Système respiratoire

1 386 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par voie nasale par la bactérie de la coqueluche, hébergés avec des animaux sains pour étudier la transmission, puis tués pour prélever nez et poumons. Le porteur indique une surveillance quotidienne du poids et du comportement, une perte de plus de 20 % du poids pouvant déclencher la mise à mort. Il présente le hamster comme un modèle permettant, contrairement à la souris, d'étudier la transmission par aérosol, et revendique le recours à l'animal pour valider son vaccin vivant.

Objectifs

Ce projet a pour but d'étudier une phase critique de la coqueluche qui est la phase de transmission et la potentialité de notre vaccin vivant à protéger contre l’infection bactérienne par aérosolisation naturelle.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but d’étudier et comprendre la phase de transmission de Bordetella pertussis dans un modele Hamster et de potentialiser notre vaccin vivant pour définir la protection médiée contre une infection par transmission naturelle par infection nasale.

Procédures

1) administration intranasal de Bordetella chez le hamster (5 min par animaux). Les animaux seront euthanasiés 0, 3, 7, 14,21, 28 et 56 jours post administration pour prelevement post mortel de sang, du nez et des poumons 2)exposition des animaux sains à l'infection par co-hebergement avec les animaux infectés. Le temps de co-hebergements est de 0, 7, 14, 28 et 56 jours, ensuite les animaux sains et infectés initialement seront euthanasiés pour prelevement post mortel de sang, du nez et des poumons 3) les hamsters seront vaccinés par instilation intranasal de Bordetella pertussis (5 min) ou injection sous cutanée de vaccin commercial (5 min). Un mois plus tard, le groupe ayant recu le vaccin commercial sera boosté par la même dose. 28 jours plus tard, les hamsters immunisés ou naifs seront infectés par une souche virulente de Bordetella (5min). 3h et 7j après ce challenge, les hamsters seront euthanasiés pour prelevement post mortel de sang, du nez et des poumons. 4) les hamsters seront vaccinés par instilation intranasal de Bordetella pertussis (5 min) ou injection sous cutanée de vaccin commercial (5 min). Un mois plus tard, le groupe ayant recu le vaccin commercial sera boosté par la même dose. 28 jours plus tard, les hamsters immunisés ou naifs seront mis en contact avec des hamsters préaleblement infectés par une souche virulente de Bordetella (5min). 3 heures, 14 jours, 28 jours et 56 jours après la mise en contact les hamsters seront euthanasiés pour prelevement post mortel de sang, du nez et des poumons.

Impact sur les animaux

Nous avons déjà démontré que l’infection nasale par BPZE1 dans un modèle hamster ne provoque aucun symptôme bien que les bactéries puissent coloniser le nez pendant 56 jours. En revanche bien que la littérature montre une résistance naturelle des hamsters à Bordetella bronchiseptica, nous ne connaissons pas la virulence des souches cliniques de Bordetella pertussis ni des souches de Bordetella parapertussis dans le modèle hamster.

Devenir

Les hamsters seront mis à mort à la fin de chaque expérience pour la récupération des nez et poumons ou à l'atteinte des points limites

Remplacement

Il nous tient à coeur d'appliquer au mieux la règle des 3R. Les modèles in vitro ou in silico ne suffisent pas pour comprendre les phénomènes de colonisation et d’induction de l’immunité induits par l’infection. En outre, dans l’optique de positionner le vaccin BPZE1P comme protecteur contre une infection naturelle, son efficacité doit être validée par une expérimentation animale in vivo. D'autre part l'etude de la phase de transmission necessite de mettre en contact (cocconing) les animaux infectés avec des animaux sains pour tenter de mimer une infection naturelle, cette etape ne peut etre reproduite in vitro.

Réduction

Il nous tient à coeur d'appliquer au mieux la règle des 3R. le nombre d’animaux est basé sur un calcul de puissance statistique en fonction de la variabilité attendue concernant la significativité des différences observées entre les groupes expérimentaux. Si la variabilité inter-individus et inter-expérimentation est faible le nombre d’animaux par groupe sera revu à la baisse.

Raffinement

Il nous tient à coeur d'appliquer au mieux la règle des 3R. nous serons extrêmement vigilants sur le respect de la notion de points limites. Chaque jour, les critères de souffrance seront évalués (changement comportemental, prostration, etc.) à l’aide d’une grille de cotation. Dans le cas où le score atteint le seuil limite fixé, l'animal sera mis à mort. Les résultats de la procedure 2 nous permettra d'affiner les points de prelevement d'organe pour la procedure 5 ce qui limitera le nombre d'animaux utilisés. Le bien-être animal sera vérifié quotidiennement au travers de : - Contrôle du poids de l’animal (si une perte de poids de plus de 20% était observée, nous procéderions à l’euthanasie des animaux concernés) - Comportement général de l'animal (prostration, isolement dans la cage ou au contraire hyperactivité) - Aspect physique, en particulier si le poil est hérissé ou si la respiration est rapide ou saccadée (puisque Bordetella pertussis responsable de la coqueluche est une maladie respiratoire).

Choix des espèces

Le modele animal utilisé pour étudier Bordetella pertussis, l’agent responsable de la coqueluche chez l'humain, est depuis plus de 30 ans le modèle murin. En effet cette bactérie colonise transitoirement le nez et le poumon de la souris. Cependant, la pathologie humaine de la coqueluche met en évidence une infection des voies aériennes supérieures (nez, trachée, bronche) mais très rarement l’entièreté du poumon. Le mode d’infection utilisé pour le modèle murin semble être trop intrusif pour mimer complètement l’infection naturelle humaine. D’autre part, malgré de nombreux essais, le modèle murin ne permet pas d’étudier la phase de transmission car les souris ne toussent pas et n’aérosolisent pas la bactérie. En revanche, le modèle hamster a été mis en évidence comme permettant l’aérosolisation de particule virale du SARS-COV2 et permet l’infection d’animaux naïfs présents dans la même cage avec une séparation physique. l'age de 3 semaines et le sexe sont liés au fait que des hamsters males de 3 semaines ont deja ete utilisés dans un autre protocol APAFIS#27475-2020100514546435 v3 et nous voulons puvoir comparer les resultats experimentaux avec ces deux projets l'age de 3 semaines est aussi liée au fait que les animaux qui seront vaccinés a deux reprises par le vaccin acellulaire auront alors 11 semaines lors du challenge avec les souches de Bordetella

5 500 animaux non-humains vont être utilisés, 3 000 rats, 2 000 cobayes et 500 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est placé plusieurs heures dans une chambre de pléthysmographie, reçoit une substance à tester, parfois après pose chirurgicale d'un cathéter dans la veine jugulaire, avant un prélèvement de sang terminal. Le porteur mène ces tests de pharmacologie de sécurité respiratoire comme prérequis réglementaire à la mise sur le marché de médicaments, et prévoit de tuer les animaux prélevés ou exposés à des substances mal connues, les autres cobayes étant remis en stock. Il affirme que ces effets sur la fonction respiratoire de l'animal vigile ne peuvent être observés par des méthodes alternatives.

Objectifs

Ce projet permet l'évaluation de l'effet des substances sur le système respiratoire: effet secondaire dans le contexte de la pharmacologie de sécurité ou modèle d'efficacité tel que des modèles d'asthme par exemple. L’objectif du projet est d’étudier les effets pharmacologiques principaux des substances étudiées, par rapport aux cibles thérapeutiques visées et d’établir le profil de sécurité de nouvelles substances médicamenteuses avant leur passage chez l’homme, et ce dans le cadre des recommandations européennes, américaines ou japonaises en vue de l’obtention des autorisations de mise sur le marché. Les tests utilisés dans ce cas sont des modèles prédictifs pour l’évaluation des risques au niveau du système respiratoire chez l’animal conscient et non restreint. La substance est généralement administrée à dose unique. Les études des effets de substances sur la fonction respiratoire sont réalisées par pléthysmographie, principalement chez le Rat, le Cobaye ou la Souris. Les tests décrits dans l’ensemble des procédures utilisées dans ce projet ont été caractérisés de façon extensive dans la littérature scientifique et sont mis en œuvre au sein du laboratoire. Par ailleurs, la méthode de pléthysmographie peut également être un outil de choix pour l’étude de la fonction respiratoire sur des modèles animaux physiopathologiques tels que les souris transgéniques ou des modèles de bronchoconstriction ou d'asthme chez le Rat, le Cobaye ou la Souris. L’intérêt sociétal est évident puisqu’il s’agit de prérequis réglementaires pour l’enregistrement de nouveaux médicaments. Les documents réglementaires (CPMP, FDA et MHW) s’accordent pour considérer le système respiratoire comme une des fonctions vitales à explorer dans le cadre des études de pharmacologie de sécurité (ICH S7A guideline, 2001).

Bénéfices attendus

Ces modèles seront mis en place et utilisés afin de tester l’efficacité des médicaments et de s’assurer qu’ils n’induisent pas d’effets secondaires ou inattendus. Ils entrent comme prérequis règlementaires pour obtenir les autorisations de commercialisation des nouveaux médicaments. Avant les tests sur l’animal, les produits sont généralement testés et présélectionnées avec attention in vitro. Néanmoins, les procédures utilisées dans ce projet ont été étudiées attentivement et caractérisées de façon extensive par une bibliographie approfondie. Ainsi, les techniques utilisées dans ce projet ont été optimisées, afin d’assurer un maximum de bien- être pour l’animal dans le strict respect des 3Rs.

Procédures

Lors l'expérience, les animaux sont pesés puis installés dans la chambre de pléthysmographie (un animal par chambre) pendant une durée de 3 heures (temps d'habituation et de stabilisation). Ils sont ensuite sortis de la chambre, administrés puis remis dans la chambre. Pour certaines administrations en intraveineuse, les animaux subissent une chirurgie de courte durée pour la pose d'un cathéter au niveau de la veine jugulaire. Cette intervention est réalisée quelques jours avant le test. A la fin de l'expérience, les animaux sont observés. Un prélèvement de sang terminal est réalisé soit au niveau de la veine sublinguale sur animaux vigiles, soit en intracardiaque sur animaux anesthésiés de façon à pouvoir effectuer les analyses nécessaires sur les mêmes lots. Cela permet de ne pas inclure des animaux satellites pour la vérification de paramètres complémentaires.

Impact sur les animaux

Il est possible de choisir des doses efficaces qui ne présentent pas d’effet sur l’animal. Il est également à noter que des effets toxiques majeurs ne sont pas attendus. A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée au médicament. Une procédure spécifique est toutefois présente dans ce dossier pour prendre en compte ce cas rare ou lorsque les prélèvements vivo sont importants. La pléthysmographie corps entier permet de suivre les paramètres respiratoires sur plusieurs heures sur l’animal vigile en leur laissant une liberté de mouvements.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, s’il y a un prélèvement, les animaux sont tous sacrifiés. S’il n’y a pas de prélèvement les animaux ayant reçu des substances dont l’effet à long terme n’est pas connu sont sacrifiés. Les animaux n’ayant pas reçu de substances dont l’effet à long terme n’est pas connu sont remis en stock.

Remplacement

L’impact de substances pharmacologiques sur les paramètres respiratoires des espèces choisies est prédictif de leurs effets chez l’Homme. De plus, le choix des espèces est basé sur la bibliographie scientifique, les modèles expérimentaux étant largement décrits chez le rat, la souris et le cobaye. Les tests/modèles que nous souhaitons développer et valider dans ce projet ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur la fonction respiratoire des animaux vigiles. Les techniques, décrites et validées dans ce projet, sont utilisées dans divers modèles animaux qui ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement, le système immunitaire, les paramètres physiologiques, le métabolisme ou l’interaction entre différents organes ou systèmes.

Réduction

Huit animaux par groupe sont classiquement inclus dans ces expériences. Les analyses de puissance ne sont pas réalisées car il serait nécessaire de générer de nombreuses études. Si cela est pertinent et afin de réduire le nombre d’animaux, tous les prélèvements d’échantillons biologiques seront réalisées à la fin des évaluations pharmacologiques (et non sur des animaux surnuméraires satellites). Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des mesures. Dans le but de réduire le nombre d’animaux (dans l’application de la règle des 3R), certains animaux peuvent être réutilisés à la stricte condition qu’ils n’aient pas subis de procédures sévères et après accord du vétérinaire.

Raffinement

Un soin particulier dans le raffinement des méthodes est assuré et garantit l’utilisation systématique du modèle apportant le maximum de réponses scientifiques et le minimum de souffrance pour l’animal. Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids, des yeux, la posture, les réactions de l'animal quand il est approché ou stimulé, la respiration, l'appétit, l'état d'hydratation, les tremblements ou convulsions), afin d’assurer d’une part, un bon suivi des animaux et d’autre part, une fin sans souffrance ou angoisse lorsque nécessaire. Les méthodes d’euthanasie choisies, le cas échéant, sont sélectionnées pour supprimer toute forme d’angoisse, de stress ou de douleur. .). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment et il est mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des mesures.

Choix des espèces

Principalement rongeurs (rats, souris, cobayes) sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique Les études des effets de substances sur la fonction respiratoire sont réalisées par pléthysmographie, principalement chez le Rat, le Cobaye ou la Souris. Les documents réglementaires (CPMP, FDA et MHW) s’accordent pour considérer le système respiratoire comme une des fonctions vitales à explorer dans le cadre des études de pharmacologie de sécurité (Touvay et le Mosquet, 2000 ; ICH S7A guideline, 2001). Cette technique a montré toute sa pertinence pour détecter les effets broncho-stimulants de nouvelles substances qui augmentent la fréquence respiratoire et la ventilation/minute (De Sanctis et al., 1991) ou bien des effets broncho-constricteurs allergiques ou non-allergiques en augmentant le paramètre de pause augmentée, pris comme index d'obstruction des voies aériennes chez le Rat (Kirschvink et al., 2005), la Souris (Delorme and Moss, 2002; Hamelmann et al., 1997) et le Cobaye (Chong et al., 1998) ou d'asthme chez le Rat, le Cobaye ou la Souris (Murphy, 2003)..

5 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal sain subit six séances sous un dispositif d'assistance respiratoire avec des acquisitions tomodensitométriques avant, pendant et après, sous anesthésie générale. Le porteur cherche à vérifier l'absence de lésions pulmonaires comme des atélectasies avant de proposer le dispositif à des patients, et prévoit la mise à mort des cinq animaux pour confirmer les images par histologie des poumons. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit des conditions cliniques et retient le porc pour la taille de ses poumons proche de celle de l'humain, jugeant leur prélèvement "indispensable".

Objectifs

De nombreuses pathologies respiratoires, telles que la mucoviscidose, la broncho-pneumapathie chronique obstructive ou les dilatations de bronches nécessitent une prise en charge pluridisciplinaire. La physiothérapie respiratoire est proposée aux patients souffrant d’affections respiratoires dans le but de gérer la dyspnée, contrôler les symptômes, améliorer la mobilité et la fonction, dégager les voies respiratoires et optimiser la toux. Un nouveau dispositif d’assistance en physiothérapie respiratoire a été développé. Avant de pouvoir le tester chez les patients, une étude sur l’effet du dispositif en utilisation intensive grâce à des données tomodensitométriques thoraciques avant, pendant et après traitement sur un modèle animal sain est nécessaire afin de s’assurer de l’absence de dommage sur le poumon notamment d’atélectasies, qui correspondent à un collapsus du tissu pulmonaire avec perte de volume.

Bénéfices attendus

Ce projet d'étude de la tolérance d'un dispositif d'assistance en physiothérapie respiratoire permettra de s'assurer de l'absence d'effets délétères sur le poumon malgré une utilisation intensive. Les résultats de cette étude permettront de proposer sereinement ce dispositifs aux patients souffrant de pathologies pulmonaires chroniques.

Procédures

Ce projet se déroule sur 5 jours après la semaine d'cclimatation des animaux. Chaque animal sera soumis à 6 sessions de 15 minutes de mise sous dispositif d'assistance en physiothérapie respiratoire avec des acquisitions tomodensitométriques avant, pendant et après l'utilisation du dispositif. Les 6 sessions seront réparties sur 3 jours (à J0, J2 et J4): une session en début de matinée et une en fin d'après-midi pour chaque journée expérimentale. La durée de chaque session sera d'environ 40minutes: 20 min de préparation de l'animal et 15 min de mise sous dispositif.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables qui pourraient survenir sont des lésions pulmonaires dont des atélectasies (collapsus du tissu pulmonaire avec perte de volume respiratoire). L'étude est menée pour s'assurer de leur absence. Les animaux seront imagés avant, pendant et après les sessions de physiothérapie respiratoire, ce paramètre sera évaluer tout au long de l'étude.

Devenir

Tous les animaux du projet (n=5) seront mis à mort à la fin de la procédure. Le prélèvement des poumons est indispensable afin de pouvoir confirmer les données d'imagerie par les analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet a pour objectif d'évaluer les effets sur le poumon d'un dispositif d'assistance en physiothérapie respiratoire. Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’atteindre cet objectif dans des conditions le plus proches possibles des cas cliniques, le recours à l'animal est donc nécessaire pour atteindre cet objectif. Le modèle animal choisi est le Porc qui présente l’avantage d'avoir des poumons et des bronches de taille comparable à ceux de l'Homme. Le dispositif médical testé ne serait pas compatible avec un animal de plus petite taille.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit en veillant toutefois de travailler sur un nombre suffisant pour obtenir des résultats fiables. Les sessions d'assistance respiratoire seront de 6 par animal, ce qui permettra d'avoir 30 sessions au total. La plupart des analyses dépendront de données qualitatives, par expérience, un nombre de 30 permettra d'obtenir des résultats interprétables, en tenant compte de la variabilité interindividuelle et de l'effet de répétition sur chaque individu.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales ainsi que l’environnement d’hébergement ont été optimisées. Les gestes interventionnels seront toujours réalisés sous anesthésie générale, par du personnel formé, permettant un temps interventionnel réduit au maximun, afin de prévenir la souffrance et l’angoisse de l’animal. Le bien-être de l'animal sera contrôlé en veillant aux conditions d'hébergement et au comportement des animaux. L'acclimatation des animaux sera d'une semaine avant d'entrer dans le protocole. Des observations quotidiennes seront réalisées par une personne compétente basées sur l'apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales aux stimuli externes (peu enclins aux manipulations, tentative de fuite). Ces contrôles sont enregistrés et permettent de repérer tout animal malade ou blessé pour prendre des mesures appropriées. Des controles biquotidiens en postopératoire sur toute la durée de la procédure (5 jours) seront réalisés par une personne compétente avec évaluation du bien-être et de la douleur. L'évolution du score permet de noter l'amélioration ou l'aggravation de l'état de l'animal et de prendre des mesures appropriées (points limites). Chaque paramètre est ainsi quantifiable, les scores sont additionnés et l'atteinte d'un score supérieur ou égal à 6 définit un point limite et engendre la sortie de l'animal du programme et sa mise à mort après consultation du vétérinaire référent si nécessaire. Tout constat d'un mal-être est remonté au responsable du bien-être des animaux pour examen approfondis, traitements adaptés et/ou consultation du vétérinaire référent.

Choix des espèces

Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’atteindre cet objectif dans des conditions le plus proches possibles des cas cliniques, le recours à l'animal est donc nécessaire pour atteindre cet objectif. Le modèle animal choisi est le Porc qui présente l’avantage d'avoir des poumons et des bronches de taille comparable à ceux de l'Homme. Le dispositif médical testé ne serait pas compatible avec un animal de plus petite taille. De plus, l'anatomie et la physiologie de l'appareil respiratoire du Porc présentent de grandes similitudes avec l'Homme.

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont sensibilisées à un allergène par injections intrapéritonéales puis intranasales sous anesthésie, avant des mesures respiratoires réalisées après trachéotomie sans réveil, pour produire des lignées de cellules de muscle lisse bronchique. Le porteur indique un risque de dyspnée corrigé par nébulisation de salbutamol. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne rend compte du remodelage bronchique, tout en présentant ces cultures cellulaires comme un moyen de réduire à terme le nombre de souris.

Objectifs

L’asthme est une maladie très fréquente des voies respiratoires qui touche 300 millions de personnes dans le monde. Le terme « d’asthme sévère » s’applique aux patients présentant un asthme dont le contrôle est impossible malgré des traitements inhalés à fortes doses. Un des besoins non couvert dans l’asthme sévère est la prévention efficace des exacerbations. Ces exacerbations sont des épisodes caractérisés par une majoration des symptômes d'essoufflement, de toux, de respiration sifflante ou d'oppression thoracique et par une diminution de la fonction respiratoire. L'asthme est caractérisé par une hyperréactivité, une inflammation et un remodelage bronchique. Le remodelage bronchique est un changement structurel qui comprend entre autre des altérations de l’épithélium, des modifications de la matrice extracellulaire, un épaississement de la membrane basale, une hyperplasie des cellules à mucus, et une augmentation de la taille du muscle lisse bronchique (MLB). La taille du muscle lisse bronchique est une valeur très importante car son augmentation est associée à une fonction respiratoire dégradée et à un taux d’exacerbation plus élevé. Les muscles lisses des bronches d’asthmatique se caractérisent par l’excès de prolifération cellulaire dont les mécanismes sont encore inconnus. Les travaux de notre laboratoire ont déjà mis en évidence un lien entre la taille du muscle lisse bronchique et l’augmentation de la masse mitochondriale. L’augmentation de la masse mitochondriale est un support pour la prolifération des cellules du muscle lisse bronchique. L’étude sur les cellules musculaires lisses bronchiques en culture offre une possibilité de mieux déceler les mécanismes sous-jacents à l’augmentation de la masse mitochondriale des MLB et à son influence sur le remodelage bronchique. Le but de ce travail est de produire les lignées primaires de MLB à partir des bronches de souris témoins et asthmatiques sensibilisées soit à l’ovalbumine soit aux acariens. Ces cellules primaires seront analysées avec les techniques très variées. Les résultats ainsi obtenus seront comparés avec ceux obtenus avec les lignées primaires de MBL humaines de témoins et asthmatiques. Cette approche nous indiquera les mécanismes communs jouant le rôle primordial dans l’asthme. Cela permettra également d’apercevoir les différentes caractéristiques des MLB suite au fait d’être allergique aux acariens ou à l’ovalbumine.

Bénéfices attendus

L’obtention des cultures primaires des MLB des souris asthmatiques et témoins permettra considérablement élargir le champs techniques d’études de remodelage bronchiques. Les résultats ainsi obtenus seront comparés avec ceux obtenus avec les lignées primaires de MBL humaines des témoins et asthmatiques. Cette approche in vitro nous indiquera les mécanismes communs jouant le rôle important dans l’asthme. Cela permettra également de repérer la différence dans les caractéristiques des MLB suite au fait d’être allergique aux acariens ou à l’ovalbumine.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux injections intrapéritonéales de l’allergène et à 9 injections intranasales sous l’anesthésie gazeuses (2 minutes). A la fin de protocole les mesures des paramètres respiratoires seront effectuées sur les animaux trachéotomisés (protocole sans réveil sous anesthésie).

Impact sur les animaux

Le risque de dyspnée chez les animaux suite à l’instillation de l’allergène sous anesthésie gazeuses existe. Après l’anesthésie, les animaux seront observés par l’opérateur et la dyspnée éventuelle sera corrigée par la nébulisation de salbutamol.

Devenir

L’objectif de ce projet est la récupération des bronches des animaux asthmatiques et témoins afin de produire les lignées primaires de MLB. La première phase nous permet de développer l’asthme murin. Lors de la seconde phase, les mesures des paramètres respiratoires seront faites et les animaux seront euthanasiés pour le prélèvement des organes d’intérêt.

Remplacement

En raison de la complexité de la communication intercellulaire menant à la maladie, il n’existe pas de modèle in vitro qui permet d’estimer l’évolution du remodelage bronchique dans l’asthme. L’utilisation du modèle d’asthme chronique murin dans nos études nous donnera une meilleure compréhension des phénomènes. Les lignées primaires des MLB nous permettront d’utiliser plusieurs techniques additionnelles pour déceler les causes de la maladie. Au final, cela permettra de réduire le nombre des souris de l’expérimentation animale dans l’étude de l’asthme.

Réduction

Se souciant de réduire le nombre des animaux en expérimentation, comme pour chaque test statistique, nous avons défini le nombre de souris par groupe pour obtenir des résultats significatifs, et nous réaliserons de multiples études ex vivo sur différents organes et selon différentes techniques. Ainsi, nous utiliserons 10 souris dans chacun des trois groupes pour trois productions des lignées primaires en question. Le nombre défini est le nombre minimal de souris qui peut être utilisé pour l'obtention de données scientifiques robustes.

Raffinement

Afin de diminuer la souffrance et l’angoisse des animaux, des dispositifs sont prévus (anesthésie pour les instillations, analgésie et anesthésie pour les mesures des paramètres respiratoires), raffinement des conditions d’hébergement (hébergement en groupes sociaux, copeaux et bâtons), vérification par la structure en charge du bien-être des animaux et nous avons soigneusement décrit des points limites en relation avec notre protocole (critères de perte de poids, comportement anormal ou difficulté respiratoire). La dyspnée éventuelle induite par les instillations intranasales d’allergène, peut être traitée par la nébulisation pendant 15 s d’un broncho-dilatateur d’action rapide (salbutamol 1g/ml). La dernière phase du projet, comporant les mesures des fonctions respiratoires est réalisée sous anesthésie générale avec une couverture analgésique adaptée, sans réveil pour l'animal.

Choix des espèces

La souris est une espèce classiquement utilisée pour l’étude de la réactivité des voies aériennes normales et pathologiques. De plus, le laboratoire utilise cette espèce depuis plusieurs années, et dispose donc dans cette espèce, de nombreuses données sur lesquelles s’appuie la présente étude. Les animaux utilisés pour commencer le protocole sont des jeunes adultes âgés de 5 à 10 semaines. La plupart des études scientifiques dans le domaine pneumologique sont réalisées sur les animaux de cet âge.

450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit quatre injections d'antigène avec adjuvant, dont l'adjuvant complet de Freund, suivies de prélèvements sanguins et de la mise à mort pour prélever la rate et produire des anticorps monoclonaux. Il indique que ces immunisations peuvent provoquer des ulcérations aux points d'injection. Sur le remplacement, il affirme que l'immunisation animale reste la "méthode de référence" et présente le recours in vivo comme "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.

Objectifs

Le but du projet est d’assurer la production d’AcM pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Pour répondre à ce besoin, il est pertinent de mettre en œuvre la méthode de référence, qui consiste à réaliser une fusion cellulaire entre un lymphocyte B et un myélome de souris.

Bénéfices attendus

Les anticorps monoclonaux (AcM) ont permis le développement de remarquables outils de recherche fondamentale, de diagnostic et plus récemment d’agents thérapeutiques. En recherche fondamentale, les AcM représentent des outils essentiels, en biochimie et en histologie pour la réalisation d’immunomarquages (immunohistochimie/ immunofluorescence) permettant la mise en évidence d’antigènes d’intérêts au sein d’un tissu, en biochimie dans des applications de type ELISA ou immunoprécipitation, et en biologie moléculaire pour la révélation de Western Blot. Dans le cadre du diagnostic, les tests de grossesse reposent classiquement sur la capacité d’AcM à détecter la présence de l’hormone Gonadotrophine Chorionique humaine (hCG), une glycoprotéine produite par le placenta. Les AcM sont également essentiels pour le diagnostic de différentes pathologies oncologiques et infectieuses. Les AcM demeurent aujourd’hui les outils de diagnostic tissulaire les plus performants. En parallèle de leur utilisation diagnostique, les développements menés depuis une quarantaine d’années ont abouti à la production de plus d’une vingtaine d’AcM à visée thérapeutique disposant d’une autorisation de mise sur le marché pour diverses applications, dont le domaine de l’oncologie et des maladies inflammatoires. L’ensemble de ces éléments permettent de justifier la pertinence de pouvoir assurer le développement d’AcM pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées, travaillant sur des approches fondamentales ou appliquées (diagnostic/ thérapeutique).

Procédures

4 injections seront réalisées : J00 (IP ou SC en ACF), J07 (AIF en SC ou IP), J14 (AIF en IM ou IP) et J21 une injection en intraveineuse sans adjuvant. Des prélèvements seront effectuée sur animaux vigiles : un pré-immun (qui sera le témoin négatif), un à J14 (suivi immunitaire) et J24 (jour de sacrifice de la souris). Injection IP/ SC ou IM, 30 sec pour la contention qui change à chaque point d’injection effectué + 30 secondes d’injection par point d’injection + 30 secondes de massage de la zone injectée, avec injections en 1, 2 ou 4 points suivant le type d’injection (IP, IM ou SC). Injection intraveineuse : 2 à 3 minutes de contention pour la dilation des veines caudales et 1 minute pour l’IV (l’injection en tant que telle ne prend que quelques secondes), mais la réalisation du geste technique (mise en place, maintien de la queue à demande de maintenir l’animal calme pendant 1 minute environ) Prélèvements, maintien de la souris et prélèvement 5 minutes

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Il n’y a pas d’opération chirurgicale dans les protocoles. Les prélèvements sont réalisés sur animaux vigiles au niveau de la veine sous-mandibulaire afin de remplacer le prélèvement en rétro-orbitaire.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, les souris ne peuvent pas être réutilisées pour d’autres protocoles, elles sont donc toutes euthanasiées en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcM reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. Toutefois l’isolement de la rate des souris immunisées, afin d’en isoler les plasmocytes sécrétant les anticorps et de les fusionner à des cellules immortalisées, aboutira à l’obtention d’hybridomes permettant la production d’anticorps in vitro sans avoir de nouveau à immuniser un animal.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (3 souris par protéine immunisée) est adapté au plus juste par rapport à la faible quantité d’antigène. Le nombre d’animaux utilisé est réduit au maximum, il s'agit de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire afin d’éviter la variabilité interindividuelle

Raffinement

Raffiner : Les souris sont hébergées dans des cages adaptées, proposant des objets d’enrichissement (abri, coton pour fabrication de nid) permettant de stimuler l’activité des animaux et de maintenir leur sociabilisation. Un contrôle des animaux et des sites d’injection est réalisé chaque jour. Cette observation quotidienne par un personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et permet ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Il s'agit d'un protocole de simple vaccinations avec adjuvants.

Choix des espèces

La souris est l'animal référent pour l'obtention d'AcM. Les cellules de la rate et des ganglions lymphatiques des souris immunisées contiennent des cellules lymphocytaires sécrétant des anticorps contre l'antigène d'intérêt. Ces lymphocytes fusionnés avec des cellules de myélome issues de souris, permettent d'obtenir des AcM dirigés contre l'antigène d'intérêt. Le protocole nécessite des jeunes adultes immunocompétents de 6 à 8 semaines au moment de la première injection, afin d'obtenir une bonne réponse immunitaire. Par conséquent, les souris sont reçues à l’âge de cinq semaines. Elles sont mises pendant une semaine en quarantaine dans une zone d’hébergement dédiée conforme à la règlementation avant le début du protocole

150 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent six injections sous-cutanées d'antigène associé à un adjuvant et trois prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux vendus comme réactifs à des équipes de recherche. Le porteur indique que les immunisations peuvent provoquer des ulcérations aux points d'injection. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est aussi efficace et que le recours à l'animal vivant reste "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces immunoglobulines constituent des ressources largement utilisées dans des applications analytiques et thérapeutiques. Les AcP sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ils trouvent des applications en biologie et en biochimie, en tant que ligand de colonne d’immunoaffinité. Ils possèdent également de nombreux emplois en recherche tel que la détection de molécules dans les essais du type enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), les révélations de Western Blot, les procédures immunohistochimiques et d'immunoprécipitation, en immunofluoromicroscopie et en immunoélectromicroscopie. Notre processus de production assure la production d’AcP pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les antisérums sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps ; lorsque le titre est suffisamment élevé, on prépare un antisérum en effectuant une prise de sang suivie de l'isolement du sérum puis, si nécessaire, de la purification des anticorps à partir du sérum

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux (AcP) seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. Les anticorps développés de cobaye dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe. L’utilisation du cobaye interviendra dans des projets particuliers pour lesquels, cette espèce présente un avantage par rapport à d’autres. En effet, les cobayes présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal le plus communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Le cobaye étant phylogénétiquement plus éloigné de la souris que le rat, il permet l’obtention d’anticorps anti-protéines de souris. Plusieurs exemples ont montré l’intérêt des cobayes en comparaison d’autres espèces, notamment pour la production d’anticorps dirigé contre l’insuline porcine, où les cobayes ont permis d’obtenir d’une meilleure réponse en comparaison des lapins.

Procédures

Six injections aux cobayes en sous-cutané de l’antigène associé à un adjuvant. Trois prélèvements sanguins seront réalisés, au niveau de la veine saphène sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné). Injection sous-cutanée : 8 minutes dont 4 minutes pour prendre avec délicatesse l’animal, le rassurer et le préparer, 30 secondes par injection et 30 secondes pour masser la zone injectée (4 injections), c’est-à-dire 4 min. Prélèvement : l’endormissement sous anesthésie gazeuse prend 10 minutes pour être effective. Le prélèvement sous anesthésie au masque est réalisé pendant 3 à 4 minutes. Le réveil de l’animal prend 1 à 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Il n’y a pas d’opération chirurgicale dans les protocoles. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie.

Devenir

Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (3 cobayes par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant dans l’obtention des protéines médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Raffiner : L’environnement des cobayes est enrichi pour améliorer leur bien-être (tunnel de jeu, friandises, foin, jouets,…). Les animaux seront particulièrement suivis pendant les 24h suivant les injections, puis quotidiennement pour examiner leur état de santé. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et permet ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Les prélèvements réalisés, sous anesthésie, concerneront de faibles volumes afin de ne pas induire de souffrance chez l’animal. Il s'agit d'un protocole de simple vaccinations avec adjuvants.

Choix des espèces

Les cobayes présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal le plus communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Etant phylogénétiquement plus éloigné de la souris que le rat, ils permettent l’obtention d’anticorps anti-protéines de souris. Plusieurs exemples ont montré l’intérêt des cobayes en comparaison d’autres espèces, notamment pour la production d’anticorps dirigé contre l’insuline porcine, où ils ont permis d’obtenir d’une meilleure réponse en comparaison des lapins. Ils permettent également l’obtention d’anticorps ayant une forte capacité à fixer le système du complément. Ils permettent en comparaison des souris de Réduire le nombre d’animaux engagés dans chaque protocole à 3 individus. La production d’anticorps chez le cobaye nécessite de faibles doses d’antigène. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les cobayes entreront en protocole à l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine d’une semaine, sans incident durant ce temps, ils seront aptes à rentrer en protocole.

72 poissons, daurades royales et loups sauvages, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une marque électronique est implantée dans leur cavité péritonéale sous anesthésie, puis chaque individu est placé en tunnel de nage et exposé à un réchauffement, un refroidissement ou une hypoxie pour mesurer sa perte de performance. Le porteur indique que la mise à mort finale sert à récupérer la marque et les données enregistrées. Il présente ces seuils de tolérance comme utiles à de futurs plans de gestion des stocks de pêche.

Objectifs

Le Golfe du Lion est une des zones les plus productives de la Méditerranée. La zone côtière est constellée de lagunes qui sont de véritables nourriceries et zones d’alimentation pour la faune marine. Les lagunes sont aussi des écosystèmes vulnérables, particulièrement sensibles aux effets des changements globaux. Notamment, des vagues de chaleur et des épisodes d’hypoxie estivaux sont susceptibles de stresser les organismes résidents, entraînant une baisse de leur performance physiologique, voire même menaçant leur survie. De nombreuses espèces de poisson à haute valeur économique occupent les lagunes du Golfe de Lion au cours de leur cycle de vie, et l'altération anthropique de ces habitats pourrait largement affecter les dynamiques de ces populations. Dans ce contexte, la daurade royale et le loup représentent des cas d’étude par excellence. Ces espèces exploitent tous les ans les lagunes en tant que nourriceries estivales, permettant aux individus de constituer des réserves pour la saison hivernale en mer ouverte. Il est essentiel comprendre l’importance des lagunes pour le maintien des stocks de poissons à haute valeur économique dans le Golfe du Lion, afin de développer des plans de gestion. En particulier, pour mieux comprendre comment les effets du changement climatique affecteront le cycle biologique des espèces exploitant les lagunes. L'objectif général de ce projet est de mieux comprendre l’écophysiologie des daurades et loups sauvages, issus des lagunes en période estivale. En particulier, leurs performances physiologiques en termes de capacité de nage, et comment des changements de température et des épisodes d'hypoxie peuvent influencer cette capacité. Nous cherchons à établir des seuils de tolérance sous-létaux, en utilisant une perte de la performance de nage comme indicateur.

Bénéfices attendus

Les données du présent projet, sur les seuils sous-létaux au-delà desquels la température et l’hypoxie nuisent à la performance de nage, permettront de mieux interpréter des migrations saisonnières entre lagune et mer, mais aussi les migrations ponctuelles vers la mer en été, pour échapper à des conditions extrêmes dans les lagunes. Ces informations seront utiles pour informer le développement de plans de gestion, des stocks de daurade royale et loup, et des habitats clé pour leurs cycles de vie.

Procédures

Les poissons seront équipés avec une marque électronique dans leur cavité péritonéale, sous anesthésie générale. La durée de l'opération est moins de 30 minutes. Cette chirurgie sera suivie par 96 heures de récupération dans un bassin isolé des perturbations humaines. Puis, chaque individu sera placé dans un tunnel de nage pour 48 heures et subira deux procédures en séquence. Premièrement, un test de performance de nage, puis un test de tolérance à un stress (réchauffement, refroidissement, hypoxie). Chaque test dure entre 4 et 6 heures, avec 20 heures de récupération entre les deux tests.

Impact sur les animaux

Les nuisances et les effets indésirables devraient être limités, les procédures sont d'une sévérité modérée. Les 96 heures de récupération de la chirurgie permettent aux poissons de regagner une fréquence cardiaque baisse et stable, situation qui se met en place à partir de 72 heures. Les procédures en tunnel de nage ne sont pas douloureuses, et la performance de nage dans le tunnel n’est pas différente entre les poissons qui portent une marque et des poissons qui n’ont pas subi une intervention chirurgicale.

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux (72) seront euthanasiés pour récuperer la marque éléctronique et les données de fréquence cardiaque et d'accélération corporelle.

Remplacement

Il est impossible de remplacer les daurades et les loups sauvages par des autres modèles, l'intérêt du projet étant justement de regarder l'impact sur ces espèces.

Réduction

Le nombre total d'individus testés sera limitée à n = 36 de chaque espèce, parmi lesquels n = 12 seront exposés à chaque facteur environnementale (n = 72 animaux en total). Le nombre de 12 individus exposés à chaque facteur environnemental (réchauffement, refroidissement, hypoxie) permettra d'établir des réponses moyennes de chaque population d’étude, en tenant compte de la possibilité d'une variation interindividuelle. Les réponses seront évaluées statistiquement en utilisant des modèles linéaires mixtes et des analyses de variance.

Raffinement

Tout a été mis en place pour limiter la souffrance et le stress des animaux liés au placement des capteurs. Le capteur sera placé dans la cavité péritonéale sous anesthésie, en proximité du coeur afin de capter les signaux bioélectriques (électrocardiogramme) qui permettent de calculer la fréquence cardiaque. Le placement du capteur sera suivi par un minimum de 96h de récupération dans des bassins externes isolés des perturbations humaines, avec une alimentation journalière « ad-libitum ». Les procédures en tunnel de nage sont bien établies chez les poissons et sont des techniques largement maîtrisées et utilisées par l’ensemble de la communauté scientifique, ainsi que par notre équipe. L’objectif de nos protocoles est de limiter au maximum la souffrance et le stress des animaux pendant les manipulations, avec capture des poissons sous l’eau et placement dans les tunnels sans exposition à l’air, suivi par une durée minimale d’acclimatation de 4h. Les poissons sont à l’abri de toute nuisance visuelle et sonore pendant la récupération et les expériences. Cela permet d'obtenir des mesures valides et fiables de leurs réponses aux facteurs environnementaux, qui ne sont pas influencées par un état préalable de souffrance, stress ou agitation.

Choix des espèces

La daurade royale et le loup sont des espèces côtières de premier plan en Méditerranée française, tant pour l'importance de leur exploitation, leur valeur commerciale et leur aquaculture, que pour leurs aspects emblématiques. Aujourd'hui concernées par les plans de gestion des petits métiers en Méditerranée, de nombreux aspects de leurs cycles de vie restent pourtant inconnus. L’acquisition des connaissances sur leur capacité de nage et leur tolérance à la température et à l'hypoxie est primordiale pour une compréhension des migrations de ces espèces et leur utilisation des lagunes côtières. Ces informations seront un appui aux mesures de gestion de ces espèces en Occitanie. Les animaux seront tous adultes reproducteurs et auront une masse comprise entre 300 et 700g, une taille qui permet le placement des capteurs électroniques dans la cavité péritonéale.

164 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles de myopathie de Duchenne, elles subissent des mesures de la fonction respiratoire, dont une technique nécessitant une trachéotomie, une ventilation mécanique et une injection de curare sous anesthésie sans réveil, pour tester une molécule sur la respiration. Le porteur indique que les 144 souris passées à cette technique sont systématiquement tuées, la trachéotomie et les oscillations forcées lésant l'appareil respiratoire. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative pour étudier la fonction respiratoire au niveau d'un "organisme entier".

Objectifs

La souris MDX (X-linked muscular dystrophy) est un modèle spontané de la myopathie de Duchenne, myopathie héréditaire et fatale due à l'absence de dystrophine. Un médicament administré dans l'eau de boisson permet de restaurer la fonction musculaire et la mobilitée. Dans ce projet, nous evaluerons donc l'influence d' un traitement (molécule BIO101- 50mg/ml*jr) sur la fonction respiratoire. Deux nouveaux groupes contrôles C57BL6/J seront mis en place pour tester l'effet de la molécule BIO101 : ils nous permettront de vérifier que les différences observées chez les souris Mdx ne sont pas dépendantes du fond génétique du groupe expériemental.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est que la molécule BIO101 améliore la fonction respiratoire quelque soit le fond génétique du modèle expérimental.

Procédures

Pour l'analyse de la fonction respiratoire : - par plethysmo: n= 144 souris . Cette technique dure en moyenne 45 minutes et sera répétée au maximum 4 fois. - par flexivent n= 144 souris . Cette technique dure en moyenne 30 minutes. Pour les souris de référence, aucune intervention sera faite sur les souris au cours du traitement. Il y aura uniquement un changement de biberon et de litière pour ces animaux.

Impact sur les animaux

Pour explorer la capacité respiratoire de nos animaux, pour ce projet, deux approches seront utilisées : 1-la pléthysmographie, qui permet de mesurer l'ensemble des volumes pulmonaires de façon non-invasive. Pour cela, les souris, libres de leur mouvement, sont placées dans des enceintes de pléthysmographie, hermétiquement fermées, à l'exception de l'arrivée d'air contrôlée. Les souris pourront ressentir du stress, dû à leur manipulation et à un nouvel environnement plus restreint pendant un temps limité. 2- la technique d'oscillation forcée (FlexiVent), nécessitant une trachéotomie et une ventilation mécanique adaptée, est réalisée sous anesthésie générale profonde sans réveil, évitant toute souffrance aux animaux tout au long de l'expérience. Concernant les groupes contrôles, les 20 animaux ne recevront que le traitement par eau de boisson et ne subiront aucune procédure décrite dans cette DAP. Seules les bronches seront prélevées post-mortem donc pas d'effets indésirables prévus.

Devenir

Tous les animaux soumis à la technique du flexivent (soit 144 souris) sont systématiquement sacrifiés en raison de la trachéotomie, l’injection de curare et des oscillations forcées induisant des lésions tissulaires au niveau de l’appareil respiratoire.

Remplacement

Nous travaillons sur la fonction respiratoire et il n’existe pas d’alternative pour étudier les phénomènes mis en jeu au niveau d’un organisme entier mis à part les modèles animaux.

Réduction

Les principes de raffinement et de remplacement contribuent à réduire le nombre d’animaux utilisés tout au long du protocole. Le modèle animal utilisé a été soigneusement conçu et évalué pour permettre de réduire au maximum le nombre d’animaux du fait de la connaissance et la précision des paramètres observés selon la règle des 3R. Le projet étudiera l'effet du traitement sur les souris mdx dont la souche est connue et caractérisée. Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Un test non paramétrique et non apparié de type Student test, Mann-Whitney ou une analyse de la variance par un test de Bonferroni sera réalisé. Une pvalue inférieure à 0.05 sera considérée comme significative.

Raffinement

Tout au long de cette procédure, les animaux seront surveillés quotidiennement par les animaliers et seront en plus surveillés tous les 2 jours par les expérimentateurs (traitement en eau de boisson nécessitant un changement ou un réajustement des volumes tous les 2 jours). Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les animaux seront hébergés à raison de 4 mâles par cage dans un environnement enrichi pour limiter le stress et faciliter les relations sociales. En cas d'agressions répétées, des mâles pourraient être isolés de façon transitoire. Si une souffrance de l’animal est détectée et jugée trop importante, alors la souris sera mise à mort sans délai. Si un seul signe clinique spécifique ou 2 signes notables sont détectés alors le responsable de la SBEA et le responsable de l’étude seront prévenus et la souris sera mise à mort sans délai. Les signes spécifiques et notables sont les suivants : - Les signes notables, définis sur l’aspect extérieur de l’animal, seront les suivants : pelage sale, pâleur (yeux, oreilles, peau), isolement, position recroquevillée, faciès contracté, yeux larmoyants. - Les signes cliniques spécifiques seront surtout visibles à la manipulation : zone urogénitale souillée, réticent à se déplacer, respiration difficile, évolution pondérale anormale (Perte de poids >10%). Concernant les groupes contrôles, les 20 animaux ne recevront que le traitement par eau de boisson et ne subiront aucune procédure décrite dans cette DAP. Seules les bronches seront prélevées post-mortem donc nous n’attendons aucun effet indésirable pour ce dernier groupe.

Choix des espèces

Au cours de cette étude seront utilisées des souris de souche mdx mimant la pathologie étudié et des C57BL10 comme controles. Ces souris constituent un modèle de choix, reconnu, dans le cadre d’étude de la pathologie Deux nouveaux groupes contrôles C57BL6/J seront mis en place pour tester l'effet de la molécule BIO101 : ils nous permettront de vérifier que les différences observées chez les souris Mdx ne sont pas dépendantes du fond génétique du groupe expériemental. Les souris seront utlisées à un âge avancé (12 semaines) pour se rapprocher de la situation clinique.