en vue de réduire le stress induit par l’isolement.
Choix des espèces
Le rat constitue un modèle nécessaire à cette étude en raison du fonctionnement de son système respiratoire proche de celui de l’être humain. En plus de sa taille adéquate qui permet une facilité et une répétition des prélèvements, son métabolisme est très semblable à celui de l’Homme, ce qui facilitera la translation des données de concentrations sanguines à l’Homme. Pour les études mesurant la respiration ainsi que l’activité du cerveau et des muscles la pose des sondes est plus aisée sur le rat et donc les résultats seront plus reproductibles. La population jeune étant la plus affectée par les problèmes de mésusage de substance, des rats jeunes adultes Sprague Dawley âgés de 6 à 8 semaines seront utilisés. Ceci nous permettra de pouvoir faire l’analogie avec les résultats déjà obtenus et les articles publiés dans la littérature. La population jeune étant la plus affectée par les problèmes de mésusage de substance, des rats jeunes adultes Sprague Dawley âgés de 6 à 8 semaines seront utilisés.
Développement d’antiviraux virucides à large spectre non toxiques
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Perte de poids, hypothermie, difficultés respiratoires : réunir ces critères déclenche la mise à mort immédiate. 3 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dont 1 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Toutes sont infectées par instillation intranasale sous anesthésie, par le virus respiratoire syncytial ou la grippe A, puis manipulées chaque jour pour la pesée et la prise de température, traitées par gavage, injection ou instillation, 2 880 passant deux séances d'imagerie. Le porteur reconnaît que l'infection peut aller jusqu'à une atteinte clinique sévère, voire la mort, et présente ces antiviraux comme une "avancée importante en médecine" dont le passage au développement préclinique et clinique reste entièrement à venir.
Objectifs
Ce projet a pour objectif principal l’optimisation et l’évaluation approfondie d’une nouvelle famille d’antiviraux développée conjointement par les différents laboratoires co-porteurs. Cette nouvelle classe d'antiviraux utilise des molécules organiques (bêta-cyclodextrines) mimant les récepteurs cellulaires pour se lier aux virus et détruire physiquement leur structure de façon irréversible et non toxique. Elle constitue donc une forme de nanoparticules antivirales. S’appuyant sur une expertise complémentaire en virologie et en science des matériaux, ces trois équipes ont mis en évidence le fort potentiel thérapeutique de ces molécules. Néanmoins, plusieurs verrous scientifiques majeurs subsistent, que ce projet vise à lever afin d’accélérer le développement de cette famille d’antiviraux. En identifiant des molécules plus puissantes dotées d’une activité à large spectre, nous ambitionnons de renforcer l’efficacité in vivo contre le virus respiratoire syncytial, le virus influenza A et d’autres virus humains d’importance majeure. Cet objectif est particulièrement crucial pour la prise en charge des virus respiratoires circulants chez les populations à risque et constitue un enjeu clé de la préparation pour faire face aux pandémies. Nous étudierons également la possibilité de modifications chimiques visant à conférer une biodisponibilité orale, un critère déterminant pour faciliter l’administration, améliorer l’observance thérapeutique et soutenir de futures études cliniques. Une autre question centrale portera sur la capacité de l’inactivation virale induite par ces molécules à générer des débris viraux immunogènes, susceptibles de stimuler une réponse immunitaire protectrice et une mémoire immunologique. L’objectif est ainsi de développer non seulement un antiviral hautement efficace, mais également une molécule capable de conférer une protection durable contre l’infection. Les résultats attendus permettront d’optimiser davantage la structure de ces antiviraux et de les rapprocher d’un développement clinique, tout en contribuant à l’émergence de nouveaux outils et méthodologies de recherche. Les travaux portant sur les stratégies de conjugaison pour une administration orale et sur la détection in vivo de ces macromolécules complexes apporteront des connaissances essentielles à la synthèse et à la caractérisation de nouveaux matériaux bioactifs ciblant les virus respiratoires.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait constituer une avancée importante en médecine en validant un concept de traitement capable de convertir une simple inactivation virale en une réponse immunitaire protectrice, robuste et durable. L’optimisation de la biodisponibilité orale des composés lèvera un verrou technologique déterminant, ouvrant la voie à leur transfert vers le développement préclinique et clinique.
Procédures
3600 animaux concernés pour l’ensemble des interventions, chaque type d’intervention impliquant une proportion variable : Anesthésie et instillation intranasale : chaque animal recevra une anesthésie chimique unique d’environ 20 minutes (par injection, 30s), nécessaire pour l’administration intranasale. Cette intervention sera réalisée sur tous les 3600 animaux. Manipulation et contention pour le suivi clinique : les animaux vigiles seront manipulés quotidiennement pour la mesure du poids et de la température corporelle, chaque opération durant environ 1 minute par animal. Cette mesure sera effectuée sur l’ensemble des 3600 souris. Traitement des animaux : les souris traitées recevront les solutions de composés par gavage, instillation intra-nasale ou injection, durée de l’administration inférieure à 1 minute. Imagerie: effectuée sous anesthésie gazeuse, à deux reprises espacées de quatre jours, chaque séance (anesthésie incluse) durant moins de 5 minutes. Cette intervention sera réalisée sur 2880 animaux. Imagerie: Les souris recevront une injection sous anesthésie gazeuse (durée de l’injection inférieure à 30 secondes). Prélèvement sanguin : deux échantillons seront prélevés sur chaque animal anesthésié, (1 minute). Cette intervention concernera 10% des effectifs soit 360 animaux. Mesure des paramètres respiratoires : réalisée à deux reprises au cours du protocole sur les animaux vigiles, chaque mesure durant 2 à 3 minutes. Cette intervention sera appliquée à tous les animaux. Ces interventions ont été planifiées pour limiter la durée de manipulation et le stress des animaux tout en garantissant la collecte de données fiables sur l’ensemble du groupe. Génotypage : une petite partie des souris pourra être l’objet d’un prélèvement de 1mm de queue.
Impact sur les animaux
Le protocole implique une manipulation quotidienne des animaux afin d’une part de leur administrer les composés antiviraux, et d’autre part pour évaluer différentes constantes physiologiques (poids, température, etc.). Il faut mentionner que les molécules testées ont une base organique de type sucre et sont très bien tolérées par les animaux. Ces manipulations répétées sont susceptibles d’induire un stress modéré chez les souris, notamment lorsque les traitements nécessitent une injection (IP ou IV). L’infection virale nécessite une anesthésie générale de courte durée (< 1 heure), réalisée par injection parentérale de l’anesthésique, pouvant entraîner une douleur transitoire liée à la piqûre. Une légère perte de poids est parfois observée le lendemain de l’anesthésie. L’infection virale induit une pathologie dont la sévérité dépend du virus et de la dose d’inoculum administrée, pouvant aller jusqu’à une atteinte clinique sévère, voire une mortalité. Une perte de poids et une hypothermie sont notamment observées au cours des infection par le virus influenza. Une gêne respiratoire, objectivée par des mesures de pléthysmographie, est détectable entre J4 et J10 post-infection. Enfin, les sessions de pléthysmographie, bien que de courte durée (environ 3 minutes), peuvent également générer un stress lié à l’isolement temporaire de l’animal durant la phase de monitoring. Enfin, l’éventuel génotypage des souris IFNAR-/- va induire une nuisance liée au prélèvement de 1mm de queue, correspondant principalement à une douleur transitoire au moment du geste, associée à un stress de courte durée lié à la contention et à la manipulation, ainsi qu’à un inconfort local temporaire au site de prélèvement.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes.
Remplacement
Notre thématique de recherche ne peut être mise en œuvre sans recours à des modèles animaux. En effet, l’évaluation de l’efficacité de nos nanoparticules antivirales repose sur l’étude d'interactions biologiques complexes s’exerçant à l’échelle de l’organisme entier. L’établissement d’une réponse immunitaire protectrice, incluant la capture des débris viraux immunogènes et le recrutement de cellules immunocompétentes vers les sites d’infection, nécessite une coordination systémique entre les systèmes lymphatique, vasculaire et les tissus cibles. De plus, les enjeux de biodisponibilité et de pharmacocinétique liés à l’administration orale impliquent des processus de barrières biologiques et de métabolisme qu’aucune approche in vitro ou ex vivo ne peut actuellement reproduire fidèlement. L’étude intégrée de ces mécanismes d'action et de la mémoire immunologique induite nécessite donc impérativement le recours à des modèles animaux diversifiés, conformément aux principes éthiques des 3R.
Réduction
Notre stratégie de réduction est basée sur l’emploi de tests statistiques nous permettant de valider nos hypothèses scientifiques sur la base de résultats obtenus avec le nombre minimal d’animaux en termes d’effectifs. Afin de garantir la robustesse des résultats tout en respectant le principe de Réduction (3R), les effectifs ont été calculés pour détecter une taille d’effet importante de d = 1,4 (différence de Cohen) avec une puissance statistique de 80 % (risque alpha = 5 %). Ce calcul de la taille d’effet s’appuie sur nos données préliminaires ainsi que sur la pertinence biologique attendue. Il vise à identifier uniquement des variations d’une amplitude significative afin d’écarter les différences minimes et dénuées d'intérêt clinique. En fixant l’effectif à n = 10 par groupe, et en prenant en compte ces paramètres statistiques, l'étude devient calibrée pour détecter des tailles d'effet importantes et garantit donc la robustesse et la reproductibilité des conclusions biologiques. Ces paramètres permettent de mettre en évidence des différences biologiquement pertinentes, même en présence d'une variabilité interindividuelle modérée au sein de groupes de 10 animaux. Les analyses statistiques seront réalisées en fonction de la nature des données (sécrétion de cytokines, détresse respiratoire, réplication virale…), avec des tests t de Student ou des tests non paramétriques (Mann-Whitney) pour les comparaisons simples, et des modèles d’ANOVA à deux facteurs pour les analyses intégrant plusieurs facteurs expérimentaux (nanoparticules et voies d’administration). Des corrections pour comparaisons multiples (Benjamini-Hochberg) pourront être appliquées. La taille d’échantillon est définie à partir de la réplication virale qui correspond à la variable biologique principale de réponse, correspondant au critère quantitatif retenu pour évaluer l’effet des conditions expérimentales. En complément, des analyses multivariées de type analyse en composantes principales (ACP) seront réalisées afin de visualiser les structures globales des données et d’identifier d’éventuels regroupements ou tendances au sein des différents paramètres expérimentaux.
Raffinement
Le bien-être animal est un axe central de notre démarche, visant à minimiser le stress et la souffrance tout au long du challenge infectieux. Les souris sont hébergées par groupes de cinq au sein de cages à couvercle filtrant, dans un environnement climatisé avec accès ad libitum à l’eau et à une alimentation standard. Afin de favoriser les comportements naturels et réduire l'anxiété, l'environnement est enrichi par des carrés de coton (type Neslets/Sizzle-nest), des bûchettes de bois à ronger et des abris en carton. Une surveillance quotidienne rigoureuse permet de déceler tout signe clinique précurseur (perte de poids, hypothermie, difficulté respiratoires, diarrhée, poil hérissé, léthargie, yeux clos ou dos courbé). Pour prévenir toute souffrance inutile, des points limites précis ont été établis : tout animal répondant à l'ensemble des critères prédéfinis sera immédiatement euthanasié. Nous veillons à réduire l'impact des manipulations par des techniques de précision : les prélèvements sanguins sont réalisés avec des micro-aiguilles pour minimiser les volumes prélevés et les traumatismes tissulaires. De même, les administrations de composés antiviraux sont effectuées par injections lentes, garantissant une meilleure tolérance et réduisant la variabilité induite par le stress. Bien que la pléthysmographie impose un bref isolement (2 à 3 minutes), la répétition de la procédure permet une habituation rapide des animaux, confirmée par une diminution du temps d'acquisition dès la deuxième mesure. Lors des génotypages des souris IFNAR-/- nécessitant un prélèvement de queue, une application locale de pommade anesthésiante sera réalisée. De plus, une hémostase par pression manuelle sera faite immédiatement après prélèvement et jusqu'à l'arrêt du saignement. Enfin, une surveillance post-prélèvement sera effectuée jusqu’à 24 heures pour s'assurer de la parfaite cicatrisation du site de prélèvement.
Choix des espèces
Le choix de la souris est guidé par la possibilité de disposer de souris génétiquement modifiées (NF-kB luciférase, IFNAR KO) et donc de pouvoir suivre des processus dynamiques sur les mêmes animaux sans avoir à les euthanasier pour réaliser des mesures. De plus, la disponibilité de certaines souris immunodéficientes nous permet d’élargir le panel de virus ciblés (hPIV3). De plus, la souris constitue un modèle pertinent pour étudier les mécanismes pathologiques induits par les infections virales respiratoires ainsi que la mise en place de réponses humorales et cellulaires adaptatives. Souris âgées de 8 semaines car le système immunitaire est mature.
Maintien d’une lignée de rat modèle de mucoviscidose
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Porteurs par construction génétique d'une mucoviscidose, 600 rats reçoivent une alimentation modifiée et du laxatif dans l'eau de boisson depuis l'âge de dix jours jusqu'à leur mise à mort, ce qui provoque des selles molles en continu. Le niveau de souffrance déclaré est léger et le projet se limite à entretenir la lignée. Les rats sont tués pour prélèvement d'organes ou versés dans d'autres projets soumis à autorisation, sans que le RNT indique la part de chacun. Le porteur écarte les modèles drosophile et poisson zèbre, qui existent, au motif qu'ils ne renseignent ni sur le microbiote pulmonaire ni sur la fonction testiculaire, et affirme la supériorité du rat sur la souris.
Objectifs
Le projet a pour but le maintien d'une lignée de rat mucoviscidose. Ce modèle permettra de mieux comprendre la genèse de la pathologie, d'évaluer son impact sur les différents organes et sur le microbiote intestinal et pulmonaire et de proposer ou de tester des solutions thérapeutiques pour limiter l'expression de la maladie.
Bénéfices attendus
Mettre à disposition d'équipes de recherche un modèle pertient de la mucoviscidose pour répondre à leurs questions scientifiques sur le sujet.
Procédures
Les animaux recoivent une alimentation adaptée et du laxatif dans l'eau de boisson depuis l'âge de 10 jours jusqu'à leur mise à mort.
Impact sur les animaux
Les animaux recoivent une alimentation modifiée et du laxatif dans l'eau de boisson qui peuvent provoquer la production de selles molles depuis le sevrage jusqu'à l'âge de sortie du projet.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l'issue de cette procédure en cas de prélèvement d'organes ou de matériel biologique post mortem ou ils seront inclus dans d'autres projets soumis à demande d'autorisation.
Remplacement
Pour la mucoviscidose qui touche de nombreux organes, il n'existe pas de modèle intégré in vitro reproduisant la compléxité de la pathologie et les interactions entre les différents organes touchés. Il existe des modèles drosophile et zebrafish mais qui ne permettent pas de répondre à certaines questions ( caractérisation du microbiote pulmonaire et digestif, fonction testiculaire, ...). Des expériences ont montrées une supériorité du modèle rat sur le modèle souris avec un phénotype qui se rapproche plus de celui de l'humain.
Réduction
En fonction des demandes des équipes intéressées par le modèle, des tests statistiques seront réalisés à priori pour déterminer la taille des groupes expérimentaux en vue des différentes attendues (test de puissance) et/ou des tests à posteriori pour s’assurer de la validité statistique des résultats obtenus. En cas de projets en prévision ou en préparation, la lignée sera maintenue sous forme d'animaux porteurs d’une seule mutation ce qui permet d'avoir des animaux qui n’expriment pas la maladie et avec une alimentation conventionnelle (en effet, seuls les rats porteurs de 2 mutations expriment la maladie). Cela permettra la production des animaux d'intérêt au moment de la réalisation du projet. Si aucun projet n'est en prévision, la lignée sera conservée au maximum 12 mois à l'état respirant puis sera maintenue sous forme non respirante par conservation d’embryons congelés. Le maintien de la lignée à l’état respirant sur 12 mois correspond à peu près à une génération de rat (car les rats mâles peuvent être mis en reproduction jusqu'à cet âge) et permet d'éviter la décongélation de la souche cryoconservée qui est aussi consommatrice d'animaux. En effet les animaux obtenus nécessitent des accouplements sur une génération avec des animaux non consanguins pour éviter tout accouplement frère-sœur issus des embryons ce qui pourrait introduire un biais lié à la consanguinité
Raffinement
Des grilles de score seront mises en place pour détecter une altération du bien-être des animaux et prendre des mesures correctrices grâce à des points limites qui déclencheront une action curatrice ou une mise à mort des animaux si la souffrance ne peut pas être réduite. Un antalgique sera administré en cas de signe d'expression de douleur.
Choix des espèces
Le modèle rat a montré qu'à plusieurs égards qu'il est plus pertinent que le modèle souris. Il existe des modèles drosophile et zebrafish mais qui ne permettent pas de répondre à certaines questions ( caractérisation du microbiote pulmonaire, fonction testiculaire, ...).
Création d’un modèle de souris mutante pour l’étude des capacités antivirales d’un facteur immunitaire
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Tout ce projet consiste à fabriquer deux lignées de souris invalidées pour un gène de défense antivirale. 412 souris y sont utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les femelles reçoivent jusqu'à cinq injections hormonales en 48 heures, certaines subissent une chirurgie de quinze minutes, et des mâles sont vasectomisés pour rendre des femelles pseudogestantes. 24 souris transgéniques de troisième génération sont conservées pour propager les lignées et subir une infection grippale, tout le reste est tué, y compris les mâles vasectomisés devenus trop vieux à la fin du projet.
Objectifs
Ce projet cherche à établir une lignée de souris transgéniques qui permettra de comprendre comment une protéine d’intérêt aide notre corps à se défendre contre les virus. Des premiers résultats montrent qu’elle pourrait empêcher les virus de se multiplier dans nos cellules. Mais pour vraiment comprendre son rôle, il faut observer ce qui se passe dans un organisme entier, car le système immunitaire est très complexe.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche vise à créer des animaux génétiquement modifiés qui permettront de mieux comprendre comment notre corps se défend contre les virus qui attaquent nos poumons. Le but est d'observer comment l'absence ou la présence de cette protéine modifie la façon dont l'organisme réagit à une infection. Ces recherches permettront de mieux comprendre comment lutter contre les virus et pourraient aider à développer de nouveaux traitements. À long terme, elles pourraient aussi nous aider à mieux faire face aux épidémies et aux infections graves.
Procédures
Pour les injections, chaque souris est injectée au maximum 5 fois (sur une durée de 48h). Ces interventions sont rapides (une injection dure quelques secondes). Les interventions chirurgicales sous anesthésie générale sont réalisées une fois et durent une quinzaine de minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les souris concernent : (1) douleurs liées aux injections, et 2) risques d’infection ou hémorragies et douleurs liées aux interventions chirurgicales. Les souris pourront subir jusqu’à cinq injections, pouvant provoquer une légère douleur comparable à une piqûre. Certaines auront également une intervention chirurgicale d’environ 15 minutes, entraînant des douleurs modérées pendant quelques jours le temps de la cicatrisation. Aucun effet négatif particulier lié aux hormones n’est attendu, mais le bien-être des animaux sera surveillé attentivement.
Devenir
Tous les animaux ayant servi à la création et au développement des lignées seront mis à mort, à l’exception de 4 mâles et 8 femelles transgéniques (troisième génération) qui seront conservés pour chacune des deux lignées afin de propager ces lignées et réaliser l’analyse de leur résistance à une infection virale influenza. A la fin du projet, les mâles vasectomisés seront trop vieux pour être utilisés et seront donc euthanasiés.
Remplacement
Notre recherche porte sur le rôle d’un gène dans la défense contre les virus. Pour bien comprendre son fonctionnement, nous devons étudier ce qui se passe dans un organisme vivant entier, et pas seulement sur des cellules en laboratoire. En effet, la réponse du corps face à une infection est très complexe. Elle implique la coopération de plusieurs systèmes (comme le sang, les ganglions lymphatiques et les tissus infectés) et la mobilisation coordonnée de différentes cellules immunitaires. Ces interactions ne peuvent pas être reproduites de manière fiable en dehors d’un organisme vivant. De plus, certains aspects importants (comme la manière dont un virus se propage dans le corps, les organes qu’il infecte, ou encore les réactions inflammatoires) ne peuvent être observés que chez un organisme complet. C’est pourquoi nous utilisons des modèles animaux, en particulier des souris génétiquement modifiées qui ne possèdent pas ce gène. Cela nous permet de mieux comprendre son rôle réel dans la défense contre les infections et dans la mémoire immunitaire.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire au projet a été optimisé pour permettre la production de huit souris mutantes pour un gène d’intérêt et l’obtention au final de deux lignées de souris invalidées pour le gène d’intérêt. Ces lignées de souris n’existent pas actuellement. Ce nombre est basé sur l’expérience du laboratoire pour la production de lignées de souris transgéniques avec ces outils et à l’aide des principes généraux fournis par le guide européen « animaux génétiquement altérés » pour la procédure d’évaluation du bien-être animal des deux lignées créées.
Raffinement
Toutes les souris (mâles, femelles et juvéniles) seront élevées en groupe avec un enrichissement dédié dans chaque cage (maison en carton et coton). Les souris mâles adultes vasectomisées utilisées pour les accouplements seront hébergés avec des femelles de compagnie (souvent de vieilles femelles). Une observation quotidienne des animaux sera réalisée pour évaluer leur bien-être et en cas de douleur suspectée par l’évaluation quotidienne des animaux, une injection d’analgésique sera administrée en sous-cutanée. Des analgésiques seront administrés en pré-opératoire et en post-opératoire en sous-cutané. Du gel sera appliqué pour éviter tout dessèchement oculaire au cours des interventions chirurgicales. Les interventions chirurgicales seront réalisées sur un tapis thermorégulé afin d’éviter toute hypothermie, sous anesthésie et analgésie. Des points limites seront appliqués afin d’éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle souris pour deux raisons principales. D'abord, c'est un animal dont on peut facilement modifier l'ADN en manipulant des œufs juste après fécondation: cela nous permet de « désactiver » certains gènes pour comprendre leur rôle et de modifier ainsi le génome dans toutes les cellules de l’animal, y compris les cellules germinales (transmission alors du génotype par reproduction sexuée). Ensuite, la souris est un modèle couramment utilisé pour étudier la réponse aux infections grippales. Le virus s'attaque aux mêmes organes et provoque une maladie respiratoire très proche de celle de l'être humain, ce qui en fait un excellent modèle pour tester des traitements. Pour la production de la lignée génétiquement modifiée, nous utiliserons des souris adultes. Pour la caractérisation du bien-être de la lignée, nous utiliserons des souris des stades nouveau-né à adulte.
Recherche de nouveaux traitements pour traiter la fibrose pulmonaire dans un modèle murin reproduisant cette pathologie
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Une fibrose pulmonaire est déclenchée par activation d'un gène, puis les souris reçoivent jusqu'à vingt injections en trente jours et boivent une solution sucrée pendant un mois. 584 souris vont être utilisées, dont 496 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur annonce un stress de préhension, un stress d'isolement, des lésions pulmonaires et une perte de poids, sans décrire ce que devient la respiration d'un animal dont le poumon se fibrose pendant un mois. Toutes sont tuées à l'issue, au plus tard deux mois après le début de l'expérience, pour prélever les tissus.
Objectifs
Nous étudions une protéine qui est exprimée sur les membranes des cellules et qui permet un échange de sels entre l’intérieur et l’extérieur de la cellule. Cette protéine est impliquée dans l’établissement des fibroses pulmonaires. Nous avons montré qu’un modulateur positif de cette protéine inhibe la fibrose pulmonaire induite par un agent chimique. Dans ce projet, nous souhaitons étendre nos observations à un autre modèle de fibrose pulmonaire qui mime plus fidèlement les mécanismes d’induction de la fibrose chez l’Homme. Sur ce modèle, nous allons tester l’effet de molécules anti fibrosantes combinées aux modulateurs de notre protéine d’intérêt et caractériserons leurs mécanismes d’action dans la résorption de la fibrose pulmonaire.
Bénéfices attendus
Les pathologies fibrosantes du poumon sont aujourd’hui incurables. Au mieux les traitements actuels permettent de ralentir leur progression. Ces expériences pré-cliniques nous permettront de caractériser de nouvelles options thérapeutiques sur un modèle murin qui mime le développement de la fibrose pulmonaire chez l’homme. A terme, ce projet pourrait inciter les cliniciens à tester de nouvelles combinaisons thérapeutiques dans des essais cliniques pour les patients présentant des pathologies fibrosantes du poumon.
Procédures
- Les souris boiront une solution sucrée à volonté pendant 30j. - Injections : 10 secondes x nombre d’injection, au maximum 20 injections par animal réparties sur 30j. - Manipulation pour prise de poids : 15 secondes par animal, au maximum 5 pesées par semaines pour 4 semaines. - Anesthésie, 1 fois. -Traitement anti douleur pré anesthésie.
Impact sur les animaux
- Stress à la préhension. - Stress à l’isolement dans un espace restreint Lésions. - pulmonaires liées à l’induction d'un gène. - Perte de poids liée à la progression de lésions pulmonaires. – Stress liés aux l’injections .
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure
Remplacement
Les concentrations actives des molécules que nous testerons ont été validées in vitro ou grâce à une étude exhaustive de la littérature. Cependant à ce jour il n'existe pas de méthode de remplacement (co culture de cellules, modèles invertébrés, intelligence artificielle) qui permettent de caractériser chez les mammifères les interactions cellulaires et moléculaires mises en jeu dans les pathologies telle que la fibrose pulmonaire. De ce fait, le recours à l’animal vivant est requis.
Réduction
Une étude exhaustive de la littérature a été menée avant d'initier ce projet pour s'assurer de la non-reproduction de résultats déjà publiés. Nous adopterons une technique qui nous permettra de tester plusieurs combinaisons thérapeutiques à partir d'un seul poumon malade. Nous utiliserons une approche non invasive pour caractériser la progression de la fibrose ainsi que l’efficacité des traitements sur animaux vivants. De plus, nous avons réalisé une étude statistique prévisionnelle qui nous permet de prédire le nombre minimal d’animaux qu’il faut inclure par groupe expérimental afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Dès que nos hypothèses scientifiques seront validées, nous mettrons fin à nos expériences, même si cela signifie utiliser moins d’animaux que prévu initialement. Notre objectif est de limiter au maximum leur utilisation, tout en garantissant la rigueur et la fiabilité de nos résultats.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans des portoirs ventilés et stériles et sont surveillées quotidiennement. Nous avons montré l’absence de toxicité de nos composés et de leur véhicule sur des cellules en culture et sur des animaux vivants. Nous utilisons des méthodes non invasives pour étudier les capacités respiratoires des animaux. Pour limiter au maximum la souffrance des souris nous avons établi une fiche d’observation qui liste les mesures que nous prenons pour assurer le bien-être. Les drogues seront administrées par injection en rotation sur différents points, pour limiter les effets locaux.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris car la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. De plus, il existe beaucoup d’outils (Anticorps, imagerie) qui permettent de travailler avec les souris. Le modèle génétiquement altéré que nous utiliserons est bien caractérisé dans la littérature. Il est particulièrement adapté à notre projet avec un développement de fibrose pulmonaire après l’expression de la forme active d'une protéine pro fibrosante. Les souris femelles et mâles seront mises en expérimentation à un âge minimum de 8 semaines, soit à l’âge adulte. A cet âge, le système immunitaire des souris est mature. Les souris seront mises à mort au maximum 2 mois après le début de l’expérience pour permettre le prélèvement des tissus et leur analyse.
Etude de l’efficacité de candidats médicaments dans un modèle préclinique d’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système respiratoire
Tués à l'issue de mesures que le porteur décrit comme trop invasives pour permettre un réveil, 1 960 rats vont être utilisés dans ce projet, dont 1 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent sous anesthésie une substance qui provoque une hypertension pulmonaire, puis un traitement quotidien pendant cinq semaines, parfois par pompe implantée sous la peau, deux séances d'imagerie cardiaque et une chirurgie de mesure de pression dans le cœur et l'artère pulmonaire. Le porteur indique que la maladie induite peut réduire l'activité, l'appétit et la prise de boisson jusqu'à une perte de poids. Il affirme que les tests sur cellules isolées ne permettent pas d'étudier les effets d'un médicament sur le cœur et les poumons, qualifie de "nécessaire" le recours au rat, et précise que l'âge des animaux sera choisi selon la sévérité recherchée du modèle.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de tester de nouveaux médicaments destinés au traitement d’une maladie grave des poumons appelée hypertension pulmonaire artérielle. Cette maladie entraîne une augmentation de la pression dans les vaisseaux des poumons, ce qui fatigue progressivement le cœur et peut conduire à une insuffisance cardiaque. Elle peut apparaître sans cause connue, être liée à des facteurs familiaux, ou être associée à d’autres maladies ou à certains médicaments. Bien que des traitements existent déjà pour soulager les symptômes, leur efficacité reste limitée et variable selon les patients. Le but de cette étude est donc d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques dans un modèle animal, afin de mieux comprendre leur potentiel avant une éventuelle utilisation chez l’être humain.
Bénéfices attendus
Le modèle utilisé dans ce projet reproduit de manière fiable les principales caractéristiques de la maladie étudiée, en particulier les atteintes des vaisseaux des poumons et du cœur. Chez les animaux, l’augmentation progressive de la pression dans les poumons entraîne des modifications du cœur similaires à celles observées chez les patients atteints de cette maladie. L’utilisation de ce modèle permet de mieux comprendre les mécanismes de la maladie et d’évaluer l’effet de nouveaux médicaments dans des conditions proches de celles rencontrées chez l’être humain. Les résultats obtenus permettront d’identifier les futurs molécules thérapeutiques les plus prometteuses, qui pourraient ensuite être étudiés chez l’homme dans le cadre d’essais cliniques, avec pour objectif d’améliorer la prise en charge future des patients.
Procédures
Les animaux sont anesthésiés afin d’injecter la substance induisant une augmentation de la pression artérielle dans les petits vaisseaux sanguins localisés dans les poumons c'est-à-dire l'hypertension artérielle pulmonaire (durée de l’intervention : 6-8 min). Durant les 5 semaines suivantes, les animaux seront traités quotidiennement avec plusieurs composés par différentes voies d'administration selon les objectifs de l’étude (durée de 1 à 5 minutes selon la voie choisie). Le traitement pourra également être administré via des pompes diffusant les composés, implantées sous anesthésie et analgésie. Au cours du protocole, les animaux seront à nouveau anesthésiés afin de réaliser une imagerie cardiaque (environ 20 min) pour contrôler les répercussions de l'induction de la pathologie et l'effet potentiel des nouvelles molécules thérapeutiques à tester. Une autre imagerie cardiaque sera effectuée en fin de protocole (environ 20 min), puis une chirurgie sera effectuée sous anesthésie et analgésie afin de réaliser des mesures de pression dans le cœur et dans l'artère pulmonaire (environ 20 min). Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours du protocole sur animaux vigiles ou anesthésiés (environ 5 minutes par prélèvement), ou en fin de protocole après les mesures de pression et avant leur mise à mort.
Impact sur les animaux
Les animaux recevront une substance destinée à provoquer la maladie étudiée. Cette administration est réalisée sous anesthésie générale et peut entraîner une gêne passagère, notamment au niveau respiratoire ainsi qu'une gêne au niveau du site d'injection (démangeaisons, sensation de brûlure). Avec le développement de la maladie, les animaux peuvent présenter une diminution de l’activité, une baisse de l’appétit et de la prise de boisson, pouvant conduire à une perte de poids. Une intervention chirurgicale pourra être réalisée pour implanter un dispositif diffusant le traitement. Cette intervention implique une ouverture de la peau et peut entraîner une douleur ou une gêne temporaire liée à la présence du dispositif. L’administration répétée de médicaments peut générer du stress, car elle nécessite une manipulation et une contention des animaux. Certains effets indésirables liés aux médicaments testés ou aux gestes techniques peuvent survenir, en particulier avec de nouvelles molécules. Des prises de sang et des examens d’imagerie cardiaque seront réalisés sous anesthésie ou avec contention, ce qui peut entraîner un inconfort temporaire, du stress ou une douleur légère. En fin de protocole, des mesures complémentaires seront effectuées sous anesthésie générale.
Devenir
Afin de caractériser l'effet des traitements testés, notamment l'effet biologique, nous devons faire des mesures qui sont trop invasives pour permettre le réveil de l’animal, et il est indispensable de récupérer le cœur et les poumons en fin d'expérience pour évaluer l’efficacité des traitements
Remplacement
Ce projet vise à évaluer l’efficacité de nouveaux médicaments dans un organisme vivant. Les tests réalisés sur des cellules ou des tissus isolés ne permettent pas d’étudier les effets globaux du médicament sur le cœur et les poumons. L’utilisation d’un modèle animal est nécessaire pour mieux comprendre ces effets et le comportement du médicament dans le corps.
Réduction
Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d'animaux nécessaire en utilisant les données précédemment acquises dans notre laboratoire. Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, de l'imagerie est utilisée pour permettre de suivre plusieurs paramètres dans le temps sur le même animal.
Raffinement
A l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 5 jours est respectée. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Une grille de score est établie afin de faire un suivi clinique des animaux, avec la mise en place de mesures adaptées en fonction du score et des critères d’arrêt de souffrance. Des enrichissements multiples leur sont proposés en alternance, pour limiter l’habituation et l’ennui. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie. Lorsqu’une chirurgie avec réveil sera nécessaire, elle sera réalisée en conditions propres (sans microbes) et les animaux auront un suivi post-opératoire intensif pendant au moins 3 jours. Par ailleurs, les animaux seront habitués à la manipulation et à la contention ainsi qu’aux environnements nouveaux afin de réduire le stress.
Choix des espèces
Le rat est le modèle animal le plus approprié pour cette étude car la maladie peut y être reproduite de façon fiable et ses effets sur le cœur sont comparables à ceux observés chez les patients. Sa taille permet également de réaliser des prises de sang répétées pour mieux suivre l’action du médicament dans l’organisme. Des rats entre 4 et 8 semaines au moment où ils arrivent en acclimatation dans nos locaux sont utilisés dans ce modèle. L’âge des animaux impactant la sévérité du modèle, ces paramètres seront choisis selon les objectifs de l’étude.
Modélisation et caractérisation de modèles murins précliniques d’infection par les virus respiratoire syncytial (VRS) : étude des mécanismes physiopathologiques et évaluation de candidats thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
2 700 souris, toutes classées en souffrance sévère et toutes tuées à l'issue, vont être infectées par le virus respiratoire syncytial puis traitées par des molécules candidates administrées par voie orale, nasale, intraveineuse ou dans le muscle. Les manipulations répétées incluent gavages, injections et prélèvements sanguins, le gavage comportant un risque d'étouffement en cas de fausse route. Les fonctions respiratoires sont mesurées sur l'animal éveillé, et les organes prélevés après la mise à mort. Le porteur justifie le recours à la souris par l'incapacité des modèles in vitro à reproduire la complexité des réponses immunitaires d'un organisme vivant.
Objectifs
Ce projet a pour but de mieux comprendre les infections causées par le virus respiratoire syncytial (VRS), un virus responsable notamment de bronchiolites chez les nourrissons, et de développer de nouveaux traitements ou moyens de prévention. Pour cela, nous utilisons des modèles chez la souris qui permettent de reproduire la maladie observée chez l’être humain. Nous étudions comment le virus se développe dans l’organisme, comment il se propage et comment la maladie évolue au fil du temps. Nous analysons aussi la manière dont le corps réagit face à l’infection, en particulier au niveau des poumons, mais aussi dans d’autres organes. Cela nous aide à comprendre pourquoi certaines personnes développent des formes plus graves ou plus longues de la maladie. Le projet permet également de tester de nouveaux traitements et des vaccins potentiels afin de vérifier s’ils peuvent diminuer la gravité de l’infection, réduire les symptômes et éviter les complications. Enfin, nous appliquons les principes des 3R (Réduire, Raffiner, Remplacer), qui visent à limiter l’utilisation des animaux et à réduire leur inconfort. Avant toute étude chez l’animal, les traitements sont d’abord testés en laboratoire sur des cellules. Nous adaptons également nos méthodes pour utiliser le moins d’animaux possible et assurer leur bien-être.
Bénéfices attendus
L’objectif de cette étude est de mettre au point et de valider de nouveaux modèles de souris pour mieux comprendre l’évolution de la maladie provoquée par les VRS et d’identifier les facteurs qui rendent certains individus plus sensibles à l’infection. Ces modèles permettront d’évaluer l’efficacité de nouvelles approches de traitement et de prévention contre ces virus. Les résultats attendus de ce projet visent à améliorer les modèles utilisés avant les essais chez l’Homme ainsi qu’à valider des stratégies médicales prometteuses, contribuant ainsi au devéloppement de solutions plus efficaces pour la santé humaine.
Procédures
Les souris recevront différents traitements selon le protocole étudié et la nature des molécules testées. Les produits pourront être administrés par différentes voies : -Par la bouche : Une à deux fois par jour pendant quelques jours, -Par injection dans le ventre : Une à plusieurs reprises selon le calendrier prévu, -Par injection sous la peau : Une à plusieurs reprises selon le calendrier prévu, -Par le muscle, -Par le nez, -Par voie intraveineuse. L’état général des animaux sera observé attentivement avant et après chaque manipulation afin de s’assurer de leur bon rétablissement. Des prélèvements sanguins pourront être effectués à différentes étapes (avant et après infection) afin de suivre la réponse de l’organisme. Les fonctions respiratoires seront mesurées à l’aide d’un appareil permettant d’enregistrer la respiration de la souris sans la contraindre : l’animal reste éveillé et peut bouger à l’intérieur de la chambre. Une observation clinique sera réalisée avant et après chaque mesure pour vérifier qu’il n’y a pas de signe d’inconfort. Certaines procédures nécessiteront une anesthésie, réalisée avec des produits adaptés au poids de l’animal. Dans certains cas, un antidouleur (buprénorphine) sera administré avant l’anesthésie afin d’éviter toute douleur. En fin d’étude, une anesthésie profonde sera pratiquée avant la perfusion terminale, qui consiste à faire circuler une solution dans les organes pour pouvoir ensuite les prélever et les analyser. Cette étape est effectuée uniquement lorsque l’animal est totalement endormi et insensible.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables généralement attendus dans le cadre de nos projets et procédures expérimentales sont principalement liés à la répétition des manipulations : gavage oral, injections (intramusculaire, intraveineuse, intranasale), prélèvements sanguins et mesures physiologiques. Ces interventions peuvent entraîner des effets transitoires, essentiellement dûs à la douleur locale, au stress de contention ou à des réactions tissulaires passagères. - Gavage oral : Un risque d’étouffement existe en cas de fausse route. Dans ce cas l’animal sera placé en position verticale et frictionné afin de dégager les voies respiratoires. Si ces mesures ne rétablissent pas la respiration de l'animal, une mise à mort immédiate sera réalisée. - Injection intramusculaire : La mise en place d’une réaction inflammatoire locale peut provoquer une sensibilité à la palpation, un léger gonflement ou une réduction temporaire de la mobilité des membres postérieurs. - Injection intraveineuse : L’injection par voie rétro-orbitaire peut entrainer un saignement localisé au niveau de l’œil. Une compression douce suite à l’injection est exercée afin de stopper le saignement et limiter la formation d’un hématome. - Injection intranasale : Une irritation locale transitoire peut être provoquée avec un écoulement nasal ou une respiration plus rapide suite à l’administration. Si une détresse respiratoire ou une fausse route surviennent l’animal sera placé en position verticale et frictionné pour dégager les voies respiratoires. Si ces mesures ne rétablissent pas la respiration de l'animal, une mise à mort immédiate est réalisée. - Equipement d'analyse des fonctions respiratoires : La restriction temporaire de mouvement et l’isolement de l’animal peut induire un léger stress pendant la mesure. Afin de limiter cet inconfort une période d’entrainement préalable est mise en place : par une habituation une à deux fois pendant 30 minutes, dans un délai de deux à trois jours avant les mesures. - Prélèvement sanguin : Le prélèvement sanguin par voie submandibulaire est une procédure rapide. Le volume de sang prélevé est adapté au poids de l’animal. La ponction peut induire une douleur brève, une compression douce et immédiate est alors appliquée afin de stopper le saignement et limiter la formation d’un hématome.
Devenir
Pour toutes les procédures prévues dans ce projet, les animaux sélectionnés seront euthanasiés conformément aux recommandations réglementaires, afin de permettre le prélèvement des organes et leur analyse.
Remplacement
À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet pas de reproduire de manière satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans l’initiation des réponses immunitaires lors d’une infection naturelle ou après une vaccination. En effet, les modèles in vitro ne parviennent pas à capturer la complexité des interactions entre les différents types cellulaires, les tissus et les mécanismes systémiques qui se produisent dans un organisme vivant. C’est pourquoi, il est indispensable de recourir à des modèles animaux, qui permettent une étude plus fidèle des réponses immunitaires dans un contexte biologique complet et dynamique. Ces modèles animaux offrent une plateforme essentielle pour mieux comprendre les mécanismes de défense de l’organisme et pour tester l’efficacité des traitements et des vaccins avant toute application clinique.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour chaque type de procédure sera précisé dans le protocole. Les effectifs sont déterminés sur la base d’expériences antérieures et/ou de calculs de puissance statistique, afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons des animaux des deux sexes, âgés de 6 à 20 semaines et répartis en groupes homogènes pour garantir des analyses statistiques pertinentes. Lorsque possible un même groupe témoin sera partagé entre plusieurs expériences afin de réduire encore le nombre d’animaux.
Raffinement
Les souris sont élevées dans des conditions optimales, avec un soin ainsi qu’un respect constant, et sont exposées à divers éléments d'enrichissement pour favoriser leur bien-être. Elles seront hébergées en groupes de 2 à 5 souris afin de prévenir le stress lié à l'isolement. Les cages seront systématiquement enrichies par l'ajout d'éléments comme un dôme, offrant aux animaux un abri, et de la nourriture hydratée, qui sera fournie dès que nécessaire pour pallier toute perte de poids ou déshydratation durant leur hébergement. Pour tous les actes nécessitant une anesthésie, nous privilégions une anesthésie chimique par voie intrapéritonéale. Les souris en expérimentation feront l'objet d'une surveillance quotidienne par du personnel qualifié et formé pour mener ces expérimentations. L'utilisation d'une grille de score spécifique et un suivi pondéral quotidien permettront de détecter rapidement tout signe de souffrance et de mettre en place les actions nécessaires pour la soulager. Étant donné que notre étude porte sur la réponse immunitaire, il est impératif de ne pas administrer d'anti-inflammatoires aux souris. En effet, ces molécules pourraient interférer avec nos résultats en altérant l'expression des marqueurs d’intérêt, ce qui pourrait fausser l’interprétation des réponses immunitaires observées.
Choix des espèces
Nous utiliserons le modèle murin car ce sont des mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’Homme. C’est un animal de petite taille, à reproduction rapide et facile d’élevage. De plus, la communauté scientifique dispose à ce jour d’une bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Le modèle murin est donc un modèle de choix pour l’étude du système immunitaire dans les conditions d’infection grâce aux connaissances acquises et à l’arsenal d’outils existants. En effet, un vaste répertoire d’anticorps ciblant des marqueurs murrins sont disponibles, permettant de caractériser finement la réponse immunitaire par des méthodes à très haut contenu. Les lignées murines utilisées dans ce projet incluent des animaux génétiquement modifiés afin d’étudier l’impact de certaines mutations sur la susceptibilité à l’infection virale et sur les mécanismes de la réponse immunitaire. Ces modifications génétiques sont utilisées exclusivement dans un objectif de compréhension fonctionnelle des voies impliquées dans l’infection et la pathologie respiratoire. Il est important de préciser que ces lignées ne présentent pas, en conditions d’élevage standard, de phénotype dommageable spontané associé à la modification génétique. Elles possèdent un système immunitaire globalement fonctionnel et ne développent pas d’altération physiologique ou comportementale en dehors du contexte expérimental. L’utilisation de ces modèles permet néanmoins de reproduire ou de moduler spécifiquement des voies biologiques d’intérêt (par exemple des récepteurs ou voies de signalisation impliquée dans l’entrée virale ou la réponse immunitaire), afin d’évaluer leur rôle dans la susceptibilité à l’infection et dans la sévérité de la maladie. Ces approches sont indispensables pour établir un lien causal entre une fonction génique donnée et la réponse à l’infection. Ainsi, les lignées génétiquement modifiées sont utilisées non pas en raison d’un phénotype dommageable intrinsèque, mais comme outils expérimentaux permettant de disséquer les mécanismes de l’infection virale et de la réponse de l’hôte. Pour ces expériences nous utiliserons des animaux adultes âgés de 6 à 20 semaines, présentant un système immunitaire mature.
Développement d’une thérapie innovante afin d’améliorer les conditions de conservation et la fonction des greffons marginaux hépatiques–Etude chez le modèle porcin-Modification
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Quinze cochons vont être utilisés dans une chirurgie de prélèvement du foie de trois heures, menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. L'opération sert à récupérer un greffon hépatique entier pour tester un anticorps, le NP-137, censé réduire l'inflammation des greffons dits marginaux avant transplantation chez l'humain. Le porteur écarte tout modèle cellulaire au motif qu'il faut un "organe entier" de taille comparable à celle de l'humain, et justifie la mise à mort par le prélèvement d'organe. Les bénéfices annoncés pour les patients en attente de greffe restent à distance de cette procédure, qui vise d'abord à évaluer le traitement sur l'animal.
Objectifs
Ce projet vise à améliorer la qualité des greffons de foie disponibles, afin d’augmenter le nombre d’organes utilisables et sauver plus de vies. En France, 1 342 transplantations hépatiques curatives ont été réalisées en 2023, avec un taux de survie à un an de 88 % et 76% à 5 ans. Au 1er janvier 2024, 1332 patients étaient en attente de greffe soit 2,4 candidats pour un greffon. Cette pénurie de greffons conduit à des décès sur liste d’attente. Certains greffons sont de qualité insuffisante pour être transplantés. La technique de perfusion hypothermique oxygénée (HOPE), développée à Lyon, permet de mieux conserver les greffons de qualité dite « marginale », mais des problèmes d’inflammation persistent. Le principal défi est de diminuer ces lésions pour améliorer le pronostic des greffons marginaux et des patients transplantés. Un traitement par un anticorps nommé NP-137 sera testé pour réduire cette inflammation en bloquant une protéine spécifique : la nétrine-1. La nétrine-1 joue un rôle dans les maladies chroniques du foie et l’inflammation. Ceci permettra d’améliorer la qualité et la quantité des greffons disponibles et ainsi de réduire le nombre de patients en attente de greffe.
Bénéfices attendus
Cette étude de preuve de concept est la première étape indispensable à l’utilisation chez l’humain. Elle explore l’utilisation de l’anticorps NP-137 pour dépléter la nétrine-1, afin de réduire les lésions inflammatoires des greffons dues aux différentes phases d’ischémie-reperfusion. Grâce à l’homologation clinique du NP-137 en oncologie et l’utilisation de la machine de perfusion en clinique et de notre modèle pré-clinique, cette approche pourrait être testée chez les patients dans des délais très raisonnables. Si les résultats sont positifs, cette stratégie pourrait alors être testée et étendue à d’autres greffons d’organes solides impactés par l’ischémie-reperfusion et l’inflammation.
Procédures
Le premier et seul acte invasif réalisé vigile concerne la réalisation d’une prémédication, réalisée très rapidement en une injection (5 min), permettant ensuite le transport (20 min) et la réalisation de l’anesthésie générale (30 min) dans de bonnes conditions. La période d’acclimatation préalable permet de réalisér cette prémédication dans des conditions moins stressantes pour l’animal. Par la suite, il s'agit d'une procédure chirurgicale sans réveil (3 heures) au cours de laquelle l'animal sera anesthésié et analgésié en continu sans réveil. La chirurgie consiste en la réalisation d’un prélèvement hépatique, qui dure environ 180 minutes. Lors de la procédure chirurgicale, sous anesthésie générale, des prélèvements sanguins sont prévus afin de contrôler l’état physiologique de l’animal toutes les heures (pendant 3 heures). Une biopsie hépatique (1 min) sera réalisée en début de procédure pour avoir un examen des tissus du foie de référence avant toute manipulation mais sera là encore réalisée sous anesthésie générale. Tous ces prélèvements ne durent que quelques secondes.
Impact sur les animaux
Il s’agit dans le contexte de ce projet, d’une procédure sans réveil, réalisée sous anesthésie générale, avec un monitoring de l’analgésie per opératoire. Par ailleurs, le déroulé des sessions respecte la période d’acclimatation de ces animaux et les séances se déroulent dans le respect du bien-être animal. Les nuisances habituellement rencontrées dans ce type de modèle comprennent le choc anesthésique et le risque hémorragique, plus rarement le risque de reprise de conscience généralement couvert par un monitorage approprié de l'anesthésie/analgésie et des administrations médicamenteuses adaptées. La procédure étant sans réveil, il n’y a par ailleurs pas de nuisances ou effets secondaires attendus après la procédure.
Devenir
Il s’agit d’une procédure chirurgicale sans réveil qui est principalement motivée par des raisons scientifiques qui justifient l’utilisation du modèle décrit. En effet, dans le respect du bien-être animal, par soucis de standardisation, mais aussi pour permettre une analyse pertinente et exhaustive du greffon hépatique, seule la première partie nécessitant le prélèvement d’un greffon hépatique est réalisé chez l’animal. Dans la mesure où il s’agit d’un prélèvement d’organe la mise à mort de l’animal est indispensable en fin de procédure.
Remplacement
Pour limiter au maximum, le nombre de biais, il est important que la procédure expérimentale reflète au plus près les conditions réelles d'une procédure de transplantation hépatique chez l'humain. C'est pourquoi un modèle uniquement cellulaire n'est pas envisageable pour cette étude. De plus pour se servir des machines de perfusion, il est d'indispensable d'obtenir un organe entier à perfuser de taille comparable à l'humain, éliminant le modèle murin. Il n'est pas possible de récupérer cet organe en abattoir car nous devons contrôler le décès de l'animal pour que celui-ci soit semblable aux conditions d'obtention des greffons issues de donneur à cœur arrêté en transplantation hépatique chez l'humain.
Réduction
L’utilisation de ce modèle expérimental permet ensuite de s’intégrer dans une dynamique de réduction, n’utilisant qu’un seul animal au lieu de deux. Nous n’avons en effet pas recours à un second animal pour une transplantation (un animal donneur et un animal receveur) ou pour utiliser du sang lors de la reperfusion puisqu’il s’agit du sang provenant du même animal. Sur le plan statistique, le nombre d’animaux par groupe est le nombre minimal afin d’obtenir une puissance statistique significative. Enfin, les greffons ainsi que les prélèvements d’organes et tissus seront utilisés ultérieurement pour les formations et recherches. [Modif.03/06/26 : À la suite d’une optimisation du protocole par rapport à l’ensemble de la cohorte, nous avons besoin de rajouter 3 animaux au projet. Ce point augmente l’effectif total mais nous restons dans un modèle de réduction en utilisant un seul animal au lieu de deux ]
Raffinement
Durant toute la période d’acclimatation, les animaux sont hébergés sur de la litière. Nous leur donnons en complément des briques de litières compactées avec du pop-corn ce qui leur permet de faire de la recherche de nourriture et réduit les bagarres entre individus liées au stress du voyage et de leur arrivée. Quotidiennement, le personnel passe les voir pour donner à manger et interagir avec les individus permettant leur socialisation avec l’homme. Cette socialisation est faite par un enrichissement positif avec de la banane qui est très appréciée par le porc. Afin de détecter tout mal-être, nous utilisons une grille de suivi individuel durant la période d’acclimatation. Durant la chirurgie, l’enregistrement des paramètres vitaux en continu, associé à des alarmes sonores, est complété par une vérification humaine toutes les 30 minutes, effectuée par le personnel compétent dédié. Ce suivi permet de s’assurer du stade anesthésique et de son maintien pendant toute la durée de la procédure. Pour lutter contre l’hypothermie (baisse de la température corporelle), les animaux sont installés sur une table chauffante à 37°C et sont perfusés avec du liquide de perfusion chaud (37°C). La présence d’un vétérinaire sur le site permet d’intervenir rapidement et à tous moments durant la période de présence de l’animal dans nos locaux. Pour toutes les chirurgies, l’animal est intubé puis placé sous ventilation avec un anesthésique gazeux et sur une table chauffante pour maintenir la température corporelle. Un anti-douleur (analgésique) d'action longue sera injecté à l’animal pour prévenir la sensation de la douleur la veille de la chirurgie. Le jour de la chirurgie, l’animal sera anesthésié à l’aide d’un hypnotique couplé à un analgésique.
Choix des espèces
Le foie de porc présente une taille, un poids et une microstructure similaire au foie humain. Ces caractéristiques anatomiques et histologiques permettent d’effectuer un prélèvement d’organe standardisé et reproductible, ainsi que d’utiliser des machines de perfusion d’organes identiques à celles utilisées en pratique clinique. Un argument supplémentaire est l’utilisation et la validation de ce modèle animal dans la littérature scientifique sur la préservation des greffons hépatiques.
Rôle d’un facteur de transcription dans la sénescence cellulaire et l’emphysème pulmonaire
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
304 souris vont être utilisées contre l'emphysème pulmonaire, dont 96 opérées ou traitées sous anesthésie sans jamais reprendre conscience, les autres dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. On leur instille de l'élastase dans les narines pour léser le poumon, puis on les gave quotidiennement jusqu'à quarante-deux jours avec une molécule expérimentale. Les souris perdant au moins 10 % de leur poids sont mises à mort. Toutes sont tuées pour prélever les poumons, un modèle que le porteur juge "incontournable" face aux cultures de cellules menées en parallèle.
Objectifs
La sénescence cellulaire est un processus de vieillissement naturel qui contribue fortement à la détérioration de la santé. Il a été montré que l’accumulation de cellules sénescentes accentue précocement la sévérité dans la physiopathologie humaine notamment dans les maladies respiratoires comme la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO), l’emphysème et la fibrose pulmonaires. Aussi cibler les cellules sénescentes peut avoir des effets thérapeutiques dans les principales maladies associées à l’âge. Récemment a été défini un réseau de facteurs de transcription organisé hiérarchiquement comme un acteur dans le contrôle du phénotype de sénescence. L’inhibition de la fonction d’un de ces facteurs de transcription reprogramme le phénotype de sénescence, réduisant son impact néfaste dans la progression de la maladie. Ce projet prévoit de caractériser l’emphysème pulmonaire, maladie liée à l’âge qui affecte les poumons, entrainant une gêne respiratoire accompagnée d'une dyspnée à l'effort et actuellement sans traitement curatif disponible. Il serait intéressant de montrer que l’inhibition pharmacologique de la fonction de ce facteur de transcription retarde le début de la sénescence cellulaire, supprime l’inflammation délétère associée, tout en gardant l’architecture tissulaire. Cela favoriserait une réparation et une régénération de manière plus robuste dans le modèle murin de l’emphysème pulmonaire.
Bénéfices attendus
L’intérêt ici serait de contrôler l’accélération du processus de sénescence cellulaire induit par l’élastase au niveau pulmonaire via l’inhibition de la fonction d’un facteur de transcription en utilisant une petite molécule inhibitrice. Cela permettrait de retarder la sénescence, de préserver l’architecture tissulaire et de favoriser les mécanismes de réparation, en vue d’une régénération alvéolaire. Ce concept innovant dans la réparation/régénération pulmonaire aurait de larges implications dans les maladies chroniques respiratoires liées à l’âge.
Procédures
Afin d’induire un emphysème pulmonaire, tous les animaux seront traités par inhalation à l’élastase (ou véhicule, contrôle sans effet) : un dépôt de gouttes contenant le traitement est effectué au niveau des narines de l'animal sous anesthésie générale, moins de 5 minutes par souris (304 souris). Les traitements par des molécules pharmacologiques se font par gavage, car ne pouvant être administrés dans l’eau de boisson. Les animaux vigiles sont gavés quotidiennement selon les groupes pendant 2 jours (32 souris), 7 jours (32 souris), 14 jours (64 souris), 21 jours (96 souris) et 42 jours (64 souris), à l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une sonde de gavage adaptée sans induire de souffrance ou détresse chez les souris. Suite aux traitements, nous mesurerons les fonctions pulmonaires à J14 (32 souris), J21 (32 souris) et J42 (32 souris) à l’aide d'un appareil durant 15 minutes environ pour chaque souris sous anesthésie générale, connectée grâce à une sonde.
Impact sur les animaux
Les différents actes peuvent générer du stress chez l'animal. Notamment lorsque l’on doit tenir l'animal, lors des pesées, des traitements par gavage, des anesthésies ou encore lors des déplacements de cage, qui peuvent être une source de stress chez l’animal. De plus, ces différentes manipulations sont effectuées durant la journée, ce qui peut perturber la phase de sommeil, et induire un stress supplémentaire.
Devenir
L'étude nécessite le prélèvement des organes afin de mesurer différents paramètres biologiques et histologiques. Les animaux seront mis à mort en fin de procédures.
Remplacement
En parallèle des études menées sur la souris, une étude est portée sur des cellules issues de biopsies pulmonaires obtenus lors d'une chirurgie chez des patients avec ou sans emphysème. Différents types cellulaires sont isolés, les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses vasculaires et les fibroblastes pulmonaires, ce qui facilite l’utilisation des organoïdes, mais également la mise en culture des PCLS (Precision Cut Lung Slide, section pulmonaire de 200µm). L’in vitro permet de comparer des cellules ou PCLS de patients vs témoins sur différents critères cliniques et biologiques, traitées ou non avec l’inhibiteur. L’évaluation de la cinétique du modèle élastase chez la souris semble néanmoins incontournable afin de comprendre à l’échelle d’un organisme entier le mécanisme de sénescence et de réparation mis en place au niveau pulmonaire. Cela nous permet d’accéder à des données essentielles pour la caractérisation de l’emphysème pulmonaire, et de transposer à la pathologie humaine afin d’envisager une approche pharmacologique adaptée.
Réduction
Nous choisissons d'étudier des groupes de 8 souris. Dans la mesure du possible, les groupes seront constitués de souris de même sexe, même âge, même fratrie pour réduire au maximum la variabilité des mesures biologiques, des paramètres hémodynamiques ou encore des analyses histologiques. Suite à la collecte des résultats, nous analyserons les données avec différents types de tests statistiques. Afin d'observer une différence significative entre deux groupes, nous nous devons de constituer des groupes de 8 animaux, calculé grâce au logiciel de statistique R. Nous essayons au maximum de regrouper les protocoles expérimentaux similaires afin d'utiliser les mêmes souris contrôles.
Raffinement
L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent présent à l’animalerie ainsi que par les porteurs de ce projet. L'animalerie est en cycle classique, respectant les phases jour/nuit. L'environnement des souris sera enrichi par des maisons ou tube en carton, du papier craft et du coton. Les zootechniciens et les porteurs du projet seront en communication concernant le bien-être et la santé des animaux. Mise en place d’une grille de score permettant d’évaluer les points suivants, considérés comme points limites : 1. Tout dérèglement physiologique aboutissant à une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire. 2. Modification du comportement caractéristique d'une douleur intense, une détresse ou une souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et/ou terne, prostration, dos vouté). 3. Anomalies pouvant entrainer une douleur intense, une détresse ou une souffrance : perte de poids supérieure ou égale à 10% du poids initial de l'animal, plaies et ulcères, tumeurs, fractures... Le poids des animaux sera mesuré chaque semaine. Si un animal présente un de ces points limites, l’animal sera profondément anesthésié et analgésié, puis mis à mort par un euthanasiant chimique. De plus, les procédures que nous utilisons ont été optimisées et standardisées, ce qui permet de limiter la répétition des procédures.
Choix des espèces
Le modèle d'élastase murin classiquement utilisé dans la littérature, mime au mieux l’emphysème pulmonaire humain. Il fait l'objet de plusieurs publications notamment dans le domaine des maladies vasculaires et pulmonaires. Ainsi le modèle expérimental choisi est donc la souris. Nous utiliserons des souris mâles de 8 semaines issus des mêmes portées, provenant d'une lignée très pure et contrôlée. En effet, le développement pulmonaire continue chez la souris après la naissance, et nous considérons que ces animaux ont des poumons matures à partir de 2 mois. Nous suivrons leur évolution tout au long des différentes procédures, afin d'étudier l'effet de l'élimination des cellules sénescentes dans l'enphysème pulmonaire.
Élevage, génotypage de lignées murines transgéniques
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système gastrointestinal
- Système respiratoire
- Système urogénital
Environ 3 000 de ces souris sont maintenues en vie pour la reproduction des lignées, les surnuméraires et celles au mauvais génotype étant tuées. 5 000 souris au total vont être utilisées, dans des procédures classées légères à modérées, pour l'élevage et le génotypage de lignées transgéniques. Chaque animal subit au sevrage une biopsie de la queue et la pose d'une bague auriculaire, certaines lignées développant un prolapsus anal ou des troubles respiratoires à l'âge adulte. Le porteur décrit ces lignées comme "indispensables" et affirme qu'aucune méthode sans animaux ne reproduit les défenses des muqueuses à l'échelle de l'"organisme entier".
Objectifs
Les souris sont utilisées pour le maintien et l’amplification de lignées transgéniques, y compris des lignées présentant ou susceptibles de présenter un phénotype dommageable. Elles sont identifiées au sevrage par pose de bague auriculaire et, lorsque nécessaire, par génotypage à partir d’une biopsie de queue.
Bénéfices attendus
Les lignées transgéniques sont indispensables pour des projets visant à démontrer le rôle d’une famille de gènes fortement conservée entre l’Homme et la souris dans la protection des muqueuses. Elles permettent également de mieux comprendre les relations entre la variabilité de ces gènes et les altérations des mécanismes de défense des muqueuses sécrétrices. Ces modèles contribuent au développement de stratégies thérapeutiques et, à terme, à la mise en place de méthodes alternatives à l’expérimentation animale pour des études mécanistiques. Le projet permet également de maintenir un noyau de lignées transgéniques et de fournir des animaux à des laboratoires partenaires dans le cadre de collaborations scientifiques.
Procédures
La biopsie de queue (< 1 mm) est réalisée au sevrage sur des animaux vigiles, sous contention, pour le génotypage, concomitamment à la pose d’une bague auriculaire pour l’identification. Dans de rares cas, un génotypage complémentaire peut être réalisé à l’âge adulte par prélèvement au poinçon auriculaire sur animal vigile, sous contention.
Impact sur les animaux
Certaines lignées présentent un phénotype dommageable avéré ou potentiel. Des souris d’une lignée peuvent développer un prolapsus anal associé à une inflammation colorectale, tandis que des troubles respiratoires peuvent apparaître dans une autre lignée. Ces phénotypes sont observés uniquement chez des souris homozygotes âgées de plus de 5 mois. Sur la base de l’expérience acquise sur ces deux lignées, suivies depuis plusieurs années chez des souris âgées de moins de 6 mois, le phénotype dommageable reste peu fréquent (
Devenir
Les souris avec des génotypes requis sont maintenues en vie pour l’établissement et l’entretien des lignées ainsi que pour leur utilisation dans les protocoles expérimentaux du présent projet ou de projets associés. Les souris ne présentant pas de génotype requis (souris surnuméraires ou non nécessaires) sont mises à mort, soit dans le cadre de la gestion des colonies, soit en fin d’utilisation expérimentale. Les souris présentant un phénotype dommageable sont également mises à mort en cas d’atteinte des points limites définis dans le protocole.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale permettant d’étudier de manière intégrée les anomalies de la barrière des muqueuses sécrétrices, en particulier les interactions entre l’hôte et les agents pathogènes. Les modèles alternatifs actuels ne permettent pas encore de reproduire l’ensemble des interactions au niveau de l’organisme entier. Les investigations chez l’Homme restent limitées et reposent principalement sur des observations cliniques et des analyses ex vivo. Le développement de stratégies thérapeutiques dans ces pathologies nécessite une compréhension approfondie des mécanismes biologiques et de leur régulation. Dans ce contexte, la souris constitue un modèle pertinent, permettant le contrôle de l’environnement expérimental et de la variabilité génétique. Son système immunitaire est bien caractérisé, son génome entièrement séquencé, et de nombreuses lignées transgéniques sont disponibles pour étudier des gènes impliqués dans la défense des épithéliums. Certaines lignées utilisées dans ce projet contribueront également au développement d’approches complémentaires visant à réduire à terme le recours à l’expérimentation animale.
Réduction
La production de souris est planifiée en fonction des besoins expérimentaux, estimés à partir d’approches statistiques et de l’expérience acquise. Les schémas d’accouplement sont optimisés afin de produire le nombre nécessaire de souris présentant les génotypes requis. Le maintien de certaines lignées par accouplement d’animaux homozygotes permet de limiter le recours aux prélèvements invasifs pour le génotypage. Les lignées qui ne seront plus utilisées sont conservées par cryoconservation.
Raffinement
Les souris sont élevées et utilisées dans des locaux agréés disposant d’un statut sanitaire « exempt de pathogènes spécifiques » (EOPS). Elles sont hébergées en cages enrichies, par groupes de 2 à 5 individus, avec accès ad libitum à une alimentation standardisée stérile et à de l’eau de boisson stérile. Le personnel en charge de l’élevage et des manipulations est formé et habilité conformément à la réglementation en vigueur. Les souris font l’objet d’une surveillance quotidienne afin de détecter précocement tout signe de mal-être. Les procédures réalisées dans le cadre du projet sont peu invasives et associées à une douleur de faible intensité. L’identification par bague auriculaire et le prélèvement d’une biopsie de queue (< 1 mm) pour le génotypage sont réalisés par du personnel formé, selon des gestes rapides et standardisés. Le poinçon auriculaire réalisé à l’âge adulte est effectué par du personnel formé, sur animal correctement maintenu, avec une contention brève et un geste rapide limitant le stress et permettant une lésion de petite taille à cicatrisation rapide. Les conditions d’hygiène sont adaptées afin de limiter tout risque de complication locale. Une anesthésie locale peut être envisagée en cas de sensibilité accrue ou d’évolution des pratiques. Les animaux susceptibles de développer un phénotype dommageable sont identifiés afin de permettre un suivi adapté. En cas d’apparition de signes cliniques évocateurs d’un phénotype dommageable, ils sont soumis aux points limites définis dans le protocole et retirés de l’étude si nécessaire.
Choix des espèces
Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale permettant d’étudier de manière intégrée les anomalies de la barrière des muqueuses, en particulier les interactions entre l’hôte et les agents pathogènes. Les modèles alternatifs actuels ne permettent pas encore de reproduire l’ensemble des interactions à l’échelle de l’organisme entier. Les investigations chez l’Homme sont limitées et reposent principalement sur des observations cliniques et des analyses ex vivo. Le développement de stratégies thérapeutiques dans ces pathologies nécessite une compréhension détaillée des mécanismes biologiques et de leur régulation. Dans ce contexte, la souris constitue un modèle pertinent de recherche, permettant le contrôle de l’environnement expérimental et de la variabilité génétique. Son système immunitaire est bien caractérisé, son génome entièrement séquencé, et de nombreuses lignées transgéniques sont disponibles pour l’étude de gènes impliqués dans la défense des épithéliums. Tous les stades de développement postnataux peuvent être concernés, dans le cadre du maintien et de l’amplification des lignées utilisées pour les besoins de projets de recherche faisant l’objet d’autorisations spécifiques.