Système respiratoire
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- Biologie du développement
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- Multisystémique
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- Système immunitaire
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- Système nerveux
- Système urogénital
Impact de NLRP3 sur la fibrose pulmonaire chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Pour une étude pilote sur la fibrose pulmonaire, 32 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un inducteur de fibrose par aspiration dans la gorge, sous anesthésie brève, puis peuvent perdre du poids dans la semaine qui suit. Leur mise à mort permet de quantifier la fibrose sur les poumons prélevés. Le porteur présente ce travail comme préliminaire, destiné à décider s'il est utile de poursuivre sur davantage d'animaux.
Objectifs
La fibrose pulmonaire est une maladie grave des poumons. Dans ce contexte, certaines cellules du système immunitaire jouent un rôle important avec un déséquilibre entre les cellules. Parmi ces cellules, les lymphocytes T CD4 peuvent avoir des effets opposés. Nos travaux récents, ont montré NLRP3 pourrait être impliqué dans le contrôle de cet équilibre. Pour mieux comprendre si NLRP3 peut modifier cet équilibre, nous proposons de réaliser une première étude pilote dans des souris transgéniques en provoquant une fibrose pulmonaire expérimentale. Nous étudierons si cette absence de NLRP3 aggrave ou modifie les lésions pulmonaires. Cette étude préliminaire permettra de savoir s’il est utile de poursuivre ce travail dans un projet de recherche plus large.
Bénéfices attendus
Cette étude est une première étape pour mieux comprendre une maladie appelée fibrose pulmonaire, qui abîme les poumons et rend la respiration difficile. Le but de cette étude est de voir si une protéine joue un rôle important dans la maladie. C’est une étude exploratoire, c’est-à-dire une étude de départ, qui sert à savoir si cela vaut la peine d’aller plus loin. Cette recherche aidera à mieux comprendre comment fonctionne le système immunitaire dans la fibrose pulmonaire. Ces informations sont importantes pour décider si ce travail doit être poursuivi avec des études plus grandes, ou arrêté s’il n’apporte pas de résultats utiles. À plus long terme, mieux comprendre ces mécanismes pourrait aider les chercheurs à développer de nouveaux traitements pour les personnes atteintes de fibrose pulmonaire.
Procédures
Les souris recevront une administration d’un inducteur de fibrose par aspiration oropharyngée. Cette intervention sous anesthésie générale dure 30 secondes maximum.
Impact sur les animaux
Le modèle expérimental décrit dans ce projet est couramment utilisé en recherche dans le domaine de la fibrose pulmonaire. Entre 2 et 7 jours après l’induction du modèle, les souris peuvent perdre du poids. Lors des réveils de l’anesthésie, les animaux connaissent quelques minutes de désorientation, rapidement résolues par la reconnaissance de leur environnement.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure afin de mesurer et quantifier la fibrose pulmonaire par des méthodes ex vivo classiques (histologie, dosage de protéines) et analyses des populations immunitaires par cytométrie en flux
Remplacement
Les poumons sont des organes très complexes, composés de plus de 40 types de cellules différentes. La fibrose pulmonaire est une maladie qui fait intervenir plusieurs mécanismes dans les poumons, comme l’inflammation et la transformation des tissus. Ainsi, pour bien comprendre cette maladie, il est nécessaire d’étudier l’organe entier, car aucun test en laboratoire sur des cellules seules ne peut remplacer l’étude chez un animal.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, cette étude est d’abord une étude pilote, c’est-à-dire une petite étude exploratoire. Elle permettra de vérifier si la protéine qui nous intéresse a un effet sur l’évolution de la fibrose et sur l’équilibre entre les cellules. En menant d’abord cette étude préliminaire, nous pourrons décider s’il est utile de faire une étude plus grande, ce qui évite d’utiliser un grand nombre d’animaux sans raison scientifique. De plus, notre équipe possède déjà beaucoup de données obtenues sur des cellules in vitro en laboratoire. En combinant ces informations avec l’étude pilote, nous utilisons le minimum d’animaux nécessaire tout en obtenant des résultats fiables.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans un environnement confortable, avec lumière, température et bruit contrôlés, dans des cages adaptées pouvant accueillir jusqu’à 10 animaux. Elles disposeront d’éléments pour jouer et se cacher, comme des tunnels en plastique et des papiers, afin de réduire le stress et l’ennui. Elles auront aussi de la nourriture spéciale à volonté, comme des aliments gélifiés ou des morceaux de pommes, pour éviter la perte de poids. Le suivi sera quotidien, assuré par du personnel qualifié, afin de détecter rapidement tout signe de malaise. Une attention particulière sera portée pour s’assurer qu’elles reprennent une activité normale après l’anesthésie.
Choix des espèces
Nous allons utiliser des souris pour cette étude car elles sont le meilleur modèle connu pour étudier la fibrose pulmonaire. Beaucoup de recherches ont déjà utilisé des souris pour cette maladie, ce qui permet de comparer facilement nos résultats avec ceux d’autres équipes dans le monde. Les souris ont aussi l’avantage d’être les seules espèces où il est possible de créer des animaux transgéniques. Les souris permettent également de réaliser plusieurs types d’injections et de prélèvements, un peu comme ce qui se fait chez l’homme en recherche clinique. Pour cette étude, nous utiliserons des souris âgées de 8 à 14 semaines et pesant au moins 21 grammes. À cet âge, elles sont considérées comme adultes, avec des poumons et un système immunitaire bien développés. D’après notre expérience, la fibrose, est plus toxique chez les souris petites. Pour limiter ce risque, nous choisissons des souris suffisamment grandes et robustes : des mâles pesant plus de 21 grammes, afin de réduire les signes de malaise.
Asthme allergique dans le modèle souris : Etude des mécanismes d’activation et évaluation de molécules à visée thérapeutique
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
13 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, certains animaux recevant jusqu'à cinquante administrations d'allergène ou de composés. Les produits sont instillés dans le nez ou la trachée pour déclencher un asthme allergique, avec inflammation des voies respiratoires, gêne à respirer et perte de poids. Toutes sont mises à mort pour analyser leurs poumons et leur réponse immunitaire. Le porteur situe l'effectif à dix animaux par groupe et rappelle que le précédent projet a donné lieu à quatre publications, la finalité restant l'accumulation de données sur les mécanismes de la maladie.
Objectifs
Ce projet est la suite d’un précédent projet qui vise à étudier les mécanismes qui participent à la mise en place de la réponse immunitaire pulmonaire en réponse à des allergènes et causant l'asthme allergique sur des modèles murins. L’objectif est d’étudier le rôle des acteurs immunologiques qui participent à la réponse inflammatoire pulmonaire suite à une exposition à un allergène et qui peuvent conduire au développement de pathologies irréversibles comme l'asthme allergique et la difficulté respiratoire et de tester des composés à visée thérapeutique. L'asthme allergique est une maladie complexe caractérisée par une inflammation des voies respiratoires, une obstruction variable du flux d'air et une hyperréactivité bronchique, souvent influencée par des facteurs génétiques, environnementaux et immunologiques. Il se manifeste à travers des crises durant lesquelles il existe une gêne respiratoire (dyspnée) et des sifflements liés à une inflammation chronique associée à des perturbations locales du tissu respiratoire. Selon l’OMS, d’ici 2050, une personne sur deux dans le monde sera allergique, contre trois sur dix aujourd’hui. L’asthme allergique touche environ 300 millions d’individus dans le monde dont 4 millions de personnes en France et est associé à plus de 60 000 hospitalisations et près de 900 décès par an. A ce jour, aucun médicament ne permet d’en guérir d’où la nécessité de continuer à étudier les mécanismes moléculaires impliqués. L’objectif est d’étudier le rôle des cellules, cytokines, récepteurs ou voies de signalisation impliqués dans la réponse immunitaire de l'hôte afin de participer à l’amélioration de nos connaissances et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Dans un second temps, une fois que des cibles thérapeutiques auront été identifiées, nous testerons ces composés à visée thérapeutique pour voir l’évolution sur la pathologie.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans la continuité d’un précédent projet autorisé dont les résultats ont donné lieu à 4 publications scientifiques. Nous avons pu montrer l’implication de certaines voies de signalisation dans la réponse inflammatoire pulmonaire suite à l’exposition aux allergènes. Nous avons également pu montrer le rôle des voies d’activation des récepteurs d’acides nucléiques cGAS-STING suggérant une nouvelle approche pour identifier des cibles thérapeutiques. L’utilisation des souris déficientes en certains gènes a permis de valider la contribution des gènes correspondants et donc des voies de signalisation ou cytokines impliquées dans ces mécanismes pathologiques. Nous poursuivons nos investigations pour tester l’implication de ces voies en utilisant des agonistes et inhibiteurs de ces voies de signalisation et des voies annexes qui ont pu être identifiées grâce à nos travaux. Une fois validées, ces molécules représentent des cibles thérapeutiques potentielles dont la pertinence sera vérifiée par l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques. Ces travaux feront l’objet de publications scientifiques.
Procédures
Un prélèvement sanguin unique sous anesthésie gazeuse sur tous les animaux utilisés dans la partie A et B du projet pourra être effectué. Les administrations d’allergène se feront par voie intranasale, intratrachéale, sous anesthésie ou par voie sous-cutanée ou intrapéritonéale. 3 administrations maximales/semaine espacées de 24 h pour les procédures 4 à 6 auront lieu. Les administrations de « candidat médicament » pourront se faire par voie intranasale/intratrachéale, intrapéritonéale, sous-cutanée, sublinguale ou intragastrique. Le traitement pourra commencer jusqu’à 1 semaine avant l’administration d'allergènes ou au moins 1h après induction et se prolonger pendant toute la durée de l’expérience pour assurer un effet optimal. A noter que certains traitements (notamment ceux administrés par voie intragastrique) pourront être réalisés 2x par jour durant toute la période d’expérimentation, soit au maximum 50 administrations par animal. Les administrations sont de courte durée maximum 2min/souris.
Impact sur les animaux
Ce modèle induit des douleurs inflammatoires chez l'animal liées au développement de la pathologie. La douleur pourra générer une perte de poids. L’administration de traitement par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqûre de l'aiguille pour l'injection des traitements entraînent une douleur légère, de courte durée (quelques secondes) et du stress. Pour les traitements en intragastrique, aucune douleur n'est attendue mis à part un léger stress (quelques secondes) lié à la contention des animaux. Les effets secondaires liés aux molécules à visée thérapeutique ne sont pas attendus. Certaines lignées utilisées sont immunodéficientes, cependant, les phénotypes ne s’expriment pas dans nos conditions d’élevage en portoir ventilé.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques nécessaires à l'évaluation des mécanismes de l'asthme allergique et l’analyse de l’effet des différentes molécules et thérapies testées.
Remplacement
Nous menons des études in vitro sur des cellules épithéliales et immunitaires murines qui nous permettent d’évaluer la toxicité des molécules utilisées. Nous évaluons l’efficacité potentielle de ces molécules en mesurant la sécrétion de molécules de l’inflammation (cytokine pro-inflammatoire par exemple). Bien que nous conduisons en parallèle ces études in vitro, l’inflammation et l’asthme allergique sont des pathologies globales qui ne peuvent être étudiées de façon complète que sur des animaux entiers avec leur physiologie et les différents échanges inter-organes. Le modèle animal reste indispensable afin d’examiner la réponse de l’organisme dans son ensemble. Aucun modèle expérimental in vitro n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier la réponse et les inter-relations entre les différents acteurs cellulaires et moléculaires des réponses immunitaires innées et acquises. C’est le seul moyen d’analyser les interactions entre les différents types cellulaires au niveau du poumon et d’examiner la pathologie au niveau histologique, aspects qui ne peuvent pas être développés in vitro ou in silico.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence des résultats statistiquement pertinents et reproductibles, sur les paramètres étudiés. Il ressort ainsi que 10 animaux maximum /groupe seront nécessaires. Ce nombre d'animaux par groupe permet de réduire la répétition des expériences car les résultats sont moins variables. Nous optimisons chaque expérience en termes de prélèvements effectués et de paramètres mesurés.
Raffinement
Les animaux sont observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être et pour détecter la douleur au moment de l’expérimentation. De plus, si des animaux présentent des signes de souffrance au cours de l'étude, un analgésique sera administré et des croquettes humides seront ajoutés dans les cages. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués. Dans le cas d'une analyse de la capacité pulmonaire, la pléthysmographie sera effectuée sous anesthésie générale avec administration d'un analgésique et anesthésique local. La température corporelle sera maintenue constante entre 37 et 38°C par un tapis chauffant.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie scientifiquement : -La souris est un mammifère qui présente une architecture anatomique et fonctionnelle comparable à l’espèce humaine. -La souris est l’un des seuls modèles de mammifères permettant de telles modifications génétiques de précision cellulaire. -La souris reste l’animal modèle de référence dans la communauté scientifique pour étudier expérimentalement les mécanismes immunitaires pulmonaires. En particulier, des modèles de maladies pulmonaires chez la souris ont été développés dans différents laboratoires dont le nôtre depuis plusieurs années, ce qui nous permet de maitriser ces modèles.
Modèle murin de fibrose pulmonaire pour l’évaluation de molécules thérapeutiques anti-inflammatoires
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids ou dont la respiration se dégrade sont mises à mort avant la fin. 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Une fibrose pulmonaire est déclenchée par un agent instillé dans le nez, suivie de traitements quotidiens pendant quatre semaines et de prélèvements sanguins hebdomadaires par ponction derrière l'œil sous anesthésie. Le porteur décrit des difficultés respiratoires, une toux et une perte de poids comme des atteintes de la maladie induite, le seuil des 20 % déclenchant l'arrêt pour les animaux les plus dégradés.
Objectifs
La fibrose pulmonaire (et plus particulièrement la fibrose pulmonaire idiopathique, FPI) est considérée comme un problème de santé publique. Il s'agit d'une maladie chronique, progressive, et souvent diagnostiquée tardivement. La fibrose pulmonaire est une maladie complexe et souvent mortelle, caractérisée par une cicatrisation progressive du tissu pulmonaire. Il n’existe pas de guérison aujourd’hui, mais plusieurs options thérapeutiques ralentissent la progression de la pathologie. Malgré les avancées de la recherche, les mécanismes exacts de cette maladie ne sont pas encore entièrement élucidés, et les traitements actuels sont limités. Les modèles murins de fibrose pulmonaire sont indispensables pour (i) comprendre les mécanismes pathogéniques, (ii) identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, (iii) évaluer l'efficacité de nouvelles thérapies et (iv) étudier l'évolution de la maladie: La gestion de l'inflammation est cruciale pour prévenir les complications et améliorer la qualité de vie des patients.
Bénéfices attendus
Bénéfices à court terme (0-2 ans): Le projet devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes de l'inflammation dans la fibrose pulmonaire. On s'attend à identifier de nouvelles voies moléculaires impliquées dans le processus de cicatrisation anormale. Cela pourrait conduire à la découverte de biomarqueurs. Bénéfices à moyen terme (2-5 ans): Valider des cibles thérapeutiques identifiées à court terme, et de nouveaux candidats médicaments. De plus, le projet pourrait contribuer au développement de protocoles thérapeutiques combinés, associant des traitements anti-inflammatoires à des thérapies déjà existantes, pour une efficacité accrue. Bénéfices à long terme (5 ans et plus): l'impact le plus significatif serait la mise sur le marché de nouveaux traitements curatifs ou du moins plus efficaces que ceux actuellement disponibles. Ces avancées thérapeutiques amélioreraient considérablement la qualité et l'espérance de vie des patients atteints de fibrose pulmonaire idiopathique. Le projet pourrait également ouvrir la voie à une médecine plus personnalisée, où les traitements seraient adaptés au profil inflammatoire spécifique de chaque patient, optimisant ainsi les résultats. Enfin, ces découvertes pourraient servir de base pour la recherche sur d'autres maladies pulmonaires ou fibrotiques.
Procédures
Tous les animaux expérimenteront une administration unique d'agent inducteur de fibrose en intranasal (30 sec). Les animaux seront traités au maximum une fois par jour pendant 4 semaines par le candidat médicament (intrapéritonéal 10 sec, intranasal 15 sec, sous-cutané 15 sec, gavage 20 sec). Un prélèvement sanguin (20 sec) de 100 μl par semaine pendant 4 semaines consécutives. Les prélèvements sanguins se feront dans le sinus rétro-orbitaire sur animaux anesthésiés, alternativement sur l'œil gauche puis droit.
Impact sur les animaux
L'agent inducteur de fibrose provoque une lésion pulmonaire qui va évoluer vers une fibrose. Cela peut causer des difficultés respiratoires, une toux, et un inconfort général pour la souris. Les traitements administrés peuvent également causer de l'inconfort ou de la douleur. Les injections peuvent être douloureuses au point d'injection, et le gavage (per os) peut être stressant. La perte de poids est un indicateur clé de la dégradation de l'état de santé de l'animal et est une nuisance en soi, reflétant la maladie et le stress métabolique. Le suivi quotidien du poids est une mesure de l'impact de la fibrose. Les prélèvements sanguins hebdomadaires par ponction rétro-orbitaire, même sous anesthésie, sont invasifs. Cette technique peut potentiellement causer des lésions oculaires, des saignements et un stress post-procédural pour l'animal. L'administration d'un analgésique est nécessaire pour atténuer la douleur.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de réaliser des prélèvements de sang et d'organes à des fins analytiques, avec pour objectif de quantifier les effets protecteurs des molécules administrées pendant l'étude.
Remplacement
Il existe plusieurs alternatives non animales dans la recherche sur les maladies inflammatoires, mais elles ne peuvent pas remplacer totalement les tests sur les animaux utilisés dans ce projet. 1. Modèles in vitro : Les cultures cellulaires humaines ou animales permettent d’étudier des interactions cellulaires et des réponses inflammatoires. Cependant, elles ne peuvent pas reproduire la complexité d'un organisme entier, notamment les interactions multicellulaires complexes et la réponse immunitaire systémique. 2. Modèles ex vivo : Les tissus humains ou animaux (biopsies, organes) permettent d’étudier des processus biologiques en conditions plus réalistes, mais il manque des interactions entre plusieurs systèmes organiques, essentiels pour comprendre les maladies inflammatoires. 3. Modèles organoïdes et organes sur puce : Ces systèmes imitent des organes comme les poumons ou les reins pour étudier les réponses biologiques. Cependant, ils ne peuvent pas reproduire la réponse systémique d'un organisme complet. 4. Modélisation informatique : Les simulations informatiques peuvent modéliser certaines interactions immunitaires, mais elles ne peuvent pas simuler toutes les réactions biologiques complexes d'un organisme vivant. Ces alternatives ne peuvent pas complètement remplacer les animaux, pour les raisons suivantes : • Complexité biologique : Les modèles non animaux ne peuvent pas reproduire la complexité d’un organisme vivant complet, limitant leur capacité à simuler des réponses biologiques globales. • Interactions systémiques : Les maladies inflammatoires nécessitent l'étude des interactions complexes entre les systèmes biologiques, ce qui ne peut être simulé sans un modèle vivant.
Réduction
De façon systématique des analyses statistiques sont effectuées pour déterminer le nombre optimal d’animaux afin de produire des résultats robustes pour chaque point de mesure. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux.
Raffinement
Dans les expérimentations sur les maladies inflammatoires, la fréquence de surveillance des animaux est essentielle pour garantir leur bien-être. Les signes de détérioration de l’état de santé, tels que perte de poids, modifications de la mobilité, ou respiration laborieuse, sont particulièrement surveillés. Après l'administration de l'inducteur d'inflammation, une surveillance rapprochée (toutes les 2 à 4 heures) est mise en place. Si des signes de stress apparaissent, nous ajusterons l'environnement pour améliorer le bien-être des souris et notamment stimuler leurs sens et leurs comportements naturels. Nous augmenterons l’enrichissement physique par l’apport de cachettes (boîtes, tunnels) et de matériaux pour la construction de nids (papier déchiqueté, fibres) ainsi que l’enrichissement sensoriel par la modification régulière de la disposition de leur cage et des éléments à l’intérieur de la cage pour offrir de la nouveauté. L'introduction de nouveaux enrichissements se fera progressivement pour éviter un stress supplémentaire. Des critères d'arrêt stricts sont définis pour éviter la souffrance excessive des animaux. Par exemple, une perte de poids de plus de 20%, l’apparition de signes cliniques tels qu'une respiration difficile, ou une perte de réponse à un stimulus, ou une lésion irréversible oculaire conduiront à l’interruption immédiate de l’expérience. L’objectif est de garantir que l’état de l’animal est constamment suivi et que des soins vétérinaires sont fournis dès que nécessaire. La prévention du stress est intégrée au protocole expérimental par l'utilisation d'une anesthésie gazeuse et administration d'analgésique au préalable des gestes douloureux à chaque fois que cela sera nécessaire.
Choix des espèces
La souris est un modèle privilégié pour le modèle de fibrose pulmonaire idiopathique car elle permet de reproduire en seulement 21 jours les mécanismes clés de la fibrose humaine, notamment l'activation du TGF-beta et l'accumulation excessive de collagène. Sa proximité génétique et physiologique avec l'humain offre une base solide pour étudier les lésions alvéolaires et les remaniements tissulaires caractéristiques de la pathologie Les souris seront âgées de 6 à 8 semaines car nous souhaitons utiliser des animaux adultes.
Étude de l’intérêt d’inhibiteurs du métabolisme du lactate dans la formation et le développement des métastases osseuses des cancers pulmonaires et combinaison avec les immunothérapies.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
Une injection de cellules tumorales dans le tibia ou dans une artère, puis une séance d'imagerie sous anesthésie tous les cinq jours : 484 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue. Une partie est immunodéprimée par construction pour accueillir des tumeurs humaines. Le porteur décrit des douleurs osseuses, des boiteries, des difficultés respiratoires et des atteintes neurologiques selon le site des métastases. Les retombées cliniques espérées contre les métastases osseuses du cancer du poumon restent hypothétiques et lointaines, quand les atteintes infligées aux souris sont immédiates.
Objectifs
Ce projet vise à comprendre si le blocage de deux transporteurs du lactate, à l’aide de molécules spécialement conçues pour les inhiber, permet de ralentir ou de réduire le développement de métastases pulmonaires chez la souris. Le lactate est une substance produite par les cellules tumorales, et certains transporteurs permettent sa sortie de la cellule, facilitant ainsi la progression du cancer. En empêchant leur fonctionnement, nous cherchons à savoir si la croissance tumorale peut être limitée. Si ces inhibiteurs montrent une efficacité, nous évaluerons ensuite si leur utilisation conjointe avec des traitements d’immunothérapie peut renforcer la diminution du développement métastatique. L’objectif est de déterminer si cette approche combinée offre une meilleure réponse que chaque traitement pris séparément. Enfin, pour mieux comprendre les mécanismes en jeu, des analyses complémentaires seront réalisées sur les tissus et les cellules. Elles permettront d’identifier les processus cellulaires et moléculaires responsables des effets observés, afin de mieux expliquer comment ces inhibitions influencent l’évolution des métastases.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment l’inhibition de transporteurs du lactate influence la progression des métastases du cancer du poumon et la réponse à l’immunothérapie. L’étude précisera les mécanismes cellulaires et moléculaires associés aux phénomènes de résistance ou de sensibilité aux traitements. Même en l’absence d’effet majeur sur les métastases osseuses, les données obtenues apporteront des informations utiles sur l’impact de ces inhibiteurs dans d’autres sites métastatiques (poumon, foie, cerveau, glandes surrénales), contribuant ainsi à clarifier leur rôle dans différents microenvironnements tumoraux. Ces résultats enrichiront la littérature existante et aideront à identifier des biomarqueurs prédictifs de réponse aux approches ciblant le métabolisme lactique. Sur le plan clinique, le projet pourrait ouvrir la voie à une stratégie innovante pour traiter les métastases osseuses du cancer du poumon, pour lesquelles les options actuelles sont très limitées. En montrant que l’inhibition de transporteurs du lactate peut renforcer l’efficacité de l’immunothérapie, il pourrait soutenir le développement de nouvelles combinaisons thérapeutiques. Si une activité est également observée sur d’autres métastases, ces agents pourraient être envisagés pour des patients atteints de formes avancées et de mauvais pronostic. À terme, ce travail contribuera à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et à la conception d’essais cliniques dédiés.
Procédures
Les animaux seront injectés avec des cellules tumorale soit en intra-tibiale ou en intra-artérielle, sous anesthésie générale avec analgésie préalable, pour chaque procédure d’injection, 5 min seront nécessaire. Les animaux feront l’objet d’un suivi régulier par imagerie. La colonisation tumorale sera évaluée par bioluminescence, une méthode non invasive consistant à anesthésier les souris, à les placer dans l’appareil pour capturer les images, puis à les retirer. Dans un second temps, les animaux seront maintenus sous anesthésie afin de réaliser une analyse complémentaire par scanner, permettant d’évaluer l’état des structures osseuses. Ainsi, chaque séance d’imagerie représentera une procédure d’une dizaine de minutes, répétée tous les cinq jours. En parallèle, un suivi quotidien sera assuré, comprenant l’observation clinique et la pesée de chaque animal.
Impact sur les animaux
Les modèles expérimentaux peuvent générer différents niveaux de nuisances, suivies de près afin d’éviter douleur ou détresse. • Injection intra-tibiale : le développement tumoral dans l’os de la patte arrière peut provoquer une douleur locale, se traduisant par une moindre utilisation du membre, des troubles de la marche ou une boiterie. Cela est identifié lors de l’examen quotidien des souris, lorsqu’elles sont placées en une cage individuelle quelques instant avant la pesée et les traitements, une douleur est repérée lorsque la souris utilise moins sa patte colonisée par la tumeur lorsqu’elle se lève ainsi qu’une boiterie lorsqu’elle se déplace. • Injection intra-artérielle : les cellules tumorales diffusent par la circulation sanguine et peuvent former des métastases dans le squelette, les poumons, le système digestif, le cerveau ou d’autres organes. Leur localisation sera suivie par imagerie bioluminescente. Cela peut engendrer des douleurs osseuses, des difficultés respiratoires, des atteintes neurologiques, une perte de poids, des lésions cutanées, et est identifiable lorsque les souris présentent des signes d’isolement, de prostration, d’hyperactivité ou d’agressivité envers le soigneur ou les congénères). • Les traitements par gavages et ou par intra péritonéale peuvent induire une inflammation dans les voies digestives supérieures ou une inflammation cutanée au site d’injection intrapéritonéale. • Les animaux traités avec les inhibiteurs du lactate devraient subir des dommages moindres que les animaux témoins, compte tenu des effets antitumoraux présumés.
Devenir
La mise à mort sans douleur des animaux sera réalisée pour tous les animaux. Elle est requise pour une analyse plus approfondie de la colonisation des organes par les cellules cancéreuses réalisées via des analyses de biologie cellulaire et moléculaire.
Remplacement
Ce projet vise à évaluer l’effet de traitements ciblant le métabolisme tumoral dans le cadre des métastases osseuses, en reproduisant au mieux la situation observée chez les patients. Actuellement, aucune méthode alternative (cultures cellulaires, modèles informatiques, systèmes ex vivo) ne permet de recréer l’ensemble du processus métastatique dans un os vivant, avec sa vascularisation, ses interactions cellulaires et sa réponse immunitaire. Avant de recourir à l’animal, différentes approches ont été utilisées : cultures de cellules tumorales, cocultures avec des cellules osseuses, os en culture et modèles informatiques. Ces techniques sont utiles pour explorer certains mécanismes, mais elles ne reflètent pas la complexité d’un organisme entier. L’utilisation de la souris reste donc nécessaire pour modéliser la dissémination tumorale par la circulation sanguine, observer l’évolution de la tumeur dans l’os, évaluer l’efficacité des traitements sur l’ensemble du corps et analyser leurs effets secondaires. Aucune autre méthode ne permet actuellement d’atteindre ces objectifs avec la même pertinence scientifique.
Réduction
Nous appliquons le principe des 3R en cherchant à limiter autant que possible le nombre d’animaux. Le plan expérimental est conçu de façon à inclure seulement le nombre minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Ainsi, même si un petit surplus d’animaux est prévu pour anticiper d’éventuelles exclusions, nous évitons de répéter inutilement les expériences. Le suivi de l’évolution des tumeurs est réalisé grâce à des techniques d’imagerie, ce qui permet d’observer les mêmes animaux au fil du temps sans avoir besoin de procéder à des mises à mort à chaque étape. De plus, nous utilisons certains animaux provenant d’autres projets de recherche : ces animaux, qui auraient été euthanasiés car non conformes aux besoins initiaux, trouvent une utilité scientifique dans nos travaux. Enfin, lorsqu’un animal ne peut pas être inclus dans le groupe principal en raison d’une réponse expérimentale trop faible ou trop forte, il n’est pas perdu : il contribue à des analyses complémentaires (histologie, étude du système immunitaire, etc.). Cette approche maximise les informations obtenues tout en réduisant les effectifs globaux. Le projet est construit avec différentes étapes, dont deux de mise au point ; les résultats obtenus à chaque étape sont analysés et l’étape suivante n’est entreprise que si les résultats précédents ont été concluants.
Raffinement
Afin de limiter au maximum la douleur et le stress des animaux, plusieurs précautions sont mises en place. Les interventions douloureuses sont systématiquement réalisées sous anesthésie et un traitement antidouleur est administré au réveil et par la suite si nécessaire sont réalisées sous anesthésie et un traitement antidouleur est administré si nécessaire. Les animaux sont observés chaque jour pour détecter rapidement tout signe de souffrance, avec une prise en charge immédiate si besoin. Ils sont hébergés en groupes, dans des cages enrichies favorisant leur confort et leurs comportements naturels. Un temps d’acclimatation et une accommodation progressive aux manipulations permettent aussi de réduire leur stress. Nous privilégions des méthodes non invasives, comme l’imagerie, pour suivre l’évolution des tumeurs sans multiplier les interventions. Enfin, les animaux qui ne peuvent pas être inclus dans l’expérience sont utilisés pour d’autres analyses afin de réduire leur nombre global. L’ensemble du protocole est régulièrement ajusté avec le vétérinaire et l’équipe est formée en continu aux bonnes pratiques de bien-être animal. Notre projet utilise des animaux immunodéprimés maintenues sous barrières et les manipulations en conditions stériles pour limiter le risque infectieux.
Choix des espèces
Les animaux utilisés pour le projet sont des souris normales immunocompétentes et des souris mutantes immunodéprimées. Les souris normales immunocompétentes disposent d’un système immunitaire bien caractérisé, indispensable pour évaluer l’efficacité de traitements métaboliques et immun thérapeutiques. Les souris mutantes immunodéprimées présentent une déficience en lymphocytes T. Cette immunodépression rend possible l’implantation et la croissance de lignées tumorales humaines (xénogreffes), indispensables pour étudier la biologie des tumeurs humaines et la formation de métastases en contexte in vivo. Dans le contexte de notre étude, les protocoles seront réalisés avec des souris âgées de 6 semaines. A cet âge, l’ensemble des fonctions sont matures.
Etude du r?le de m?tabolites de la flore microbienne intestinale dans le traitement de l’ob?sit? du diab?te et de l’asthme chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système respiratoire
688 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune enchaînant traitement antibiotique, gavages répétés, inoculations rectales sous anesthésie et tests de tolérance au glucose. Certaines reçoivent en plus l'implantation d'une pompe osmotique sous la peau pendant six semaines et des instillations nasales d'acariens pour induire un asthme. Le projet étudie un métabolite du microbiote intestinal dans l'obésité, le diabète et l'asthme, avec des applications probiotiques adossées à un brevet. Le porteur affirme qu'il reste "nécessaire" de recourir à l'animal vivant, la complexité des interactions entre organes étant difficile à reproduire in vitro.
Objectifs
Ce projet vise ? mieux comprendre comment les bact?ries pr?sentes dans l?intestin influencent certaines maladies chroniques fr?quentes, comme l?ob?sit?, le diab?te de type 2 et l?asthme. Ces maladies sont souvent li?es entre elles et partagent des m?canismes communs, notamment une inflammation persistante de l?organisme et un d?s?quilibre du microbiote intestinal (ensemble des bact?ries vivant dans l?intestin). Certaines bact?ries intestinales produisent naturellement des substances appel?es m?tabolites, qui peuvent avoir des effets b?n?fiques sur la sant?. L?un de ces m?tabolite, est produit uniquement par la flore intestinale, mais son r?le exact dans ces maladies reste encore mal connu. L?objectif de ce projet est d??tudier comment ce m?tabolite d'int?r?t et les bact?ries le produisant, influence le m?tabolisme du glucose et des lipides, ainsi que l?inflammation des voies respiratoires. Pour cela, nous utiliserons des mod?les de souris pr?sentant des caract?ristiques proches de celles observ?es chez l?Homme dans l?ob?sit?, le diab?te et l?asthme. Les effets de ce m?tabolite seront ?tudi?s sur le contr?le de la glyc?mie, la prise de poids, l?accumulation des graisses au niveau du foie et l?inflammation des poumons. Ce projet, men? sur cinq ans, respectera strictement les r?gles ?thiques et le bien-?tre animal. Les r?sultats attendus pourraient contribuer au d?veloppement de nouvelles approches pr?ventives ou th?rapeutiques bas?es sur le microbiote intestinal.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche ouvre des perspectives prometteuses pour le d?veloppement de nouvelles strat?gies th?rapeutiques chez l?Homme fond?es sur des produits probiotiques. L?enrichissement cibl? en bact?ries productrices de m?tabolites b?n?fiques, comme le 4-cr?sol, pourrait non seulement am?liorer l?hom?ostasie glucidique et lipidique, mais aussi att?nuer l?inflammation syst?mique impliqu?e dans l?ob?sit?, le diab?te de type 2 et l?asthme allergique. Le brevet sur lequel ce projet se fonde (Compounds for the prevention and treatment of glucose intolerance related conditions and obesity. Patent Ref. EP 17306326.4 -1466, filed 4 October 2017), et les essais cliniques en cours pour ?valuer l?efficacit? de produits probiotiques, en particulier pour le traitement de la maladie de Crohn, illustrent l?importance des applications th?rapeutiques potentielles des r?sultats des proc?dures exp?rimentales. Les m?canismes sous-jacents, impliquant des interactions complexes entre le microbiote, l'h?te et son environnement, font l'objet de recherches intensives. Bien que des d?fis persistent concernant la s?lection des souches, le dosage ou la variabilit? interindividuelle, ce projet pourrait contribuer ? l??mergence de th?rapies probiotiques de nouvelle g?n?ration en compl?ment ou en alternative aux traitements actuels.
Procédures
Proc?dure 1 Les animaux sont soumis ? des interventions non chirurgicales, r?alis?es chez des animaux vigiles ou sous anesth?sie l?g?re. Ils re?oivent un traitement antibiotique dans l?eau de boisson pendant 11 jours, suivi d?un enrichissement de la flore intestinale par inoculation de bact?ries non pathog?nes, comprenant un gavage oral trois fois par semaine chez l?animal vigile (contention < 30 s) et une inoculation rectale une fois par semaine sous anesth?sie l?g?re ? l?isoflurane. Le poids et la glyc?mie sont mesur?s une fois/semaine ? partir d?une goutte de sang pr?lev?e ? la queue. Un premier test de tol?rance au glucose par voie intrap?riton?ale (IPGTT, dur?e ? 2 h) est r?alis? ? J15, avec 6 pr?l?vements glyc?miques (< 3 ?l) aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 minutes, et 4 pr?l?vements sanguins suppl?mentaires (10?15 ?l) aux temps 0, 15, 30 et 90 minutes pour le dosage de l?insuline. Un second IPGTT est r?alis? deux mois apr?s le d?but des inoculations. Un test de tol?rance au pyruvate (PTT, ? 2 h) est r?alis? ? J30 avec 7 pr?l?vements glyc?miques (0, 15, 30, 45, 60, 90, 120 min). Un test de tol?rance ? l?insuline (ITT, ? 2 h) est r?alis? ? J45 avec 7 pr?l?vements glyc?miques selon le m?me sch?ma temporel. Proc?dure 2 Les animaux subissent une proc?dure chirurgicale unique correspondant ? l?implantation sous-cutan?e dorsale d?une minipompe osmotique, r?alis?e sous anesth?sie ? l?isoflurane et analg?sie pr?ventive. Cette intervention de courte dur?e (? 10 min) permet une perfusion continue de solution saline ou de 4-cr?sol pendant 6 semaines. Deux semaines apr?s l?implantation, les animaux sont soumis ? 4 administrations intranasales d?extraits d?acariens ou de solution saline (J0, J11, J12, J13), r?alis?es chez des animaux vigiles et de tr?s courte dur?e (< 1 min). Proc?dure 3 Les animaux sont soumis ? des interventions non chirurgicales. Ils re?oivent un traitement antibiotique pendant 11 jours, suivi d?un enrichissement de la flore intestinale par gavage oral r?p?t? trois fois par semaine chez l?animal vigile et une inoculation rectale hebdomadaire sous anesth?sie l?g?re ? l?isoflurane. Un suivi clinique hebdomadaire (poids, glyc?mie) est r?alis?. Les animaux sont ?galement soumis ? 4 administrations intranasales d?extraits d?acariens ou de solution saline (J0, J11, J12, J13), chacune de courte dur?e et sans proc?dure chirurgicale.
Impact sur les animaux
Compte tenu de notre exp?rience dans les proc?dures mises en ?uvre dans ce projet, toutes optimis?es et publi?es, nous ne pr?voyons pas de nuisances ou d?effets ind?sirables conduisant ? une mise ? mort anticip?e. Induction de l?ob?sit? et du diab?te par r?gime HFD (Proc?dure?1) : l?ob?sit? induite reste mod?r?e et n?entrave ni les mouvements ni l?acc?s ? la nourriture ; les troubles associ?s correspondent ? une nuisance l?g?re. Enrichissement de la flore par des bact?ries productrices de 4?cr?sol (Proc?dures?1&3) : l?inoculation par gavage, n?cessitant une contention br?ve (10?% avec diarrh?e, une injection sous-cutan?e de s?rum physiologique est r?alis?e. Tests de tol?rance au glucose et ? l?insuline (Proc?dure?1) : les volumes sanguins pr?lev?s sont minimes et espac?s d?une semaine. La micro-coupure distale de la queue induit une douleur mod?r?e ? cicatrisation rapide (nuisance mod?r?e). Administration chronique de 4?cr?sol par minipompes osmotiques (Proc?dure?2) : l?implantation sous?cutan?e dorsale est r?alis?e sous analg?sie par bupr?norphine (0,03?mg/ml, vol. = poids ??6, i.p.) et 30 min plus tard sous isoflurane 3,5?% induction, 1,5?% maintien. Cette proc?dure induit une nuisance mod?r?e avec douleur postop?ratoire transitoire, soulag?e par m?loxicam (5 mg/kg). Les minipompes implant?es pendant 6?semaines sont bien tol?r?es, sans rejet ni infection, et n?entravent ni les mouvements ni l?acc?s ? la nourriture (Brial et al., Cell Reports?2020 ; Gut?2021). Induction de l?asthme par administration intranasale d?extrait d?acariens (HDM) (Proc?dures?2&3) : l?administration intranasale est peu invasive et induit une nuisance l?g?re et transitoire. Les administrations aux jours 0, 11, 12 et 13 (Wypych et al., Nature Immunology, 2021) conduisent ? l?installation progressive d?un mod?le d?asthme allergique exp?rimental avec inflammation des voies a?riennes, sans crise aigu? imm?diate, correspondant ? une nuisance mod?r?e. Les animaux peuvent pr?senter une respiration l?g?rement plus rapide ou superficielle mais conservent activit? normale et acc?s ? nourriture et eau. Une surveillance quotidienne (respiration, activit?, poids) est r?alis?e, et toute aggravation s?v?re, notamment perte de poids >15?%, entra?nera une mise ? mort anticip?e.
Devenir
Les 688 animaux de la proc?dure seront euthanasi?s ? la fin de la proc?dure.
Remplacement
Le contr?le du m?tabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux, avec la contribution de produits du microbiote intestinal, en permanence pour informer l'organisme des besoins ?nerg?tiques et contr?ler les flux ?nerg?tiques en fonction des besoins. Il est tr?s difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des mod?les animaux vivants est encore n?cessaire.
Réduction
Pour r?duire le nombre d'animaux, nous avons effectu? un travail en amont qui nous a permis d'identifier les bact?ries, non virulentes et qui peuvent cro?tre dans des conditions compatibles ? la souris, gr?ce ? des analyses in vitro et in silico. Ainsi cette s?lection, effectu?e en partenariat avec l'?quipe de microbiologie, a abouti ? ne retenir que les bact?ries candidates les plus fiables et ce sont elles qui seront test?es in vivo, r?duisant ainsi le nombre d'animaux n?cessaires ? l'?tude. Les ?chantillons pr?lev?s chez chaque animal permettront de g?n?rer un grand nombre d?informations sur des marqueurs mol?culaires. De plus, nous avons estim? la taille des ?chantillons (n=8) permettant une analyse statistique efficace gr?ce aux donn?es de la litt?rature.
Raffinement
Les animaux feront l?objet d?une observation quotidienne durant les phases d?induction exp?rimentale, notamment lors de l?induction de l?asthme allergique. Un suivi du poids corporel sera ensuite r?alis? trois fois par semaine afin de d?tecter pr?cocement tout signe de mal-?tre ou de d?tresse respiratoire. Toute souris atteignant un point limite pr?d?fini, notamment une perte de poids sup?rieure ? 15 % ou des signes respiratoires s?v?res, sera imm?diatement euthanasi?e conform?ment aux proc?dures en vigueur. Afin de r?duire le stress et l?inconfort, l?enrichissement de la flore intestinale par voie rectale sera r?alis? sous anesth?sie l?g?re apr?s induction ? l?isoflurane. Les sondes utilis?es seront souples et de diam?tre adapt? ? la taille de l?animal afin d??viter toute l?sion. L?inoculation par voie orale sera r?alis?e chez l?animal vigile, cette m?thode ?tant mieux tol?r?e et ne n?cessitant qu?une contention de courte dur?e. Lors des tests de tol?rance au glucose, le volume de sang pr?lev? sera strictement limit? au minimum n?cessaire au dosage de l?insuline (5 ?l de plasma), afin de r?duire la contrainte li?e aux pr?l?vements r?p?t?s. Apr?s l?implantation des minipompes osmotiques, les animaux seront surveill?s attentivement et une analg?sie appropri?e (m?loxicam (5 mg/kg)) toutes les 12h pendant 2 jours sera syst?matiquement mise en place pour pr?venir la douleur postop?ratoire. Enfin, les animaux seront pr?alablement habitu?s ? la contention et au gavage avant le d?but des inoculations, afin de limiter le stress li? aux manipulations r?p?t?es.
Choix des espèces
Les mod?les murins pr?sentent de fortes homologies physiologiques et immunologiques avec l?Homme et constituent des outils indispensables pour ?tudier les m?canismes de r?gulation de l?hom?ostasie ?nerg?tique, incluant les m?tabolismes glucidique, lipidique et inflammatoire. La majorit? des lign?es isog?niques de souris d?veloppent une prise de poids, une hyperglyc?mie et une st?atose h?patique en r?ponse ? un r?gime riche en graisses, reproduisant des caract?ristiques cl?s de l?ob?sit? et du diab?te de type 2 humains. Les voies mol?culaires impliqu?es dans ces pathologies sont largement conserv?es entre la souris et l?Homme. La souris est ?galement le mod?le de r?f?rence pour l??tude de l?asthme allergique. L?exposition intranasale ? des allerg?nes tels que les extraits d?acariens permet de reproduire les principales caract?ristiques de l?asthme humain, notamment l?inflammation des voies a?riennes, le recrutement de cellules immunitaires et les r?ponses de type 2. Les m?canismes immunopathologiques sous-jacents sont fortement conserv?s, justifiant l?utilisation de ce mod?le. Nous utiliserons des souris C57BL/6J ?g?es de 2 ? 6 mois. Cet ?ge a ?t? choisi pour plusieurs raisons. Tout d'abord, ? cet ?ge, le microbiote intestinal est relativement stable, ce qui permet de minimiser les variations interindividuelles et de mieux contr?ler les effets de la manipulation exp?rimentale. De plus, les souris ont atteint leur maturit? physiologique, ce qui est essentiel pour ?tudier les m?canismes sous-jacents ? la question scientifique. Enfin, cet ?ge a ?t? largement utilis? au laboratoire dans des ?tudes pr?c?dentes sur le m?me mod?le, en particulier dans des protocoles de perfusion de 4-cresol avec des minipompes osmotiques (Brial et al. Cell Reports 2021), ce qui peut r?duire le nombre de souris en retirant le besoin d?exp?riences exploratoires, et facilite la comparaison de nos r?sultats avec la litt?rature existante.
Étude de l’atteinte musculaire dans la bronchopneumopathie chronique obstructive
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
Deux heures par jour, cinq jours sur sept, pendant un à trois mois d'exposition à la fumée de cigarette: 1 100 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent en plus une instillation d'élastase dans la trachée, l'implantation d'une pompe sous la peau et un cathétérisme cardiaque. Le projet vise à comprendre la perte musculaire associée à la bronchopneumopathie chronique obstructive et à explorer des pistes thérapeutiques. Le porteur retire les éléments de nidification des cages pendant les deux heures d'exposition quotidienne et met à mort tout animal atteignant un score de dégradation trop élevé, les organes étant ensuite prélevés.
Objectifs
La bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) est l’une des maladies respiratoires les plus fréquentes dans le monde et constitue une cause majeure de décès. Elle provoque une dégradation progressive des poumons, rendant la respiration de plus en plus difficile. Le tabagisme en est la principale cause, mais d’autres facteurs, comme la pollution de l’air, des infections respiratoires répétées durant l’enfance ou certaines prédispositions héréditaires, peuvent également favoriser son développement. Cette maladie s’accompagne souvent d’une diminution de la masse et de la force musculaires, appelée sarcopénie, ce qui altère la qualité de vie des personnes atteintes. Chez l’adulte, les muscles possèdent normalement une grande capacité d’adaptation et de réparation, leur permettant de se renouveler efficacement. Cette capacité repose sur des cellules souches présentes dans les muscles, généralement au repos, mais capables de s’activer en cas de besoin pour assurer leur entretien et leur régénération. Avec l’âge, ces mécanismes deviennent toutefois moins performants : les muscles se réparent moins bien, ce qui entraîne une diminution progressive de leur masse et de leur force, comme observé dans certaines situations de fragilité musculaire. Par ailleurs, certaines protéines présentes dans l’organisme jouent un rôle clé dans ces processus et pourraient constituer des pistes prometteuses pour de futurs traitements, afin de limiter les atteintes pulmonaires et de préserver la fonction musculaire. L’objectif de ce projet est donc de mieux comprendre les mécanismes responsables de la perte musculaire associée à cette maladie et d’explorer de nouvelles approches thérapeutiques pour améliorer la santé et la qualité de vie des patients.
Bénéfices attendus
Ce travail devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la sarcopénie associée à la BPCO et fournir un cadre de traitement potentiel.
Procédures
Exposition à la fumée de cigarette : 2h/ jour, 5 jours/7 pendant 1, 2 ou 3 mois. Administration intratrachéale d'élastase sous anesthésie : 15min, 1 fois. Implantation sous-cutanée de pompe osmotique : 10-15min. Test d'agrippement : 5 min, entre 2 et 4 fois par procédures. Test de course : 16 min, entre 2 et 4 fois par procédures. Évaluation de la fonction cardiaque et de la pression artérielle par cathétérisme : 25-30min, 1 fois.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont principalement dues au stress lié : - à la contention et aux manipulations sur animal vigile (test d’agrippement, test de course). - à l’exposition à la cigarette incluant l’odeur et le bruit généré par la machine. Remarque : en cas d’agressivité ou de mortalité, les animaux pourraient être isolés (seul dans une cage) afin de les garder dans l’étude.
Devenir
A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort. Leurs organes seront prélevés afin de réaliser des analyses histologiques et/ou moléculaires nécessaires pour atteindre les objectifs de notre étude.
Remplacement
Afin de tester l’impact direct de l’hypoxie intermittente sur la biologie des cellules satellites, des expériences de culture cellulaire seront menées indépendamment. Pour répondre à notre question biologique, le remplacement total par de la culture cellulaire n'est pas envisageable. En effet, les modèles in vitro ne rendent pas compte de l'immense complexité des interactions physiopathologiques qui existent entre les populations cellulaires au sein d’un organisme ou d’un tissu entier. L'utilisation de modèles animaux, dont les systèmes musculosquelettique et pulmonaire sont similaires à l’Homme, reste essentielle afin d’étudier les effets délétères de la BPCO sur le muscle squelettique et la biologie des cellules satellites. Par ailleurs, la variabilité des caractéristiques des patients comme leur âge, leur consommation de tabac, ou encore l’implication d’autres maladies rend plus complexe l’interprétation des résultats en provenance de l’Homme. Les modèles animaux nous permettent de mieux définir les organes et types cellulaires touchés et nous précisent donc les cibles moléculaires intéressantes pour des thérapeutiques éventuelles.
Réduction
Nous allons réduire le nombre d'animaux en utilisant des méthodes non invasives (test d’agrippement, test de course sur tapis roulant) qui permettent de répéter les analyses sur le même animal mais aussi en utilisant des tests statistiques appropriés. Des expériences dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=11 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour les analyses histologiques, moléculaires et fonctionnelles compte tenu de la variabilité biologique inter-individuelle dans nos modèles de BPCO.
Raffinement
Les animaux importés de fournisseurs agréés pour les besoins expérimentaux sont laissés en acclimatation une semaine avant toute manipulation. Pour raffiner, la souffrance des souris sera réduite en utilisant des anesthésiques et analgésiques. Tout au long de l’étude, nous suivrons la grille d’évaluation proposée tenant compte des changements du poids, des perturbations de l'apparence physique et du comportement. Tout animal auquel aura été attribué un score élevé à cette évaluation recevra des analgésiques. Tout animal auquel aura été attribué un score trop élevé sera immédiatement mis à mort. Une surveillance accrue sera mise en place pendant les 24h suivant l’instillation d’élastase. La qualité de l'élevage est améliorée en enrichissant les cages expérimentales avec des bâtons à ronger, des éléments permettant la nidification (papiers, maison en carton) ainsi qu’un accès illimité à la nourriture et à l’eau de boisson. Remarque : Afin de facilité l'exposition à la fumée de cigarettes, les éléments de nidification seront retirés des cages pendant les 2h d'exposition.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix car les systèmes physiologiques pulmonaire et musculosquelettique sont proches de ceux de l’Homme. Par ailleurs, la souris a l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des souris génétiquement modifiées afin de faciliter les analyses nécessaires pour atteindre les objectifs de notre étude. Enfin, nous utilisons des outils permettant les évaluations fonctionnelles et structurelles du muscle squelettique et des cellules satellites in vivo ainsi que ex vivo chez la souris. Nous utiliserons des animaux adultes jeunes de 8 semaines. A ce stade, l’appareil respiratoire est totalement développé et les muscles squelettiques sont parfaitement formés avec les cellules souches musculaires résidant en périphérie de la fibre musculaire à l’état de repos.
Etude par imagerie de l’impact de la neurostimulation pour améliorer les capacités ventilatoires suite à un trauma cervical sur un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
Opérées d'une lésion de la moelle épinière cervicale, 350 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, la moitié classée sévère, toutes tuées à l'issue. La lésion entraîne une perte sensorielle et une réduction de la capacité respiratoire d'un côté du corps, avant deux semaines de stimulation électrique des muscles sous anesthésie et un suivi par IRM. Elles sont ensuite mises à mort pour l'analyse des tissus, le porteur indiquant que les méthodes alternatives n'y répondent pas. Les retombées pour les patients tétraplégiques sont présentées comme un 'objectif ultime' et une preuve de concept, à distance de toute application.
Objectifs
Chaque année, près de 500 000 personnes dans le monde subissent des lésions de la moelle épinière, que ce soit à la suite d'un accident ou d'une autre cause. La plupart de ces blessures touchent la région cervicale, ce qui entraîne non seulement une paralysie des muscles, mais aussi une réduction importante de la capacité pulmonaire, ce qui peut entraîner des difficultés respiratoires graves. De nombreuses personnes tétraplégiques (paralysées des quatre membres) ont besoin d’une assistance respiratoire, parfois à vie, ce qui a un fort impact sur leur qualité de vie et sur la société en général. Nos recherches visent à trouver des solutions alternatives à l’utilisation permanente de la ventilation mécanique. Dans ce cadre, après une lésion de la moelle épinière, nous travaillons sur une stratégie de réparation des réseaux neuronaux et des fonctions musculaires basée sur une stimulation électrique neuromusculaire. L’objectif de l’étude est de voir si une simulation électrique neuromusculaire permet d'augmenter l'activité neuronale au niveau de la moelle et/ou de réduire la lésion, afin de mieux comprendre comment se déroule la récupération de fonction qui a été observée et d'avoir des pistes pour optimiser plus avant cette stimulation. Pour réaliser ces observations, nous allons d’une part mettre en place l’imagerie fonctionnelle IRM de la moelle épinière de la souris et d’autre part de caractériser par imagerie IRM, au niveau anatomique et fonctionnelle, les effets de la stimulation électrique neuromusculaire. Ces informations sur l'impact de la stimulation électrique neuromusculaire sont importantes pour pouvoir, à terme, porter cette technique chez l'homme.
Bénéfices attendus
Notre objectif ultime est d’apporter des preuves de concept de la récupération de l’activité ventilatoire partielle ou totale après une lésion de la moelle épinière. Les résultats de cette étude serviront à montrer qu’il est possible de réactiver et de soutenir la plasticité de la moelle épinière, même dans les conditions les plus toxiques et néfastes d'une lésion de la moelle épinière, tout en apportant des nouvelles données scientifiques sur les mécanismes de récupération respiratoire et des indications pour une utilisation chez l’humain. Certains patients restent dépendants à vie d’une assistance respiratoire, un équipement qui les coupe d’une vie sociale et des centres de rééducation, et diminue par conséquent leur espérance de vie. Trouver une solution est indispensable.
Procédures
Tous les animaux subiront une chirurgie qui consiste en une lésion ou une incision pour les animaux contrôles (durée inférieure à 40 min), chirurgie réalisée sous anesthésie et analgésie. Par la suite, les animaux seront impliqués dans un traitement basé sur la stimulation des muscles (30 min, 5 fois par semaine pendant 2 semaines, réalisé sous anesthésie). Tous les animaux seront également impliqués dans un suivi par imagerie IRM (3 sessions en 3 semaines).
Impact sur les animaux
Les nuisances principales attendues sur les animaux sont celles induites par la chirurgie de lésion de la moelle épinière. Lors de l’anesthésie, il y a un risque d’hypothermie et de douleur au réveil. La lésion entraine également un inconfort dû à la perte sensorielle des pattes postérieures et antérieures correspondant au côté lésé, ainsi qu’une réduction de la capacité respiratoire liée à l’atteinte de la conduction nerveuse vers la partie du diaphragme qui correspond au côté lésé de la moelle épinière. Ces atteintes ne sont cependant que d'un côté, et elles permettent donc à l’animal de se mouvoir, de se nourrir et de respirer mais cela peut entrainer un inconfort du fait de ne pas se mouvoir complètement librement. Une diminution du volume d'air inspiré à chaque respiration est possible les premiers jours mais elle est compensée naturellement par une augmentation de la fréquence respiratoire. Les animaux sont sous analgésie injectée par voie sous-cutanée trois fois par jour pendant 2 jours (le jour de la chirurgie + 2 jours suivants). Cela peut entrainer un stress. Il peut aussi exister un risque de soif et de dénutrition si les animaux n’arrivent pas à se nourrir et boire suffisamment les jours après la chirurgie. Un stress pourra également être ressenti par les animaux lors des tests fonctionnels, notamment lorsqu’ils seront dans le tube permettant de mesurer le volume respiratoire (durée 20 min) où ils peuvent ressentir une limite de leur liberté d’expression physique.
Devenir
Chaque animal sera euthanasié à l’issue des expériences, afin de réaliser des études des tissus à l'échelle cellulaire sur les prélèvements post-mortem. Ces analyses constituent une part importante des projets sur lesquels nous travaillons, auxquelles les méthodes alternatives ne répondent pas.
Remplacement
À l'heure actuelle, il n'y a pas de modèle expérimental clinique autre que les sujets humains ou animaux pour étudier les réponses physiologiques intégrées. Ce projet a pour but de développer des preuves de concept de réparation d’une neuropathologie pour laquelle aucune thérapie n’est proposée aux patients. Nous ne serions pas en mesure d'effectuer les manipulations nécessaires chez l'homme (par exemple, une intervention pharmacologique dans les systèmes de neurotransmetteurs, des observations à l'échelle cellulaire, des prélèvements de moelle épinière), et nous devons donc recourir à l'expérimentation sur les espèces de mammifères non humains. Les connectivités neuronales de ces systèmes intégrés nécessaires pour mener "des études de modélisation" ne sont pas disponibles, ou encore, aucun comportement suite à un traitement innovant ne peut être prédit, et il n'existe actuellement aucun substitut à l'expérimentation animale. Les concepts qui ont guidé cette recherche sont nouveaux dans le domaine et, à ce titre, doivent être soigneusement étudiés dans des situations biologiquement pertinentes.
Réduction
Plusieurs mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Grâce à une approche statistique, le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet. Nous réaliserons un suivi par imagerie IRM, ce qui permet de suivre un même animal à plusieurs temps et ainsi de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Une semaine d'acclimatation est prévue à l'arrivée des animaux avant toute expérience. Les animaux sont hébergés dans des cages enrichies, selon le protocole mis en place à l'animalerie. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur (critères pris en compte : prostration, renfoncement des yeux, arrêt du nettoyage du pelage). Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance (notamment, suppression de la douleur grâce à l’administration d’antalgiques). Une couverture analgésique et anesthésique est prévue pour chaque intervention pouvant générer de la douleur (par exemple chirurgie) ou du stress (par exemple imagerie). En cas d'anesthésie, les animaux sont placés sur une couverture chauffante pour maintenir leur température corporelle et leurs yeux sont couverts d'un gel oculaire pour éviter le déssèchement. En situation où l'animal serait affaibli (par exemple juste après une chirurgie), une nourriture hypercalorique et hydratée sera fournie.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux d’expérimentation très utilisés dans la recherche préclinique sur le traumatisme du système nerveux, afin d’améliorer la connaissance de la pathologie et de développer des stratégies thérapeutiques adaptées. Malgré des différences entre l’homme et les rongeurs, les changements pathologiques, la réponse inflammatoire et l’expression des gènes précoces après une lésion sont les mêmes. L’induction de la lésion est très reproductible et standardisée chez le rongeur et de nombreux tests comportementaux ont été très bien établis. Les outils disponibles sont multiples et permettent de caractériser l’évolution d’une lésion (par exemple microscopie optique ou imagerie IRM). L’ensemble des animaux utilisés seront adultes afin de travailler sur un système nerveux mature et stable.
Compréhension des mécanismes inflammatoires dans l’hypertension pulmonaire
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système respiratoire
766 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie est maintenue plusieurs jours dans un air appauvri en oxygène pour reproduire une hypertension pulmonaire, d'autres reçoivent des injections répétées, avant une échographie cardiaque sous anesthésie. Le porteur décrit une gêne respiratoire qu'il classe modérée et renvoie les bénéfices, de futurs traitements plus efficaces, au long terme. Toutes sont tuées pour prélever les poumons et le cœur et mesurer l'inflammation et le remodelage du ventricule droit.
Objectifs
L’hypertension artérielle pulmonaire est une maladie rare et grave qui touche les vaisseaux sanguins des poumons. Ceux-ci se rétrécissent progressivement, ce qui augmente la pression sanguine dans les poumons et fatigue le cœur, pouvant conduire à une insuffisance cardiaque. Malgré les traitements actuels, cette maladie reste associée à une espérance de vie réduite. Des traitements récents ont montré des effets encourageants, mais leur mode d’action reste encore mal compris. Par ailleurs, l’inflammation semble jouer un rôle important dans l’apparition et l’aggravation de la maladie. Ce projet vise à mieux comprendre comment l’inflammation contribue aux lésions des vaisseaux pulmonaires et à déterminer comment de nouveaux traitements pourraient agir sur ces mécanismes. Pour cela, des modèles murins seront utilisés afin d’étudier le rôle de certaines voies biologiques identifiées comme importantes dans la maladie. Les objectifs sont : • mieux comprendre le rôle de l’inflammation dans la maladie ; • identifier les mécanismes biologiques impliqués dans l’atteinte des vaisseaux pulmonaires ; • évaluer l’effet de nouveaux traitements et explorer de nouvelles pistes thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment l’inflammation contribue à l’apparition et à l’aggravation de l’hypertension artérielle pulmonaire, une maladie grave caractérisée par une altération progressive des vaisseaux sanguins des poumons et une surcharge du cœur droit. Les résultats attendus aideront à préciser le rôle de certaines cellules immunitaires présentes dans les poumons et leurs interactions avec les cellules des vaisseaux sanguins. L’étude des phases précoces et tardives de la maladie permettra d’identifier les mécanismes impliqués dans l’initiation de l’inflammation puis dans le remodelage des artères pulmonaires. Les bénéfices attendus sont multiples : • mieux comprendre les étapes clés menant au développement de la maladie ; • identifier des mécanismes biologiques pouvant servir de cibles thérapeutiques ; • repérer des indicateurs précoces utiles pour le diagnostic ou le suivi ; • contribuer au développement futur de traitements plus efficaces et personnalisés. À plus long terme, ces connaissances pourraient améliorer la prise en charge des patients atteints de cette maladie sévère.
Procédures
Dans ce projet, une partie des animaux sera maintenue dans un environnement appauvri en oxygène pendant 4 à 21 jours afin de reproduire certaines caractéristiques de la maladie étudiée. Selon les groupes expérimentaux, certains animaux recevront une ou plusieurs injections au cours de l’étude, d’autres recevront des administrations quotidiennes pendant une semaine, et certains recevront des traitements répétés sur plusieurs semaines. En fin d’étude, certains animaux feront l’objet d’une échographie cardiaque sous anesthésie de courte durée afin d’évaluer la fonction cardiaque.
Impact sur les animaux
L’exposition à un environnement appauvri en oxygène peut entraîner une adaptation progressive de l’organisme, se traduisant par une diminution d’activité et une gêne respiratoire modérée. Cette nuisance est classée comme modérée. Les manipulations répétées nécessaires aux injections ou aux administrations peuvent provoquer un stress bref lié à la contention ainsi qu’un inconfort transitoire au site d’administration. Ces effets sont classés comme légers. L’anesthésie de courte durée utilisée pour l’échographie peut entraîner un stress lors de l’induction gazeuse ; la nuisance associée est faible.
Devenir
À l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés conformément aux modalités décrites dans la demande, afin de permettre la collecte standardisée des organes nécessaires aux analyses. Les poumons seront prélevés afin de caractériser de manière précise l’impact des différentes interventions sur la réponse inflammatoire induite par l’hypoxie. Ces tissus permettront d’évaluer la composition et l’activation des populations immunitaires pulmonaires (cytométrie en flux, histologie, immunomarquages), d’analyser la polarisation macrophagique et d’étudier l’expression de marqueurs moléculaires associés aux voies inflammatoires. Le cœur sera également collecté afin de documenter le remodelage du ventricule droit dans un contexte d’hypertension pulmonaire. L’ensemble de ces analyses post-mortem est indispensable pour relier les mécanismes inflammatoires précoces aux altérations vasculaires et fonctionnelles observées, et pour définir avec précision l’effet biologique des interventions évaluées dans ce projet.
Remplacement
Ce projet s’appuie sur des résultats déjà obtenus à partir d’échantillons humains et d’études in vitro sur des cultures cellulaires, qui ont mis en évidence un rôle potentiel des macrophages de type 2 ainsi que des voies de signalisation dans l’inflammation pulmonaire et le remodelage vasculaire associés à l’HTAP. Ces approches in vitro ont permis de caractériser les altérations de polarisation macrophagique, les interactions précoces avec les cellules endothéliales et les effets de ces voies sur la réponse inflammatoire. Cependant, elles ne permettent pas de reproduire la dynamique spatio-temporelle complexe de l’HTAP, notamment l’évolution de l’inflammation (Jour 4), l’apparition progressive du remodelage vasculaire (Jour 21) et l’implication coordonnée de plusieurs populations cellulaires au sein du microenvironnement pulmonaire. Pour valider le rôle exact des macrophages de type 2 et de voies de signalisation dans ces processus, des modèles animaux restent indispensables. Le modèle d’hypoxie chronique chez la souris est un modèle préclinique largement validé, permettant de reproduire une HTAP modérée et réversible et d’étudier de manière intégrée les interactions entre macrophages, cellules vasculaires, cœur et poumons. Il constitue l’unique approche permettant d’évaluer l’impact réel de ces mécanismes dans un organisme entier, dans un contexte hémodynamique, vasculaire et immunitaire pertinent, et de distinguer les effets précoces de l’inflammation des altérations structurales responsables de l’HTAP.
Réduction
Le nombre d’animaux a été strictement limité en s’appuyant sur des calculs de puissance statistique (GPower) réalisés à partir de nos données préliminaires et des valeurs de référence issues de la littérature sur le modèle d’hypoxie chronique. Les effectifs ont été déterminés pour obtenir une puissance suffisante sur les paramètres majeurs de l’HTAP (pression ventriculaire droite, remodelage vasculaire, infiltration inflammatoire), ce qui évite d’inclure un nombre d’animaux supérieur au nécessaire. Bien que les fonds génétiques distincts ne permettent pas de mutualiser les groupes témoins, chaque animal contribuera à plusieurs analyses complémentaires (hémodynamiques, histologiques et moléculaires), maximisant ainsi l’information obtenue par individu et limitant le recours à des cohortes additionnelles. De plus, les procédures J4 et J21 sont conçues pour analyser deux phases distinctes (inflammation précoce et remodelage vasculaire) au sein d’un même schéma expérimental, ce qui évite de multiplier les modèles. Les analyses en cytométrie, histologie et expression génique seront réalisées sur les mêmes prélèvements, permettant de regrouper les mesures et de réduire fortement le nombre d’animaux par expérience. Enfin, les données produites seront systématiquement exploitées pour les procédures connexes, afin d’éviter la redondance expérimentale et de limiter au strict nécessaire le nombre total d’animaux utilisés dans le projet.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’un enrichissement de leur environnement avec des matériaux adaptés tels que du coton, des rouleaux de carton et des bâtonnets en bois, leur permettant de réaliser des comportements naturels. Ils seront toujours hébergés en groupes pour éviter l’isolement, et une période d’acclimatation de 2 semaines sera respectée avant le début des procédures. Pour garantir leur bien-être, un score de points limites sera appliqué afin de surveiller de près leur état de santé et d'intervenir rapidement si nécessaire. De plus, l’utilisation de crème anesthésiante à la lidocaïne avant chaque injection sous-cutanée ou intra péritonéale permettra de réduire toute gêne potentielle associée aux administrations. Nous appliquerons également cette crème avant la réalisation des mesures hémodynamiques sur le site d’ouverture. L’ensemble des procédures sera réalisé dans le strict respect des principes éthiques, afin d’assurer des conditions optimales pour les animaux tout au long de l’étude.
Choix des espèces
Les souris sont des modèles standards d’étude des maladies cardiovasculaires et de l’hypertension pulmonaire. Le modèle d’hypoxie chronique, bien qu’il ne reproduise qu’une partie des aspects de l’HTAP humaine, mime fidèlement l’inflammation pulmonaire précoce, la polarisation macrophagique, le remodelage vasculaire et les altérations hémodynamiques. Cette espèce offre un accès privilégié à des outils génétiques, permettant la manipulation ciblée de gènes impliqués dans les réponses immunitaires et de voies de signalisation, tout en limitant le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement robustes. Afin de garantir la comparabilité des résultats avec les travaux publiés dans le domaine de l’hypertension artérielle pulmonaire expérimentale, des souris adultes jeunes (5 à 6 semaines d’âge, pesant environ 18–22 g) seront utilisées. À ce stade de développement, leur système immunitaire et cardiovasculaire est mature, ce qui permet d’évaluer de manière fiable la réponse inflammatoire, la polarisation macrophagique et le remodelage vasculaire induits par l’hypoxie chronique. L’utilisation de souris jeunes adultes assure également une homogénéité des effets des traitements expérimentaux, tout en limitant la variabilité liée à la croissance ou à l’âge avancé. Ce choix correspond aux standards internationaux pour les modèles murins d’HTAP et permet l’interprétation des résultats dans un cadre comparable à la littérature scientifique.
Etude de nouvelles thérapeutiques innovantes dans différents modèles d’inflammation pulmonaires.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système respiratoire
Pour tester des molécules dans trois modèles d'inflammation pulmonaire, dont l'asthme et la vascularite, 1460 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. La maladie est provoquée par des inhalations intranasales de molécules bactériennes sous anesthésie et des injections répétées dans l'abdomen, avec inconfort et désorientation au réveil. Tous les animaux sont tués en fin d'étude pour évaluer l'évolution de la maladie et l'effet des molécules. Les bénéfices annoncés, une nouvelle génération de traitements et une baisse des dépenses de santé, sont renvoyés au moyen et au long terme.
Objectifs
Les maladies pulmonaires liées au système immunitaire sont causées par divers mécanismes. Parmi elles, l’asthme allergique résulte d’une réaction excessive de l’immunité face à un allergène (comme les acariens, le pollen, etc.). L’asthme constitue un problème de santé publique majeur, car il touche un nombre croissant de personnes. L’un des éléments clés dans l’apparition de l’asthme est l’activation de cellules appelées lymphocytes B, qui produisent des molécules pathogènes. Ces dernières reconnaissent l’allergène et déclenchent une série de phénomènes responsables des symptômes de l’asthme. Par ailleurs, l’activation du système immunitaire dans les poumons peut parfois conduire à la formation de structures appelées structures lymphoïdes tertiaires. Ces regroupements de cellules immunitaires peuvent être bénéfiques, notamment lors d’infections pulmonaires ou de cancer du poumon, en renforçant les défenses locales. Cependant, lorsqu’elles sont mal régulées, elles peuvent provoquer des lésions et aggraver certaines maladies. Il est donc essentiel de mieux comprendre comment elles se forment et comment les contrôler selon les besoins. Un sous-type particulier de lymphocytes B, appelés lymphocytes B régulateurs, joue un rôle important dans ces deux phénomènes. Ils peuvent atténuer les symptômes de l’asthme et limiter la formation des structures tertiaires, empêchant ainsi les dommages aux tissus pulmonaires. Ce projet a donc pour objectif de tester des molécules capables d’induire l’activation des lymphocytes B régulateurs, à la fois dans un modèle d’asthme allergique et dans un modèle de formation de structures lymphoïdes tertiaires dans les poumons. Enfin, le projet s’intéresse à une autre maladie grave : la vascularite, une maladie auto-immune sévère qui peut toucher les petits vaisseaux sanguins, notamment au niveau des poumons et des reins. Le traitement repose actuellement sur des médicaments immunosuppresseurs, qui doivent être administrés rapidement pour limiter les dommages. Cependant, ces traitements présentent de nombreux effets secondaires, et leur efficacité dépend de la rapidité du diagnostic. L’objectif est donc de développer de nouvelles approches thérapeutiques, à la fois plus ciblées, mieux tolérées, et utilisables plus précocement dans le cours de la maladie. Ce projet vise ainsi à enrichir les options de traitement disponibles pour les patients.
Bénéfices attendus
L’asthme allergique touche de plus en plus de personnes, et les traitements disponibles aujourd’hui ne sont souvent que partiellement efficaces. Avec ce projet, à moyen terme, nous espérons développer de nouvelles approches thérapeutiques capables de rétablir une tolérance du système immunitaire face aux allergènes, afin de mieux contrôler la maladie. À long terme, nous espérons ouvrir la voie à une nouvelle ère thérapeutique fondée sur l’induction de la tolérance immunitaire, plutôt que sur la suppression de l’immunité. Un autre objectif de nos recherches, à moyen terme, est de mieux comprendre la formation de certaines structures immunitaires au niveau des poumons. Ces structures peuvent être utiles ou nuisibles selon les contextes. Une fois ces mécanismes élucidés, à long terme, les bénéfices attendus seraient un meilleur contrôle du système immunitaire, notamment dans des cas tels que le cancer du poumon ou les infections pulmonaires chroniques. Enfin, notre étude s’intéresse également à une maladie auto-immune grave : la vascularite, qui peut affecter les poumons ou les reins. Cette maladie est difficile à traiter et peut entraîner des complications sévères. Notre objectif est de mieux comprendre ses mécanismes, afin de développer des traitements plus spécifiques, plus ciblés, et mieux tolérés, dans le but de soigner plus efficacement les patients et d’améliorer leurs chances de guérison. À moyen terme, cela permettra une meilleure prise en charge des patients. À long terme, cela pourrait réduire drastiquement les dépenses de santé, car les traitements actuellement disponibles ont un coût sociétal important.
Procédures
Les souris seront prélevées pour des analyses sanguines une fois au début de la procédure et une fois à la fin. Afin de minimiser le stress lié à ces prélèvements, les souris seront sous anesthésie générale pendant le prélèvement, qui dure moins de 2 minutes. Selon les mêmes modalités, certaines souris recevront des traitements par voie intraveineuse tous les deux jours (entre 3 et 4 injections). Ce geste dure également moins de 2 minutes. L’induction des pathologies pulmonaires se fera par inhalations intranasales (entre 1 et 8 selon les modèles) de molécules issues de bactéries, effectuées sous anesthésie générale et durant moins de 2 minutes. Ces inhalations pourront, dans certains cas, être associées à une injection intrapéritonéale réalisée sur souris vigile pour induire la pathologie. Ce geste dure également moins de 2 minutes. Certaines souris seront traitées par injection intrapéritonéale sur souris vigile (entre 4 et 8 injections).
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, certaines procédures pourraient entraîner des changements de comportement chez les souris, en lien avec la modulation de leur fonction pulmonaire. Des injections répétées dans la cavité abdominale pourront occasionner un inconfort momentané. Par ailleurs, des prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale afin d’éviter toute douleur. Après leur réveil, les souris pourraient être temporairement désorientées.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés selon des régles stricte à la fin de l'étude afin d'évaluer l'évolution de la maladie et d'analyser l'impact des molécules testées sur cette dernière.
Remplacement
Les études réalisées dans des systèmes simplifiés ont démontré l’efficacité de ces molécules. Cependant,ces systèmes ne parviennent pas à reproduire la complexité des interactions cellulaires dans un organisme entier et ne permettent pas d’évaluer l’efficacité thérapeutique de nos molécules dans un contexte aussi complexe que l’asthme allergique, la formation de structures lymphoïdes tertiaires dans un organe, ou la vascularite.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire a été déterminé en fonction du nombre minimum requis pour atteindre une puissance statistique suffisante. Ce calcul prend en compte l’hétérogénéité intrinsèque des modèles de maladies induites. Pour éviter tout biais lié aux cages, les animaux seront aléatoirement répartis entre les différentes cages. De plus, des études préliminaires seront menées sur les souris génétiquement modifiées afin d’évaluer le développement normal de la maladie. En cas de résultats non concluants, cela permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Chaque animal bénéficiera d'une période d'acclimatation d'une semaine après sa réception. Chaque cage sera équipée d'enrichissements, tels que des igloos en plastique, pour permettre aux souris de se cacher et d'améliorer leur bien-être. Par ailleurs, le bien-être des animaux sera régulièrement évalué par le personnel de l'animalerie à l'aide d'une grille de score spécifique. Cette grille permet d'évaluer le bien-être animale et, si un seuil critique est atteint, des soins particuliers seront fournis aux animaux. Si les niveaux de souffrance dépassent un seuil prédéfini, les animaux seront euthanasiés conformément à cette grille.
Choix des espèces
Les modèles disponibles d’inflammation pulmonaire sont, le rat et la souris. Les modèles murins ont été privilégiés, car notre équipe ainsi que le personnel de l’animalerie possèdent une meilleure expertise dans ces modèles. Les souris utilisées seront âgées de 8 à 10 semaines.
Optimisation de la vaccination à ARNm : efficacité de transfection des nanoparticules lipidiques selon différentes voies d’injection
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Jusqu'à douze anesthésies à l'isoflurane et douze injections par animal pour l'imagerie: 3250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections d'ARN messager encapsulé dans des nanoparticules par différentes voies, puis des séances d'imagerie répétées, avec possible perte de poids et réaction immunitaire. Le projet teste de nouvelles formulations vaccinales à ARN messager avant un éventuel passage chez l'humain. Tous les animaux sont tués pour mesurer l'efficacité de transfection et d'immunisation.
Objectifs
Suite à l’émergence de vaccin à acides nucléiques, l’ARN messager (ARNm) ouvre de nouveaux horizons thérapeutiques dans le développement de vaccins pour diverses pathologies tels que les maladies infectieuses, les cancers, les maladies auto-immunes, les maladies génétiques… Ils sont d’autant plus importants que c’est une technologie rapide à déployer qui pourra nous aider à faire face aux menaces sanitaires émergentes. Le principe repose sur la délivrance de molécules d’acide nucléique (ARNm), codant pour une protéine ou un fragment protéique, dans une cellule cible et d’utiliser la machinerie cellulaire pour produire la protéine d’intérêt. Cet ARNm peut coder pour une protéine fluorescente, une enzyme, un antigène viral ou bactérien dans le cas de maladies infectieuses ou encore une protéine spécifique pour rétablir une voie modifiée lors de maladie génétique. Les avantages de cette technologie sont nombreux incluant une rapidité de développement, la modularité des cibles, l’efficacité immunitaire et la sécurité puisque l’ARNm ne s’intègre pas dans le génome. De plus, il n’y a aucun risque infectieux. En revanche, l’ARNm est une molécule fragile qui se dégrade facilement. S’il est injecté seul dans l’organisme, il sera éliminé par notre propre système avant d’avoir rempli sa mission. Il faut donc le protéger. De nombreux vecteurs peuvent être utilisés pour protéger et délivrer l’ARNm. Ils agissent comme des bulles protectrices pouvant transporter l’ARNm jusqu’à sa cible. Dans ce contexte, notre laboratoire a fait le choix de développer des nanoparticules non virales lipidiques et/ou polymériques. Notre projet s’inscrit dans une démarche globale pour notre unité, qui vise à développer et accélérer des projets d'innovation thérapeutique et fournir une expertise en technologies ARNm. Cela comprend la mise en place et le test de nouveaux vecteurs ainsi que l’évaluation de séquences d’ARNm spécifiques conçus au laboratoire. À cette fin, ces approches doivent être testées dans des modèles complexes ; nous avons donc choisi d’utiliser des modèles murins. Objectif 1 : Evaluer l’efficacité de vecteurs non viraux pour l’encapsulation. Objectif 2 : Evaluer l’immunogénicité des nanoparticules et des séquences d’ARNm dans un organisme complexe. L’enjeu est de maximiser l’efficacité de nos formulations tout en minimisant les effets indésirables possibles dans le but de passer par la suite à des études cliniques chez l’homme.
Bénéfices attendus
Actuellement il existe moins d’une dizaine de formulations d’ARNm thérapeutique acceptées et validées par les instances chargées de la surveillance et de l’autorisation des produits pharmaceutiques. Ce projet vise à concevoir de nouvelles formulations innovantes et souveraines, à la fois sûres et efficaces, évaluées dans des modèles complexes représentatifs de conditions physiologiques réalistes. Le but à court terme est d’identifier des formulations efficaces et non immunogènes qui permettent de produire notre protéine d’intérêt et de perfectionner nos techniques de fabrication. Le but à long terme est de permettre l’émergence de nouvelles techniques de fabrication et des formulations adaptées à différents types de pathologies ou de maladies émergentes. Les demandes en traitement à base d’ARNm sont en pleine expansion, il y a donc un besoin croissant de trouver de nouvelles formulations.
Procédures
Procédure 1 : Chaque animal recevra au maximum : 2 injections d’ARNm avec une voie d’injection choisie (IM, ID, SC, IV, IN) 12 injections de substrat Luc en IP (1/jour pendant 5 jours puis 2x/semaine pendant 3 semaines) 12 Anesthésies générales à l’isoflurane de 15 min (1/jour pendant 5 jours puis 2x/semaine) 1 prélèvement sanguin sur la veine caudale sur animal vigile 1 prélèvement sanguin en rétro-orbital sous anesthésie isoflurane Procédure 2 : Chaque animal recevra au maximum : 2 injections d’ARNm avec une voie d’injection choisie (IM, ID, SC, IV, IN) 2 prélèvements sanguins sur la veine caudale sur animal vigile 1 prélèvement sanguin en rétro-orbital sous anesthésie isoflurane
Impact sur les animaux
Les animaux recevront une formulation par type d’injection choisi (intraveineuse (IV), intramusculaire (IM), intranasale (IN), sous cutanée (SC) ou intra-dermique (ID)). Les séances d’imagerie, d’environ 15 min, seront répétées et limitées à une fois par jour, avec injection de substrat à la luciférase en intrapéritonéale (IP). A la suite des injections, les animaux pourront avoir une perte de poids transitoire dûe au stress que peuvent engendrer les gestes techniques, une légère douleur au point d’injection pendant quelques heures, et une réaction immunitaire pouvant entrainer une baisse d’activité, modification du pelage, perte de poids modérée suivant l’antigène testé.
Devenir
A l’issue des procédures, tous les animaux seront mis à mort pour réaliser les prélèvements nécessaires aux analyses pour évaluer l’efficacité de transfection et d’immunisation post traitement.
Remplacement
Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux pour tester l’effet des composés dans un contexte physiologique. Les méthodes d’études in vitro sont limitées par des éléments importants tels que la complexité des différents organes, leur architecture qui organise les relations entre ces populations cellulaires, ou encore la distribution des formulations dans les organes qui peut être différente selon les voies d’injections testées. Il est donc nécessaire d’évaluer la mise en jeu des différents éléments dans un système complexe comme le modèle murin. Aucun modèle alternatif ne peut remplacer un organisme entier pour ce type de projet.
Réduction
Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, des études in vitro sont réalisées en amont pour valider l’efficacité et l’innocuité des formulations. Seules les formulations les plus efficaces et biocompatibles sont testées in vivo. Le nombre d’animaux pour chaque procédure est fixé au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement fiables, avec une puissance de 80 %, sur la base d’expériences antérieures. La première injection permet de suivre la cinétique d’expression chez le même animal, et la seconde sert au prélèvement des organes, réduisant ainsi le nombre total d’animaux. Pour l’objectif 2, le nombre de candidats est déjà limité et une seule voie d’injection sera choisie en se basant sur les résultats obtenus lors de la première procédure.
Raffinement
Une grille de score clinique, conçue spécifiquement pour cette procédure avec des points de contrôle spécifiques et pertinents, sera tenue à jour pour les animaux en cours d'expérimentation. Si des animaux présentent des signes de souffrance, un analgésique sera administré. Un analgésique local sera appliqué avant les injections intra-musculaires. De l’isoflurane sera utilisé comme anesthésiant pour limiter la douleur du geste réalisé lors des injections en intramusculaire, et permettre un meilleur contrôle de la respiration de la souris lors des injections intranasales. Lors de l’imagerie par bioluminescence, les animaux seront positionnés sur tapis chauffant pour limiter la perte de température corporelle. A chaque utilisation de l’isoflurane, les animaux seront observés jusqu’au réveil complet. Pour les injections intraveineuses, les souris seront mises en chambre chauffée pour augmenter légèrement leur température corporelle et permettre la dilatation des vaisseaux et limiter leur stress. A la suite des injections d’ARNm, de la nourriture humide sera déposée dans le fond des cages pour permettre un meilleur accès à la nourriture et garder une hydratation optimale.
Choix des espèces
La souris sera utilisée comme modèle d’études pour plusieurs raisons : - La génétique de la souris est bien connue, entièrement séquencée et proche de celle de l’être humain. Nous allons être amenés à tester différentes séquences d’ARNm et la machinerie cellulaire qui prend en charge l’ARNm est très similaire entre l’homme et la souris. - Les études menées sur les vaccins à ARNm sont basées sur des études murines. Nous pourrons donc comparer les résultats obtenus avec ceux de nos confrères. - Nous utiliserons des souris Ai9 capables de produire une protéine fluorescente uniquement dans les cellules qui exprimeront les vecteurs contenant une séquence ARNm codant pour la protéine Cre recombinase, ce qui n’existe pas dans d’autres modèles animaux. - La finalité de cette étude est de passer à un stade clinique. La souris est un mammifère qui présente une physiologie comparable à l’espèce humaine, il nous sera plus facile de comparer les réponses immunitaires obtenues et d’étudier la bio-distribution des vecteurs et séquences utilisées. Pour la procédure 1, Nous utiliserons des souris au stade adulte. Elles seront injectées à partir de 8 semaines et jusqu’à 16 semaines afin de garantir un système immunitaire mature et un processus de développement corporel terminé. Pour la procédure 2, les souris seront réceptionnées à l’âge de 5 à 6 semaines. Les injections se feront sur les souris âgées de 7 semaines. En effet, les procédures de vaccination avec deux doses espacées d’un mois sont longues, ce qui justifie de démarrer à un âge jeune, le vieillissement étant connu pour impacter la réponse immunitaire. Cependant, il est important d’attendre 6 semaines minimum pour avoir un système immunitaire mature.
Étude de l’impact d’une neuroinflammation préalable sur les réponses neuro-inflammatoires, neuro-plastiques et fonctionnelles après un traumatisme cervical de la moelle épinière chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une injection destinée à déclencher une inflammation de la moelle épinière, l'autre subit en plus une chirurgie de 45 minutes reproduisant un traumatisme cervical, suivie d'une paralysie transitoire, d'une perte allant jusqu'à 20 % du poids et, pour 1 % des animaux, d'une automutilation de la patte. Le projet veut savoir si une inflammation préalable modifie la récupération après un tel traumatisme. Toutes sont tuées pour prélever la moelle épinière et l'analyser.
Objectifs
Les lésions de la moelle épinière au niveau cervical sont relativement fréquentes chez l’homme, entrainant des problèmes au niveau locomoteur ainsi qu’au niveau du contrôle neural de l’activité respiratoire et cardio-vasculaire, représentant ainsi la première cause de mortalité chez les patients. Une restauration partielle spontanée de l’activité respiratoire, cardiovasculaire ainsi que locomotrice peut être observée après lésion incomplète au niveau cervical, principalement due à une réorganisation des connexions nerveuses restantes. Cette récupération reste modeste et peut être fortement influencée par l’état médical antérieur des individus, notamment lorsqu’une maladie ou un épisode inflammatoire a déjà sollicité le système immunitaire de la moelle épinière. Dans ce cas, la réponse immunitaire à un traumatisme ultérieur ne sera pas la même que chez un individu dont le système immunitaire spinal est sollicité pour la première fois. Il est donc nécessaire d’identifier l’impact d’une atteinte inflammatoire préalable de la moelle épinière sur les processus inflammatoires et plastiques déclenchés à la suite d’un traumatisme de la moelle épinière.
Bénéfices attendus
Les traumatismes cervicaux de la moelle épinière entraînent des déficits respiratoires et cardiovasculaires majeurs, altérant fortement la qualité de vie des patients. Les résultats attendus de ce projet se situent à l’interface entre recherche fondamentale, recherche préclinique et applications cliniques, et visent à améliorer la compréhension des mécanismes qui limitent la réparation du système nerveux après un traumatisme de la moelle épinière. L’identification de ces processus permettra d’approfondir nos connaissances de la physiopathologie des lésions de la moelle épinière et d’orienter le développement de nouvelles approches thérapeutiques ciblant spécifiquement les mécanismes neuroinflammatoires et neuroplastiques impliqués dans la récupération. Un apport majeur de ce projet réside dans la comparaison entre les animaux présentant une neuroinflammation de la moelle épinière préalable et ceux subissant uniquement le traumatisme de la moelle épinière. Les différences attendues dans la réponse inflammatoire et dans les capacités de réparation entre ces groupes mettront en évidence l’importance de l’état immunitaire initial de la moelle épinière. Ces résultats soutiendront l’idée que le passif inflammatoire d’un patient constitue un déterminant crucial de sa trajectoire de récupération et qu’il doit être pris en compte pour optimiser les interventions thérapeutiques. À terme, ce projet contribuera ainsi à promouvoir des stratégies de médecine de précision, mieux adaptées au profil de chaque patient et potentiellement plus efficaces pour améliorer les fonctions perdues.
Procédures
Les animaux seront soumis à l’une des deux procédures. Une partie des animaux recevront une injection d’un composé permettant d’induire une neuroinflammation. Différentes concentrations de ce composé seront testés afin de déterminer la concentration permettant d’induire une neuroinflammation spinale significative chez nos animaux, sans induire de phénotype pathologique délétère. Cette concentration sera déterminée dans cette procédure grâce à des tests comportementaux (maximum 2 par animal, d’une dizaine de minutes chacun), ainsi que des évaluations fonctionnelles neuromusculaires (force de contraction et excitabilité neuromusculaire, durant une dizaine de minutes chacune). L'autre partie des animaux seront injectés avec le composé à la concentration déterminée précedemment, puis recevront une chirurgie sous anesthésie générale (chirurgie durant environ 45 minutes), permettant de créer le modèle préclinique de trauma de la moelle épinière cervicale, afin de mimer la pathologie humaine. Ces animaux seront ensuite eux aussi soumis à des tests comportementaux et fonctionnels.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues ou effets indésirables pouvant être attendus sur les animaux sont : - Stress et douleur potentiellement induits par l’administration en intra-péritonéal du composé testé sur souris vigile en contention. - Paralysie transitoire des pattes avant et arrière du côté lésé suite à la lésion de la moelle épinière cervicale. Cette paralysie est transitoire et disparaît en l’espace d’une semaine, permettant à l’animal de retrouver une locomotion comparable à celle observée avant la lésion spinale. - Perte de poids jusqu’à 20% du poids initial durant la première semaine après lésion de la moelle épinière cervicale. - Autophagie de la patte arrière contralatérale à la lésion spinale (1% des animaux).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole, et les tissus récupérés pour être utilisés dans des analyses tissulaires, cellulaires et moléculaires
Remplacement
À l’heure actuelle, il n’existe aucun modèle expérimental permettant d’étudier de manière pertinente et intégrée les réponses physiologiques complexes autrement qu’à travers des organismes vivants. Les connectivités neuronales et les interactions neuro-immunitaires impliquées dans ces processus ne peuvent être reproduites ni par des modèles in vitro, ni par des approches in silico. De plus, les manipulations nécessaires à l’étude de ces mécanismes, telles que l’intervention sur certains systèmes de neurotransmission ou les analyses neurochimiques en conditions physiologiques, ne peuvent pas être réalisées chez l’être humain. En l’absence d’alternative scientifiquement valable, l’utilisation de modèles animaux demeure indispensable pour répondre aux objectifs du projet.
Réduction
L’étude repose sur l’analyse de l’influence d’un état inflammatoire spinal préexistant sur la récupération fonctionnelle après une lésion cervicale incomplète de la moelle épinière, un concept encore peu exploré nécessitant une approche intégrative in vivo. Le protocole expérimental a été spécifiquement conçu afin de limiter le nombre d’animaux au strict nécessaire, en s’appuyant sur les données déjà disponibles dans la littérature et sur l’expertise du laboratoire concernant la physiopathologie des lésions de la moelle épinière cervicales. Ces connaissances ont permis de définir précisément le niveau et la sévérité de la lésion, ainsi que les fenêtres temporelles d’analyse, afin de réduire la variabilité interindividuelle et d’éviter toute répétition expérimentale non justifiée. Par ailleurs, les mêmes animaux sont suivis longitudinalement pour l’évaluation des paramètres comportementaux et respiratoires, ce qui permet de maximiser la quantité de données obtenues par individu et de réduire le nombre total d’animaux requis tout en garantissant la robustesse statistique de l’étude.
Raffinement
L’ensemble des procédures expérimentales a été élaboré afin de minimiser la contrainte imposée aux animaux et de préserver leur bien-être tout au long de l’étude. Le choix d’un modèle de lésion cervicale incomplète de la moelle épinière permet d’induire des déficits fonctionnels pouvant être compensés physiologiquement chez les animaux, évitant ainsi des atteintes sévères et prolongées. Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale, associée à une analgésie péri- et post-opératoire adaptée, et les paramètres opératoires ont été optimisés sur la base de l’expérience du laboratoire afin de limiter la durée de la chirurgie et les manipulations. Le suivi fonctionnel repose majoritairement sur des évaluations comportementales et respiratoires non-invasives, réalisées chez les mêmes animaux au cours du temps, ce qui permet de limiter les manipulations et d’éviter des procédures supplémentaires. Enfin, l’état clinique des animaux est surveillé quotidiennement après la lésion de la moelle épinière, et les conditions d’hébergement et de manipulation sont adaptées afin de réduire le stress, favoriser la récupération fonctionnelle et assurer une prise en charge individualisée, conformément aux principes de raffinement. Des tissus de moelle épinière seront de plus récupéré après mise à mort des animaux afin poursuivre en profondeur cette étude par des expérimentations moléculaires et cellulaires.
Choix des espèces
Nous utilisons cette espèce pour plusieurs raisons : 1) Plusieurs élevages de souris de laboratoires sont disponibles 2) Grâce à leur petite taille et leur cycle de vie court, les conditions environnementales peuvent être contrôlées de la naissance à l’âge adulte 3) Les souris constituent un modèle reproductible d’étude de la neurobiologie respiratoire et cardiovasculaire 4) Les souris ont un taux de mortalité faible (moins de 2%) suite à une lésion médullaire cervicale 5) Les souris présentent une récupération motrice très rapide suite à une lésion médullaire cervicale 6) Un des aspects clés du programme de recherche concerne les voies nerveuses phréniques croisées (voies respiratoires), données publiées dans la littérature 7) Les souris et les humains partagent plusieurs caractéristiques communes dans le contrôle du système respiratoire et cardiovasculaire, ce qui en fait un bon modèle préclinique. Les animaux utilisés seront des souris jeunes adultes (âgées de 8-12 semaines) afin de s’affranchir de toutes incidences liées au développement de l’individu. La nécessité d’avoir un sujet adulte s’avère indispensable afin d’étudier de manière précise les effets de potentielles futures stratégies réparatrices qui pourront être appliquées sur des patients humains adultes.
Production d’anticorps chez le lama immunisé (lama glama) – MODIFICATION
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies des plantes
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Jusqu'à huit épisodes d'injections d'antigènes et d'adjuvant, une prise de sang finale de cinq à dix minutes dans un couloir de contention avec licol et sangles sous-ventrières, et pour les meilleurs répondeurs jusqu'à trois campagnes supplémentaires espacées de six mois. 375 lamas vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous gardés vivants, 200 restant à l'élevage comme reproductrices et 175 placés chez des détenteurs qualifiés. Les anticorps polyclonaux obtenus sont produits à la demande de clients, un anticorps monoclonal étant ensuite sélectionné pour son potentiel thérapeutique. Le porteur affirme qu'il est "indispensable", "du moins pour le moment", de passer par le système immunitaire d'animaux, les banques d'anticorps synthétiques demandant selon lui encore une dizaine d'années de recherche.
Objectifs
MODIFICATION : L’objectif de ce projet est de produire des anticorps polyclonaux à usage thérapeutique. Les anticorps polyclonaux ont plusieurs cibles sur l'antigène, tandis que les anticorps monoclonaux n'en ciblent qu'une seule. Après plusieurs étapes de sélection, un anticorps monoclonal sera sélectionné parmi la masse d’anticorps polyclonaux sur la base de son potentiel thérapeutique, par example le traitement de maladies inflammatoires comme la myasthénie grave. Les anticorps polyclonaux sont obtenus par immunisations de lamas, car les anticorps du lama ont une structure très proches des anticorps humains, ce qui pourrait de fait limiter les risques de rejet thérapeutique chez l’homme et accélérer le développement pré-clinique. En outre le système immunitaire exceptionnellement robuste des lamas réagit en créant une palette très riche d’anticorps lors d’une stimulation spécifique. Le lama ne sera pas utilisé pour la production en masse du produit thérapeutique, mais celle-ci se fera en laboratoire. L’objectif de ce projet est donc de produire des anticorps à la demande de clients (prestation de services) à but thérapeutique dans le cadre des recherches translationnelles ou appliquées réalisées par ceux-ci. La recherche translationnelle (ou recherche de transfert) se situe entre la recherche fondamentale, dont le travail consiste à comprendre les mécanismes à l’origine du développement d’un cancer par example, et la recherche clinique (ou appliquée) qui vise à évaluer l’efficacité et thérapeutique dans des champs d’application aussi variés que: La prévention, la prophylaxie, le diagnostic ou le traitement de maladies, de mauvais états de santé ou d’autres anomalies, ou de leurs effets chez l’homme, les animaux ou les plantes. L’évaluation, la détection, le contrôle ou les modifications des conditions physiologiques chez l’homme, les animaux ou les plantes. Le bien-être des animaux et l’amélioration des conditions de production des animaux élevés à des fins agronomiques. La protection de l’environnement naturel dans l’intérêt de la santé ou du bien-être de l’homme ou de l’animal. MODIFICATION : L’objectif additionnel améliore l’affinité et augmente la réactivité croisée des anticorps candidats grâce à la réutilisation des animaux les plus réactifs pour entre une à trois immunisations supplémentaires (rappel utilisant un déterminant antigénique éprouvé ou un changement d’antigène) après un délai minimal de six mois entre chaque procédure.
Bénéfices attendus
MODIFICATION: Les lamas produisent 2 types d'anticorps : les anticorps à chaînes lourdes et les anticorps conventionnels. Les anticorps conventionnels sont très similaires aux anticorps humains. Ceci est très important car les anticorps seront utilisés comme médicament chez des patients. Plus les anticorps ressemblent à l'humain, moins il y a de réactions contre ces anticorps et donc moins d’effets secondaires indésirables apparaissent. Les anticorps à chaîne lourde ne se trouvent que dans les camélidés (lamas, alpagas) et possèdent des propriétés uniques. Ils sont particulièrement petits, ce qui leur permet de pénétrer des tissus autrement impénétrables (barrière sang/cerveau) et de plus elles résistent à des environnements hautement acides ou des températures élevées. Leurs qualités se sont avérées très utiles pour diverses applications biotechnologiques. A terme, cela conduira à la mise au point de médicaments contre de nombreuses maladies graves, telles que des cancers et les maladies auto-immunes. Chaque immunisation a pour but d’augmenter la réponse immunitaire et d’accroitre l’affinité des anticorps générés par le lama pour obtenir une grande variété de candidats anticorps à portée thérapeutique. Plus le nombre de candidats est élevé, plus la chance d’avoir un anticorps efficace en clinique dans une maladie donnée est élevée. MODIFICATION : Les immunisations supplémentaires (au maximum 3) accroissent la probabilité d’obtenir des anticorps de plus forte affinité et/ou à réactivité croisée vers des gènes communs à différents espèces et réagissant spécifiquement entre eux. Ceci permet des programmes non cliniques plus efficaces tout en épargnant des espèces supérieures. Les comparaisons intra-individuelles réduisent la variabilité et diminuent le nombre d’animaux requis.
Procédures
MODIFICATION - Au jour 0, un prélèvement de sang non-encore immunisé est prélevé du lama (durée du geste 1 à 2 minutes), après quoi l'animal reçoit immédiatement la ou les injections d’immunisation qui prennent quelques secondes. La quantité totale injectée ne dépassera pas les 4ml. L'injection du cocktail d'antigènes et de l'adjuvant est effectuée 1x/semaine ou à des intervalles de temps plus longs (2 semaines, ou jusqu’à 4 semaines dans de rares projets pour lesquels le nombre d’injections sera alors réduit à 3), répétée généralement 6 fois, rarement jusqu’à un maximum de 8 épisodes d’injections. Un prélèvement sanguin unique (1 à 2 minutes) ou à intervalles réguliers (2-4 semaines) pendant les séquences de « vaccination » pourra permettre d’évaluer la réponse immunitaire avant la fin de la procédure. Dans un délai de 4 à 14 jours après la dernière injection d'antigène, un prélèvement de sang sera réalisé en bas du cou. La prise de sang finale dure 5 à 10 minutes pendant lesquelles l'animal sera immobilisé dans un couloir de contention à l'aide d'un licol et de sangles sous-ventrières. Tous les gestes sont réalisés sur animal vigile. MODIFICATION - Les lamas ayant produit les meilleures réactions à la première immunisation pourront être utilisés pour 1 à 3 campagnes supplémentaires maximum (après un délai de repos d’au moins six mois entre chacune d'elles), suivant un protocole similaire à la première immunisation (prélèvements décrits ci-dessus). Ceci pour créer premièrement des réactions croisées améliorant les anticorps identifiés pendant la première campagne, en se concentrant sur les parties de la protéine qui importent le plus, afin d’augmenter leur efficacité. Le deuxième but est de trouver des anticorps capables de réagir avec différentes espèces afin de développer des traitements tout en réduisant l’utilisation d’espèces supérieures, conformément au principe du bien-être animal.
Impact sur les animaux
L’utilisation d'un adjuvant lors des immunisations peut provoquer une réponse inflammatoire locale classique, accompagnée d'un gonflement. Comme pour toute vaccination, un épisode de fièvre peut survenir accompagnant cette inflammation. Les injections peuvent provoquer des douleurs aiguës transitoires (selon le produit injecté), ainsi qu’un inconfort dû à la contention légère nécessaire à la réalisation des gestes, un bras autour du cou pour quelques secondes. Même s’il peut y avoir un risque théorique de choc anaphylactique par l’utilisation d’un cocktail antigénique, il est finalement quasi nul, car les antigènes utilisés (protéines ou séquences ADN humaines) n'ont rien en commun avec le lama. Les prises de sang finales nécessitent une immobilisation plus longue, source d’un inconfort, voire d’un stress de 10 à 15 minutes, d’intensité et de durée variable selon les individus.
Devenir
Les femelles resteront en grande partie à l'élevage en tant que reproductrices, les mâles et les autres femelles seront placés chez des détenteurs qualifiés. Ceci après inspection par notre vétérinaire sanitaire en vue de leur état de santé et de leur socialisation.
Remplacement
Il est indispensable, du moins pour le moment, d’obtenir les anticorps polyclonaux en utilisant le système immunitaire d’animaux (in vivo). En effet, les techniques pour produire des anticorps à partir de librairies d’anticorps synthétisées (in vitro) ne sont pas encore au point et leur utilité est limitée à un nombre de domaines restreint (certains experts estiment qu’il faudrait au moins encore une dizaine d’années de recherches pour améliorer leurs capacités même dans ceux-ci). Elles génèrent des anticorps de moins bonne qualité car nous sommes encore loin de la complexité et de l’efficacité des anticorps obtenus via le système immunitaire des mammifères (ou même des humains dans le cas du covid), qui a évolué sur des millions d’années. De produire des anticorps à l’aide d’animaux fait usage d’une série de processus naturels améliorant, entre autres, leur capacité de se lier aux molécules de la maladie. Ceci car l’organisme animal est capable de sélectionner l’anticorps le mieux à même de se lier à une cible spécifique parmi mille milliards d’anticorps à l’aide un processus hautement complex, impossible à réaliser in vitro. Ce processus est déclenché par le démarrage de la réponse immunitaire de l’animal. La plus efficace des techniques in vitro arrive à gérer dix milliards. Étant donné que les anticorps des camélidés sont structurellement très proches des anticorps humains, il n'y aura que des modifications minimes qui seront nécessaires pour convertir les anticorps de lamas en anticorps pleinement tolérés par le système immunitaire humain. Ces qualités rendent les petits camélidés uniques. Les anticorps polyclonaux obtenus par immunisations de lamas sont la base pour les anticorps thérapeutiques sélectionnés (monoclonaux) qui seront séquencés et produits en masse en laboratoire (in vitro) sans utilisation d'animaux. Les anticorps prennent une place de plus en plus importante dans la recherche et les thérapeutiques humaines et vétérinaires, voir même agricoles. Nous avons donc besoin d’anticorps de la plus haute qualité. Naturellement les conditions dans lesquelles ces immunisations sont réalisés doivent obligatoirement se faire sous les meilleures conditions, afin d’éviter toutes souffrances inutiles aux animaux.
Réduction
MODIFICATION: En utilisant des cocktails de différents antigènes cibles, sous forme de protéine purifiée par exemple, le nombre d'animaux dans les essais est fortement réduit, tout en préservant le rendement expérimental. Nous visons une compatibilité suffisante des différentes protéines pour maximiser le nombre de cibles dans le cocktail. En outre le système immunitaire exceptionnellement robuste des lamas réagit en créant une palette très riche d’anticorps lors de chaque stimulation spécifique. Pour chaque expérience d’immunisation ciblée, 2 à 4 animaux maximum seront utilisés, car un individu seul pourrait produire des réactions atypiques ou non-concluantes. Le nombre d'animaux est basé sur les résultats des expériences précédentes. Des lamas non consanguins sont utilisés; donc des lamas qui sont génétiquement éloignés les uns des autres, ce qui rend leurs systèmes immunitaires plus efficaces. MODIFICATION : L’utilisation continue d’animaux présentant une forte réponse immunitaire réduit la nécessité de constituer de nouveaux groupes d'animaux naïfs pour des objectifs similaires, diminuant ainsi le nombre total d’animaux utilisés.
Raffinement
MODIFICATION: Toutes nos installations sont conçues pour permettre aux lamas de vivre de sorte que soient respectés le mieux possible leurs besoins physiologiques et comportementaux. Les animaux sont logés en groupes sociaux stables, formés d’individus compatibles. Nous élevons des animaux de pâturage et les hébergeons sur nos 30 hectares de prairies permanentes et de bois. Dans le cours des soins de routine, nos lamas sont régulièrement manipulés. Traitements vermifuges par injections sous-cutanées et par solutions administrées oralement, tous les trois mois (Moxidectine, Praziquantel, Fenbendazol). Prises de sang pour les analyses de santé, tonte, coupe des ongles etc. La tonte annuelle étant l’intervention la plus stressante dans ce cadre, mais entièrement réalisée pour le confort des lamas, nous ne commercialisons pas la laine. Ces interventions ont comme effet collatéral d’habituer les animaux aux interventions humaines, ce qui nous permet de limiter le stress ou l’inconfort liés aux gestes d’injection ou de prélèvements sanguins répétés. Comme nos lamas sont destinés à une utilisation en tant qu’animaux de loisirs et de bât, voir de médiation animale, ils suivent également un entrainement à la longe. Nous sélectionnons nos lignées depuis plus de 30 ans selon des critères d’anatomie, de laine, de couleur, mais avant tout de caractère. Même dans ces conditions il y a toujours des individus plus sensibles que d’autres, qui auront droit à des séances d’éducation complémentaires. Nos interventions durant les procédures expérimentales prévues ne dépassent pas le cadre de ce qu’ils sont habitués à subir pour leurs soins courants et sont réalisés sur des animaux vigiles. L’impact léger de ces procédures ne donne pas lieu à prévoir des points limites, ni de traitements antalgiques. Naturellement les animaux peuvent avoir un problème de santé sans relation avec la procédure durant celle-ci, en quel cas la vétérinaire les traitera selon leurs symptômes et décidera, en consultation avec le donneur d’ordre, s’ils doivent être retirés de la procédure. Les gestes réalisés sont de nature à ne provoquer qu’un inconfort voire du stress sur les animaux les plus sensibles au contact, malgré les séances d’habituation lors des soins quotidiens. MODIFICATION : Un intervalle minimal de six mois entre deux nouvelles campagnes d’immunisation est systématiquement respecté.
Choix des espèces
Les lamas produisent 2 types d'anticorps : les anticorps à chaînes lourdes et les anticorps conventionnels. Les anticorps conventionnels sont très similaires aux anticorps humains. Ceci est très important car les anticorps seront utilisés comme médicament chez les patients. Plus les anticorps ressemblent à l'humain, moins il y a de réactions contre ces anticorps et donc moins d’effets secondaires indésirables apparaissent. Les anticorps à chaîne lourde ne se trouvent que dans les camélidés (lamas, alpagas) et possèdent des propriétés uniques telles que leur taille et leur stabilité. Leur spécificité et leur sélectivité se sont avérés très utiles pour diverses applications biotechnologiques. A terme, cela conduira à la mise au point de médicaments contre diverses maladies graves, telles que des cancers et les maladies auto-immunes. Les lamas âgés de plus de 9 mois, mâles ou femelles, sont utilisés parce qu'ils ont un système immunitaire mature et que leur poids permet des prélèvements de sang adaptés à leur volume sanguin. Les lamas âgés de plus de 9 mois, mâles ou femelles, sont utilisés parce qu'ils ont un système immunitaire mature et que leur poids permet des prélèvements de sang adaptés à leur volume sanguin, c’est à dire 250ml pour les lamas de moins de 100kg et entre 250 et 400ml pour les individus plus lourds. Nos clients potentiels nous indiquent que 250ml pourraient désormais être la norme et que le maximum de 400ml sera normalement abandonné, ce qui constituerait un raffinement de la procédure.