Système respiratoire
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système urogénital
Chirurgies d’implantation de dispositifs permettant la diffusion de substances ou le suivi de paramètres biologiques chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
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- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Rats : 2500
5 500 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Ils subissent une chirurgie d'implantation, sous la peau ou dans l'abdomen, d'un dispositif diffusant des substances ou mesurant des paramètres biologiques, avec jusqu'à quatre prélèvements sanguins par jour, puis sont expédiés vivants aux chercheurs ou tués en cas d'atteinte d'un point limite ou pour contrôle qualité. Le porteur produit ces modèles implantés pour la communauté scientifique et revendique qu'ils réduisent le stress lié aux manipulations répétées. Il prévoit des animaux surnuméraires liés au taux d'échec des chirurgies et admet un "phénotype dommageable" possible selon les besoins du projet.
Objectifs
L’objectif du projet est de permettre la production et la mise à disposition pour la communauté scientifique des modèles de rongeurs équipés de manière permanente (par technique chirurgicale) d’implants sous la peau ou dans l’abdomen permettant soit la libération de substances (comme des médicaments ou des hormones) de manière répétée ou continue, soit la mesure de paramètres biologiques (comme l’activité cérébrale, musculaire ou cardiaque ou la mesure de la tension).
Bénéfices attendus
L’utilisation de modèles implantés permet l’administration répétée ou continue de substances d’intérêts (comme des médicaments ou des hormones) ou la mesure et le suivi de paramètres biologiques (comme l’activité cérébrale, musculaire ou cardiaque ou la mesure de la tension) chez l’animal sans la moindre manipulation de la part du chercheur et sans anesthésie. Cela permet donc la réduction très importante du stress provoqué chez l’animal par des manipulations répétées. Ces administrations et mesures pourront permettre à la communauté scientifique d’augmenter leurs connaissances et leurs compréhensions sur différents domaines de recherche (maladies cardiaques, maladies du cerveau, hypertension, cancer, infertilité, …) tout en réduisant les nuisances posssibles sur l’animal.
Procédures
Tous les animaux dans le cadre de ce projet seront soumis à une procédure chirurgicale unique d’une durée d’une demi-heure à une heure sous anesthésie générale et à la mise en place d’un matériel implanté. Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis à des prélèvements sanguins (maximum 4 prélèvements sanguins par jour). Les actes de prélèvements et d’injection ont une durée d’une dizaine de secondes à une minute. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux font suite à la mise en place de l’implant suite à la chirurgie : douleur, stress et perte de poids possible chez tous les animaux dus aux contentions, aux procédures chirurgicales, à la présence du matériel implanté. Hébergement individuel possible jusqu’à une semaine.
Devenir
Les animaux sont expédiés chez les scientifiques ou sont mis à mort dans le cas d’atteinte d’un point limite ou pour contrôle qualité du modèle.
Remplacement
La production de modèles implantés a pour objectif de mettre à disposition des modèles rongeurs implantés prêts à l’emploi pour les scientifiques. Les animaux opérés sont intégrés dans des programmes de recherche ou d’études précliniques. Ces programmes visent à étudier les réactions des organes ou du comportement des individus face à une substance ou un stimulus. Cela entraîne de nombreux mécanismes différents et implique de nombreux organes. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels programmes sur des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires est défini par le scientifique. Il est possible que des animaux surnuméraires doivent être utilisés de par les contraintes du modèle, ce nombre étant basé sur les taux de réussite connus et attendus des modèles. La réduction de ces animaux surnuméraires repose sur : l'expertise de l’équipe chirurgie et la maitrise des procédures, les locaux adaptés, les données historiques, l’observation de l’état clinique de l’animal en péri-opératoire afin d’adapter les traitements post-opératoires et de diminuer la mortalité éventuelle. Le nombre d’animaux surnuméraires utilisés dans chaque procédure est déterminé au cas par cas, en fonction du degré de difficulté du modèle, du taux de succès de la chirurgie, du nombre d’animaux à opérer, de la souche, du sexe et de la provenance.
Raffinement
Les implantations permettent le suivi de paramètres biologiques ou l’administration de substances en continu sans intervention humaine ce qui permet une réduction très importante pour l’animal du stress provoqué par des manipulations répétées. Le contrôle de la douleur est réalisé par une administration appropriée d’analgésique et/ou d’anesthésie locale, sous le contrôle d’un vétérinaire. Une réhydratation est pratiquée pour tous les animaux au réveil. Une habituation par la manipulation positive des animaux peut être effectuée dès la phase d’acclimatation. Une observation quotidienne de l’état clinique général des animaux est réalisée tout au long de la procédure. Des soins spécifiques sont apportés en cas de signes cliniques. En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort. Des points limites spécifiques sont établis et raffinés au fur et à mesure des observations. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score et document qualité d’enregistrement permettant une traçabilité.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce et de la souche est très généralement effectué par le scientifique. Le rat et la souris sont des animaux couramment utilisés dans ce type de projet. Ce sont des mammifères dont l’anatomie et la physiologie sont proches de l’homme, la disponibilité de données historiques chez ces espèces permet d’obtenir des informations fiables et pertinentes. Sont concernés ici que les animaux sevrés à partir de 3 semaines, dont la taille et le poids sont compatibles avec la pose du matériel implanté, selon les recommandations éthiques en vigueur et les recommandations du fournisseur.
Toxicité vasculaire pulmonaire du busulfan et des inhibiteurs du protéasome
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système respiratoire
168 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent des injections hebdomadaires de busulfan et d'inhibiteurs du protéasome, des anticancéreux, sont suivis par échocardiographie sous anesthésie, puis subissent un cathétérisme cardiaque terminal avant prélèvement du cœur et des poumons, pour étudier une hypertension artérielle pulmonaire d'origine médicamenteuse. Le porteur décrit des effets fonctionnels faibles et une "dyspnée légère" tout en classant les procédures en gravité sévère. Il qualifie le modèle chez le rat d'"incontournable" et le recours aux animaux d'"indispensable", tout en menant des expériences parallèles sur cellules humaines.
Objectifs
L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie mortelle affectant l’arbre vasculaire pulmonaire. L’HTAP peut se développer sans cause connue (HTAP idiopathique) ou peut être secondaire à des médicaments ou des toxiques (HTAP iatrogène). La liste des médicaments ou toxiques est constamment mise à jour et classifie les substances comme définitivement ou possiblement associées à de l’HTAP. Parmi ces substances le busulfan en tant qu’agent alkylant est classé comme potentiellement associés à l’HTAP et les inhibiteurs du protéasome (IP), le bortezomib et le carfilzomib n’ont pas été étudiés. Notre équipe a récemment identifié un signal fort provenant de ces molécules (travaux en cours de publication). Elles sont utilisées pour des pathologies hématologiques, notamment le myélome, et dans les conditionnements pré greffe de moelle. Les mécanismes entraînant le développement de l’HTAP après exposition à ces médicaments n’ont pas été étudiés. Les meilleurs modèles existant d’HTAP sont des modèles développés chez le rat, et miment parfaitement les caractéristiques hémodynamiques et morphologiques principales de la maladie humaine. C’est pourquoi créer des modèles d’HTAP iatrogène chez le rat est incontournable pour étudier l’effet de ces drogues sur le système cardiopulmonaire des malades. Il est en effet crucial de vérifier que ces drogues n’ont pas d’effets indésirables notamment sur le cœur et les poumons de ces animaux, qui sont très impactés par l’HTAP. Toutes les procédures seront pratiquées en utilisant des anesthésiques et des antalgiques. La pratique répétée d’échocardiographie nous permettra d’étudier la fonction cardiovasculaire de manière non invasive et de limiter le nombre d’animaux. L’utilisation simultanée des inhibiteurs du protéasome associée au busulfan nous permet d’une part de reproduire de manière fidèle les traitements reçus par les patients mais aussi de limiter le nombre d’animaux. Après traitement, un cathétérisme cardiaque et l'euthanasie seront réalisés sous anesthésie générale, suivi du prélèvement des tissus . Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s’assurer que les animaux ne subissent aucun stress. Le nombre total de rats utilisés sera de 168 sur l’ensemble de l’étude en combinant plusieurs approches expérimentales par différents expérimentateurs sur le même animal.
Bénéfices attendus
L’HTAP est une cause de handicap, d’insuffisance cardiaque et de mort. Au vu de l’absence d’identification des mécanismes expliquant le développement de l’HTAP chez les patients exposés à ces médicaments, ce projet présente une utilité majeure dans la prise en charge des patients.
Procédures
Chaque animal sera soumis à une échocardiographie hebdomadaire, sous anesthésie générale et 1 à 2 injections sous cutanées hebdomadaires sous anesthésie générale. Le projet soumis prévoit de sacrifier les animaux au bout de 6 semaines. Cependant, les échocardiographies hebdomadaires permettront de suivre l’évolution des paramètres cardiovasculaires des animaux et d’adapter si nécessaire la durée du protocole (diminution ou augmentation du nombre de semaines de suivi). A la fin du protocole les animaux seront soumis à un cathétérisme cardiaque droit, sous anesthésie générale. L'échocardiographie se fera de paire avec la 2ème injection le cas échéant, cette manipulation durera 10 minutes. Les injections se faisant en intrapéritonéale dureront moins de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Induction d'une toxicité vasculaire pulmonaire n'entrainant pas ou peu de retentissement fonctionnel. Possible dyspnée légère.
Devenir
Après réalisation du cathétérisme les organes d'intérêt que sont le coeur et les poumons vont être prélevés, leurs études sont indispensables à la compréhension des mécanismes sous-jacents au développement de l'HTAP.
Remplacement
L'objectif de recherche est d'étudier et comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de l'hypertension artérielle pulmonaire après exposition médicamenteuse. Le recours à des animaux est indispensable et se justifie par la nécessité d'étudier la fonction ventriculaire droite, la réactivité vasculaire, l'histologie pulmonaire dans un contexte physiologique et pathologique. Ce projet se justifie également par l'impossibilité de simuler ex vivo la mise en place d'une HTAP puis d'une insuffisance cardiaque droite chez l'humain qui est un processus multifactoriel complexe. Cependant, autant que faire se peut, les expériences se feront parallèlement sur cellules vasculaires pulmonaires humaines afin de limiter au maximum le recours aux animaux. Ces cellules primaires sont générées dans notre hopital, référent en ile de france de la transplantation pulmonaire des patients souffrant d'HTAP.
Réduction
La surveillance échocardiographique hebdomadaire permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés au travers d’études longitudinales où chaque animal devient son propre contrôle. Afin de réduire encore le nombre d'animaux utilisés, les animaux sont mis à mort en fin d'expérimentation après le cathétérisme permettant d'évaluer leur fonction cardiaque et les tissus prélevés seront partagés. Des expériences de biochimie et biologie moléculaire à partir des différents tissus collectés et des études sur cellules isolées seront effectuées. Les calculs de puissance ont été faits en amont de la manipulation pour réduire au maximum le nombre d'animaux inclus dans l'étude et les tests statistiques ad hoc seront utilisés pour analyser les résultats et identifier les différences attendues le cas échéant.
Raffinement
Toutes les procédures seront pratiquées en utilisant des anesthésiques et des antalgiques. Certaines expériences pourront être réalisées sur tissus pulmonaires solés. A la fin des expérimentations, les animaux seront euthanasiés pour prélèvement d'organes. De l'enrichissement sera ajouté dans les cages d'animaux. Ceux-ci seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux ne subissent aucun stress. Des points limites spécifiques ont également été mis en place. Les échographies de suivi prévues dans la procédure permettent de suivre le stade de l’insuffisance cardiaque qui peut survenir dans l'HTAP et de décider de l'euthanasie des rats avec une fonction cardiaque altérée.
Choix des espèces
Les rats sont des modèles standards de maladies cardiovasculaires. Ils présentent une anatomie vasculaire pulmonaire et des caractéristiques hémodynamiques semblables à celle de l'homme. Notre équipe travaille en routine avec des modèles murins d'hypertension artérielle pulmonaire, nous avons donc l'expérience et le matériel adapté pour travailler avec le rat. Nous allons travailler avec des rats de souches Wistar. Les animaux utilisés sont de jeunes rats (6 à 8 semaines, 100 g), l'induction de l'HTAP est connue pour être plus sévère à cet âge où le système vasculaire pulmonaire est en croissance.
Validation d’un modèle de survie d’infection pulmonaire à Pseudomonas aeruginosa dans un modèle murin et mise en pratique
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
200 souris vont être utilisées, dont 170 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, dans un modèle conçu pour tuer 80 à 100 % des animaux en sept jours. La bactérie Pseudomonas aeruginosa est instillée dans le nez sous anesthésie pour provoquer une infection pulmonaire mortelle, les survivants étant ensuite mis à mort, afin de tester une bactérie présentée comme probiotique. Le porteur décrit une perte de poids, une douleur et une mobilité réduite s'aggravant sur sept jours jusqu'à la mort ou l'atteinte d'un point limite. Il choisit de réduire ou supprimer certains groupes témoins et affirme qu'aucun modèle in vitro ne conclut sur la survie à une infection pulmonaire.
Objectifs
Pseudomonas aeruginosa est une bactérie responsable d’infection pulmonaire grave chez les patients atteints de mucoviscidose et chez les patients en réanimation. Cette bactérie, au gré de successives antibiothérapies, devient résistante à tous les antibiotiques habituellement utilisés. Aussi il est capital de rechercher des alternatives thérapeutiques aux antibiotiques comme les probiotiques. Les probiotiques sont des microorganismes qui, administrés en quantités adéquates, confèrent un bénéfice à la santé de l’hôte. Dans l’objectif de tester de potentiels bactéries probiotiques actuellement en développement au laboratoire, et ayant une action protectrice vis-à-vis de l’infection pulmonaire à Pseudomonas aeruginosa, il est nécessaire de développer et de valider un modèle de survie à l’infection à Pseudomonas aeruginosa dans un modèle murin puis de le mettre en pratique. Objectif 1 : mettre au point et valider un schéma expérimental qui permet, après infection pulmonaire par Pseudomonas aeruginosa, d’obtenir une mortalité comprise entre 80% et 100% des animaux sur une période de suivi de 7 jours après inoculation de la bactérie pathogène. Objectif 2 : mise en pratique du modèle avec les conditions validés lors de l’objectif 1 sur une bactérie probiotique potentielle (Porphyromonas catoniae)
Bénéfices attendus
Bénéfices de l’objectif 1 : La réalisation de cet objectif permettra de valider un modèle de survie de l’infection pulmonaire à Pseudomonas aeruginosa qui sera utilisé ensuite pour tester plusieurs probiotiques potentiels, voir dans plusieurs projets à venir, et donc de limiter l’utilisation future d’animaux pour des mises aux points. Bénéfices de l’objectif 2 : La réalisation de ce projet permettra de recueillir des données sur l’intérêt de l’utilisation de souches cliniques de Porphyromonas comme potentielles bactéries bénéfiques (probiotiques) à visée anti-Pseudomonas aeruginosa, pathogène clé de plusieurs pathologies respiratoires humaines étant à l’origine d’infections pulmonaires notamment dans la mucoviscidose.
Procédures
Les animaux recevront du sérum physiologique ou un probiotique potentiel puis une suspension bactérienne par instillation nasale à 18h d’écart sous anesthésie gazeuse. A la suite de quoi, soit une mise à mort est réalisée à 24h pour confirmer l’infection, soit un suivi sera réalisé sur 7 jours.
Impact sur les animaux
Ce projet peut induire un stress chez les animaux notamment : -Préhension de l’animal : intensité faible, durée environ 1 min -Sédation par anesthésie gazeuse : intensité faible, durée entre 30 et 60 secondes -Pertes de poids, douleur et mobilité réduite voire, une inactivité après début de l’infection pulmonaire : intensité progressive avec l’évolution de l’infection, durée 7 jours maximum ou mise à mort si point limite atteint -Les pesées des animaux : intensité faible, durée environ 1 min
Devenir
Les 200 souris C57BL/6 mâles sont euthanasiées à l’issu du suivi de 7 jours ou des 24h.
Remplacement
Nous souhaitons observer dans cette demande un pourcentage de survie d’animaux à une infection pulmonaire causée par la bactérie Pseudomonas aeruginosa. Les modèles cellulaires et/ou autres modèles in vitro ne permettent pas à ce jour de conclure sur la survie d’un animal à une infection pulmonaire. Pour cette raison, nous faisons le choix de conserver le modèle animal.
Réduction
Pour la phase 1 : l’analyse de la survie sera réalisée par comparaison du pourcentage de la survie au 7eme jour. Le nombre de souris nécessaire par groupe est de 10 souris (dont 5 mâles et 5 femelles) afin d’obtenir des résultats pertinent scientifiquement, non biaisés par le sexe. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous choisissons de ne pas réaliser de groupe contrôle (animaux recevant uniquement du serum physiologique) car aucune mortalité n’est attendue avec la présente méthode d’instillation. Pour la phase 2 : L’analyse de la survie sera réalisée par comparaison du pourcentage de survie au 7eme jour. Dans l’hypothèse d’une mortalité de 100% dans le groupe des souris infectées par Pseudomonas aeruginosa (souche PA01) et d’une mortalité de 60% dans le groupe des souris ayant reçu une administration prophylactique de Porphyromonas cationae clinique (PC 103) et infectées par PA01 (Groupe PC 103+PA 01) ; le nombre de souris nécessaire par groupe est de 20 souris (nombre défini statistiquement). Afin de réduire le nombre d’animaux, nous choisissons de limiter le groupe contrôle (Sérum physiologique) à 10 souris car nous n’attendons pas de mortalités. Le nombre total de souris sera donc de (3*20) + (1*10) soit 70 souris. Par ailleurs, nous nous limitons à une seule souche de Porphyromonas alors que plusieurs espèces sont décrites dans le poumon.
Raffinement
Avant toutes instillation intranasale, les animaux seront préalablement anesthésiés (isoflurane gazeux), une analgésie est mise en place en accord avec notre table se suivi de soin. Une euthanasie par CO2 sera pratiquée en cas de besoin au cours du suivi ou à la fin du protocole pour les animaux ayant survécus. De plus, les points limites seront monitorés régulièrement afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux.
Choix des espèces
Les souris C57BL6/J ont été choisies, car leur sensibilité à P. aeruginosa permet de provoquer une pneumonie tout en évitant une mortalité trop importante à 24h. Par ailleurs ce modèle a déjà été étudié au sein de notre équipe de recherche à plusieurs reprises. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 8 semaines, car c’est l’âge des souris du même modèle retrouvé dans la littérature. C’est également l’âge des souris utilisées dans de précédentes expérimentations réalisées dans notre équipe, ce qui nous permettra de conserver le même modèle d’étude pour l’interprétation de nos résultats.
Étude des fonctions de modifications du squelette cellulaire et leur implication dans les pathologies
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
5 209 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse de leurs organes, dans des procédures relevant de la gravité sévère ou menées sous anesthésie sans réveil. Une partie ne subit qu'un suivi de son état clinique, d'autres une ouverture du thorax sous anesthésie profonde sans reprise de conscience, pour étudier la régulation du squelette des cellules. Le porteur signale qu'une souche présente une ataxie et que l'état des nouvelles lignées créées reste inconnu à l'avance. Il justifie l'usage de la souris par l'étude de ces mécanismes au niveau de l'"organisme entier".
Objectifs
Ce projet a pour but d’analyser les rôles et les fonctions de différents aspects de la régulation du squelette cellulaire (cytosquelette): d’un côté ses composantes propres, de l’autre les éléments qui interagissent avec lui, au niveau de l’organisme entier, la souris. Le cytosquelette étant impliqué dans de nombreuses fonctions cellulaires, sa régulation est susceptible d’avoir des effets sur de nombreux processus cellulaires, qui, perturbées, pourrait avoir des répercussions sur la bonne survie de l’organisme entier. Ainsi, comprendre la régulation du cytosquelette et pouvoir l’influencer, permettra d’élucider son impact sur le maintien de la survie cellulaire et, comment sa dérégulation participe au développement de maladies. A terme, ce projet permettra de développer les moyens de dépistage et de nouvelles thérapies ciblant les maladies reliées à la dérégulation du cytosquelette. Le cytosquelette est présent dans toutes les cellules, ou il exerce des rôles très divers : il donne aux cellules leur forme, participe au mouvement des cellules et au transport intracellulaire, rend possible la division cellulaire et le déplacement de spermatozoïdes lors de la fécondation. Le cytosquelette interagit avec de nombreuses protéines qui contrôlent ses fonctions. Une des hypothèses suggère que le choix des éléments utilisés pour construire le squelette cellulaire et les modification de ces éléments constituent un code, qui définit ses propriétés et influence les interactions avec les autres protéines spécifiant ainsi ses fonctions. Le présent projet est une continuation d’un projet précèdent, qui a permis de démontrer le rôle essentiel de la régulation du cytosquelette dans la survie des neurones et dans la fertilité. Nous proposons maintenant d’étendre notre analyse à d’autres modèles murins de ce code de cytosquelette.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre les rôles des mécanismes de régulation du cytosquelette. Étant donné que le cytosquelette a des fonctions essentielles dans toutes les cellules, cela suggère que sa régulation pourrait être impliquée dans le développement normal de l’organisme. Inversement, les défauts de cette régulation pourraient être à l’origine de maladies telles que les neurodégénérescence, cancer ou infertilité. Cette étude vise à éclaircir le mode d’action de ces mécanismes de régulation du cytosquelette et de développer les moyens de dépistage et les traitements des pathologies liées à sa dérégulation.
Procédures
Les animaux sont soumis à une analyse phénotypique (analyse de l’état clinique des animaux) pendant leur vie mais ne subiront aucune intervention. A différents âges, les animaux seront anesthésiés et ensuite mis à mort pour fixation de leurs organes.
Impact sur les animaux
Une des souches murines utilisée dans ce projet a été décrite comme ataxique, c'est à dire qui présente des problèmes de coordination de mouvements. Pour les nouveaux modèles qui seront générés dans le cadre de cette étude, la condition des animaux n’est pas connue à l’avance. Les nuisances subies par les animaux seront celles liées à une thoracotomie sous anesthésie générale profonde. Les nuisances s'arrêteront en fin de chirurgie (procédure sans réveil).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyses de leurs organes
Remplacement
Après les premières étapes d'analyse des enzymes, impliquant la culture cellulaire (expression d’enzymes dans les lignées cellulaires et observation de leurs activités), le projet a pour but maintenant de comprendre la fonction de ces enzymes et leur mécanisme d’action au niveau de l'organisme vivant intégré et autonome, la souris.
Réduction
Les animaux générés lors de ce projet seront utilisés à la fois pour l’analyse phénotypique et pour l'analyse de leurs organes, permettant de réduire le nombre total d’animaux. Le nombre d’animaux nécessaires à la bonne exécution de ce projet sera suffisant pour obtenir les résultats statistiquement significatifs. Les croisements seront optimisés pour produire les animaux d'intérêt. Les animaux contrôles proviendront des mêmes portées que les animaux d’intérêt.
Raffinement
Les animaux seront surveillés deux fois par semaine minimum. Tout signe de mal-être, tel que la perte de poids, blessure, mauvaises relations sociales sera détecté et l‘animal sera soigné et soit isolé, soit mis à mort. Les soins peuvent inclure l’application d’une crème désinfectante (blessure) ou d’un complément nutritif (perte de poids). Une grille de score est mise en place pour le suivi clinique des animaux.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en biologie du développement, de cancer et de la neurodégénérescence. Les modèles génétiquement modifiés des éléments de cytosquelette, protéines interagissant avec le cytosquelette et les enzymes impliquées dans la régulation du cytosquelette permettent de définir leurs rôles dans ces différentes maladies. Du fait de la parenté biologique avec l’Homme, les modèles murins sont d’excellents modèles de différentes pathologies. Les analyses seront effectuées à 6 différents âges : nouveau-né, 1 mois (animal jeune), 4 mois (animal adulte), 12 mois (animal âgé) et 18 et 24 mois (animaux très âgés). En effet, les niveaux de modifications changent au cours du développement de l’organisme. De plus, certains mutants devront être analysés très âgés, vu que l’on veut observer la dégénérescence liée à l’âge chez ces animaux. Les analyses de certaines lignées (à phénotype non-dommageable uniquement) nécessiteront la génération d’embryons au stade embryonnaire E14.5 ou E17.5 (soit 14,5 jours-post fécondation ou 17,5 jours post-fécondation) E14.5 ou E17.5. En effet à partir d’embryons de ces âges (en jour post-fécondation) il est possible de cultiver les cellules primaires nécessaires pour l’étude de mécanismes cellulaires impliqués.
Étude de la circulation des cellules ILC2s au cours de l’inflammation de type 2.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système respiratoire
176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont jointes chirurgicalement deux par deux par parabiose, opération d'environ 45 minutes créant une circulation sanguine commune, puis reçoivent des injections et des prélèvements de sang au sinus rétro-orbital sous anesthésie. Le porteur décrit un protocole "parfaitement maîtrisé" et une "absence de signes quantifiables de souffrance". Il étudie la circulation de cellules immunitaires liées à l'asthme et renvoie les applications thérapeutiques au long terme.
Objectifs
Le système immunitaire permet de se défendre contre les agressions des pathogènes, mais sa dérégulation est aussi impliquée dans le développement diverses maladies telles que l’asthme. Le système immunitaire est partagé en deux grandes parties : la partie innée, préexistante, et reconnaissant des caractéristiques partagées entre différents pathogènes, et la partie adaptative, qui comme son nom l’indique s’adapte en fonction du pathogène rencontré, par des jeux de sélection et de prolifération de cellules extrêmement spécifiques du pathogène en question. Les cellules innées de groupe 2 (ILC2s) sont des lymphocytes innés résidents des tissus (poumons/intestin). Elles participent à la défense contre les parasitique, à la réparation tissulaire mais aussi aux processus physiopathologiques comme l’asthme. Les ILC2 se développent dans la moelle osseuse puis se maintiennent à long terme dans les tissus, avec la capacité de proliférer et répondre in situ en cas d’inflammation. Des résultats récents indiquent cependant qu’il existe des sous-populations ILC2s circulantes stimulées par l’inflammation et impliquées dans le maintien de l’intégrité d’un tissu, selon un axe intestin-poumon et/ou axe moelle osseuse-poumon. La fonction de ces ILC2s est encore peu connue (inflammation/régénération). Seules des expériences de parabioses peuvent permettre dans un même tissu de différencier les cellules ILC2s circulantes du sous-groupe des cellules résidentes. Les objectifs du projet sont donc 1- de déterminer les situations inflammatoires qui aboutissent à une circulation d’ILC2 2- comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans cette circulation 3- déterminer le stade de développement auquel les ILC2s circulent (progéniteur ou cellule mature) 4- déterminer l’importance physiologique de ce recrutement sur la situation inflammatoire et la régénération tissulaire. Cliniquement, il est important de comprendre ces processus car dans les cas d’allergies et asthme, la présence d’ILC2 en circulation corrèle avec une évolution défavorable ; déterminer leur rôle et mode de migration nous permettra d’envisager de bloquer leur migration chez les patients à risque.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet scientifique permettra de comprendre ce qui régit la circulation des ILC2 en détaillant les mécanismes moléculaires mis en jeu par cette population pour se propager dans les tissus en inflammation. Le mode de circulation de populations cellulaires initialement considérées comme résidentes est encore peu compris mais des données préliminaires indiquent que leur rôle serait crucial pour obtenir une réponse adaptée du tissu. A long terme, ces données moléculaires de la circulation de sous-populations d’ILC2s pourrait représenter une source importante de moyen d’actions supplémentaires pour lutter contre les crises d’asthme ou d’allergies non résolues par les corticoïdes. Ces cas sont nombreux et en constante augmentation au vu du nombre croissant d’allergies dans le monde. Il est clairement établi que ces ILC2 seraient « trop » inflammatoires dans le cas d’inflammation chronique de type 2 et donc qu’un moyen d’empêcher la mise en place d’un recrutement constant de cellules supplémentaires dans les voies aériennes des patients pourraient représenter une chance thérapeutique de deuxième intention.
Procédures
• Chirurgie de parabiose : 1 chirurgie par animal, environ 45 minutes d’anesthésie générale • Prélèvements de sang au sinus rétroorbital sous anesthésie, 1 fois 5 minutes. Si le chimérisme n’est pas effectif, les animaux pourront être prélévés de la même manière à 4 semaines et à 6 semaines • Des injections de molécules non toxiques seront réalisées dans l'abdomen des animaux anesthésiés à raison de 3 à 7 fois sur une semaine. Des administrations de molécules non toxiques seront réalisées en intranasale sur des animaux anesthésiés à raison de 2 à 3 fois. Pour ces interventions les anesthésies sont de l’ordre de 5 minutes.
Impact sur les animaux
Le protocole de parabiose est parfaitement maîtrisé dans notre laboratoire tant au niveau réalisation qu'au niveau de la gestion de l'analgésie pré et postopératoire avec une absence de signes quantifiables de souffrance animale, sans réduction de la mobilité. Injections de cytokines et d’anticorps antagonistes. Toutes les injections sont réalisées par voie intrapéritonéale ou intranasale après anesthésie des animaux en utilisant l’isoflurane, le dépôt dans la première narine est réalisé en sortant la souris une minute de la chambre à induction suivi d’un retour et du dépôt dans la seconde narine de façon identique. Ces injections n’induisent pas de douleur perceptible chez les animaux traités (pas de perte de poids, pas de changement de comportement alimentaire, pas de perturbation du comportement social ou nerveux (mobilité, interactions, agressivité ou prostration).
Devenir
les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Aucune data préliminaire in vitro ne peut être réalisée pour motiver cette étude de circulation. La présence d’une fréquence de cellules ILC2s non négligeable dans le sang de patients asthmatiques contrairement aux contrôles sains est une motivation importante pour décider de comprendre ce qui génère des cellules circulantes à partir de populations résidentes et le mécanisme de circulation mis en place. La circulation des populations immunes à travers les différents organes est très contrôlée. Les cellules passent par une circulation sanguine et lymphatique qui sont des environnements complexes et impossible à mimer sur des tests in vitro. Afin de pouvoir conclure sur des fonctions différentielles de nos cellules circulantes versus celles résidentes et de comprendre les mécanismes moléculaires en jeu, les expériences in vivo sont absolument essentielles et aucun système in vitro n’existe pour obtenir des résultats préalables.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires, l'étude des mécanismes moléculaires (anticorps bloquants) ne sera réalisée que si le taux circulation des ILC2s est significativement différent entre les conditions testées. De plus, les données de la littérature et celles déjà générées au laboratoire nous permettent de limiter le nombre d’hypothèses à tester. Enfin, le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Seulement dans les conditions adéquates où l'augmentation du taux circulant des ILC2s est validé, une étude du blocage des molécules de circulation se fera par l’injection des anticorps bloquants. Nous vérifierons ainsi en étudiant le tissu cible si les populations ILC2s bloquées avaient plutôt un effet inflammatoire ou réparateur. Appliquer les bloquants uniquement dans le cas d’une circulation statistiquement signifiante permet de réduire les effectifs requis et visera à réduire le nombre de souris nécessaires pour maintenir une interprétation biologique robuste.
Raffinement
Les animaux seront manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences afin de les habituer et de limiter leurs stress. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement lors de la première semaine post-chirurgie, puis deux à trois fois par semaine afin d’assurer leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress. Une grille de score a été établie afin d’évaluer régulièrement la souffrance des souris, et des points limites ont été définis. Une fiche d’observation tout au long des procédures permettra de vérifier leur état (pelage, poids, respiration, mobilité…) et des scores seront tenus afin de vérifier que le traitement n’induit pas de modifications des habitudes et du bien-être animal. En cas de changement des scores, des points limites sont établis (perte de poids rapide, modification aspect pelage/alopécie, déshydratation, changement de consistance/couleur des selles) et le suivi rapproché des animaux permettra de définir s’il est nécessaire de - diminuer la dose et/ou d’administrer des antalgiques selon la gravité des changements de comportement. Ces conditions s’appliquent à toutes les procédures.
Choix des espèces
Une circulation d’ILC2s chez l’homme est corrélée à la sévérité des allergies/crises d’asthme. La souris est un modèle de choix par la forte similitude des systèmes immunitaires humains/murins. Elles sont les plus facilement manipulables (chirurgie ici et génétiquement modifiées) pour comprendre la circulation (système sanguin/lymphatique et production des cellules immunes). Nous avons besoin de travailler avec différents types de souris depuis longtemps utilisées dans les laboratoires et qui ne présentent pas de signe de souffrance. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (6 à 10 semaines après la naissance, afin d’avoir un système immunitaire mature). Nous n’attendons pas d’effet lié à l’âge des souris. Cependant, des animaux plus âgés ont aussi une peau plus épaisse. Nous éviterons donc de les utiliser.
Role de la dérégulation de la voie BMP dans l’hypertension pulmonaire
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
560 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit une injection de monocrotaline pour induire une hypertension pulmonaire, puis des traitements par injections, avec deux anesthésies pour échographie cardiaque et cathétérisme, avant d'être tué pour prélever poumons et cœur. Le porteur qualifie de bénins les effets attendus car la maladie est étudiée à un stade précoce, et applique une crème anesthésiante aux points d'injection. Sur le remplacement, il indique disposer de résultats sur cellules humaines mais vouloir les valider dans trois modèles animaux d'hypertension pulmonaire.
Objectifs
L'hyperTension Artérielle Pulmonaire (HTAP) est une maladie qui affecte les petits vaisseaux du poumon qui vont s'épaissir par un processus appelé remodelage vasculaire pulmonaire. Cette altération va imposer un effort au cœur qui à terme va aboutir à une insuffisance cardiaque. Bien que les mécanismes restent encore méconnues, il est maintenant établi que les protéines osseuses morphogénétiques joue un rôle important dans ce remodelage vasculaire pulmonaire. Cependant, les connaissances autour du mode de fonctionnement de ces protéines dans les petits vaisseaux du poumon sont très limitées. C'est pourquoi nous souhaitons étudier leurs rôles dans l'HTAP et tester l’efficacité de molécules ciblant ces protéines pour lesquelles nous avons trouvé une efficacité sur des cellules de vaisseaux pulmonaires en culture.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet seront multiples et devraient permettre non seulement de mieux comprendre le rôle des protéines présentes dans les petits vaisseaux du poumon, mais aussi leur contribution au développement de l'HTAP. De plus, ce projet permettra de tester l'efficacité de certaines molécules ciblant ces protéines pour lesquelles de premiers résultats in vitro sont encourageants.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés pour effectuer une échocardiographie afin de valider le modèle avant les traitements (temps : 5 min/ rat). En fin de traitement les animaux seront à nouveaux anesthésiés afin de mesurer tous les paramètres nécessaires à l'étude (échographie et cathétérisme).
Impact sur les animaux
La procédure appliquée à ce projet nécessite d'effectuer 2 types d'injection chez le rat : 1 injection sous-cutanée et des injections intra-péritonéales pour les traitements ou du placébo. Pour limiter ces nuisances, une crème lidocaïne sera appliquée sur la zone où s'effectueront les injections. Également, deux anesthésies gazeuses (isoflurane) seront pratiquées sur l'animal : la première pour valider le modèle expérimental avant traitement par échographie transthoracique, et la deuxième pour évaluer l'efficacité du traitement par échographie transthoracique et cathétérisme. Nous veillerons donc au bon réveil de l'animal et évaluerons son bien-être et prendrons, si nécessaire, les mesures développées dans la description de la procédure. La première injection de la procédure est réalisée avec la monocrotaline, une molécule naturelle extraite de la plante Crotalaria. Cette molécule est connue pour induire une hypertension pulmonaire modérée chez le rat. Les effets seront bénins dans notre projet car nous étudierons la mise en place de la maladie en phase précoce. Nous avons également des données qui valident la non toxicité cellulaires de nos molécules pour les différents traitements du projet. D’ailleurs, une étude publiée récemment a démontré l’innocuité et l’efficacité de ce type de molécules pour lutter contre le métabolisme du glucose et des lipides dans le cadre de modèles animaux axés sur l’étude de l’obésité.
Devenir
Des prélèvements d'organes (poumons et cœur) seront réalisés afin de valider l'efficacité des traitements dans les tissus biologiques. De plus, comme décrites dans notre demande, différentes expérimentations biologiques seront réalisées au laboratoire pour démontrer les mécanismes mis en jeu.
Remplacement
Nous avons obtenu des résultats sur des échantillons pulmonaires humains et des cultures de cellules qui indiquent une altération de voies de signalisation dans les cellules endothéliales HTAP et que celle-ci peuvent être restaurées sous l'effet d'une molécule spécifique. Dans l'objectif de valider l'importance de ce défaut sur la fonction cardiaque et sur le remodelage des petites artères pulmonaires, nous souhaitons restaurer ces voies dans 3 modèles complémentaires d'HTAP reconnus internationalement et conclure sur son potentiel thérapeutique.
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d'animaux, nous avons choisi de cibler nos traitements sur les protéines de la voie ayant la plus forte dérégulation que nous comparons aux contrôles positifs et négatifs d'hypertension pulmonaire. De plus, les effectifs ont été calculés à l’avance et se basent sur nos études passées et celles récemment publiées autour de ce type de molécules. Le critère déterminant pour évaluer l'efficacité du projet est la mesure de la pression artérielle pulmonaire moyenne. Les données de ce projet seront traitées statistiquement à l'aide d'un logiciel spécifique. Par ailleurs, les échantillons provenant d'animaux témoins non malades et témoins d'HTAP pourront être réutilisés pour d'autres projets de recherche pour des analyses histologiques et moléculaires.
Raffinement
Les rats bénéficieront d'un enrichissement de milieu avec du coton, des rouleaux de carton et des bâtonnets en bois. Ces animaux ne seront jamais hébergés seuls dans des cages séparées et feront l'objet d'une période d'adaptation d'une semaine après leur arrivée avant de débuter une procédure. Pour la réalisation de la procédure, nous avons établi des points limites au moyen d'un score afin d'évaluer le bien-être animal. Les animaux seront donc suivis quotidiennement afin de veiller à ce bien-être et de prendre les mesures nécessaires développées dans la description de la procédure.
Choix des espèces
Les rats sont des modèles standards d’études de maladies cardiovasculaires. Afin que nos résultats soient comparés aux travaux de la littérature dans ce domaine, des rats âgés de 4 semaines et pesant 100 grammes chacun seront utilisés.
Effet de la délétion d’un gène impliqué dans la régulation de la voie du TGF-β1 dans le développement de la fibrose pulmonaire
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
120 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une fibrose pulmonaire leur est induite par administration dans la trachée d'un virus, avant leur mise à mort pour prélever le sang, le liquide pulmonaire et les poumons, afin d'évaluer le rôle d'un gène régulant une protéine impliquée dans la fibrose. Le porteur ne détaille pas les procédures dans la rubrique prévue, qui reprend le texte des objectifs, mais mentionne un suivi de la douleur par une échelle intégrant la perte de poids et les difficultés respiratoires. Il affirme travailler in vitro "si possible" tout en jugeant "indispensable" le recours au poumon entier vivant.
Objectifs
La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est un processus pathologique létal aboutissant à une destruction fibreuse des poumons. C’est une maladie rare avec une prévalence de 10 à 20 cas pour 100 000. Elle conduit à une insuffisance respiratoire et au décès avec une médiane de survie de 3 à 5 ans après diagnostic. Il n’existe actuellement aucun traitement pharmacologique efficace. La fibrose pulmonaire est le fait d’une cicatrisation exagérée avec accumulation de collagène et remodelage de la matrice extracellulaire. Le Transforming Growth Factor (TGF)-β1 est une cytokine clé impliquée dans la fibrogenèse. Nous proposons d’utiliser des souris C57bl/6J avec une délétion génétique d’une protéine cible qui est impliquée dans la régulation de la voie du TGF-β1. Plusieurs publications ont récemment démontré que l’activation de cette protéine permettait de limiter le développement de la fibrose. L’objectif principal de ce projet consiste à étudier l’impact de la délétion génique d’une protéine cible (identité confidentielle) sur la gravité de la fibrose pulmonaire induite par administration intra-trachéale d’un adénovirus codant pour le TGFbeta.
Bénéfices attendus
La fibrose pulmonaire idiopathique est un processus pathologique létal. Il n’existe actuellement aucun traitement pharmacologique efficace. Cette expérimentation permettra de mettre en lumière la protéine délétée comme une cible thérapeutique potentielle dans la fibrose pulmonaire.
Procédures
La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est un processus pathologique létal aboutissant à une destruction fibreuse des poumons. C’est une maladie rare avec une prévalence de 10 à 20 cas pour 100 000. Elle conduit à une insuffisance respiratoire et au décès avec une médiane de survie de 3 à 5 ans après diagnostic. Il n’existe actuellement aucun traitement pharmacologique efficace. La fibrose pulmonaire est le fait d’une cicatrisation exagérée avec accumulation de collagène et remodelage de la matrice extracellulaire. Le Transforming Growth Factor (TGF)-β1 est une cytokine clé impliquée dans la fibrogenèse. Nous proposons d’utiliser des souris C57bl/6J avec une délétion génétique d’une protéine cible qui est impliquée dans la régulation de la voie du TGF-β1. Plusieurs publications ont récemment démontré que l’activation de cette protéine permettait de limiter le développement de la fibrose. L’objectif principal de ce projet consiste à étudier l’impact de la délétion génique d’une protéine cible (identité confidentielle) sur la gravité de la fibrose pulmonaire induite par administration intra-trachéale d’un adénovirus codant pour le TGF-β1.
Impact sur les animaux
La fibrose pulmonaire idiopathique est un processus pathologique létal. Il n’existe actuellement aucun traitement pharmacologique efficace. Cette expérimentation permettra de mettre en lumière la protéine délétée comme une cible thérapeutique potentielle dans la fibrose pulmonaire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer le sang, le liquide lavage broncho-alvéolaire et le tissu pulmonaire dans le but d’étudier l’impact de la délation du gène régulant la voie du TGF-β1 sur le développement de la fibrose pulmonaire.
Remplacement
Nous remplacerons si possible l’expérimentation sur animaux par des expériences in vitro. Mais le tissu pulmonaire est un tissu complexe issu de différentes cellules épithéliales, fibroblastiques, mésothéliales, organisées en tissu et interagissant dans un système dynamique. La fibrose pulmonaire est elle aussi complexe et son développement implique plusieurs processus (inflammation, remodelage tissulaire). Tout ceci rend indispensable de travailler in vivo sur l’organe pulmonaire entier pour bien comprendre le rôle du gène d’intérêt dans le développement de la FPI.
Réduction
Nous réduirons le nombre d’animaux au minimum tout en permettant de remplir nos objectifs. Le nombre d’animaux sera déterminé a priori par une analyse de puissance et représentera le nombre minimal d’animal permettant de produire des résultats statistiquement interprétables.
Raffinement
Une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé (lumière, température, bruit) au sein d’un centre de zootechnie. Leur surveillance et l’entretien des cages seront réalisés par un personnel expérimenté. Ils bénéficieront d’un enrichissement du milieu de vie par des éléments creux plastiques (tunnels), et des bandelettes de papiers (permettant leur isolement dans la cage). De plus, ils bénéficieront depuis 7 jours avant le début du protocole et pendant toute sa durée, d’une alimentation enrichie sous forme d’aliments gélatineux déposés sur la litière, ce qui en facilite l’accès pour limiter la perte de poids et la déshydratation qui caractérisent le modèle. Le modèle de fibrose pulmonaire sera appliqué par du personnel qualifié et entrainé. Afin de réduire la douleur, les animaux seront suivis au moyen d’une échelle d’évaluation de la douleur (Apparence physique, perte de poids, altération de la mobilité et difficultés respiratoires). Les points limites fixés nous permettront de décider de la mise à mort ou non des animaux.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car le processus de fibrose pulmonaire est très bien documenté dans la littérature chez cette espèce, ce qui en fait un modèle d’étude validé par la communauté scientifique. De plus, le modèle murin offre la possibilité de manipulation génétique, et ce projet utilisera des souris génétiquement modifiées (souris KO pour un gène d’intérêt). Nous utiliserons des souris âgées de 10 à 15 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant. Pour minimiser la dégradation de l’état général des animaux induit par le développement de la fibrose pulmonaire, nous utiliserons des souris de poids supérieur à 21g.
Étude chez le rat des effets neurorespiratoires de dérivés opioïdes et leur réversion par un antidote
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
380 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une chirurgie de trente à quarante-cinq minutes, ils reçoivent de fortes doses de fentanyl ou d'autres opioïdes puis l'antidote, pour comparer les effets respiratoires et leur réversion. Le porteur indique attendre une sédation pouvant aller jusqu'au coma, une rigidité musculaire et, du fait des doses choisies, possiblement la mort. Il affirme que ces effets sur le système respiratoire ne peuvent s'étudier que sur un "animal entier".
Objectifs
Le fentanyl est un opioïde synthétique peropératoire dont l’efficacité analgésique en comparaison à l’intensité des effets secondaires est à l'origine de l'essor de son utilisation en particulier en anesthésie mais aussi dans la prise en charge de la douleur. L’utilisation du fentanyl exposerait néanmoins au risque de toxicité opioïde typique avec survenue d’un trouble de conscience et d’une dépression respiratoire ainsi qu’un risque de dépendance et d’abus. De plus, on observe une rigidité thoracique et diaphragmatique survenant très rapidement après injection, durant près de 15 min et pouvant conduire au décès rapide en l’absence de prise en charge immédiate et optimale. Il a par ailleurs été rapporté la nécessité de plus grandes doses de naloxone, l’antidote utilisé pour reverser les effets des opioïdes. Depuis récemment, le Center for Disease Control (CDC) américain considère que les opioïdes représentent désormais la première cause de mort toxique aux États-Unis, avec une contribution supérieure à 85% du fentanyl et de ses dérivés aux décès. Les effets neurorespiratoires délétères observés en clinique en cas de surdosage par les dérivvés du fentanyl ainsi que la particularité des décès qui leur sont attribués (survenue dans les minutes suivant l'injection d'une forte dose, rigidité musculaire entrainant la paralysie des muscles respiratoires), nous ont conduits à concevoir ce travail expérimental chez le rat, avec pour objectifs d’abord, de caractériser de façon comparative, la réponse ventilatoire et diaphragmatique après administration d’une dose élevée de différentes molécules opioïdes. Ensuite, on étudiera l’efficacité de la réversion de leurs effets neurorespiratoires respectifs par l'antidote de référence.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément les mécanismes et les spécificités de la toxicité neuro-respiratoire à la suite d'overdose aux dérivés opioïdes et ainsi permettre l'optimisation ou le développement de nouvelles thérapeutiques pour la prise en charge des patients intoxiqués.
Procédures
Pour les animaux de la procédure 1 : Procédure chirurgicale (30 mins) et injection de substances (1-2 injections; 5 - 10 secondes). Pour les animaux de la procédure 2 : Procédure chirurgicale (30 mins), injection de la substance étudée (1 injection; 5 secondes) et prélevements sur animaux vigiles (8 prélèvements; environ 1 min). Pour les animaux de la procédure 3 : Procédure chirurgicale (45 mins) et injection de substances (1-2 injections; 5 - 10 secondes).
Impact sur les animaux
En raison du contexte d’exposition des animaux et des effets recherchés dans ce projet, on s’attend à plusieurs effets secondaires à l’utilisation des dérivés opioides y compris : Sédation allant d’une réduction de l’activité locomotrice jusqu’au coma, myoclonies, rigidité musculaire, ou encore l'élévation non contrôlée de la queue. De part le choix de la dose, on s’attend possiblement au décès. La présence de ces effets, leur durée ainsi que leur intensité varient en fonction de l’opioïde utilisé. De plus, les procédures 2 et 3 nécessiteront l'hébergement en cage individuelle des rats à la suite de leur chirurgie et jusqu'à la fin de la procédure.
Devenir
La réutilisation des animaux est impossible en raison de la récupération post-mortem de l'appareillage de télémétrie ou de l'atteinte d'un point limite (atteinte du volume sanguin de prélèvement maximal autorisé) qui requiert la mise à mort des animaux.
Remplacement
L’ensemble des procédures ne sont pas remplaçables par des expériences in silico ou in vitro, en raison d’une approche physiopathologique du système respiratoire intégrée sur animal entier.
Réduction
Par nos expériences passées sur les mêmes modèles animaux, il est estimé qu’un groupe de 6 animaux exploitables est suffisant pour appliquer une analyse statistique et mettre en évidence des différences le cas échéant. Ce nombre est prédéterminé à l’aide du logiciel InVivoStat® (Essex, Royaume-Uni). Pour tous les tests, une valeur de p
Raffinement
Le suivi quotidien des animaux par un personnel qualifié et la mise en place de points limites adaptés permettront d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur, d’abord par des antalgiques dans la limite du possible pour ne pas interférer avec l’expérience en cours et par une mise à mort anticipée selon les méthodes réglementaires, si nécessaire. L'ensemble des chirurgies de ce projet sera réalisé sous anesthésie générale associé à une analgésie péri-opératoire. Enfin, une ouate en silicone sera utilisée en post-opératoire pour permettre une meilleure cicatrisation et une prise en charge plus rapide en cas de saignement.
Choix des espèces
La quasi-totalité des études expérimentales in vivo effectuées sur les dérivés opioïdes ainsi que sur la physiologie neurorespiratoire a été faite chez le rongeur, et principalement chez le rat. De plus, le rat est un bon modèle pour les études de pharmacocinétique ayant un métabolisme semblable à celui de l’Homme. De par sa taille, les prélèvements sanguins, ainsi que la pose des sondes de télémétrie sont plus aisés et donc plus reproductibles. Enfin, les prélèvements sanguins peuvent se faire de manière repetée sur un même animal permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire dans ces études. Nous utiliserons des rats Sprague-Dawley adultes, âgés de 8 à 9 semaines (jeunes adultes, poids : 250-350 g) au moment de l’expérimentation. Ce stade de développement a été choisi par analogie avec la littérature.
Etudes des interactions hôtes-pathogènes appliquées à la recherche de nouveaux types d’antituberculeux.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
6704 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1676 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par la tuberculose, parfois co-infectées par le SARS-CoV-2, la grippe ou le pneumocoque, et reçoivent des composés par gavage jusqu'à sept jours par semaine. Le porteur indique que les surinfections peuvent provoquer des signes cliniques graves pouvant aller jusqu'à la mort des animaux. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'infection et revendique la souris comme un "modèle incontournable".
Objectifs
L'objectif du projet est d'étudier l'effet de composés (médicaments, substances chimiques ou produits biologiques) à visée thérapeutique contre la tuberculose, et d'évaluer la pathogénicité de différentes souches bactériennes de Mycobacterium tuberculosis sauvages ou mutantes, ainsi que la contribution de l'hôte à la pathogénicité des mycobactéries in vivo chez la souris. L'intéraction entre la tuberculose chronique et d'autres pathogènes pulmonaires étant encore mal caractérisée, un autre objectif de ce projet sera de caractériser et d'étudier l'évolution de la co-infection (tuberculose et agents pathogènes viraux/bactériens pulmonaires, tels que les virus SRAS-CoV-2 et Influenza H3N2/H1N1 et les bactéries Streptococcus pneumoniae Sérotype 1) dans un modèle de souris.
Bénéfices attendus
Selon les estimations de l’Organisation Mondiale de la Santé, 9,9 millions de personnes ont développé la tuberculose dans le monde, et 1,5 million de personnes sont mortes de la tuberculose en 2020 (dont 214 000 présentaient également une infection à VIH). À l’échelle mondiale, la tuberculose est la 13e cause de mortalité et la deuxième due à une maladie infectieuse, derrière la COVID-19 (et avant le sida). Cette évolution est principalement liée à la recrudescence de la tuberculose chez des patients immunodéprimés, ainsi qu'à l’émergence des souches résistantes aux antibiotiques. Dans ce contexte, nos projets visent (i) à identifier de nouveaux types d'antituberculeux efficaces sur les souches multirésistantes de Mycobacterium tuberculosis, (ii) à comprendre les mécanismes fondamentaux de l'interaction de l'hôte avec ces mycobactéries, afin de comprendre les mécanismes responsables de l’infection, et (iii) à caractériser et étudier l'impact d'une co-infection pulmonaire chez la souris atteinte d'une tuberculose latente.
Procédures
Selon leur formulation, les composés peuvent être administrés quotidiennement (5 à 7 jours par semaine) par gavage ou voie intrapéritonéale ou une fois par semaine par voie intraveineuse (dans la veine caudale) aux souris non-anesthésiées, pendant 3 à 8 semaines. L’administration par voie endotrachéale ou intranasale peut également être utilisée 3 à 4 fois par semaine et pendant 1 à 3 semaines sur souris préalablement anesthésiées. L'infection des souris avec les différents agents pathogènes pulmonaires est réalisée par voie intranasale sous anesthésie ou par voie intraveineuse ou sous cutanée sur animaux vigiles. Dans le cadre des expériences de co-infections, les animaux seront infectés à deux reprises, (i) avec Mycobacterium tuberculosis, puis (ii) un des autres pathogènes pulmonaires étudiés. Pour l'imagerie, les animaux sont anesthésiés et placés dans une cassette de contention pendant une durée de 5 minutes pour permettre l'acquisition des images (1 à 2 fois par semaine).
Impact sur les animaux
Lors des expériences de surinfection, des signes cliniques graves pourraient etre observés, pouvant aller jusqu'à entrainer la mort des animaux.
Devenir
Pour chaque procédure, les animaux sont euthanasiés par dislocation cervicale en fin d'expérience pour effectuer le prélèvement de différents organes pour analyse.
Remplacement
Aucun modèle expérimental in vitro ne permet d'englober tous les aspects de l'interaction hôte-pathogène qui aboutissent à la tuberculose pulmonaire évolutive, ni de reproduire la physiopathologie de l’infection respiratoire, ni d’étudier les mécanismes de défense contre l’infection. Seules les études in vivo permettent de déterminer l'efficacité de composés face à une épreuve virulente de M. tuberculosis. Et l’efficacité chez la souris constitue un pré-requis avant toute phase clinique sur l'homme. De nombreux aspects de la pathogénicité étant comparables entre l’homme et la souris, il est ainsi admis que la souris constitue un modèle incontournable pour le suivi de la réplication du bacille tuberculeux in vivo et l’étude de l’interaction entre l’hôte et les mycobactéries. Les différentes stratégies innovantes de vaccination contre les mycobactéries pathogènes peuvent être évaluées et validées chez la souris qui, infectée efficacement par des souches de M. tuberculosis pathogènes humaines, développe une tuberculose pulmonaire active.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux, une partie des organes est également utilisée et analysée par histologie ou par FACS, afin de visualiser la localisation des bactéries dans différents types cellulaires. Une approche par imagerie du petit animal, sous anesthésie, sera développée au sein du Laboratoire de Haute Sécurité pour permettre le suivi de l'infection d'un seul groupe d'animaux au cours du temps, sans avoir besoin de sacrifier les animaux. Nous espérons à terme que cela puisse réduite le nombre d'expériences.
Raffinement
De façon à réduire le stress, l'inconfort et la douleur, les souris sont anesthésiées avant l''infection ou le gavage. De plus, la surveillance sera accrue, 2 à 3 fois par semaine ou quotidienne, selon les procédures. L'apparence physique, l'alimentation et le comportement des anmaux seront surveillés, afin de détecter le plus tot possible une éventuelle morbidité. Une grille de signes cliniques a été établie et est utilisée pour évaluer un "score" de douleur et permet d'évaluer le niveau de souffrance des animaux. Les animaux présentant des signes cliniques défavorables seront euthanasiés. Les souris seront sacrifiées au maximum 10 semaines post-infection, i.e. avant l'apparition des signes de morbidité, sur la base des connaissances de la souche de M.tuberculosis de type sauvage qui est la plus pathogène parmi les mycobactéries que nous étudions. Si des signes de morbidité étaient observés, les points de cinétiques serons revus et réajustés, les individus seront euthanasiés et les analyses prévues réalisées plus précocément par rapport à celles initialement prévues.
Choix des espèces
1)La possibilité d’induction d’une tuberculose chronique chez la souris par des souches de M. tuberculosis pathogènes pour l’homme et la pertinence de ce modèle expérimental en ce qui concerne l’évolution de la maladie, 2)L’existence de nombreuses similitudes de l’immunité anti-mycobactérienne entre l’homme et la souris, 3)Les nombreuses connaissances disponibles pour cette espèce, font de ce modèle expérimental un système de choix qui permet d’éviter le recours aux espèces plus sensibles. Les animaux (Balb/C et C57BL/6, wild-type et KO) utilisés sont âgés de 6 à 10 semaines au moment de l'infection par M. tuberculosis. Cet intervalle d’âge permet d’avoir un système immunitaire optimal.
Mise au point d’un modèle de dénutrition chez la souris âgée mimant la personne sénescente afin d’étudier la physiologie pulmonaire
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
33 souris âgées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère. Le porteur les soumet à un régime carencé en protéines et calories jusqu'à la dénutrition, qu'il qualifie lui-même de stress sévère, en s'attendant à un affaiblissement, une mobilité réduite et une possible surmortalité. Cette étude pilote vise à fixer les points limites de futurs projets, les souris étant hébergées seules et pesées quotidiennement avant d'être mises à mort pour prélever leurs organes. Il affirme que l'impact de la dénutrition sur la santé respiratoire des personnes âgées ne peut s'étudier que sur des animaux vivants.
Objectifs
Les personnes âgées présentent un risque accru de développer des maladies respiratoires telles que les infections pulmonaires. L’apparition d’infections respiratoires récurrentes chez les personnes âgées est associée à un état de dénutrition qui affaiblit les fonctions physiologiques de manière générale et qui affecte aussi la composition des microbiotes de l’intestin et des poumons. L’objectif de cette étude pilote est d’évaluer l’impact de la dénutrition protéino-énergétique sur des souris âgées afin de définir des points limites pour de futurs projets qui étudieront l’effet de cette dénutrition sur la physiologie pulmonaire et la susceptibilité aux infections respiratoires, et l’impact de différents compléments alimentaires. Cette étude permettra aussi de déterminer la durée de régime nécessaire à l’installation de la dénutrition chez ces animaux âgés en établissant une cinétique de l’affaiblissement des animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d’établir le modèle de dénutrition chez la souris âgée dans notre laboratoire et servira à déterminer les points limites auxquels nous pourront nous attendre lors des études qui s’attacheront à établir l’effet de la dénutrition protéino-énergétique sur la susceptibilité aux infections pulmonaires et leur modulation grâce à des compléments alimentaires (probiotiques et prébiotiques). A terme, ce projet permettra de (i) identifier les mécanismes d’action de la dénutrition sur la santé respiratoire et (ii) de proposer des compléments alimentaires pour prévenir le développement de pathologies infectieuses pulmonaires chez les personnes âgées en état de dénutrition. L’objectif de cette étude pilote est d’évaluer l’impact de la dénutrition protéino-énergétique sur des souris âgées afin de définir des points limites pour de futurs projets qui étudieront l’effet de cette dénutrition sur la physiologie pulmonaire et la susceptibilité aux infections respiratoires, et l’impact de différents compléments alimentaires. A terme, ce projet permettra de (i) identifier les mécanismes d’action de la dénutrition sur la santé respiratoire et (ii) de proposer des compléments alimentaires pour prévenir le développement de pathologies infectieuses pulmonaires chez les personnes âgées en état de dénutrition.
Procédures
Les animaux recevront un régime restricitif en protéines et calories riche qui entrainera une diminution de leur poids. Ils seront aussi manipulés quotidiennement afin de les peser, méthode qui ne prendra pas plus que quelques minutes. Une fois par semaine, au moment de la pesée, les souris seront aussi mises dans dans pots individuels pendant quelques minutes afin de récolter 2-3 fèces.
Impact sur les animaux
Lors de cette procédure, il sera nécessaire d’héberger les animaux en cages individuelles car nous devrons suivre précisément la prise alimentaire de chaque souris, cela entraine un stress modéré. La diminution de l’apport alimentaire (en quantité) entrainera une perte de poids qui sera mesurée quotidiennement et rapportée au poids du J0 de l’expérience. Du fait de l’âge de ces animaux et de ce régime alimentaire carencé, nous nous attendons à ce que les animaux soient affaiblis et montrent une réduction de leur mobilité. Cette dénutrition est considérée comme un stress sévère. L’accumulation de l’âge avancé des animaux avec le régime alimentaire restrictif pourra avoir des conséquences importantes sur le bien-être et la santé des souris âgées pouvant aller jusqu’à une mortalité accrue. La mise en place de cette étude pilote est prévue dans cette optique et permettra de sélectionner le temps d’étude de la dénutrition le plus approprié dans les futurs projets.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de la procédure afin de collecter les organes et tissus permettant d'évaluer les effets de du régime restrictif sur les marqueurs de l’inflammation et de la sénescence.
Remplacement
L’impact de la dénutrition sur la santé respiratoire d’individus âgés n’est actuellement possible que sur des animaux vivants. En effet, il n’existe pas de système permettant de récapituler un être constituté de plusieurs organes interagissant entre eux par de multiples voies. D’autre part, les systèmes de « communication » entre le tractus digestif et l’appartil respiratoire n’étant pas connus à l’heure actuelle, il n’est pas possible d’utiliser des systèmes in vitro.
Réduction
Les animaux utilisés, au nombre maximum de 33, seront des animaux de l’élevage de l’unité qui fournira les animaux. Ces animaux ont préalablement été utilisés pour générer des souriceaux pour d’autres projets d’autres équipes/unités du centre de recherche (ces animaux n’ont pas été inclus dans des projets soumis à une demande d’autorisation). Nous nous inscrirons donc dans le cadre d’une réduction des animaux en expérimentation animale en évitant d’avoir recours à des animaux commandés chez un fournisseur externe. Ce projet ayant pour but de déterminer le temps de restriction calorique nécessaire à l’installation de la dénutrition, tout en évitant l’atteinte des points limite, nous estimons que nous aurons besoin de 8 animaux par groupe pour les 3 temps d’étude de la dénutrition (3 × 8 = 24) et de seulement 3 animaux par temps pour les animaux sans restriction énergétique (3 × 3 = 9 ; 24 + 9 = 33). Cela prend en compte la possibilité de mise à mort de certains animaux (25% = 2 animaux par groupe dénutris) à des temps précoces si ceux-ci atteignent les points limite. Dans le cas où nous devrions mettre à mort les animaux plus précocément que prévu (particulièrement pour les groupes pour lesquels la mise à mort est prévue à J45 et J55), nous en tirerons la conclusion que pour nos futures études, il faudra se baser sur un temps précoce de dénutrition.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’un enrichissement, avec dans chaque cage, en plexiglas transparent qui permet aux animaux des interactions visuelles, olfactives et auditives avec leurs congénères, l'ajout d’un abri obscur en polycarbonate et des feuilles de cellulose. Du fait de l’âge de ces animaux et du régime alimentaire carencé, nous éviterons un stress supplémentaire et nous nous assurerons de la prise complète de la nourriture, par l’humidification de celle-ci et son dépôt dans une coupelle à l’intérieur des cages, avec de l’eau gélifiée. Cela permettra aux animaux de s’alimenter et s’abreuver sans effort physique. La manipulation régulière des animaux par les mêmes personnels expérimentés pour les mesures du poids, de la prise alimentaire et le prélèvement des fèces permettra de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Les animaux seront surveillés quotidiennement (surveillance visuelle, suivi de la prise alimentaire et de la perte de poids) et le remplissage d’une grille de scoring quotidien permettra de d’arrêter l’expérience pour les animaux ayant atteint un état de stress ou de souffrance trop élevé.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence en nutrition et immunologie ; disciplines au carrefour desquelles la thématique du projet nous positionne. Elle est aussi une espèce largement utilisée dans l’étude du vieillissement et dans le cadre de la restriction calorique. Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies liées à l’alimentation. Les animaux utilisés seront des adultes âgés d’environ 16 mois ce qui équivaut à 50 ans pour les humains. Cet âge a été choisi car les souris auront environ 18 mois à la fin du protocole, limitant le risque de mort prématurée des animaux, non-due au protocole, l’espérance de vie moyenne des souris C57BL/6 étant d’environ 24 mois, en l’absence de tout traitement.
Efficacité et toxicité après administration buccale et nasale de biothérapies anti-hémophiliques A et B chez des souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système respiratoire
2 400 souris hémophiles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Sous anesthésie, elles reçoivent des facteurs de coagulation par le nez ou par un patch collé sur la langue, puis subissent un prélèvement sanguin terminal ou une section de la queue pour mesurer le temps de saignement, sans être réveillées. Le porteur indique que leur maladie prédispose à des hémorragies parfois mortelles en cas de bagarre, d'où une surveillance quotidienne, week-ends compris. Il affirme que la souris hémophile est, après le chien, le seul modèle permettant de mesurer l'activité de ces médicaments et que son statut hémophile est "indispensable".
Objectifs
L’hémophilie est une maladie hémorragique grave caractérisée par un déficit en agents de la coagulation, appelés facteurs de coagulation, sans lesquels la coagulation (formation du caillot de sang permettant de tarir l’hémorragie lors d’un traumatisme) est impossible. Un déficit en facteur numéro VIII aboutit à l’hémophilie de type A et un déficit en facteur numéro IX aboutit à l’hémophilie de type B. Le traitement actuel de cette maladie, qui consiste en l’administration régulière au long cours des facteurs de coagulation par voie intraveineuse, est efficace pour prévenir ou traiter l’apparition d’un saignement mais altèrent fortement la qualité de vie des patients. Le développement de voies d’administration, autres qu’intraveineuse, pour le traitement de l’hémophilie, permettrait donc d’améliorer la qualité de vie des patients. En pratique courante, il existe des médicaments qui peuvent être administrés au travers des muqueuses de la bouche ou du nez. Le nez a déjà montré son efficacité pour le passage de médicaments et de vaccins en dehors de l’hémophilie. La bouche présente elle l’avantage d’éviter le tube digestif (pas de dégradation du médicament, ni de réaction de défense de l’organisme) et d’avoir une muqueuse très fine facilitant la traversée des médicaments. Parmi les éléments impliqués dans la biodisponibilité muqueuse, un récepteur semble jouer un rôle majeur dans la capture des médicaments, qui s’appelle le FcRn. Ce récepteur joue ainsi un rôle de transporteur permettant le passage d’actifs à travers la barrière muqueuse. L’objectif de ce projet est ainsi de comparer deux voies d’administration muqueuses (voie nasale et voie buccale) de facteurs anti-hémophiliques dans un modèle de souris (souris sauvages ou modifiés génétiquement). Ce modèle permettra d’identifier les paramètres d’efficacité et de toxicité associé à ces deux nouvelles voies d’administrations non invasives. Cinq médicaments seront testés : les facteurs VIII et IX non modifiés, 2 dérivés du facteur IX et 1 dérivé du facteur VIII, modifiés pour améliorer leur disponibilité dans le sang leur liaison au récepteur FcRn. Après chaque traitement, des études de coagulation seront effectuées, nécessitant 2400 souris sur une durée de 5 ans afin d’atteindre une puissance statistique nécessaire à l’interprétation des données.
Bénéfices attendus
Le développement de voies d’administration non invasives pour les facteurs anti-hémophiliques pour le traitement de l’hémophilie A et B seraient bénéfiques pour les patients : - Améliorer l’adhésion au traitement - Améliorer l’observance (la prise régulière des médicaments à visée préventive) - Améliorer la qualité de vie en réduisant les contraintes liées aux injections répétées - Eviter des réactions de défenses de l’organisme en évitant le tube digestif (comprimé) et la circulation sanguine (administration par voie intraveineuse)
Procédures
Pour la procédure 1, seulement un poiçon d'oreille sera réalisée pour pouvoir bien contrôler la qualité génétique de la lignée, Ce geste de quelques secondes sera réalisée par un zootechnicien entrainé et une légère compression (quelques secondes) sera réalisée si besoin. Pour les procédures 2 à 5, l’administration des médicaments se fera sur des animaux anesthésiés pour pouvoir évaluer l’efficacité de deux nouvelles voies d’administrations au travers de la muqueuse, la voie nasale (gouttes nasales) et la voie buccale (application d’un patch). Le patch, composé de sucres et des facteurs de coagulation, mesure 6mmx2mm et est placé sur la face ventrale de la langue. Il est mucoadhésif, biocompatible et se dégrade dans la salive en environ 20 min. Seulement une voie d’administration sera testée pour chaque souris. Il s’agit d’un inconfort de niveau léger et de très courte durée (temps d’administration inférieur à 1min dans les 2 cas (nasale et buccale) et prélèvement au maximum 24 heures après l’administration). De plus, cette administration sera exécutée après une anesthésie générale gazeuse. Il y aura 2 tests d’efficacités, un prélèvement sanguin et une section de la queue pour observer la coagulation, un seul réalisé pour chaque souris. Dans les deux cas, les gestes seront réalisés sous anesthésie générale et suivi d’une mise à mort alors que la souris sera toujours sous anesthésie générale. Ces tests seront réalisés au maximum 24 heures après l’administration nasale ou buccale. Durant le projet, tout sera mis en œuvre pour répondre au mieux aux critères de remplacement, de réduction et de raffinement (3R).
Impact sur les animaux
Un inconfort léger après administration nasale ou buccale est attendu pour une durée de quelques minutes. Puis les animaux seront tous mis à mort au maximum dans les 24h après l'administration des facteurs de la coagulation pour prélever le sang et pouvoir doser les facteurs de coagulation qui sont passés de la muqueuse à la circulation sanguine. Concernant le test de coagulation par section de la queue, il sera intégralement réalisé sous anesthésie générale avec mise à mort en fin d’expérimentation donc aucun effet indésirable n'est attendu. En raison du phénotype dommageable (l’hémophilie prédispose à des saignements), même si ces souris présentent très peu de signes cliniques tels qu’observés chez l’homme (hémorragies internes spontanées), en cas d’agressivité et de combats dans la cage, une hémorragie peut survenir et elle peut être mortelle. Une surveillance quotidienne de ces lignées est donc prévue (weekends et jours fériés inclus). En cas d’hémorragie, les souris seront mises à mort.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure : - pour la procédure 1 : après 6 mois de reproduction les souris seront mise à mort pour le remplacement des géniteurs. - pour les procédures 2 et 3 : le prélèvement sanguin est terminal car un important volume de plasma (partie du sang contenant les facteurs de coagulation) est nécessaire. Les souris seront mises à mort en fin de prélèvement alors qu’elles sont encore sous anesthésie générale. - pour les procédures 4 et 5 : l’efficacité clinique des facteurs anti hémophiliques, c’est-à-dire leur capacité à arrêter un saignement, ne peut se démontrer qu’à l’aide d’un test de coagulation réalisé en conditions réelles de blessures. Ce test de référence est la section d’un petit morceau de queue et une observation du temps de saignement (au maximum pendant 10minutes) chez une souris sous anesthésie générale. Les souris ne seront pas réveillées à l’issu du test, et elles seront mises à mort. - pour toute les procédures de 1 à 5, si un point limite est atteint, les animaux seront tous mis à mort.
Remplacement
Des analyses préliminaires sur modèle murin sont nécessaires avant de commencer les essais cliniques chez l’homme. Premièrement, des études préliminaires de toxicité de ces médicaments sur les muqueuses ont été effectuées in vitro, mais bien que satisfaisante, la toxicité n’a pas été étudié in vivo et donc le recours à l’homme n’est pas possible. Deuxièmement, le recours à l’animal vivant est justifié car il n’existe pas d’autres modèle permettant l’analyse des effets doses et effets temps après que des médicaments aient été administrés par voie nasale ou buccale. De la même façon, seul un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire est nécessaire pour des études sur la coagulation sanguine (test de saignement). Enfin, des études chez l’homme ne peuvent pas être réalisées car cela mettrait le pronostic vital de patients hémophiles en jeu et le volume sanguin requis serait trop important dans un délai trop court.
Réduction
Dans la procédure 1, le nombre minimal de reproducteurs a été sélectionné. Dans les procédures 2 à 5, le groupe contrôle est commun à l’analyse des facteurs VIII et IX ce qui réduit le nombre d’animaux. Dans les procédures 4 et 5, seulement 2 temps d’analyse seront étudiés car les résultats des procédures 2 et 3 seront utilisés pour réduire le nombre d’animaux utilisés. De plus, des souris mâles et femelles seront utilisées de façon indifférente car aucune différence n’est attendue entre espèces pour les paramètres étudiés. Ainsi, toutes les naissances d’animaux seront concernées par les procédures, sans mise à mort sélective d’un des deux sexes. Ainsi, le principe de réduction du nombre d’animaux est appliqué au sein des 5 procédures.
Raffinement
Pour veiller au bien-être de l’animal, les conditions d’élevage, d’hébergement, des soins et des méthodes utilisées pour chaque étape de l’expérimentation seront optimisées pour minimiser douleurs, souffrance et angoisse, tel que l’enrichissement du milieu (copeau de bois, coton et dôme de cellulose). Un suivi quotidien des animaux sera effectué, cela permettra d’augmenter la surveillance (contrôle à 1h et antalgique dans l’eau de boisson) en cas d’altération du comportement (présence d’une courbure du dos) et d’identifier rapidement si un animal a atteint un des points limites définis ; auquel cas il sera profondément anesthésié puis mis à mort. L’administration par voie buccale ou nasale (inconfort de niveau léger et de très courte durée) sera exécutée sous contention légère après anesthésie gazeuse. Le prélèvement sanguin et le test in vivo de coagulation par section de la queue seront réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie (anti-douleur).
Choix des espèces
La souris hémophile est la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de la coagulation. En effet, le dosage de l’activité coagulante des facteurs anti-hémophiliques humains ne peut être effectué qu’en l’absence des protéines analogues du modèle. Le statut hémophile est donc indispensable. C’est pourquoi l’utilisation de souris pour cette étude se justifie car uniquement deux modèles d’animaux hémophiles sont disponibles : le chien et la souris. Les deux modèles murins hémophiles (hémophilie A et hémophilie B) servant de base à tout protocole préclinique concernant l’activité coagulante des facteurs sont très bien caractérisées. Ils permettent de mettre en évidence la capacité coagulante des molécules générées après l’administration de molécules thérapeutiques. L’absence des facteurs anti-hémophiliques murins proches de nos facteurs anti-hémophiliques humains est un prérequis pour la mesure de l’activité du produit. En plus d'être un modèle pertinent en hématologie et en immunologie, la souris est un animal de petite taille, facilement manipulable et génétiquement bien caractérisé. Ce protocole sera effectué sur des souris sevrées depuis 3-4 semaines (le sevrage se fait entre 3 et 4 semaines de vie selon la taille des souriceaux). Ces souris (entre 6 et 12 semaines) seront pesées quotidiennement à partir de la 3ème semaine de sevrage pour vérifier qu’elles ont le poids idéal (soit au moins 20-25g), pour recevoir un maximum de 10µl de matériels à tester par voie nasale et un patch de 10mm². En effet, ces jeunes individus présentent des parois vasculaires plus propices à une bonne efficacité des molécules à tester nous permettant de nous rapprocher des conditions chez l’homme. Ainsi, les modèles animaux seront bien représentatifs du profil hémorragique observé dans l’hémophilie. Des individus plus âgés ont un profil de coagulation différent des individus plus jeunes. Les expérimentateurs sont formés aux gestes impliquant un contact avec la souris, et à l'observation des signes cliniques fondamentaux, coagulation inclus.
Evaluation de la capacité de microorganismes à prévenir des infections de type grippal dans un modèle souris.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système respiratoire
478 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, presque toutes tuées à l'issue et quatre gardées pour l'entraînement du personnel. Elles reçoivent une infection grippale, jusqu'à 26 gavages de microorganismes, des prélèvements de sang et de fèces et des séances d'imagerie sous anesthésie, avant le prélèvement des poumons et du tube digestif. Le porteur teste des probiotiques censés réduire les symptômes grippaux et évoque un objectif commercial. Il affirme que les interactions virus-hôte ne peuvent pas être reconstituées en culture cellulaire.
Objectifs
Les virus influenza A sont responsables de milliers d’infections chaque année et constituent de ce fait un problème de santé publique. Le modèle d'infection grippale par le virus influenza que nous utilisons chez la souris reproduit très bien ces mécanismes inflammatoires et son emploi permet d'étudier en détail la réponse immunitaire développée en réponse à l'infection. Dans ce modèle infectieux, le virus grippal induit une pathologie marquée. Ce modèle pathologique permet de tester des stratégies antivirales (drogues, probiotiques, vaccins) en développement afin de valider leurs effets contre ce type de virus. En outre, des virus modifiés permettent le suivi de la réplication virale in vivo grâce à un système d’imagerie intra-vitale. L’imagerie intra-vitale consiste à observer des processus biologiques et à quantifier des signaux lumineux provenant de l’animal vivant sans devoir l’euthanasier, de façon non-invasive. Ce système permet de visualiser in vivo l’importance de la réplication virale la réponse de l’hôte. L'emploi du modèle souris pour étudier les mécanismes pathologiques liés aux virus influenza est extrêmement puissant car il permet de comprendre la dynamique de l'inflammation pulmonaire et de suivre l'afflux de cellules immunitaires au niveau des voies respiratoires. Il permet ainsi de caractériser finement des éléments clés de la réponse de l'hôte qui peuvent être de futures cibles thérapeutiques. Par ailleurs, certaines souches de microorganismes ont été étudiées pour leurs effets positifs sur ces infections virales En effet, il a été démontré que les produits contenant des probiotiques ont un effet immunomodulateur et un effet protecteur contre les infections virales respiratoires chez les souris et l’Homme Plusieurs études, incluant des essais cliniques chez l’homme, démontrent que certains microorganismes peuvent réduire les symptômes pseudo-grippaux (fièvre, écoulement nasal, incidence de la toux et durée de la prescription d'antibiotiques). Ainsi leur emploi comme agents préventifs et thérapeutiques dans les infections respiratoires communes constitue une piste sérieuse pour la réduction de la sévérité de ces infections dans la population générale.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus à court terme : Certains microorganismes sont déjà inclus dans des produits destinés à la consommation humaine. Si des effets bénéfiques sont confirmés par ces essais, les microorganismes testés au cours du projet pourraient également être inclus dans des études cliniques humaines ciblant les pathologies grippales. Il pourrait amener à un positionnement nouveau pour ce produit et bénéficier à la population générale en terme de bien-être (réduction de symptômes grippaux). Par ailleurs, des bénéfices en termes de connaissance sur l’interaction hôte-microorganisme, et plus particulièrement l’interaction microbiote intestinal/santé pulmonaire devraient pouvoir être obtenus en cours de projet. Il s’agit pour notre équipe de l’intérêt principal. Par quelle(s) voie(s) les microorganismes utilisés peuvent-ils stimuler les réactions de défense de l’hôte ? Dans cet objectif d’acquisition de connaissances sur le mode d’action de microorganismes et le rôle du microbiote intestinal dans des pathologies respiratoires, nous inclurons également un groupe test avec de l’acetate. L’acetate est un acide gras à chaine courte (AGCC) produit et consommé par le microbiote intestinal. Il peut notamment être consommé par certaines espèces bactériennes pour produire un autre AGCC, le butyrate, doté de propriétés anti-inflammatoires. Dans la littérature, une administration d’acetate à des souris dans un modèle comprenant une infection grippale suivie d’une infection bactérienne a permis d’amoindrir les effets de ces agents pathogènes. Nous voudrions voir si une protection peut être conférée dans le cas d’une infection grippale seule. Cela pourrait orienter les futures sélections de souches bactériennes, en retenant des bactéries capables de produire des quantités importantes d’acetate. A plus long terme : Pour les microorganismes nouveaux, n’étant actuellement pas commercialisés, leur mise à disposition sur le marché sera forcément plus longue mais constituent un objectif également à la fois commercial et de bien-être (réduction de symptômes grippaux).
Procédures
Prélèvement de feces : sur animal vigile, 474 animaux concernés, 1 prélèvement = maximum 10 minutes dans un pot transparent, 4 prélèvements prévus pour chaque animal sur la durée de la procédure Gavage : sur animal vigile, 478 animaux concernés, 1 gavage = 5-10 secondes avec insertion d’une sonde de gavage dans l’œsophage et injection de 200µl de liquide, 26 gavages prévus pour chaque animal (1 par jour) Contention pour le gavage, sur animal vigile, 478 animaux concernés, 1 contention = 10 secondes où l’animal est immobilisé par une main de personnel compétent / empêche mouvement pour permettre gavage, 26 contentions prévues pourr chaque animal (1 par jour)? Administration intra-nasale : sur animal anesthésié, 474 animaux concernés, 1 administration = 20 secondes, 1 seule par animal pendant la procédure Anesthésie générale pour administration intra-nasale : sur animal vigile, 474 animaux concernés, 1 anesthésie = 1 piqûre en voie intra-péritonéale avec injection de 150µl, 1 seule par animal pendant la procédure Anesthésie gazeuse générale pour imagerie : sur animal vigile, 474 animaux concernés, 1 anesthésie = faire respirer du gaz isoflurane dans une boite hermétique jusqu’à endormissement puis déplacement des animaux dans l’imageur, prise de clichés et remise en cage pour réveil, durée totale = 5 minutes, 3 sessions d’imagerie Prélèvement de sang : sur animal vigile, 474 animaux concernés, 1 prélèvement = une incision à la veine submandibulaire pour recueillir environ 300µl de sang, durée totale = 30 secondes, 1 seule fois par animal pendant la procédure
Impact sur les animaux
L’aspect dommageable de ce protocole réside dans l’infection virale elle-même. Le virus utilisé génére des symptômes très légers à très sévères, en fonction de la dose utilisée lors de l’infection. Dans le cadre de ce projet, aucune mortalité consécutive à l’infection n’est attendue car nous souhaitons utiliser des doses faibles de virus qui ne génèrent pas de symptômes trop importants. Le suivi quotidien est néanmoins indispensable afin d’effectuer un contrôle des signes cliniques. Les dommages principaux liés à l’infection peuvent se manifester par une perte de poids, une détresse respiratoire (sifflement respiratoire, bronchoconstriction) ou une hypothermie. Des signes cliniques peuvent également être relevés : pelage hérissé, posture voûtée, yeux clos ou mi-clos.
Devenir
A l’exception des animaux destinés à l’entrainement pour la contention et les gavages, les autres animaux subiront un prélèvement d’organes post-mortem (poumons, tractus digestif) incompatible avec une survie.
Remplacement
Les rongeurs sont couramment utilisés pour les études des interactions virus-hôte. De telles expériences ne peuvent être réalisées sur des cultures cellulaires qui ne permettent pas de reconstituer les communications entre les différents organes. De plus, les paramètres respiratoires : fréquences respiratoires, volumes respiratoires, bronchoconstrictions; ainsi que les paramètres sanguins : pression partielle en oxygène, hypoxie; malgré de gros progrès réalisés dans le développement d'organoïdes respiratoires, ne peuvent encore aujourd'hui être quantifiés que sur l'animal.
Réduction
Comment mentionné dans les objectifs, certains microorganismes sont issus d’un programme de criblage in vitro au préalable. A partir d’une collection contenant plusieurs dizaines de souches de microorganismes, des essais in vitro sont effectués. Ils ont pour but d’identifier des microorganismes potentiellement intéressants. Ainsi seuls des microorganismes les plus prometteurs sont envisagés pour un test in vivo. Alternativement, d’autres microorganismes ont déjà fait preuve d’une efficacité contre une autre pathologie et sont étudiés dans ce projet en repositionnement. Ce sont des candidats avec de bonne chances de succès, également. Par ailleurs, nous utilisons toujours une approche statistique pour déterminer la taille de nos groupes en fonction de l’intensité des effets que nous souhaitons mettre en évidence et des données déjà disponibles. Dans notre cas, des données acquises les années précédentes nous ont permis de calculer les tailles de groupes suivants avec des paramètres classiques (risques α=0,05 et 1-β=0,9) : Pour les pertes de poids, nous avons mesuré un écart-type de 5.33 et nous aimerions distinguer des groupes différents par 5% de perte de poids. Les tables indiquent dans ce cas 25 animaux nécessaires. Pour les analyses en plethysmographie, nous avons un écart-type de 0.8 sur l’indicateur PenH et nous aimerions distinguer des groupes différents par 0.6 unités de cet indicateur. Les tables indiquent dans ce cas 38 animaux nécessaires. Nous pensons qu’un compromis de 30 animaux par groupe reste raisonnable : il nous permettra de mettre en évidence des différences de poids et nous donnera de bonnes opportunités de voir une différence en détresse respiratoire également. Nous effectuerons des ANOVA non paramétriques (Kruskal-Wallis) suivies de test de Dunnet. D’autres types de tests pourront également être menés, notamment pour les analyses de microbiotes où des procédures dédiées existent.
Raffinement
Tout au long des procédures expérimentales, les animaux sont observés et pesés quotidiennement. A partir du moment où la phase infectieuse débute, la température des animaux est également prise chaque jour, et un score clinique individuel est établi. Toutes ces mesures représentent une surveillance accrue nécessaire à cette phase. Par ailleurs, les animaux sont hébergés à plusieurs (4 ou 5) afin de ne pas exposer ces animaux sociaux à un stress lié à l’isolement. Les quelques fois où les animaux sont séparés ne représentent qu’un temps très faible (5-10minutes, environ une fois par semaine) et ne sont pas considérées comme dommageables. Des anesthésies sont prévues lors des phases qui pourraient être stressantes pour l’animal (administrations intra-nasales). L’anesthésie est également requise pour l’imagerie, afin que l’animal ne bouge pas. Nous veillons toujours à ce que les durées d’anesthésie soient limitées au minimum nécessaire (quelques minutes pour l’imagerie, 30 minutes maximum pour l’administration intra nasale). Nous incluons des enrichissements dans les cages : cellulose à dechiqueter et permettant la création de nids, bâtons à ronger et maisonnettes en carton (sans encre). Le matériel que nous utilisons (sonde rectale pour la prise de température, sonde de gavage) est évidemment adapté à nos animaux. Les sondes de gavages sont en plastique souple et fin (diamètre externe voisin du millimètre), à bords arrondis et de taille adaptée (4cm) pour empêcher les blessures et réduire l’inconfort. Des points limites sont définis afin de réduire au maximum la douleur ressentie par les animaux. Enfin, toutes les personnes manipulant les animaux sont formées et compétentes pour ce type d’expérimentation.
Choix des espèces
La souris est un modèle de référence très largement utilisé dans le cadre de l'étude de la réponse développée en réponse aux infections respiratoires virales. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines afin de disposer d'un système immunitaire mature.